CCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCA-3'（SEQ ID Ν0.1 所示）
[0104] 下游引物：5'-biotin-TTGTATTCCTGGTCGTATATACTGTTTTCGAACGC-3'（SEQIDN0·2 所示）
[0105] 探針：5 ' -FAM-TACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTGTG
[0106] -THF-CTGAGACTACAAACT-P-3'（SEQ ID 從).4所示）。
[0107] 首先，我們確定LFS RPA方法的最佳反應(yīng)溫度，我們分別試驗了 15°C、20°C、25°C、 30°(3、35°(3、37°(3、40°(3、45°(3、50°(3不同反應(yīng)溫度，并且將孵育時間設(shè)定為301^11。結(jié)果表明 反應(yīng)溫度低于30°C時，在試紙條上沒有出現(xiàn)試驗條帶，在30°C時出現(xiàn)較弱的試驗條帶，在 35°C_45°C之間試驗條帶沒有可觀察的差異，當(dāng)溫度大于50°C時沒有出現(xiàn)試驗條帶，結(jié)果表 明該試驗的最佳反應(yīng)溫度為35°C_45°C，我們選擇37°C作為該方法的反應(yīng)溫度。
[0108] 隨后，我們測試了37°C條件下，不同孵育時間對于擴(kuò)增結(jié)果的影響，我們試驗了 〇111；[11、1111；[11、5111；[11、10111；[11、15111；[11、20111；[11、25111；[11、30111；[11的試驗結(jié)果，結(jié)果表明在擴(kuò)增10111；[11的 時候，試驗條帶上出現(xiàn)微弱的條帶，當(dāng)反應(yīng)時間在15min-30min之間時試驗條帶沒有出現(xiàn)可 觀測的差異，因此，我們選擇20min作為該試驗的孵育時間。
[0109] 我們用該體系對設(shè)計合成的三對上游引物、三對下游引物與探針組合進(jìn)行評價， 評價結(jié)果表明其中一對(Fn3/Rnl)引物與探針組合能夠產(chǎn)生最強的擴(kuò)增信號，因此，該引物 對與探針進(jìn)行組合應(yīng)用到本發(fā)明中。
[0110]檢測結(jié)果判定:一個樣品在特定的條件下（37°C，20min)試紙條上控制線為陽性， 并且試驗線為陽性的樣品為陽性樣品；試紙條上控制線為陽性，而試驗線為陰性的樣品為 陰性樣品。
[0111] 6、反應(yīng)靈敏度檢測
[0112] 在進(jìn)行LFS RPA方法的靈敏度檢測時，按照上述體系加入反應(yīng)物。使用模板為上述 合成的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，通過核酸測定儀測定濃度計算出拷貝數(shù)，分別稀釋出濃度梯度為lOtlO 1 拷貝/反應(yīng)的共計6個梯度作為模板。擴(kuò)增反應(yīng)在溫度設(shè)定為37°C的水浴鍋中進(jìn)行，時間設(shè) 定為20min，通過試紙條終點檢測擴(kuò)增結(jié)果。如圖2A所示，從該結(jié)果可以看出，該方法的敏感 性為1〇 2拷貝/反應(yīng)。并且具有較廣的檢測范圍，至少在1〇6_1〇2拷貝/反應(yīng)范圍內(nèi)的樣品均能 被檢測出來。
[0113] 在進(jìn)行LFS RPA方法的特異性的檢測時，按照上述體系加入反應(yīng)物。其中使用模板 分別為豬2型圓環(huán)病毒(PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(HP-PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬 偽狂犬病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、口蹄疫病毒(FMDV)。反應(yīng)溫度設(shè)為37°C的水浴鍋中進(jìn) 行，反應(yīng)時間設(shè)定為20min，結(jié)束后使用側(cè)流層析試紙條對結(jié)果進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，只有 PCV2能夠很好的進(jìn)行擴(kuò)增，其他病毒均不能擴(kuò)增，因此，該方法具有很好的特異性，結(jié)果如 表5所示。
[0114] qPCR方法參照文獻(xiàn)（Yang,Z.Z.，et al.，Detection of PCV2DNA by SYBR Green I-based quantitative PCR.J Zhejiang Univ Sci B,2007.8(3) :p. 162-9.)方法進(jìn)行。
[0115] 表5評估LFS RPA方法的特異性

[0118] neg:代表陰性;pos:代表陽性。
[0119] 7、LFS RPA方法檢測臨床樣品
[0120] 首先，我們用LFS RPA方法測試qPCR確認(rèn)的7份陽性樣品和7份陰性樣品，LFS RPA 試驗結(jié)果表明：qPCR確認(rèn)的7份陽性樣品均為陽性，qPCR確認(rèn)的7份陰性樣品均為陰性。我們 用建立的LFS RPA方法來檢測采集自山東省的臨床樣品（η = 45)、甘肅省的臨床樣品（η = 17)以及健康豬的血清樣品(η=12)，并將檢測結(jié)果與qPCR的檢測結(jié)果相比較。結(jié)果表明12 份健康豬的血清樣品LFS RPA檢測結(jié)果和qPCR檢測結(jié)果一致，均都為陰性。在62份臨床樣品 中，LFS RPA檢測結(jié)果為31份陽性樣品，這與qPCR檢測結(jié)果完全一致(CT值為18-30)。我們同 樣用LFS RPA方法檢測了PCV1陽性的樣品（n = 8)，結(jié)果表明，PCV2LFS RPA檢測結(jié)果均為陰 性，因此，該方法具有很好的特異性?；跈z測的82份樣品，與qPCR檢測結(jié)果相比較，LFS RPA的敏感性和特異性均為100%，結(jié)果如表6所示。
[0121] qPCR方法參照文獻(xiàn)（Yang,Z.Z.，et al.，Detection of PCV2DNA by SYBR Green I-based quantitative PCR.J Zhejiang Univ Sci B,2007.8(3) :p. 162-9.)方法進(jìn)行。
[0122] 表6比較LFS RPA方法和qPCR方法的臨床樣品檢測結(jié)果
[0123]
[0124] 綜上可見，本發(fā)明設(shè)計合成的一對引物和一條探針基因序列以及其形成的試紙條 RPA(LFS RPA)方法可以快速診斷豬2型圓環(huán)病毒，而且該檢測方法簡單、快速、檢測結(jié)果真 實可靠。
【主權(quán)項】
1. 一種用于快速檢測豬2型圓環(huán)病毒的實時熒光RPA檢測試劑盒，其特征在于包括有一 對引物和一條探針， 其中，所述的一對引物和一條探針的序列如下所示： 上游引物：5 ' -AAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCA-3 ' 下游引物：5 ' -TTGTATTCCTGGTCGTATATACTGTTTTCGAACGC-3 ' 探針：5 ' -ATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTG -FAM-dT-G-THF-C-BHQl-dT-GAGACTACAAACTGC-P-3 '。2. 如權(quán)利要求1所述的實時熒光RPA檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括水解 緩沖液，醋酸鎂以及ddH20。3. 如權(quán)利要求1或2所述的實時熒光RPA檢測試劑盒，其特征在于用于檢測豬2型圓環(huán)病 毒時，反應(yīng)體系如下：14.75yL的水解緩沖液，1.05yL的ΙΟμΜ上游引物，1.05yL的ΙΟμΜ下游引 物，0.075yL的ΙΟμΜ探針，2yL的病毒DNA模板，4.825yL的ddH 20以及1.25yL的280mM醋酸鎂； 擴(kuò)增反應(yīng)在溫度設(shè)定為37-39°C的實時熒光定量PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)時間為20min-lh， 結(jié)束后通過Mx3005P軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。4. 如權(quán)利要求3所述的實時熒光RPA檢測試劑盒，其特征在于擴(kuò)增反應(yīng)在溫度設(shè)定為37 °(3的實時熒光定量PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)時間為20min，結(jié)束后通過Mx3005P軟件對結(jié)果進(jìn)行分 析。5. 權(quán)利要求1-4任一項所述的實時熒光RPA檢測試劑盒在制備檢測豬2型圓環(huán)病毒試劑 中的用途。6. -種用于快速檢測豬2型圓環(huán)病毒的試紙條RPA檢測試劑盒，含有側(cè)流層析試紙條， 其特征在于還包括有一對引物和一條探針， 其中，所述的一對引物和一條探針的序列如下所示： 上游引物：5 ' -AAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCA-3 ' 下游引物：5 ' -biotin-TTGTATTCCTGGTCGTATATACTGTTTTCGAACGC-3 ' 探針：5 ' -FAM-TACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTGTG-THF-CTGAGACTACAAACT-P-3 '。7. 如權(quán)利要求6所述的試紙條RPA檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括水解緩 沖液，醋酸鎂以及ddH20。8. 如權(quán)利要求6或7所述的試紙條RPA檢測試劑盒，其特征在于用于檢測豬2型圓環(huán)病毒 時，反應(yīng)體系如下：14.7 5yL的水解緩沖液，1.0 5yL的1 ΟμΜ上游引物，1.0 5yL的1 ΟμΜ下游引 物，0.075yL的ΙΟμΜ探針，2yL的病毒DNA模板，4.825yL的ddH20以及1.25yL的280mM醋酸鎂； 擴(kuò)增反應(yīng)在溫度設(shè)定為35-45°C的水浴鍋中進(jìn)行，反應(yīng)時間為15min-30min，結(jié)束后使 用側(cè)流層析試紙條對結(jié)果進(jìn)行檢測。9. 如權(quán)利要求8所述的試紙條RPA檢測試劑盒，其特征在于擴(kuò)增反應(yīng)在溫度設(shè)定為37°C 的水浴鍋中進(jìn)行，反應(yīng)時間為20min，結(jié)束后使用側(cè)流層析試紙條對結(jié)果進(jìn)行檢測。10. 權(quán)利要求6-9任一項所述的試紙條RPA檢測試劑盒在制備檢測豬2型圓環(huán)病毒試劑 中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測豬2型圓環(huán)病毒的實時熒光RPA試劑盒及其用途，還公開了一種快速檢測豬2型圓環(huán)病毒的試紙條RPA試劑盒及其用途。該兩種試劑盒分別包括SEQ？ID？NO.1及SEQ？ID？NO.2所示的引物及各自的探針，雖然針對同一靶標(biāo)序列，但引物和探針的修飾堿基和檢測平臺不同。實驗證明本發(fā)明的兩個試劑盒的敏感性均為102拷貝/反應(yīng)，并均只能特異性檢測豬2型圓環(huán)病毒。分別用本發(fā)明的兩個試劑盒檢測豬2型圓環(huán)病毒疑似樣品，結(jié)果表明這兩個試劑盒的檢測結(jié)果與qPCR的符合度均為100％。因此，本發(fā)明的兩個試劑盒均能快捷、高效、靈敏的檢測豬2型圓環(huán)病毒，為豬2型圓環(huán)病毒的鑒別診斷提供了有效技術(shù)手段。
【IPC分類】C12Q1/70, C12R1/93, C12Q1/68
【公開號】CN105525040
【申請?zhí)枴緾N201610060957
【發(fā)明人】張志東, 楊洋, 秦曉東, 孫英軍
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2016年1月28日