專利名稱：基于ito玻璃基底的細胞培養(yǎng)芯片的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬細胞培養(yǎng)芯片領域，特別是涉及一種玻璃細胞培養(yǎng)芯片的制備方法及其應用。
技術背景利用C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞的常規(guī)培養(yǎng)方法是一種研究活細胞的良好方法，在病毒學、免疫學、遺傳學、腫瘤學等各個領域都得到了廣泛的應用，但仍然存在明顯不足。首先是 細胞操作方法繁瑣，不易控制細胞生長的微環(huán)境，難以全面模擬細胞生活的真實環(huán)境；還 有就是細胞所需數(shù)量巨大，不易進行單細胞的控制和操縱，觀察不直接，耗費世紀。將微 流控芯片和細胞培養(yǎng)技術相結合所得到的細胞培養(yǎng)芯片，具有明顯的優(yōu)越性。從器件尺寸 而言，芯片特征尺寸可與細胞大小相比擬，有助于實現(xiàn)單細胞的生物化學實驗；從結構上 而言，芯片內(nèi)物質傳輸與熱傳導非常迅速，有利于細胞培養(yǎng)環(huán)境的快速穩(wěn)定；從集成性而 言，芯片上可以集成多種分析手段，實現(xiàn)細胞培養(yǎng)的微型化。由于這些優(yōu)勢的存在，細胞 培養(yǎng)芯片在細胞遷移、細胞分化、藥物篩選等多個領域正在發(fā)揮越來越重要的作用。在設計芯片時，必須考慮芯片材料的生物兼容性、培養(yǎng)液流動導致的機械力對細胞的 影響和有效成分的傳遞輸送等因素。其中，如何通過簡單快速的微細加工工藝加工生物兼 容性良好的材料是需要解決的首要問題。目前用于加工細胞培養(yǎng)芯片的材料主要有硅、玻 璃和聚二甲基硅氧烷(PDMS)等聚合物材料。PDMS芯片通常采用復制壓模技術制作， 能夠實現(xiàn)微米級圖案的高保真復制，并且具有良好的生物兼容性，可直接培養(yǎng)各類細胞。 但由于PDMS為彈性材料，易受有機試劑作用產(chǎn)生微通道變形、溶脹等現(xiàn)象。并且PDMS 管道表面為疏水性，很難潤濕親水性溶液，在培養(yǎng)液進樣過程中容易產(chǎn)生氣泡而損傷細胞。硅材料親水，能夠耐受硫酸；鹽酸等液體，性質相對穩(wěn)定，加工技術成熟。其缺點主 要是易碎、價格較高、不透光、電絕緣性不夠好、表面化學行為較復雜。與硅、PDMS材 料相比，玻璃廉價、易得，且具有良好的親水性能、力學性能，制作設備與傳統(tǒng)IC (集成 電路)工藝設備相兼容。然而，現(xiàn)在制作玻璃芯片的方法是在玻璃基底上濺射一層金屬 或多晶硅等薄膜材料作為刻蝕掩模層，然后進行濕法或干法刻蝕，最后在超凈環(huán)境中利用 高電壓或高溫進行鍵合，整個加工工藝復雜，價格昂貴。細胞體外培養(yǎng)還需要一定的恒溫環(huán)境和合適的氣體供應。常規(guī)培養(yǎng)下，C02培養(yǎng)箱能 夠為細胞培養(yǎng)提供37X:的恒溫環(huán)境和適當?shù)?2、 C02供應。因此，制作細胞培養(yǎng)芯片時， 需要集成溫度控制裝置，并滿足細胞對氣體的需求。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種基于ITO (Indium-Tin-Oxide,氧化銦錫)玻璃基底的細胞培 養(yǎng)芯片制備方法及其應用，克服現(xiàn)有的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片的疏水性問題和玻 璃材質芯片的加工工藝復雜問題，為細胞在體外的穩(wěn)定培養(yǎng)提供了良好的條件。本發(fā)明的基于ITO玻璃基底的細胞培養(yǎng)芯片的制備方法，包括步驟以ITO玻璃為細胞培養(yǎng)芯片的基質材料；以ITO玻璃未濺射ITO薄膜的一側甩涂 AZ4620光刻膠作為玻璃腐蝕的掩模層，根據(jù)設計的掩膜版進行曝光、顯影；將PDMS單 體、固化劑按比例均勻混合，澆注在ITO薄膜一側，加熱固化；將ITO玻璃置于腐蝕液中， 刻蝕得微管道和"壩型"結構；剝離ITO薄膜上的PDMS;將PDMS單體、固化劑按比例 均勻混合后，平鋪在載玻片上，加熱固化得PDMS薄膜將PDMS薄膜和己刻蝕微管道的 ITO玻璃一側在氧等離子體作用下鍵合得到細胞培養(yǎng)芯片；再在ITO玻璃未鍵合PDMS薄 膜的一側通過黏附金屬導線連入外部溫度控制系統(tǒng)。所述的微管道分兩個區(qū)域，其中一個區(qū)域為細胞培養(yǎng)區(qū)域，另外一個區(qū)域為培養(yǎng)液進 樣區(qū)域，兩個區(qū)域通過"壩型"結構連接；所述的"壩型"結構髙度小于微管道深度；所述的腐蝕液是BOE (Buffered Oxide Etch);所述的固化劑是Dow Coming公司所提供的sylgard184產(chǎn)品；所述的PDMS單體與固化劑的重量混合比為10:1;所述的加熱固化是8(TC加熱固化1小時；所述的黏附金屬導線是通過導電膠將金屬導線黏附在ITO薄膜上； 所述的外部溫度控制系統(tǒng)，其溫度控制對象為芯片微管道內(nèi)液體的溫度，其溫度傳感器為PtlOOO溫敏電阻，其加熱方法為ITO薄膜導電發(fā)熱的直接加熱方式，其控制中心為ADfiC812單片機。本發(fā)明的一種基于ITO玻璃基底的細胞培養(yǎng)芯片的應用在于細胞遷移、細胞分化、細 胞之間相互作用研究。所述的細胞是動物細胞或植物細胞，或正常體細胞或腫瘤細胞； 所述細胞的培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)液添加Leibovitz's L-15培養(yǎng)基。 本發(fā)明的有益效果(1)利用玻璃濕法腐蝕過程中的鉆蝕效應刻蝕出高度低于微管道深度的壩型結構，隔離 細胞培養(yǎng)區(qū)域和培養(yǎng)液進樣區(qū)域，減少了培養(yǎng)液進樣所產(chǎn)生的流體剪切力對細胞培養(yǎng)的影 響；(2) 利用ITO玻璃的ITO薄膜導電發(fā)熱性質，在芯片上集成溫度控制系統(tǒng)(3) 利用PDMS材料的透氣性特點，在實驗過程中無須通入氧氣，降低了細胞培養(yǎng)微系 統(tǒng)設計的復雜度；(4) 在細胞培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)液添加了Leibovitz'sL-15培養(yǎng)基，可以保持培養(yǎng)液pH 值的穩(wěn)定，從而去除CCb的供應。


圖1是ITO玻璃芯片制作工藝過程示意圖；圖2是芯片的掩膜版設計示意圖；圖3是玻璃刻蝕后的微管道示意圖圖4是細胞培養(yǎng)和觀察微系統(tǒng)示意圖；圖5是P正C內(nèi)皮細胞在芯片內(nèi)的貼壁展開示意圖；圖6是3T3細胞在芯片內(nèi)的相對運動示意圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一歩闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領域技術 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限 定的范圍。實施例1細胞培養(yǎng)玻璃芯片制作工藝流程如圖1所示，具體如下1. 清洗ITO (Indium-Tin-Oxide,氧化銦錫)玻璃，先用丙酮和酒精各超聲11分鐘，再用 去離子水沖洗干凈；2. 在ITO玻璃未濺射ITO薄膜的一側甩涂AZ4620光刻膠(2000轉/秒，30秒)，8(TC前 烘3分鐘；3. 根據(jù)設計的掩膜版(如圖2所示)進行曝光；4. 顯舉，130*0后烘，得到與芯片設計所對應的圖形結構；5. 將聚二甲基硅氧烷(PDMS)單體和固化劑(Dow Coming公司所提供的sylgaidl'84產(chǎn) 品)按重量比10:1混合均勻，脫氣處理30分鐘后澆注在ITO薄膜一側，80X:固化1 小時；6. 將ITO玻璃置于1:6稀釋的BOE腐蝕液中腐蝕50分鐘，將圖形轉移到ITO玻璃上， 刻蝕得到的微管道深度約為39微米，得到的壩型結構最大高度約為31微米，刻蝕完 成后的微管道如圖3所示；7. 去除覆蓋在ITO玻璃上的PDMS材料，將玻璃用丙酮、酒精各超聲5min清洗干凈；8. 將PDMS單體和固化劑按10:1重量比混合均勻后，脫氣處理30分鐘，澆注在水平放 置的載玻片上，8(TC固化一個小時，獲得厚度為lmm的PDMS薄膜9. 將PDMS薄膜和已刻蝕微管道的ITO玻璃一側在等離子體刻蝕儀內(nèi)處理45秒，完成兩 者的不可逆鍵合；10..在ITO玻璃未鍵合--側，即濺射有ITO薄膜處，利用導電膠黏附金屬導線，連入外部 溫度控制系統(tǒng)，其溫度控制對象為芯片微管道內(nèi)液體的溫度，其溫度傳感器為PtlOOO溫敏 電阻，其加熱方法為ITO薄膜導電發(fā)熱的直接加熱方式，其控制中心為AD(iC812單片機。實施例2培養(yǎng)液采用1640培養(yǎng)基，將其與L-15培養(yǎng)基以1:1混合后，補充10%的胎牛血清、 100Unit/ml鏈霉素。用胰酶消化液(含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA)消化常規(guī)培養(yǎng)的 P正C內(nèi)皮細胞、離心去上清、培養(yǎng)液分散重懸，將細胞懸濁液的濃度調(diào)整到4xlOscells/ mm3,然后用注射器吸入細胞懸濁液，通過注射泵緩慢注入芯片內(nèi)。將此已導入細胞的芯 片和溫度控制裝置、培養(yǎng)液進樣裝置相連進行細胞的培養(yǎng)。溫度控制目標設置在37±0.51C, 培養(yǎng)液進樣速度為8fiL/s。芯片置于倒置顯微鏡下實時觀察的細胞的生長狀況。細胞培養(yǎng) 和觀察微系統(tǒng)如圖4所示。圖5為PIEC內(nèi)皮細胞在導入芯片4小時內(nèi)，利用視頻系統(tǒng)記 錄下來的細胞貼壁展開圖。實施例3培養(yǎng)液采用DMEM (髙糖)培養(yǎng)基，將其與L-15培養(yǎng)基以1:1混合后，補充10%的胎 牛血清、100Unit/ml鏈霉素。用胰酶消化液(含0.25。/。胰蛋白酶和0.02%EDTA)消化常規(guī) 培養(yǎng)的3T3細胞、離心去上清、培養(yǎng)液分散重懸，將細胞懸濁液的濃度調(diào)整到4"05cdls/ mm3,，然后用注射器吸入細胞懸濁液，通過注射泵緩慢注入芯片內(nèi)。將此已導入細胞的 芯片和溫度控制裝置、培養(yǎng)液進樣裝置相連進行細胞的培養(yǎng)。溫度控制目標設置在37±0.5 X:，培養(yǎng)液進樣速度為8jiL/s。芯片置于倒置顯微鏡下實時觀察的細胞的生長狀況。細胞 培養(yǎng)和觀察微系統(tǒng)如圖4所示。圖6為3T3細胞在芯片培養(yǎng)過程中，利用視頻系統(tǒng)記錄下來的兩個細胞在2小時內(nèi)相 對移動過程。
權利要求
1.一種基于ITO玻璃基底的細胞培養(yǎng)芯片的制備方法，包括步驟以氧化銦錫ITO玻璃為細胞培養(yǎng)芯片的基質材料；以ITO玻璃未濺射ITO薄膜的一側甩涂AZ4620光刻膠作為玻璃腐蝕的掩模層，根據(jù)設計的掩膜版進行曝光、顯影；將聚二甲基硅氧烷PDMS單體、固化劑按比例均勻混合，澆注在ITO薄膜一側，加熱固化；將ITO玻璃置于腐蝕液中，刻蝕得微管道和“壩型”結構；剝離ITO薄膜上的PDMS；將PDMS單體、固化劑按比例均勻混合后，平鋪在載玻片上加熱固化得PDMS薄膜；將PDMS薄膜和已刻蝕微管道的ITO玻璃一側在氧等離子體作用下鍵合得到細胞培養(yǎng)芯片；再在ITO玻璃未鍵合PDMS薄膜的一側通過黏附金屬導線連入外部溫度控制系統(tǒng)。
2. 根據(jù)權利要求1所述的基于ITO玻璃基底的細胞培養(yǎng)芯片的制備方法，其特征在于-所述的微管道分兩個區(qū)域，其中一個區(qū)域為細胞培養(yǎng)區(qū)域，另外一個區(qū)域為培養(yǎng)液進樣區(qū) 域，兩個區(qū)域通過"壩型"結構連接。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的基于ITO玻璃基底的細胞培養(yǎng)芯片的制備方法，其特征在 于所述的"壩型"結構高度小于微管道深度。
4. 根據(jù)權利要求1所述的基于ITO玻璃基底的細胞培養(yǎng)芯片的制備方法，其特征在于 所述的腐蝕液是Buffered Oxide Eteh。
5. 根據(jù)權利要求1所述的基于ITO玻璃基底的細胞培養(yǎng)芯片的制備方法，其特征在于 所述的PDMS單體與固化劑的重量混合比為10:1。
6. 根據(jù)權利要求1所述的基于ITO玻璃基底的細胞培養(yǎng)芯片的制備方法，其特征在于 所述的加熱固化是80'C加熱固化1小時。
7. 根據(jù)權利要求l所述的基于ITO玻璃基底的細胞培養(yǎng)芯片的制備方法，其特征在于 所述的黏附金屬導線是通過導電膠將金屬導線黏附在ITO薄膜上。
8. 根據(jù)權利要求1所述的基于ITO玻璃基底的細胞培養(yǎng)芯片的制備方法，其特征在于 所述的外部溫度控制系統(tǒng)，其溫度控制對象為芯片微管道內(nèi)液體的溫度，其溫度傳感器為 PtlOOO溫敏電阻，其加熱方法為ITO薄膜導電發(fā)熱的直接加熱方式，其控制中心為 ADnC812單片機。
9. 一種基于ITO玻璃基底的細胞培養(yǎng)芯片的應用在細胞遷移、細胞分化、細胞之間相互 作用研究。
10. 根據(jù)權利要求IO所述的基于ITO玻璃基底的細胞培養(yǎng)芯片的應用，其特征在于所 述的細胞是動物細胞或植物細胞。
11. 根據(jù)權利要求IO所述的基于ITO玻璃基底的細胞培養(yǎng)芯片的應用，其特征在于所述的細胞是正常體細胞或腫瘤細胞。
12.根據(jù)權利要求IO、 11或12所述的基于ITO玻璃基底的細胞培養(yǎng)芯片的應用，其特征 在于所述細胞的培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)液添加Leibovitz's L-15培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于ITO玻璃基底的細胞培養(yǎng)芯片的制備方法及其應用，制備以ITO玻璃為基質材料；在ITO玻璃未濺射ITO薄膜的一側甩涂AZ4620光刻膠，曝光、顯影；將PDMS單體、固化劑混合，澆注在ITO薄膜一側，加熱固化；將ITO玻璃置于腐蝕液中，刻蝕；剝離ITO薄膜上的PDMS；制備PDMS薄膜；PDMS薄膜和已刻蝕微管道的ITO玻璃在氧等離子體作用下鍵合得到細胞培養(yǎng)芯片；再在ITO玻璃未鍵合PDMS薄膜的一側連入外部溫度控制系統(tǒng)。該芯片克服PDMS芯片的疏水性問題和玻璃材質芯片的加工工藝復雜問題，并且便于直接控制芯片溫度，可應用于細胞遷移、細胞分化、細胞之間相互作用研究。
文檔編號C03C15/00GK101148324SQ20071004599
公開日2008年3月26日 申請日期2007年9月14日 優(yōu)先權日2007年9月14日
發(fā)明者蕾 吳, 楊才表, 輝 趙, 趙建龍, 強 陳 申請人:中國科學院上海微系統(tǒng)與信息技術研究所