專利名稱：基于絲的纖維的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含由絲連續(xù)長絲再生制得的聚合物的新型可生物吸收材料及其獲得方法。這一從天然絲或絲廢棄物或其它類似絲的材料作為連續(xù)長絲而再生的材料可以被用來開發(fā)用于臨床的組織工程韌帶和腱。由此，該材料可以被用作用于組織工程產(chǎn)品的支架和用于紡織或非紡織可生物吸收植入物(例如疝氣貼劑、縫合線、韌帶固位裝置和血管移植物)。再生絲聚合物也可以被用作由材料基質(zhì)緩慢降解而實(shí)現(xiàn)的藥物控制釋放的載體。
“絲”是由多種動(dòng)物產(chǎn)生的擠出連續(xù)雙長絲的概括描述。這些長絲是基于蛋白質(zhì)的。后者代表了大多數(shù)的天然絲，而有些(源于醋栗葉蜂Nemetus ribesii)是膠原質(zhì)，但大部分由絲蛋白構(gòu)成。
自漢朝開始，就以通過蠶Bombyx mori的養(yǎng)殖而將絲用作紡織原料了。被公認(rèn)為商品絲的是從蠶在其蛻變成蠶蛾過程中產(chǎn)生的保護(hù)性繭得到的長絲產(chǎn)品。在蠶蛻變?yōu)槌赡晷Q蛾的過程中，以約30％粘性絲膠蛋白質(zhì)包裹的“粘性”連續(xù)雙長絲被蠶“吐絲”形成作為保護(hù)物圍繞在其自身周圍的長絲加強(qiáng)的繭。為了用于紡織品的最終用途，通過在蠶蛾從其繭中將脫離之前將其窒息而終止將這一蛻變過程，這樣做保持了長絲的連續(xù)性。在熱水中將繭的外層軟化后，在退纏操作中將源于幾個(gè)(約7個(gè))繭的兩束絲蛋白雙長絲同時(shí)捻/纏。最終的“連續(xù)”長絲紗長約2km，直徑15-25微米(并有7根長絲)。
剩余物(為形成/產(chǎn)生基礎(chǔ)連續(xù)規(guī)則雙長絲而從繭外表面刷下的絲、不能使用的內(nèi)部最后部分、斷裂/損壞的繭部分)不適合用于長絲紗中，被稱作“廢絲”。近年來，這種材料被切斷成短的長度，用做紡織品的“絹絲”紡織紗的生產(chǎn)的基材。
由于其受人歡迎的機(jī)械性質(zhì)和生物兼容性，多年來絲長絲纖維已被用于醫(yī)用縫合線。絲纖維是由分子大量取向的絲蛋白構(gòu)成的。由于酶對纖維結(jié)構(gòu)的無定形部分中易受影響并可接近的位點(diǎn)的攻擊，作為縫合線的天然絲在體內(nèi)隨時(shí)間將會(huì)損失長度。
美國專利第4818291號描述了適合手術(shù)中使用的含絲纖蛋白和人纖維蛋白原的混合物的新型粘合劑。該發(fā)明描述了含5至90重量％絲纖蛋白的混合物及其作為在醫(yī)療應(yīng)用中提供對表面的良好粘合的粘合劑的使用。將絲纖蛋白溶解于隨后通過滲析除去的鹽的飽和水溶液中。隨后將剩下的絲蛋白懸浮液與人纖維蛋白原混合從而產(chǎn)生粘合劑。這種方法的缺點(diǎn)是在懸浮液生成過程中將發(fā)生蛋白降解。得到的粘合劑通常具有一些與所要求的相比較差的物理性質(zhì)。
美國專利第5252285號描述了也包括將絲纖蛋白溶于鹽的水溶液的用于噴絲形成絲纖維的方法。將鹽從溶液中除去，隨后通過流延或蒸發(fā)除去水，從而形成基本為無定形物的絲薄膜。然后將該材料溶于六氟異丙醇以形成“溶液”，隨后將溶液噴絲并拉制成再生絲纖維。當(dāng)這種溶劑如所描述的使用時(shí)，減少了絲蛋白降解的問題。由于與其使用相聯(lián)系的成本和環(huán)境影響，環(huán)境方面的考慮使得不使用例如六氟異丙醇的有機(jī)溶劑的趨勢正變得越來越明顯。
目前可以得到的可生物吸收材料不適用于要求拉伸強(qiáng)度和硬度可與不可吸收聚合物(如聚酯)的拉伸強(qiáng)度和硬度相比的裝置。植入人體后，這些材料不能將其機(jī)械效用保持3-6個(gè)月以上。
這種有限的壽命對于必須在1-2年中(在此期間在康復(fù)過程中天然或組織工程細(xì)胞向內(nèi)生長從而得到完全修復(fù)的結(jié)構(gòu))保持其大部分強(qiáng)度的載荷承受結(jié)構(gòu)骨架(例如韌帶和腱)是一個(gè)嚴(yán)重的缺點(diǎn)。
因此，存在著對在延長的時(shí)間內(nèi)提供控制的可生物吸收性但也至少一年內(nèi)在保持足夠程度的強(qiáng)度和機(jī)械完整性的材料的需求。同時(shí)，該材料必須與生理學(xué)介質(zhì)相兼容并為身體所容納。為避免使用后手術(shù)除去的需要，材料應(yīng)最終降解。
本發(fā)明的目的之一是獲得被身體緩慢吸收而同時(shí)維持足夠的機(jī)械強(qiáng)度的綜合性能，從而使該材料可以被用作承受載荷的可生物吸收纖維。由此，該材料應(yīng)在醫(yī)療領(lǐng)域中得到應(yīng)用(例如組織工程韌帶和腱、可生物吸收固定系統(tǒng)和可吸收載荷承受縫合線)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于將廢絲材料轉(zhuǎn)化為有用的醫(yī)用材料。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于產(chǎn)生由絲或絲廢棄物衍生得到的、在生理學(xué)環(huán)境中具有各種機(jī)械性質(zhì)和壽命的纖維。以較低的成本生產(chǎn)材料也是本發(fā)明的目的之本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供將由非天然蠶提供的絲類蛋白質(zhì)噴絲方法。例如，本發(fā)明的方法可以被用于由經(jīng)基因修飾的生物體(例如經(jīng)基因修飾的蠶)得到的絲。該方法也可用于合成絲蛋白(例如用標(biāo)準(zhǔn)基因工程方法產(chǎn)生的絲蛋白)。絲蛋白質(zhì)的來源可以包括經(jīng)基因修飾的植物(例如番茄或煙草植株)、動(dòng)物(例如經(jīng)基因修飾的泌乳的綿羊、山羊或牛)或微生物(例如經(jīng)基因修飾的酵母或細(xì)菌)。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供無定形載體基質(zhì)從而實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放。再生絲可以被用作不同物理形式(包括噴絲/擠出的產(chǎn)物)的載體。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了以上目標(biāo)并避免了許多與已有技術(shù)方法相聯(lián)系的問題。特別地，通過在生產(chǎn)纖維時(shí)小心控制加工參數(shù)，本發(fā)明能夠改變在生理學(xué)介質(zhì)中的纖維的機(jī)械性質(zhì)和增加其壽命。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種形成絲纖維的方法，該方法包括以下步驟(1)選擇溶劑并將絲溶解以形成絲纖蛋白溶液，(1)將絲纖蛋白溶液過濾，(2)將經(jīng)過濾的溶液噴絲至凝固浴中以產(chǎn)生擠出纖維，和(3)將擠出纖維拉伸。
溶劑優(yōu)選二氯乙酸和氯仿和/或二氯甲烷的混合物。凝固浴優(yōu)選含醇。
節(jié)肢動(dòng)物包括野生和養(yǎng)殖的蠶(例如桑蠶Bombyx、柞蠶或anaphe silk)和蜘蛛(不論是否經(jīng)過基因修飾的)，而產(chǎn)品可以通過傳統(tǒng)生產(chǎn)、從節(jié)肢動(dòng)物的絲腺直接收獲或以其它方法獲得。
在一個(gè)實(shí)現(xiàn)方案中，絲是源于蟲的，例如源于蜘蛛或蛾。絲更優(yōu)選源于蛾，包括Bombyx，柞蠶或anaphe silk。源于不同地理位置和不同的蠶蛾和蜘蛛的絲可能具有不同的化學(xué)組成和分子量；所有這些絲都可以用于本發(fā)明的方法，產(chǎn)生具有不同性質(zhì)的產(chǎn)品。
在另一個(gè)實(shí)現(xiàn)方案中，絲是源于經(jīng)基因修飾的生物體的。
在一個(gè)實(shí)現(xiàn)方案中，該方法包括以下步驟(1)任選地對絲材料進(jìn)行脫膠和提純處理，(2)將絲切斷至小于1毫米的長度，(3)將切斷的絲溶解于適當(dāng)?shù)娜軇┲胁⒁詿o定形形式沉淀絲蛋白，(4)將切斷的絲重新溶解于包含二氯乙酸和氯仿和/或二氯甲烷的混合物的溶劑中，形成均勻的絲纖蛋白溶液，(5)對絲纖蛋白溶液進(jìn)行過濾和除氣處理，(6)將經(jīng)過濾的溶液干噴濕紡或濕紡至醇凝固浴中以產(chǎn)生粘性的擠出纖維，(7)除去含氯溶劑，(8)將擠出纖維拉伸。
隨后將經(jīng)拉伸的纖維洗滌并干燥?？梢詫o定形絲蛋白作為起始原料用于上述方法中，而且這樣做可以避免使用上述步驟1-3的必要。
作為起始原料而用于溶解的絲可以是任何類型的絲，包括天然絲、廢絲和作為無定形薄膜預(yù)準(zhǔn)備的絲。我們發(fā)現(xiàn)，作為無定形薄膜準(zhǔn)備的絲的溶解速度遠(yuǎn)比絲纖蛋白纖維快，由此縮短了降解可能發(fā)生的時(shí)間。這一方法將降解減至最小并由此獲得了具有更高性能的產(chǎn)品。
將用于本發(fā)明的絲用割機(jī)(cutting mill)或類似的設(shè)備切斷，這是本發(fā)明的一個(gè)重要方面。由此，本發(fā)明的另一個(gè)方面是使用割機(jī)或類似的設(shè)備將生絲切斷至小于1毫米的長度。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如常規(guī)使用錘磨機(jī)(hammer mill)對最終絲纖維是有害的，因?yàn)殄N磨機(jī)破壞了蠶絲纖維的分子完整性。
方法的概述在一個(gè)實(shí)現(xiàn)方案中，該方法包括以下步驟(1)對絲材料進(jìn)行脫膠處理以除去絲膠(非必要步驟)；(2)提純步驟(非必要步驟)；(3)將絲蛋白轉(zhuǎn)化為適當(dāng)?shù)奈锢砗?或形態(tài)學(xué)形式；(4)選擇溶劑體系并將絲溶解以形成均勻的絲纖蛋白溶液，在溶解過程中優(yōu)選發(fā)生最少的降解；(5)將絲纖蛋白溶液過濾；(6)除氣；(7)將經(jīng)過濾的溶液干噴濕紡或濕紡至選定的液體凝固浴中以產(chǎn)生粘性的擠出纖維；(8)老化步驟(非必要步驟)；(9)將擠出纖維拉伸；(10)最終兩步洗滌；(11)干燥。
在絲從其天然的生絲狀態(tài)到用于擠出/噴絲的粘性液體的初步加工過程中，將會(huì)發(fā)生絲的一些降解。氧化是絲損壞的主要原因，各生產(chǎn)階段中惰性氣氛(例如氮)的使用減小了這一影響的程度。
本發(fā)明的方法包括通過首先清潔原料、除去絲膠、切斷至極短(即小于1毫米)的長度和隨后將其溶于適當(dāng)?shù)娜軇w系從而將組織聚合物物質(zhì)分離至組份分子片段而形成絲纖蛋白溶液。將溶液過濾和除氣，然后將其噴絲和拉伸。最后對纖維進(jìn)行凈化和干燥處理。由此，通過將天然絲形態(tài)學(xué)物質(zhì)拆卸成其組份分子以及將其通過噴絲/拉伸操作重新組裝形成被身體緩慢吸收的長絲而制成本發(fā)明的再生絲聚合物。纖維降解和因此損失拉伸強(qiáng)度的速度可以比天然絲低。
在另一個(gè)實(shí)現(xiàn)方案中，任選地通過引入分子間交聯(lián)、向絲蛋白接枝或?qū)岩稍谑褂弥袝?huì)發(fā)生降解的位點(diǎn)處或附近的可接近體積內(nèi)的殘留氨基酸進(jìn)行化學(xué)改性而對絲材料進(jìn)行改性。這些改性可以在最初絲原料溶解前或在再生纖維上實(shí)現(xiàn)(即在本方法實(shí)施前或后實(shí)現(xiàn))。
對本發(fā)明的方法生產(chǎn)的再生絲材料進(jìn)行化學(xué)改性(在噴絲前或后)的目的可以是為特定醫(yī)療或其它目的而改變纖維的機(jī)械和生物性質(zhì)。由此，例如，可以改變強(qiáng)度和生物降解速度。這一改性可以使用以下一種或幾種方法實(shí)現(xiàn)(1)使用環(huán)氧化物、酸酐?；⑷┗蛞叶级s水甘油醚進(jìn)行交聯(lián)；(2)使用聚羥基甲基丙烯酸乙酯向蛋白質(zhì)接枝；(3)使用各種氣體的氣體等離子體處理并隨后進(jìn)行與改性劑的反應(yīng)；(4)在對纖維進(jìn)行噴絲或拉伸前，通過對絲殘留氨基酸進(jìn)行改性增加無定型體積。
絲纖維可用于醫(yī)療中。符合本發(fā)明的具有加強(qiáng)了的物理和生物學(xué)性質(zhì)的再生絲纖維適用于需要高強(qiáng)度紡織材料的多種應(yīng)用，特別適用于任何以下應(yīng)用(1)作為具有定制的在人體中存留的時(shí)間的可生物吸收可手術(shù)植入材料；或(2)作為具有定制的強(qiáng)度或模數(shù)的可生物吸收可手術(shù)植入材料；或(3)作為適用于藥物釋放應(yīng)用的可生物吸收可手術(shù)植入材料；或(4)作為包括某種程度的生物可降解性的紡織材料。
加工步驟可以通過在不連續(xù)步驟中逐步操作或作為連續(xù)操作實(shí)現(xiàn)再生長絲的生產(chǎn)過程。
擠出溶解于溶劑體系的絲的濃度和上述溶劑的組成也影響纖維產(chǎn)品，并且二者都可以改變以優(yōu)化纖維在具體最終用途的生理介質(zhì)中的強(qiáng)度和/或壽命。
優(yōu)選不高于40℃的最高溫度下制備用于纖維生產(chǎn)的基本最初擠出步驟的絲纖蛋白溶液，上述溫度不高于室溫更好，并且優(yōu)選在盡可能的最低溫度下儲(chǔ)存/使用上述溶液。當(dāng)溫度接近和高于50℃時(shí)降解的速度增加。
在噴絲前進(jìn)行除氣和過濾是有必要的。除氣通過離心實(shí)現(xiàn)。
初生長絲在凝固浴中時(shí)間的維持和上述浴的溫度是重要的。我們發(fā)現(xiàn)，室溫和更低的溫度使纖維的強(qiáng)度更高，但需要更長的駐留時(shí)間。上述浴的溫度優(yōu)選不高于50℃。
使用于“干噴”濕紡系統(tǒng)中的氣隙為1.0cm或2.0cm。已經(jīng)考察了其它氣隙長度并發(fā)現(xiàn)較大的氣隙的使用使得更大的噴頭拉伸環(huán)境的使用成為可能。
擠出速度也可以在常規(guī)參數(shù)內(nèi)變化，我們發(fā)現(xiàn)每分鐘14.5米的速度是特別適用的。
在另一個(gè)實(shí)現(xiàn)方案中，凝固浴溫度和組成可以各自獨(dú)立地改變以影響最終纖維的性質(zhì)。在凝固浴中的浸漬時(shí)間可以影響最終纖維的性質(zhì)。
拉伸在另一個(gè)實(shí)現(xiàn)方案中，可以選擇拉伸比以影響得到的再生纖維的強(qiáng)度和其它性質(zhì)。在較高的拉伸比下得到的纖維強(qiáng)度較高。經(jīng)如此凝固浴處理的長絲的拉伸浴溫度是重要的。如果將拉伸溫度升至170℃或更高，則產(chǎn)生更加取向化的長絲，而這種長絲的強(qiáng)度更高且更不容易降解。但是，較低的溫度使拉伸過程本身中發(fā)生的降解降至最低。但是，最優(yōu)的溫度將取決于原料的性質(zhì)和拉伸浴的性質(zhì)。為了調(diào)整纖維的性質(zhì)，可以改變浴的長度以代替拉伸速度的改變或?qū)⒃〉拈L度和拉伸速度一起改變。
化學(xué)改性旨在為再生絲提供不同穩(wěn)定性的改性包括為了取得交聯(lián)而進(jìn)行的二羧酸酐的使用，或通過聚合物接枝對絲蛋白殘留氨基酸進(jìn)行改性。這些處理可以在經(jīng)提純的絲的溶解或?qū)υ偕z長絲的最終拉伸之前進(jìn)行。
使用適當(dāng)氣氛的等離子體放電最終處理為產(chǎn)生特定化學(xué)官能團(tuán)提供了有用的工具。這使得絲長絲表面上的旨在獲得在體內(nèi)的更長壽命而不損失機(jī)械性能的具體化學(xué)改性更加容易。
作為合成絲的類似物，產(chǎn)生作為均聚物或共聚物的特定合成聚氨基酸也是可能的。這種方法可以產(chǎn)生更具結(jié)晶性的因此也是強(qiáng)度更好和更穩(wěn)定的產(chǎn)品。此類化學(xué)組合物也避免了酶和生物降解最可能發(fā)生的殘留氨基酸位點(diǎn)的存在，因此具有增加了的在活的生物體內(nèi)的穩(wěn)定性。
較大的極性和非極性殘留基團(tuán)位于纖維的30％較不規(guī)則體積內(nèi)，而生物和化學(xué)活動(dòng)被有效地限制在上述體積內(nèi)?？梢栽O(shè)想使用其它化學(xué)“處理”可以“封閉”這些處于對化學(xué)/酶降解最敏感的位置附近的絲蛋白位點(diǎn)和/或使希望取得的鏈交聯(lián)。生產(chǎn)后的交聯(lián)會(huì)阻止接近。后者當(dāng)然會(huì)增加產(chǎn)品的生物穩(wěn)定性。也可以通過增加纖維直徑(減小比表面積)降低生物降解速度。相反地，增加比表面積(更細(xì)的單根長絲)使降解更快。這種現(xiàn)象的一種應(yīng)用是對混入的藥物的釋放速度的調(diào)整。
最終處理在本發(fā)明的另一方面，可以得到比天然絲纖維在體內(nèi)在同樣生理?xiàng)l件下具有更長的壽命的再生絲纖維。
作為最終處理步驟，可以用由光聚合原位形成的非常薄(僅一或兩個(gè)分子厚)的聚合物膜對絲進(jìn)行涂層。這樣做提供了針對基體絲降解的屏障并可同時(shí)由此類聚合物形成可能結(jié)合創(chuàng)傷康復(fù)“加速劑”的位點(diǎn)，或直接作為具有上述加速劑特性或性質(zhì)的結(jié)合聚合物。此類位點(diǎn)也可以通過等離子體處理產(chǎn)生/形成。
本發(fā)明的方法的幾個(gè)方面是具有開創(chuàng)性的，特別是1.將絲纖維切斷至超短長度使得減少降解的條件下進(jìn)行的溶解變得容易?；蛘?，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法形成的無定形絲薄膜的溶解。
2.最初的絲原料的溶解所使用的溶劑的選擇是該工藝的成功實(shí)施所必需的。更具體地，確保了纖維產(chǎn)品的質(zhì)量并且與使用鹽的水溶液時(shí)所觀察的現(xiàn)象相比限制了降解的有機(jī)溶劑體系的選擇。
3.加工參數(shù)(例如紡絲參數(shù))的選擇可以影響纖維的性質(zhì)；4.通過改變再生纖維的直徑，可以改變活的生物體內(nèi)的降解速度和纖維的機(jī)械性能，從而適應(yīng)具體應(yīng)用；5.以(旨在降低生物吸收速度的)交聯(lián)為形式的絲纖蛋白化學(xué)改性的使用產(chǎn)生了纖維性能方面的創(chuàng)造性的優(yōu)點(diǎn)，這包括在生理介質(zhì)中的加強(qiáng)了的拉伸強(qiáng)度和延長了的壽命；6.此外，與標(biāo)準(zhǔn)絲相比，在有限但受控制的降解或加強(qiáng)無定形體積(通過引入大型殘留氨基酸或使用特定的噴絲條件)后的絲蛋白的使用給出了用于其它應(yīng)用的降解和吸收更快的材料；7.在活的生物體內(nèi)具有多種降解速度的絲材料為其作為控制藥物釋放載體基質(zhì)的使用做了準(zhǔn)備；8.此外，本發(fā)明的聚合物可以用于需要可生物降解聚合物的非醫(yī)療應(yīng)用中。
實(shí)施例實(shí)施例1將絲纖蛋白溶于有機(jī)溶劑從而得到絲纖蛋白溶液。使用65∶35 v∶v比例的二氯乙酸與二氯甲烷或氯仿作為溶劑。將前一體系用于“干噴濕紡”而后一體系用于100％濕紡。相比而言，在兩個(gè)紡絲系統(tǒng)中前者都產(chǎn)生了強(qiáng)度更高和更具生物穩(wěn)定性的最終產(chǎn)品。使用12％w/vol的絲溶液。
室溫凝固浴為甲醇或乙醇。乙醇比甲醇更適宜，因?yàn)檫@樣減少了已單獨(dú)擠出并正在凝固的長絲粘連在一起的情況。
也對拉伸比水平進(jìn)行了研究并發(fā)現(xiàn)4.5至1的拉伸比適用于干噴濕紡凝固長絲。
“噴絲”比(起始長絲收集速度與實(shí)際擠出速度的比)是另一個(gè)影響產(chǎn)品性質(zhì)的參數(shù)。在一個(gè)方案中，以凝固長絲的形式得到起始長絲并在實(shí)施最后拉伸階段從而形成最終的纖維之前在一個(gè)單獨(dú)的操作中在流動(dòng)的水中洗滌24小時(shí)。在另一個(gè)例子中，在一個(gè)單獨(dú)的步驟中將纖維擠出和拉伸。使用一個(gè)包括以上成份的完整連續(xù)操作是有益的。
實(shí)施例2由商業(yè)化中國絲綢生產(chǎn)商處作為長絲成份或作為廢紗得到Bomyxmori“絲廢棄物”。不僅必須除去存在的20％以上絲膠，還必須除去任何染色物和其它外來雜質(zhì)/外來物質(zhì)。在本文中脫膠大多通過用100℃下的0.4％肥皂液處理2小時(shí)、隨后依次用碳酸鈉溶液、沸水洗滌和最后用20℃下的蒸餾水洗滌實(shí)現(xiàn)。
另一個(gè)方法是使用蛋白酶處理已達(dá)到相同的目的(表1)。
表1.用于膠內(nèi)的絲的基于酶的脫膠方法
從“廢絲”再生絲蛋白連續(xù)長絲已經(jīng)在已有技術(shù)中得到了描述。本發(fā)明的程序中的一個(gè)可能的不同在于其可能能夠省去紡絲前的絲蛋白溶液初步透析。
二氯乙酸(DCA)是聚N-羧酸酐的溶劑。使用基于DCA的溶劑(65％DCA+35％二氯甲烷和65％DCA+35％氯仿)的嘗試不僅實(shí)現(xiàn)了容易進(jìn)行的絲蛋白溶解，而且還實(shí)現(xiàn)了它們分別向乙醇中的濕紡和干噴濕紡，以及非常有前途的長絲的生成而沒有將預(yù)透析包括在處理過程中的潛在需求。表2顯示了溶劑噴絲程序的細(xì)節(jié)。
將約10％w/v絲蛋白溶于選定的溶劑中并維持在15℃數(shù)小時(shí)，同時(shí)以200-500rpm的速度攪拌以確保完全溶解和均勻性。
使用氮的正壓將每一溶液通過3個(gè)不銹鋼精細(xì)濾網(wǎng)的組件，隨后通過10分鐘離心除氣。這樣做避免了噴絲過程中的斷裂。在噴絲頭中再實(shí)施額外的過濾。使用帶有5個(gè)150微米直徑的孔的噴絲頭。實(shí)施濕紡或干噴濕紡至1.2米長的乙醇凝固浴中。
表2.絲蛋白噴絲系統(tǒng)和方法
在這些例子中，沒有進(jìn)行“線內(nèi)”噴絲/拉伸。在拉伸前，將源于乙醇凝固浴的濕長絲的絲束(rope)松弛地支持在一個(gè)單獨(dú)的拉伸單元上(通過80cm長乙醇浴)一段時(shí)間(例如24小時(shí))。最后將經(jīng)拉伸的纖維纏在不銹鋼筒管上。所使用的拉伸比為3∶1至4∶5。
通過將最終的經(jīng)拉伸絲蛋白的筒管在乙醇中浸泡10-12小時(shí)實(shí)施最終提純。隨后，為了確保所有溶劑和凝固劑的完全去除，將纖維在流動(dòng)的自來水中徹底洗滌。在蒸餾水中進(jìn)行最終洗滌后在室溫下自然干燥。
為了觀察機(jī)械性質(zhì)，使用20mm計(jì)量長度的長絲(在65％RH、20℃下進(jìn)行調(diào)濕)對最終長絲進(jìn)行了測試。測試使用Instron 1122在50mm/min.十字頭速度(250％伸長率)進(jìn)行。表3中顯示了兩個(gè)在兩個(gè)噴絲條件之一下得到的長絲性質(zhì)的對比例子。
表3.再生長絲產(chǎn)品性質(zhì)[參照“標(biāo)準(zhǔn)”絲蛋白38cN/tex強(qiáng)度，23.4％伸長率和“廢絲”26.3cN/tex強(qiáng)度，9.5％伸長率]
濕紡(S1)和干噴濕紡(S2)得到的樣品的X-射線衍射數(shù)據(jù)顯示出的β-疊片規(guī)則結(jié)構(gòu)(β-pleated sheet order)的大量存在但與天然絲相比其取向程度下降了。在至少4∶1的拉伸比下β-構(gòu)象是顯著的。
通過真空導(dǎo)數(shù)熱重量分析法(DTG)進(jìn)行的絲蛋白的對比觀察顯示出了被測試的長絲中氧化降解的存在。兩種噴絲過程所得到的再生纖維樣品的DTG曲線顯示出已經(jīng)發(fā)生了一些氧化降解。
對再生長絲絲蛋白的改性進(jìn)行了研究了。與天然絲形成鮮明對比，再生長絲顯示出了顯著提高了的生物降解速度，這是降低了的總規(guī)整性水平和使這些被認(rèn)為酶活動(dòng)發(fā)生的絲蛋白鏈位點(diǎn)更容易接近的后果。因此，與符合具體機(jī)械性質(zhì)需求相類似地，為了以受控的方式加強(qiáng)或降低穩(wěn)定性的水平而設(shè)計(jì)了改性。
可以將通過兩種改性途徑用于再生絲長絲。
(a)化學(xué)改性從而封閉被認(rèn)為是特別易受酶降解影響的殘留氨基酸并潛在地改變機(jī)械性能，而在具有生物活性的位點(diǎn)處或靠近上述位點(diǎn)處或作為薄涂層的“接枝”聚合提供阻礙生物活性試劑接近的純粹物理性的障礙；和(b)絲蛋白分子鏈間的交聯(lián)可以直接加強(qiáng)機(jī)械性能并可能封閉易受可能降解的影響的位點(diǎn)。
交聯(lián)(i)環(huán)氧化物原則上與環(huán)氧化物進(jìn)行酯化的對象是HIS、LYS、ARG和TYR。使用了兩種環(huán)氧化物1，2-環(huán)氧-3-苯氧基丙烷和乙二醇二縮水甘油醚(EGDGE)。
(ii)與酸酐?；褂昧宋於狒顽晁狒Ｔ诙狒氖褂弥?，跨官能團(tuán)位點(diǎn)的交聯(lián)形成的產(chǎn)生是可能的。酸酐處理也降低了光致泛黃。衣康酸酐也具有類似的可能性。
(iii)醛通過用戊二醛處理對絲蛋白進(jìn)行改性，這可能改變生物穩(wěn)定性和機(jī)械性質(zhì)。
(iv)雙官能度二氟氯嘧啶衍生的交聯(lián)劑此類試劑能夠與絲蛋白中敏感的位點(diǎn)反應(yīng)，并引入降低可接近性的交聯(lián)。
聚合物“接枝”可以在長絲表面上形成一層薄聚合物膜(幾個(gè)分子厚)，該膜可以是在使用或不使用等離子體處理的情況下交聯(lián)到表面上的或使用紫外燈將膜交聯(lián)而不使用與絲的化學(xué)連接。
實(shí)施使用聚甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)的“接枝”。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)在表4中報(bào)告。
表4.再生絲長絲的絲蛋白改性
*dmf-二甲基甲酰胺在2cm長度上在250％十字頭速度下測定再生絲蛋白長絲的機(jī)械性質(zhì)。表5中顯示了僅一些對比數(shù)據(jù)以確定每一單獨(dú)處理引起的強(qiáng)度和斷裂伸長率的相對變化；沒有考慮所獲得的“處理”或改性的程度的不同。
改性所引起的改變是復(fù)雜的，可能包括化學(xué)、形態(tài)學(xué)和組織學(xué)成分。
表5.絲蛋白長絲嘗試進(jìn)行改性后的機(jī)械性質(zhì)改變
生物降解需要進(jìn)行在模擬生理學(xué)環(huán)境中在37℃(體溫)下的實(shí)際的研究從而測試本發(fā)明的目的是否實(shí)現(xiàn)。使用加速的測試條件(例如＞37℃)被認(rèn)為是不適宜的。如果有多于一種降解過程發(fā)生(這是可能的)，從最優(yōu)的37℃偏離的溫度將對行為產(chǎn)生被歪曲的影響。
具體的酶的選擇取決于重現(xiàn)在將使用所構(gòu)成基底的性能的位置普遍存在的特定環(huán)境的需要，例如在結(jié)締組織中的亮氨酸氨肽酶和酯酶、在牙齒環(huán)境中的α-淀粉酶和在適用于藥物釋放的位點(diǎn)可以發(fā)現(xiàn)的酶。
盡管如此，為了確認(rèn)改性對生物降解速度的影響，實(shí)施了簡單的概括性的在活的生物體內(nèi)用單獨(dú)的蛋白水解酶木瓜酶和α-胰凝乳蛋白酶進(jìn)行的生物降解試驗(yàn)。
旨在監(jiān)測在活生物體內(nèi)的測試中的生物降解的觀察的結(jié)果是機(jī)械性質(zhì)、質(zhì)量損失和分子組成方面的變化。在此以機(jī)械性質(zhì)和質(zhì)量損失作為生物降解的監(jiān)測指標(biāo)。
此處在蛋白水解酶的最優(yōu)pH下和37℃下使用蛋白水解酶，但其使用的濃度比更確定的試驗(yàn)中將大量使用的濃度大若干數(shù)量級。為了維持酶活性并同時(shí)避免通過生物降解產(chǎn)物發(fā)生的任何作為結(jié)果的二級作用，在被限制在10日中的測試過程中，此環(huán)境每24小時(shí)即被更換。
α-胰凝乳蛋白酶(pH7.8)有效地打斷了與PHE、TYR、LEU和TRP相鄰的肽鍵。與此形成對比的是，木瓜酶(pH5-7.5)打斷了與HIS和LYS相鄰的肽鍵。表6顯示了在這種酶環(huán)境中的降解條件和質(zhì)量損失和強(qiáng)度下降上的典型觀察結(jié)果。將對經(jīng)改性后的絲上的酶活性與暴露于僅緩沖液后的絲上的酶活性對比。經(jīng)10天培養(yǎng)后，將酶作用物充分洗滌、干燥并隨后稱重從而計(jì)算質(zhì)量損失。如前所述使用Isntron1122在20mm計(jì)量長度上對調(diào)濕后的樣品進(jìn)行機(jī)械測試。
表6.改性絲蛋白長絲的生物降解[條件37℃，在20ml 10日測試中的木瓜酶/α-胰凝乳蛋白酶，50mg樣品，酶浴每24小時(shí)進(jìn)行補(bǔ)充]
總結(jié)過去，已知的天然長絲生物穩(wěn)定性妨礙了確實(shí)具有生物相容性的絲纖蛋白作為縫合材料的使用?，F(xiàn)在，“廢絲”可以以相對低的成本容易地得到，而本發(fā)明成功地將這些長度和直徑易變的材料或商品化的長絲狀絲轉(zhuǎn)化為具有增加了的生物穩(wěn)定性和加強(qiáng)了的機(jī)械性能的再生連續(xù)長絲產(chǎn)品。
已經(jīng)表明，再生絲蛋白的化學(xué)改性或“接枝”加強(qiáng)了生物穩(wěn)定性而不顯著損失機(jī)械性能?？梢酝ㄟ^基本生產(chǎn)條件和隨后進(jìn)行的處理對產(chǎn)品進(jìn)行控制從而提供多種生物穩(wěn)定性的產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.從一種或多種節(jié)肢動(dòng)物的產(chǎn)物形成絲纖維的方法，該方法包括以下步驟(1)選擇一種溶劑并將絲溶解以形成絲纖蛋白溶液，(2)將絲纖蛋白溶液過濾，(3)將過濾后的溶液向凝固浴中噴絲以生成擠出纖維，和(4)將擠出的纖維拉伸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中溶劑為二氯乙酸和氯仿和/或二氯甲烷的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中凝固浴含醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的方法，其中絲是來源于蟲的。
5.根據(jù)以上權(quán)利要求中的任意項(xiàng)的方法，其中用于溶解的用作起始材料的絲可以是天然絲、廢絲、在絲蛋白被吐絲形成繭之前直接從蟲獲得的絲蛋白、從基因修飾后的生物體得到的絲或作為無定形膜而預(yù)準(zhǔn)備的絲的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意項(xiàng)的方法，其中包括以下步驟(1)任選地將絲材料脫膠和提純；(2)將絲切斷至小于1毫米的長度；(3)將切斷的絲溶解于適用的溶劑中并以無定形物的形式將絲蛋白沉淀；(4)將絲重新溶解于包含二氯乙酸和氯仿和/或二氯甲烷的混合物的溶劑中，從而形成均勻的絲纖蛋白溶液；(5)對絲纖蛋白溶液進(jìn)行過濾和除氣處理；(6)將經(jīng)過濾的溶液干噴濕紡或濕紡至醇凝固浴中以產(chǎn)生一致的擠出纖維；(7)除去含氯溶劑；和(8)將擠出的纖維拉伸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意項(xiàng)的方法，其中包含以下步驟(1)任選地將絲材料脫膠以除去絲膠；(2)任選的提純步驟；(3)將絲蛋白轉(zhuǎn)化為適當(dāng)?shù)奈锢韺W(xué)和/或形態(tài)學(xué)形式；(4)選擇溶劑體系并將絲溶解以形成均勻的絲纖蛋白溶液，優(yōu)選將溶解中的降解減至最少；(5)將絲纖蛋白溶液過濾；(6)除氣；(7)將經(jīng)過濾的溶液干噴濕紡或濕紡至選定的液體凝固浴中以產(chǎn)生一致的擠出纖維。
8.根據(jù)以上權(quán)利要求中任意項(xiàng)的方法，其中在實(shí)施方法前或?qū)嵤┓椒ê髮z進(jìn)行化學(xué)改性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中化學(xué)改性是以下的一項(xiàng)或多項(xiàng)(1)使用環(huán)氧化物、酸酐?；?、醛或乙二醇二縮水甘油醚進(jìn)行交聯(lián)；(2)使用聚甲基丙烯酸羥乙酯向蛋白質(zhì)接枝；(3)使用各種氣體的氣體等離子處理并隨后進(jìn)行與改性劑的反應(yīng)；(4)在噴絲或拉伸纖維前，通過對絲殘留氨基酸的改性增加無定型體積。
10.按以上權(quán)利要求的任意項(xiàng)的方法生產(chǎn)的絲纖維在醫(yī)藥方面的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中將再生絲纖維用作(1)具有定制的在人體中存留的時(shí)間的可生物吸收可手術(shù)植入材料；或(2)具有定制的強(qiáng)度或模數(shù)的可生物吸收可手術(shù)植入材料；或(3)適用于藥物釋放應(yīng)用的可生物吸收可手術(shù)植入材料；或(4)可要求有一定程度的生物可降解性的紡織材料。
12.按權(quán)利要求1至9中任意項(xiàng)的方法生產(chǎn)的絲纖維。
13.使用割機(jī)或類似的設(shè)備將生絲切斷至小于1毫米的長度的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及從各種可能的來源制備絲或類似絲的蛋白質(zhì)，并將其噴絲以產(chǎn)生用于生物醫(yī)藥和其它應(yīng)用的再生絲纖維的新方法。將絲預(yù)溶解以形成無定形粉，隨后重新溶解于二氯乙酸和氯仿或二氯甲烷的混合物中，從而形成用于噴絲的均勻的絲纖蛋白溶液。通過控制噴絲和拉伸條件，以及通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)改性，可以形成具有各種機(jī)械和生物性質(zhì)的纖維。此類纖維可以具有被延長或被縮短的在人體中的生物穩(wěn)定性，并且適用于可植入的裝置(例如可吸收人工韌帶和工程基質(zhì)、藥物釋放植入物和許多其它用途。
文檔編號D06M13/11GK1518612SQ02807779
公開日2004年8月4日 申請日期2002年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月2日
發(fā)明者J·S·克萊頓, J S 克萊頓 申請人:希羅斯有限公司