專利名稱：編碼具有犁頭霉屬脂酶活性的多肽的核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼具有犁頭霉屬脂酶活性的多肽的分離的核酸序列。本發(fā)明還涉及包括所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及用于制備所述多肽的重組方法。
已知用脂解酶制成的洗滌劑具有改進(jìn)的除去脂肪污漬的特性。例如，已將獲自疏棉狀高溫霉(Thermomyces lanuginosus)(又被稱為疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa))真菌的一種微生物脂酶LIPOLASETM(Novo Nordisk A/S,Bagsvaerd,Denmark)引入多種商業(yè)品牌的洗滌劑中。
還有人提出將獲自洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)(US4,876,024)、鏈霉菌屬(Streptomycetes)(WO 94/14940)和卵形孢球托霉(Gongronella butleri)菌株NRRL 3521(US 3,634,195該菌株以前被稱作卵形孢犁頭霉(Absidia butderi)，參見K.H.Domsch等，Compendinm of Soil Fungi,Academic Press 1980,p.381)的其它微生物脂酶用于洗滌劑中。
美國(guó)專利US3,634,195被披露了用柱孢犁頭霉根狀變種(Absidiacylindrospora var.rhizomorpha)NRRL 2815和Absidia blakes leeanaNRRL 1305制備脂酶。Koritala等披露(1987,Journal of theAmerican Oil Chemists Society 64:509-513)，大豆油在與藍(lán)色犁頭霉(Absidia coerula)NRRL 5926和分枝犁頭霉(Absidia ramosa)NRRL1309一起培養(yǎng)時(shí)可被部分水解。Satyanarayana(1981,Current Science50:680-682)披露，傘枝犁頭霉(Absidia corymbifera)菌株可分泌脂酶。Aisaka等(1979,Agricultural Biological Chemistry 43:2125-2129)披露，可由透孢犁頭霉(Absidia hyalospora)菌株KY 303(現(xiàn)被稱作Absidiablakesleeana)生產(chǎn)脂蛋白脂酶。
很多洗滌劑在溶液中呈堿性(例如，pH10左右)，并含有能結(jié)合Ca++離子的助劑。需要一種在沒有Ca++、高pH下具有高活性的新型脂解酶。犁頭霉屬的脂酶具有上述特性，因此，將其用于洗滌劑配方中十分理想。不過(guò)，迄今為止，尚沒有重組生產(chǎn)上述酶的方法。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供重組制備上述有價(jià)值的酶的方法。
本發(fā)明涉及編碼具有脂酶活性的多肽的分離的核酸序列，該核酸序列選自(a)編碼一種犁頭霉屬菌株的內(nèi)源多肽的核酸序列，該多肽具有序列2、序列4、序列6、序列8或序列10所示的氨基酸序列；(b)一種犁頭霉屬菌株的內(nèi)源核酸序列，它能在中等嚴(yán)格的條件下與(ⅰ)序列1、序列3、序列5、序列7或序列9所示核酸序列或(ⅱ)其任何互補(bǔ)鏈雜交；(c)一種核酸序列，它能在中等嚴(yán)格的條件下與(ⅰ)序列1、序列3、序列5、序列7或序列9所示核酸序列或(ⅱ)其任何互補(bǔ)鏈雜交；(d)一種編碼具有脂酶活性的多肽的核酸序列，該多肽的氨基酸序列與序列2、序列4、序列6、序列8或序列10所示氨基酸序列的同一性至少為65％；(e)(a)、(b)、(c)或(d)的等位形式；和(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的片段。
本發(fā)明還涉及含有所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及制備所述多肽的重組方法。


圖1表示源于Absidia griseola和Absidia griseola var.iguchii基因組DNA的脂酶特異性PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠純化結(jié)果。1泳道HindⅢ-消化的λDNA和HaeⅢ-消化的φX17RF-DNA大小標(biāo)準(zhǔn)物；2泳道Absidia griseola PCR產(chǎn)物；3泳道Absidia griseola var.iguchii的PCR產(chǎn)物。兩種PCR產(chǎn)物的大小似乎均大致為870bp。
圖2表示用來(lái)自Absidia griseola的放射性標(biāo)記的脂酶基因片段探測(cè)的源于幾個(gè)犁頭霉屬的種的基因組DNA消化物的Southern雜交分析的放射性自顯影圖。HindⅢ消化的λDNA和HaeⅢ消化的φX17RF-DNA大小標(biāo)準(zhǔn)物的大小在該放射性自顯影圖的右側(cè)。1-3泳道Absidia sporophoravariabilis DNA(分別用EcoRⅠ+Asp718Ⅰ、Asp 718Ⅰ和EcoRⅠ消化)；4-6泳道傘枝犁頭霉DNA(分別用EcoRⅠ+Asp718Ⅰ、Asp718Ⅰ和EcoRⅠ消化)；7-9泳道Absidiablakesleeana DNA(分別用EcoRⅠ+Asp718Ⅰ、Asp718Ⅰ和EcoRⅠ消化)；泳道10-12:Absidia griseola var.iguchii DNA(分別用EcoRⅠ+Asp718Ⅰ和EcoRⅠ消化)；13-15泳道Absidia griseola DNA(分別用EcoRⅠ+Asp718Ⅰ、Asp718Ⅰ和EcoRⅠ消化)。
圖3表示Absidia griseola var.iguchii脂酶的DNA序列及推斷的氨基酸序列(分別為序列1和序列2)。內(nèi)含子用實(shí)線標(biāo)出。在相應(yīng)于以前確定的肽序列的片段下面劃(---)。
圖4表示Absidia blakesleeana脂酶的DNA序列和推斷的氨基酸序列(分別為序列3和4)。內(nèi)含子用實(shí)線標(biāo)出。在相應(yīng)于以前確定的肽序列的片段下面劃(---)。
圖5表示傘枝犁頭霉脂酶的DNA序列和推斷的氨基酸序列(分別為序列5和6)。內(nèi)含子用實(shí)線標(biāo)出。在相應(yīng)于以前確定的肽序列的片段下面劃(---)。
圖6表示Absidia sporophoravariabilis脂酶的DNA序列和推斷的氨基酸序列(分別為序列7和8)。內(nèi)含子用實(shí)線標(biāo)出。
圖7表示反射犁頭霉(Absidia reflexa)脂酶的DNA序列及推斷的氨基酸序列(分別為序列9和10)。
圖8表示犁頭霉屬脂酶與米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂酶(序列15)和疏棉狀腐質(zhì)霉脂酶(序列16)的氨基酸序列的同源性比較。相同的殘基用線條框出。
圖9表示pBANe6的限制圖。
圖10表示pKB2的限制圖。
圖11表示pRamB19的限制圖。
核酸序列在第一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼具有脂酶活性的多肽的分離的核酸序列，所述多肽具有序列2、序列4、序列6、序列8或序列10所示的氨基酸序列。在一種具體實(shí)施方案中，所述核酸序列示于序列1、序列3、序列5、序列7和序列9中。本發(fā)明的核酸序列還包括編碼具有序列2、序列4、序列6、序列8或序列10所示的氨基酸序列的多肽的核酸序列，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并而分別不同于序列1、序列3、序列5、序列7或序列9。本發(fā)明還涉及分別編碼序列2、序列4、序列6、序列8或序列10的片段，但仍具有脂酶活性的序列1、序列3、序列5、序列7或序列9的亞序列。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸序列為含于質(zhì)粒pZL-NL1、pZL-NL61、pZL-ZL95和pZL-NL124上的核酸序列，而以上質(zhì)粒又分別包含在大腸桿菌(Escherichia coli)NRRLB-21520、NRRL B-21521、NRRL B-21522和NRRL B-21523中。
本文所使用的“分離的核酸序列”一詞是指基本上無(wú)其它核酸序列的核酸序列，例如，通過(guò)瓊脂糖電泳測(cè)定其純度至少約為20％，優(yōu)選至少約為40％，更優(yōu)選至少約為60％，再優(yōu)選約為80％，最優(yōu)選約為90％。例如，可以用遺傳工程中所用的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法獲得分離的核酸序列，并將該核酸序列由其天然位點(diǎn)重新定位于其被復(fù)制的不同位點(diǎn)。所述克隆方法可能包括含有編碼所述多肽的核酸序列的目的核酸片段的剪切和分離，將該片段插入一個(gè)載體分子中，并將該重組載體整合到一種宿主細(xì)胞中，在該宿主細(xì)胞中復(fù)制所述核酸序列的多個(gè)拷貝或克隆。所述核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來(lái)源的或其組合。
“脂酶”一詞在本文中被定義為脂解酶，按照國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUBMB)的規(guī)則(1992)將其歸在酶分類號(hào)E.C.3.1.1.-(羧酸酯水解酶)之下。因此，脂解酶至少對(duì)在E.C.3.1.1.一節(jié)中提及的一種類型的酯鍵具有水解活性，例如，存在于甘油單酯、甘油二酯和甘油三脂、磷脂(所有類型)、硫酯、膽固醇酯、蠟酯、角質(zhì)、木栓質(zhì)、合成酯等中的酯鍵。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的脂解酶可以具有對(duì)甘油三酯的活性(脂酶活性，E.C.3.1.1.3)，例如，1,3-位特異性脂酶活性。
在第二種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼具有脂酶活性的多肽的分離的核酸序列，所述核酸序列能在高、中或低嚴(yán)格條件下與一種能在相同條件下與序列1、序列3、序列5、序列7或序列9所示核酸序列、其互補(bǔ)鏈或其亞序列雜交的探針雜交(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harber,New York)。雜交表明，類似的核酸序列能與相當(dāng)于序列1、序列3、序列5、序列7或序列9所示核酸序列的多肽編碼部分的寡核苷酸探針在從低至高的嚴(yán)格條件下雜交(例如，預(yù)雜交和雜交是在42℃下進(jìn)行的，對(duì)于高、中和低嚴(yán)格條件來(lái)說(shuō)，分別是在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切過(guò)的和變性的鮭精DNA和50、35或25％甲酰胺的溶液進(jìn)行)，雜交是按標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡法進(jìn)行的。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸序列能在中等嚴(yán)格條件下，最好是在高度嚴(yán)格條件下雜交。在另一種實(shí)施方案中，所述核酸序列能與序列1、序列3、序列5、序列7或序列9所示序列或其互補(bǔ)鏈雜交。
可將序列1、序列3、序列5、序列7或序列9，以及序列2、序列4、序列6、序列8或序列10或其亞序列用于設(shè)計(jì)一種寡核苷酸探針，以便按照本領(lǐng)域中已知方法從不同屬或種的其它菌株中分離同源基因。因此，可以用標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡法從由所述其它生物制備的基因組或cDNA文庫(kù)中篩選能與所述探針雜交的DNA，以便鑒定并分離其中的相關(guān)基因。所述探針可明顯短于其整個(gè)序列，但其長(zhǎng)度應(yīng)當(dāng)至少為15個(gè)，優(yōu)選至少為25個(gè)，更優(yōu)選至少為40個(gè)核苷酸。也可以使用較長(zhǎng)的探針，但其長(zhǎng)度優(yōu)選不超過(guò)1200個(gè)核苷酸。DNA和RNA探針均可使用。通常對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記，以便檢測(cè)相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、生物素或親和素標(biāo)記)。用本文所述的簡(jiǎn)并探針和來(lái)自犁頭霉屬菌株的基因組DNA或第一股cDNA鏈也能得到一種犁頭霉屬脂酶特異性產(chǎn)物，然后，可將該產(chǎn)物用作探針，以克隆相應(yīng)的基因組或cDNA。
可通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離方法從所述其它生物中分離基因組DNA或其它DNA。可將來(lái)自所述文庫(kù)的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移并固定在硝酸纖纖素或其它合適載體材料上。為了鑒定與序列1、序列3、序列5、序列7或序列9同源的克隆或DNA，將所述載體材料用于Southern印跡分析中，其中，最終用2×SSC、0.2％SDS將該載體材料洗3遍，每次30分鐘，洗滌優(yōu)選是在不高于40℃的溫度下進(jìn)行，較優(yōu)選不高于45℃，更優(yōu)選不高于50℃、再優(yōu)選不高于55℃、還進(jìn)一步優(yōu)選不高于60℃，特別是不高于65℃。用X光片檢測(cè)能在所述條件下與所述寡核苷酸探針雜交的分子。
本發(fā)明還涉及分離的核酸序列，它與序列1、序列3、序列5、序列7或序列9所示核酸序列的同一性至少約為65％，優(yōu)選約為70％，優(yōu)選約為75％，優(yōu)選約為80％，更優(yōu)選約為85％，更進(jìn)一步優(yōu)選約為90％，最優(yōu)選約為95％，最最優(yōu)選約為97％，它能編碼一種活性多肽。兩個(gè)核酸序列之間的同一性程度可以用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序，如GCG程序包(Needleman和Wunsch,1970,Journal of Molecular Biology48:443-453)中提供的GAP測(cè)定。為了測(cè)定本發(fā)明的兩種核酸序列之間的同一性程度，以一個(gè)同一性表、一個(gè)為10的缺口等級(jí)(gap penalty)和一個(gè)為10的缺口長(zhǎng)度(gap length)使用Clustal方法(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)。
在第三種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼具有脂酶活性的多肽的分離的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列與序列2、序列4、序列6、序列8或序列10所示氨基酸序列的同一性至少約為65％，優(yōu)選約為70％，優(yōu)選約為75％，優(yōu)選約為80％，更優(yōu)選約為85％，更進(jìn)一步優(yōu)選約為90％，最優(yōu)選約為95％，最最優(yōu)選約為97％，其在性質(zhì)上仍然保持所述多肽的活性(以下稱之為“同源多肽”)。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述同源多肽的氨基酸序列與序列2、序列4、序列6、序列8或序列10所示的氨基酸序列有5個(gè)氨基酸的差異，優(yōu)選有4個(gè)氨基酸的差異，更優(yōu)選有3個(gè)氨基酸的差異，更進(jìn)一步優(yōu)選有2個(gè)氨基酸的差異，最優(yōu)選有1個(gè)氨基酸的差異。兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸序列的同一性程度可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序測(cè)定，如由GCG程序包(Needleman和Wunsch,1970,Journal of Molecular Biology 48:443-453)提供的GAP。為了測(cè)定本發(fā)明的兩種氨基酸序列之間的同一性，以一個(gè)同一性表、一個(gè)為10的缺口等級(jí)、和一個(gè)為10的缺口長(zhǎng)度使用Clustal方法(DNASTAR,Inc.Madison,WI)。
由本發(fā)明核酸序列所編碼的同源多肽的氨基酸序列可因一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的插入或缺失和/或一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基所取代而區(qū)別于序列2、序列4、序列6、序列8或序列10所示的氨基酸序列。理想的是，氨基酸的變化是次要性的，即不會(huì)明顯影響蛋白的折疊和/或活性的保守性氨基酸取代；小的缺失，通常為1～大約30個(gè)氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，如一個(gè)氨基末端甲硫氨酸殘基的延伸；一個(gè)至多約為20-25個(gè)殘基的小的接頭肽；或一個(gè)小的延伸，它有利于通過(guò)改變凈電荷或其它功能，如一個(gè)聚組氨酸片斷、一個(gè)抗原性表位或一個(gè)結(jié)合域而進(jìn)行的純化。
保守性置換的例子包括堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)，芳族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。大體上不會(huì)改變比活性的氨基酸取代在本領(lǐng)域中是公知的，例如，可參閱H.Neurath和R.L.Hill的著述(1979,The Proteins,Academic Press,New York)。最常見的交換有Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly，以及上述交換的相反形式。
本發(fā)明的分離的核酸序列能夠與一種寡核苷酸探針雜交，該探針能與序列1、序列3、序列5、序列7或序列9所述的核酸序列、其互補(bǔ)鏈或亞序列雜交，所述分離的核酸序列可獲自任何屬的微生物，例如，可獲自細(xì)菌或真菌來(lái)源，但優(yōu)選來(lái)自真菌細(xì)胞，更優(yōu)選來(lái)自絲狀真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。在本發(fā)明中，“獲自”(源于)一詞在與特定來(lái)源組合使用時(shí)是指所述多肽是由該來(lái)源或插入了來(lái)自該來(lái)源的一個(gè)基因的細(xì)胞產(chǎn)生。優(yōu)選的同源基因來(lái)源為犁頭霉屬及其種的菌株，這些菌株可從公共保藏機(jī)構(gòu)獲得。另外，可以用上面提及的探針從其它來(lái)源中鑒定和獲取同源基因，所述來(lái)源包括從自然界中(例如，從土壤、堆肥、水等)分離的微生物。用于從天然環(huán)境中分離微生物的方法在本領(lǐng)域中廣為人知。然后通過(guò)用類似方法篩選另一種微生物的cNDA文庫(kù)可以得到所述核酸序列。特別優(yōu)選的菌株為絲狀真菌菌株，如以下屬的菌株小枝頂孢屬(Acremonium)，曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、絲狀擔(dān)子菌屬(Filibasidium)、鐮孢菌屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、Magnaporthe、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、Neocallimastix、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌屬(Schizophyllum)、藍(lán)霉菌(Talaromyces)、Thermoascus、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium或木霉屬(Trichoderma)；或酵母菌株，如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或Yarrowia菌株。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種核酸序列獲自M.A.A.Schipper在Persoonia,Vol.14,Part 2,PP.133-148(1990)中所披露的犁頭霉屬的菌株，如Abisidia griseola、Absidia sporophora-variabilis、Abisidia griseola var.iguchii、傘枝犁頭霉或Absidia blakesleeana的菌株。在一種更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列獲自Absidia blakesleeanaNN 100826(NRRL 1304)，例如序列3中所示的核酸序列；傘枝犁頭霉NN 100062(IFO 8084)，例如序列5所示的核酸序列；Abisidiagriseola NN 000987(ATCC 20430)；Absidia griseola var.iguchiiNN000591(ATCC20431)，例如，序列1所示的核酸序列；Absidiasporophora-variabilis NN 102 427(ATCC 36019)，例如，序列7所示的核酸序列；和反射犁頭霉NN 102 427(ATCC 44896)，例如，序列9所示的核酸序列。
在犁頭霉屬內(nèi)，優(yōu)選以下的亞屬、種群、種和菌株。還包括其能產(chǎn)生脂解酶的變型和突變型。應(yīng)當(dāng)指出的是，Schipper在所引用的書中對(duì)若干以前所確定的種名進(jìn)行了重新分類，而且，為了方便起見，在下表中列舉了某些菌株以前所使用的名稱，其中，同一個(gè)方框中所列舉的多個(gè)號(hào)碼表示同一菌株的多次保藏號(hào)。<
公眾很容易從多家培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)獲得上述菌株，如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC)、DSM(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und ZellKulturen GmbH)、CBS(Centraalbureauvoor Schimmelcultures)和NRRL(Agricultural Research ServicePatent Culture Collection,Northern Regional Research center)。
一旦用所述探針檢測(cè)到一種核酸序列，便可以用本領(lǐng)域眾所周知的方法分離或克隆該序列(例如，參見Sambrook等的著述，同上)。所述用于分離或克隆核酸序列的已知方法包括從基因組DNA中分離、從cDNA中制備或這兩種方法的組合。例如，從所述基因組DNA克隆本發(fā)明核酸序列可以這樣實(shí)現(xiàn)采用眾所周知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。例如，參見Innis等，1990,A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York?？梢杂梢环N能產(chǎn)生所述多肽的犁頭霉屬菌株或其它的或相關(guān)的生物克隆所述核酸序列，因此，舉例來(lái)說(shuō)，可以是所述核酸序列的所述多肽編碼區(qū)的等位或種的變型。
為了合成大體上與所述多肽相似的多肽，可能需要對(duì)編碼所述多肽的核酸序列進(jìn)行修飾。與所述多肽“大體上相似”是指該多肽的非天然存在形式?？梢杂媚撤N工程方法使所述多肽不同于從其天然來(lái)源中所分離的該多肽。例如，合成所述多肽的變型可能令人感興趣，其中，用諸如定點(diǎn)誘變的方法使該變體在比活性、熱穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性或最佳pH等方面發(fā)生改變?？梢愿鶕?jù)序列1、序列3、序列5、序列7或序列9、其亞序列的所述多肽編碼區(qū)的核酸序列構(gòu)建所述類似序列，和/或通過(guò)引入不會(huì)產(chǎn)生由所述核酸序列編碼的多肽的另一種氨基酸序列，但符合用于生產(chǎn)所述酶的宿主生物的密碼子選擇的核苷酸取代，或通過(guò)會(huì)產(chǎn)生不同的氨基酸序列的核苷酸取代以構(gòu)建所述類似序列。關(guān)于核苷酸取代的一般性說(shuō)明，可參見Ford等的著述(1991,Protein Expression andPurification 2:95-107)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，這種取代可以在決定該分子的功能之外的區(qū)域進(jìn)行，而且仍可產(chǎn)生有活性的多肽。可以用本領(lǐng)域已知方法，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(例如，參見Cunningham和Wells的著述，1989,Science 244:1081-1085)確定對(duì)由本發(fā)明的分離的核酸序列編碼的多肽活性重要的氨基酸殘基，并因此以不對(duì)這些殘基進(jìn)行取代為宜。在后一種誘變方法中，將突變引入相應(yīng)分子的每一個(gè)殘基，并測(cè)試所得突變型分子的脂酶活性，以確定決定該分子活性的氨基酸殘基。還可以通過(guò)分析晶體結(jié)構(gòu)確定底物-酶的互作位點(diǎn)，例如，通過(guò)諸如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記之類的技術(shù)進(jìn)行分析(例如，參見de Vos等，1992,Science 255:306-312；Smith等，1992,Journal of MolecularBiology 224:899-904；Wlodaver等，1992,FEBS Letters 309:59-64)。
由本發(fā)明的核酸序列所編碼的多肽還包括融合多肽，其中，另一種多肽融合在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合多肽是通過(guò)將編碼另一種多肽的核酸序列(或其一部分)與本發(fā)明的一種核酸序列(或其一部分)融合而產(chǎn)生的。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域廣為人知，包括連接編碼所述多肽的編碼序列，以使其符合讀框，而且，所述融合多肽的表達(dá)是受相同的啟動(dòng)子和終止子的控制。
具有由本發(fā)明核酸序列編碼的脂解活性的多肽的特征是，在堿性pH(pH大約為9-10)下，即使沒有游離Ca++也具有高活性。
更具體地講，在沒有游離Ca++的條件下測(cè)試時(shí)，在pH9左右或更高pH下，所述多肽具有最佳脂解活性(在pH9下的活性高于在pH8下的活性)。
由某些優(yōu)選核酸序列編碼的多肽，在沒有游離Ca++的條件下，在pH9下測(cè)定時(shí)具有脂酶活性。這些脂解酶可獲自犁頭霉屬亞屬莖霉屬(Mycocladus)，例如，上文所列舉的種和菌株。
由另一類優(yōu)選優(yōu)核酸序列編碼的多肽，在沒有Ca++的條件下，在pH10時(shí)脂解活性高于pH9時(shí)的脂解活性。這種核酸序列可獲自反射犁頭霉NN 102 427(ATCC 44896)。
由另一類優(yōu)選核酸序列所編碼的多肽在pH10和45℃下培養(yǎng)30分鐘之后仍能保留90％以上的殘余活性。所述序列可獲自Absidiasporophora-variabilis的一種菌株，如Absidia sporophora-variabilis NN102 427(ATCC 36019)。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及含有可操縱地連接于一個(gè)或幾個(gè)控制序列的本發(fā)明核酸序列的核酸構(gòu)建體，所述控制序列能夠在適合于該控制序列的條件下指導(dǎo)相應(yīng)的編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
“核酸構(gòu)建體”在本文中被定義為單鏈或雙鏈核酸分子，該分子是從天然存在的基因中分離的或?qū)ζ溥M(jìn)行修飾，以使其含有以自然界中不存在的方式結(jié)合和并列的核酸片段。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明編碼序列所必須的全部控制序列時(shí)，“核酸構(gòu)建體”一詞與“表達(dá)盒”一詞是同義的。本文所定義的“編碼序列”一詞是指一種序列，當(dāng)該序列被置于合適的控制序列的控制之下時(shí)，能被轉(zhuǎn)錄成mRNA，并被翻譯成本發(fā)明的多肽。所述編碼序列的邊界一般是由位于5′-末端的翻譯起始密碼子ATG和位于3′-末端的翻譯終止密碼子確定的。一個(gè)編碼序列可以包括，但不限于DNA、cDNA、以及重組核酸序列。
可以用多種方法操作分離的編碼本發(fā)明的一種多肽的核酸序列，以便對(duì)該多肽進(jìn)行表達(dá)。根據(jù)表達(dá)載體情況，在將所述編碼一種多肽的核酸序列插入該載體之前對(duì)其進(jìn)行操作可能是希望的或必要的。用克隆方法修飾核酸的技術(shù)在本領(lǐng)域中廣為人知。
“控制序列”一詞在本文中被定義為包括所述核酸序列的編碼序列的表達(dá)所必須的或有利于其表達(dá)的所有因子。相對(duì)編碼所述多肽的核酸序列而言，每一個(gè)控制序列可以是天然的或外源的。所述控制序列包括，但不限于一個(gè)前導(dǎo)序列、一個(gè)聚腺苷酸化序列、一個(gè)前肽序列、一個(gè)啟動(dòng)子、一個(gè)信號(hào)序列和一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子。該控制序列最低限度地包括一個(gè)啟動(dòng)子、和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。該控制序列可以帶有接頭，以用于引入有助于該控制序列與編碼一種多肽的核酸序列的編碼區(qū)連接的特異限制位點(diǎn)。
所述控制序列可以是一個(gè)適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列，即一個(gè)能被宿主細(xì)胞識(shí)別的用于表達(dá)所述核酸序列的核酸序列。該啟動(dòng)子序列含有能介導(dǎo)所述多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。該啟動(dòng)子可以是能在所選擇的宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，并可獲自編碼與該宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因。
適于指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的例子有獲自下列的啟動(dòng)子大腸桿菌操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)果聚糖生成酶基因(sacB)、地衣型芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)生麥淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣型芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、和原核β-乳糖酶基因(Villa-Kamaroff等，1978,Proceedings ofthe National Academy of Science USA 75,3727-3731)，以及tac啟動(dòng)子(DeBoer等，1983,Proceedings of the National Academy of ScienceUSA 80:21-25)。其它啟動(dòng)子披露于Scientific American,1980,242:74-94中的“獲自重組細(xì)菌的有用蛋白”一文；以及Sambrook等的著述(1989，同上)。
用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的例子為獲自編碼以下酶的基因的啟動(dòng)子米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉(Aspergillusniger)酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、尖鐮孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶(如美國(guó)專利US4,288,627中所披露的，該專利被收作本文參考)，及其雜合體。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的特別優(yōu)選的啟動(dòng)子有TAKA淀粉酶、NA2-tpi(來(lái)自編碼黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因的啟動(dòng)子的雜合體)，和glaA啟動(dòng)子。
在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子獲自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)、和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因。其它可用于酵母宿主的啟動(dòng)子披露于Romanos等的著述中(1992,Yeast 8:423-488)。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，有用的啟動(dòng)子包括病毒啟動(dòng)子，如獲自猴病毒40(SV40)、Rous肉瘤病毒(RSV)、腺病毒和牛乳頭瘤病毒(BPV)的啟動(dòng)子。
所述控制序列還可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止序列，即能被宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。該終止序列可操縱地連接于編碼所述多肽的核酸序列的3′末端。任何能在所選擇的宿主細(xì)胞中起作用的終止子均可用于本發(fā)明中。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子獲自編碼以下酶的基因米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲酶葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉氨茴酸合成酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。
用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子獲自編碼釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)、或釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因。其它可用于酵母宿主細(xì)胞的終止子披露于Romanos等的著述中(1992，同上)。適用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的終止子序列在本領(lǐng)域中廣為人知。
所述控制序列還可以是一個(gè)合適的前導(dǎo)序列，即mRNA的一個(gè)非翻譯區(qū)，但該區(qū)對(duì)于宿主細(xì)胞的翻譯是重要的。所述前導(dǎo)序列可操縱地連接于編碼所述多肽的核酸序列的5′末端。任何能在所選擇的宿主細(xì)胞中起作用的前導(dǎo)序列均可用于本發(fā)明中。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)序列獲自編碼米曲霉TAKA淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因。
用于酵母宿主細(xì)胞的合適前導(dǎo)序列獲自釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、釀酒酵母α-因子、和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)。
所述控制序列還可以是一個(gè)聚腺苷酸化序列，該序列可操縱地連接于所述核酸序列的3′-末端，而且，在轉(zhuǎn)錄時(shí)可由所述宿主細(xì)胞識(shí)別，作為一個(gè)向轉(zhuǎn)錄的mRNA添加聚腺苷殘基的信號(hào)。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選聚腺苷酸化序列獲自編碼以下酶的基因米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉氨茴酸合酶、黑曲霉α-淀粉酶。
用于酵母宿主細(xì)胞的有用聚腺苷酸化序列披露于Guo和Sherman的著述中(1995,Molecular Cellular Biology 15:5983-5990)。適用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的聚腺苷酸化序列在本領(lǐng)域中廣為人知。
所述控制序列還可以是一個(gè)信號(hào)肽編碼區(qū)，由它編碼連接于所述多肽的氨基末端的氨基酸序列，它可以把表達(dá)的多肽引導(dǎo)至相應(yīng)細(xì)胞的分泌途徑。所述核酸序列的編碼序列的5′-末端可天然含有一個(gè)信號(hào)肽編碼區(qū)，該區(qū)在翻譯讀框中天然連接編碼所述分泌多肽的編碼區(qū)片段。另外，所述編碼序列的5′末端可以含有一個(gè)相對(duì)于所述編碼分泌多肽的編碼序列部分是外源的信號(hào)肽編碼區(qū)。當(dāng)所述編碼區(qū)不正常含有信號(hào)肽編碼區(qū)時(shí)，可能需要該外源信號(hào)肽編碼區(qū)。另外，該外源信號(hào)肽編碼區(qū)可簡(jiǎn)單地取代所述天然信號(hào)肽編碼區(qū)，以獲得比正常情況下與所述編碼序列相連的天然信號(hào)肽編碼區(qū)強(qiáng)的脂酶分泌作用。所述信號(hào)肽編碼區(qū)可獲自源于曲霉屬種的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、源于根毛霉屬種的脂酶或蛋白酶基因、編碼釀酒酵母的α-因子的基因、源于芽孢桿菌屬菌種的淀粉酶或蛋白酶基因、或牛前凝乳酶原基因。不過(guò)，任何能夠?qū)⒈磉_(dá)的脂酶引導(dǎo)至所選擇的宿主細(xì)胞的分泌途徑中的信號(hào)肽編碼區(qū)均可用于本發(fā)明中。
細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼區(qū)是獲自以下基因的信號(hào)肽編碼區(qū)源于芽孢桿菌屬NCIB 11837的生麥淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶基因、地衣型芽孢桿菌枯草蛋白酶基因、地衣型芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT,nprS、nprM)、和枯草芽孢桿菌prsA基因。其它的信號(hào)肽披露于Simonen和Palva的著述中(1993,Microbiological Reviews 57:109-137)。
絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼區(qū)是獲自以下基因的信號(hào)肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因、疏棉狀腐質(zhì)霉纖維素酶基因或米黑根毛霉脂酶基因。
可用于酵母宿主細(xì)胞的信號(hào)肽獲自編碼釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因。其它有用的信號(hào)肽編碼區(qū)披露于Romanos等的著述中(1992，同上)。
所述控制序列還可以是前肽編碼區(qū)，它編碼位于一種多肽的氨基末端的氨基酸序列。所得到的多肽被稱為酶原或多肽原。多肽原通常是無(wú)活性的，但可通過(guò)對(duì)來(lái)自所述多肽原的前肽的催化或自催化裂解而轉(zhuǎn)化成成熟的活性多肽。所述前肽編碼區(qū)可獲自枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT)、釀酒酵母α-因子基因或嗜熱毀絲霉漆酶基因(WO 95/33836)。
本發(fā)明的核酸構(gòu)建體還可以包括一個(gè)或幾個(gè)編碼一種或幾種有利于所述多肽表達(dá)的因子的核酸序列，所述因子例如有激活蛋白(例如，反式作用因子)、陪伴蛋白、和加工蛋白酶。任何能在所選擇的宿主細(xì)胞中起作用的因子均可用于本發(fā)明中。編碼上述一種或幾種因子的核酸不必是與編碼所述多肽的核酸序列呈串聯(lián)關(guān)系。
激活蛋白是能激活編碼一種多肽的核酸序列轉(zhuǎn)錄的蛋白(Kudla等，1990,EMBO Journal 9:1355-1364；Jarai和Buxton,1994,CurrentGenetics 26:2238-244；Verdier,1990,Yeast 6:271-297)。所述編碼激活蛋白的核酸序列可獲自編碼嗜熱脂肪芽孢桿菌NprA(nprA)、釀酒酵母血紅素激活蛋白1(hap1)、釀酒酵母半乳糖代謝蛋白4(gal4)、和構(gòu)巢曲霉氨調(diào)節(jié)蛋白(areA)的基因。作為基它的例子，參見Verdier的著述(1990，同上)和MacKenzie等的著述(1993,Journal ofGeneral Microbiology 139:2295-2307)。
陪伴蛋白是一種有助于另一種多肽正確折疊的蛋白(Hartl等，1994,TIBS 19:20-25；Bergeron等，1994,TIBS 19:124-128；Demolder等,1994,Journal of Biotechnology 32:179-189；Craig,1993,Science260:1902-1903；Gething和Sambrook,1992,Nature 355:33-45；Puig和Gilbert,1994,Journal of Biological Chemistry 269:7764-7771；Wang和Tseu,1993,The FASEB Journal 7:1515-11157；Robinson等，1994,Bio/Technology 1:381-384)。所述編碼陪伴蛋白的核酸序列可獲自編碼枯草芽孢桿菌GroE蛋白、米曲霉蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、釀酒酵母鈣連接蛋白、釀酒酵母BiP/GRP78、和釀酒酵母Hsp70的基因。
加工蛋白酶是能裂解一種前肽以形成一種成熟的有生化活性的多肽的蛋白酶(Enderlin和Ogrydziak,1994,Yeast 10:67-79；Fuller等，1989,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86:1434-1438；Julius等，1984,Cell 37:1075-1089；Julius等，1983,Cell 32:839-852)。所述編碼加工蛋白酶的核酸序列可獲自編碼釀酒酵母二肽基氨肽酶、釀酒酵母Kex 2、和Yarrowia lipolytica二價(jià)加工內(nèi)切蛋白酶(xpr6)的基因。
還希望增加能調(diào)節(jié)所述多肽的表達(dá)(相對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng))的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的例子有能導(dǎo)致所述基的表達(dá)相應(yīng)于化學(xué)或物理刺激，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而啟動(dòng)或終止的系統(tǒng)。原核系統(tǒng)的調(diào)控系統(tǒng)包括lac、tac、和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可將所述TAKAα-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子和米曲酶葡糖淀粉酶啟動(dòng)子用作調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它例子有允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，所述調(diào)節(jié)序列包括二氫葉酸還原酶基因，該基因是在有氨甲蝶呤的條件下擴(kuò)增，還包括金屬硫蛋白基因，該基因是由重金屬擴(kuò)增的。在上述情形下，編碼所述多肽的核酸序列與所述調(diào)節(jié)序列呈串聯(lián)形式。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及含有一個(gè)本發(fā)明的核酸序列、一個(gè)啟動(dòng)子、和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)的重組表達(dá)載體。可將上述各種核酸序列和控制序列連接在一起，以產(chǎn)生一種重組表達(dá)載體，該載體可以包括一個(gè)或幾個(gè)常見的限制位點(diǎn)，以便在所述位點(diǎn)實(shí)施編碼所述多肽的核酸序列的插入或取代。另外，本發(fā)明的核酸序列可以這樣表達(dá)將該核酸序列或含有該核酸序列的核酸構(gòu)建體插入合適的載體中進(jìn)行表達(dá)。在構(gòu)建所述表達(dá)載體時(shí)，所述編碼序列位于該載體上，使該編碼序列可操縱地與合適控制序列連接，以便表達(dá)，并有可能分泌。
所述重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，該載體能便于對(duì)其實(shí)施重組DNA方法，并可能導(dǎo)致所述核酸序列的表達(dá)。載體的選擇通常取決于載體與其中待導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。所述載體可以是線性或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。所述載體可以是自主復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，該載體可以是質(zhì)粒、染色體外因子、微型染色體或人工染色體。該載體可以含有用于確保自主復(fù)制的一切要素。另外，所述載體可以是這樣的在將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，被整合到基因組上，并與其所整合的染色體共同復(fù)制。所述載體系統(tǒng)可以是一個(gè)載體或質(zhì)粒，或是共同含有待導(dǎo)入宿主細(xì)胞的基因組中的全部DNA的兩個(gè)或兩個(gè)以上的載體或質(zhì)粒，或是一個(gè)轉(zhuǎn)座子。
本發(fā)明的載體在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)可以整合到宿主細(xì)胞的基因組中。為了進(jìn)行整合，所述載體可以依賴于編碼所述多肽的核酸序列或該載體的任何其它因子，以便通過(guò)同源或非同源重組將所述載體穩(wěn)定整合到所述基因組中。另外，所述載體可以含有其它的核酸序列，以便指導(dǎo)通過(guò)同源重組將其整合到宿主細(xì)胞的基因組中。所述其它核酸序列使得所述載體能整合到宿主細(xì)胞基因組中相應(yīng)染色體的精確位置上。為了提高整合到一個(gè)精確位點(diǎn)上的可能性，所述整合因子應(yīng)當(dāng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100-1,500bp，優(yōu)選400-1,500bp，最優(yōu)選800-1,500bp，所述核酸與相關(guān)的目標(biāo)序列是高度同源的，以增加同源重組的可能性。整合因子可以是與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源的任何序列。而且，該整合因子可以是非編碼的或編碼的核酸序列。另一方面，可以通過(guò)非同源重組將所述載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中。所述核酸序列可以是與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源的任何序列，而且，可以是非編碼或編碼序列。
為了進(jìn)行自主復(fù)制，所述載體可以包括一個(gè)使得該載體能在相關(guān)的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的例子有可以在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177的復(fù)制起點(diǎn)，和可以在芽孢桿菌屬中復(fù)制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)的例子有2μm復(fù)制起點(diǎn)、CEN6和ARS4的組合，以及CEN3與ARS1的組合。該復(fù)制起點(diǎn)可以是具有一種突變的復(fù)制起點(diǎn)，該突變可以調(diào)節(jié)其在宿主細(xì)胞中的溫度敏感性(例如，參見Ehrlich,1978,Proceedings of the National Academyof Sciences USA 75:1433)。在一種具體實(shí)施方案中，該表達(dá)載體可以是pZL-NL1,pZL-NL61,pZL-NL95，或pZL-NL124。
本發(fā)明的載體優(yōu)選含有一個(gè)或幾個(gè)便于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記是一種基因，其產(chǎn)物可以產(chǎn)生抗生劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性和對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等。細(xì)菌選擇標(biāo)記的例子有源于枯草芽孢桿菌或地衣型芽孢桿菌的dal基因，或能賦予抗生素抗性，如氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四環(huán)素抗生的標(biāo)記基因。一種常用的哺乳動(dòng)物標(biāo)記基因是二氫葉酸還原酶基因。適用于酵母宿主細(xì)胞的標(biāo)記有ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記可以選自下列一組標(biāo)記，包括，但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶、bar(膦絲菌素(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸鹽還原酶)、pyrD(乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸鹽腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)、trpC(氨茴酸合酶)、和glufosinate抗性標(biāo)記，以及獲自其它種的等同物。用于曲霉屬細(xì)胞的優(yōu)選標(biāo)記為構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG標(biāo)記，和吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar標(biāo)記。另外，選擇還可以通過(guò)共轉(zhuǎn)化而實(shí)現(xiàn)，例如，在WO 91/17243中所披露的，其中，所述選擇標(biāo)記位于一個(gè)獨(dú)立的載體上。
可將編碼本發(fā)明多肽的一種核酸序列的一個(gè)以上的拷貝插入所述宿主細(xì)胞中，以擴(kuò)增該核酸序列的表達(dá)。所述核酸序列的穩(wěn)定擴(kuò)增可以這樣實(shí)現(xiàn)用本領(lǐng)域公知的方法將至少一個(gè)額外的該序列的拷貝插入宿主細(xì)胞的基因組中，并選擇轉(zhuǎn)化體。
用于連接上述因子，以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(例如，參見Sambrook等的著述，1989，同上)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及含有一個(gè)本發(fā)明的核酸序列的重組宿主細(xì)胞，將這種細(xì)胞用于所述多肽的重組生產(chǎn)是有益的?！八拗骷?xì)胞”一詞包括一種親代細(xì)胞的所有子代，這些子代因?yàn)樵趶?fù)制期間所發(fā)生的突變而不同于其親代細(xì)胞。
優(yōu)選用含有本發(fā)明的一種核酸序列的載體轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞，然后將所述載體整合到所述宿主染色體上?！稗D(zhuǎn)化”是指將含有本發(fā)明核酸序列的一種載體導(dǎo)入一種宿主細(xì)胞中，以便以染色體整合體或自主復(fù)制的染色體外載體形式保持所述載體。一般認(rèn)為整合是有利的，因?yàn)檫@樣更可能將所述核酸序列穩(wěn)定地保持在細(xì)胞中。所述載體向宿主染色體上的整合是以上述同源或非同源重組形式進(jìn)行的。
宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上取決于編碼所述多肽的基因及其來(lái)源。所述宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如，原核生物，或是非單細(xì)胞微生物，例如，真核生物。有用的單核細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞，如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，包括，但不限于芽孢桿菌屬細(xì)胞，例如，嗜堿性芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌(Bacillusbrecis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)、Bacillus lautus、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣型芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterinm)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)；或鏈霉菌素細(xì)胞，例如，淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)、或革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌和假單胞菌(Pseudomonas sp.)。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌、地衣型芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(例如，參見Chang和Cohen,1979,Molecular.General Geuetics 168:111-115)、通過(guò)使用感受態(tài)細(xì)胞(例如，參見Young和Spizizin,1961,Journal ofBacteriology 81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,Journal of Molecular Biology 56:209-221)、通過(guò)電穿孔(例如，參見Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques 6:742-751)或通過(guò)綴合(例如，參見Koehler和Thorne,1987,Journal of Bacteriology 169:5771-5278)而實(shí)現(xiàn)。
所述宿主細(xì)胞可以是真核生物細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。有用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、COS細(xì)胞，或可以獲得的任意數(shù)量的其它無(wú)限增殖化細(xì)胞系，例如可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所獲得的細(xì)胞。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是一種真菌細(xì)胞。本文所用的“真菌”包括過(guò)江藤子囊菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門和接合菌門(如Haw-ksworth等所定義的，見Ainsworth and Bisby’s Dictionary of theFungi,8th edition,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK)以及卵菌門(參見Hawksworth等的著述，1995，同上，第171頁(yè))和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，同上)。例如，子囊菌門的代表性種群包括脈孢菌屬(Neurospora)、正青霉屬(Eupenicillium=Penicillium)、Emericella(=曲霉屬)、散囊菌屬(Eurotium=曲霉屬)，以及上述真酵母。擔(dān)子菌門的例子包括蘑菇、銹菌和黑粉菌。例如，壺菌門的代表性種群包括異水霉屬(Allomyces)、小芽枝霉屬(Blastocladiella)、雕蝕菌屬(Coelomomyces)和水生真菌。例如，卵菌門的代表性種群包括水霉真菌性水生真菌(水霉)，如綿霉屬(Achlya)。有絲分裂孢子真菌的例子包括曲霉屬、青霉屬(Penicillium)、假絲酵母屬和鏈格孢屬(Alternaria)。例如，接合菌門的代表性種群包括根霉屬(Rhizopus)和毛霉屬(Mucor)。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。本文所用的“酵母”一詞包括產(chǎn)子囊酵母(內(nèi)孢霉目)、產(chǎn)擔(dān)孢子酵母、和屬于半知菌類的酵母(芽孢鋼)。所述產(chǎn)子囊酵母可分成蝕精霉科和酵母科。后者包括四個(gè)亞科裂殖酵母亞科(例如，裂殖酵母屬)、拿遜酵母亞科、油脂酵母亞科(Lipomycoideae)和酵母亞科(例如，畢赤酵母屬、克魯維酵母屬和酵母屬)。所述產(chǎn)擔(dān)孢子酵母包括白冬孢酵母屬(Leucosporidium)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、絲狀擔(dān)子菌(Filobasidium)和線黑粉菌屬(Filobasidiella)。半知菌類的酵母可以分為兩科，擲孢子酵母科(例如，Sorobolomyces和布勒彈孢酵母屬(Bullera))和隱球酵母科(例如，假絲酵母屬)。由于酵母的分類將來(lái)可能有所變化，對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，酵母的定義如在Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.,著，Soc.App Bacteriol SymposiumSeries No.9,1980)中所披露的。酵母生物學(xué)和酵母遺傳學(xué)操作在本領(lǐng)域中廣為人知(例如，參見Biochemistry and Genetics of Yeast,Bacil,M.,Horecker,B.J.,和Stopans,AO.M.,著，第2版，1987；The Yeasts,Rose,A.H.,和Harrison,J.S.,著，第2版，1987；和The MolecularBiology of the Yeast Saccharomyces,Strathern等著，1981)。
在一種更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬、克魯維酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、畢赤酵母屬或Yarrowia屬的種的細(xì)胞。
在一種最佳實(shí)施方案中，所述酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉斯酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)細(xì)胞。在另一種最佳實(shí)施方案中，所述酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維(Kluyveromyces lactis)細(xì)胞。在又一種最佳實(shí)施方案中，所述酵母宿主細(xì)胞是Yarrowia lipolytica細(xì)胞。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門和卵菌門的全部絲狀形式的小類(由Hawksworth等確定，1995，同上)。所述絲狀真菌的特征是由殼多糖、纖維素、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、甘露聚糖和其它復(fù)合多糖組成的營(yíng)養(yǎng)性菌絲體。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲伸長(zhǎng)進(jìn)行的，而碳的分解代謝是專性需氧的。相反，諸如釀酒酵母的酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)單細(xì)胞菌體出芽進(jìn)行的，而碳的分解代謝是通過(guò)發(fā)酵進(jìn)行的。在一種更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是以下屬的種的細(xì)胞，但不局限于這些屬小枝頂孢屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢菌屬、青霉屬(Penicillium)、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium和木霉屬(Trichoderma)。
在一種更佳的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是曲霉屬細(xì)胞。在另一種進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是小枝頂孢屬細(xì)胞。在另一種進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是鐮孢屬細(xì)胞。在另一種進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是腐質(zhì)霉屬細(xì)胞。在另一種進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是毛霉屬細(xì)胞。在另一種進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是毀絲霉屬細(xì)胞。在另一種進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是脈孢菌屬細(xì)胞。在另一種進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是青霉屬細(xì)胞。在另一種進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是梭孢殼屬細(xì)胞。在另一種進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是Tolypocladium屬細(xì)胞。在又一種進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是木霉屬細(xì)胞。
在一種最佳實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一種最佳實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是谷類鐮孢(Fusarium cerealis)、Fusariumcrookwellense、禾本科鐮孢(Fusarium graminearum)、尖鐮孢(Fusarium oxysporum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)或Fusarium sulphureum細(xì)胞。在另一種最佳實(shí)施方案中，所述真菌宿主細(xì)胞是Humicola insolens或疏棉狀腐質(zhì)霉細(xì)胞。在另一種最佳實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是米黑毛霉細(xì)胞。在另一種最佳實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是嗜熱毀絲霉細(xì)胞。在另一種最佳實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是粗糙脈孢菌細(xì)胞。在另一種最佳實(shí)施方案中，所述絲狀真菌蓿主細(xì)胞是產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)細(xì)胞。在另一種最佳實(shí)施方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是Thielavia terrestris細(xì)胞。在又一種最佳實(shí)施方案中，所述木霉屬細(xì)胞是Trichodermaharzianum、康寧木霉(Trichoderma koningii)、Trichodermalongibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木霉(Trichoderme viride)細(xì)胞。
可以通過(guò)一種本身已知的方法轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，該方法包括原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、和細(xì)胞壁再生。適用于轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細(xì)胞的合適方法披露于EP 238 023和Yelton等的著述中(1984，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 81:1470-1474)。適用于轉(zhuǎn)化鐮孢菌種的方法披露于Malardier等的著述(1989,Gene 78:147-156)中或待批的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?8/269,449中，以上文獻(xiàn)被收作本文參考。酵母的轉(zhuǎn)化可以用披露于下列文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行Becker和Guarente，見Abelson,J.N.和Simon,M.I.著，Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology,Methods in Enzymology,Volume 194,pp 182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等，1983,Journal of Bacteriology153:163；和Hinnen等,1978,Proceedings of the National Academy ofSciences USA 75:1920。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以用Graham和Van derEb的磷酸鈣沉淀法(1978,Virology 52:546)通過(guò)直接攝取的方法實(shí)現(xiàn)。生產(chǎn)方法本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在能誘導(dǎo)所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)一種宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。
在上述方法中，是用本領(lǐng)域已知的方法在適于產(chǎn)生所述多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。例如，可以通過(guò)搖瓶培養(yǎng)法，在實(shí)驗(yàn)室用或工業(yè)用發(fā)酵罐中在合適的培養(yǎng)基中在所述多肽能被表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)所述細(xì)胞。培養(yǎng)是用本領(lǐng)域公知方法，在含有碳和氮源，以及無(wú)機(jī)鹽的合適營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行的(例如，參見細(xì)菌和酵母的參考文獻(xiàn)；Bennett,J.W.和LaSure,L.,著，More Gene Manipulationsin Fungi,Academic Press,CA,1991)。合適的培養(yǎng)基可自供貨商處購(gòu)買或按照公開的配方制備(例如，可參見美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所的產(chǎn)品目錄)。如果所述多肽被分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，則可以直接從培養(yǎng)基中回收這種多肽，如果所述多肽不是分泌性的，則從細(xì)胞裂解液中回收它。
所述多肽可以用本領(lǐng)域已知方法檢測(cè)，該方法是專用于該多肽的。所述檢測(cè)方法可以包括特異抗體的使用、一種酶產(chǎn)物的形成或一種酶底物的消失。例如，可將酶測(cè)定方法用于測(cè)定該多肽的活性?？梢杂帽绢I(lǐng)域任何已知方法測(cè)定脂酶活性的產(chǎn)生。在一種方法中，一個(gè)脂酶單位(LU)是在30℃和pH7.0(磷酸緩沖液)下，以三丁精為底物以阿拉伯樹膠為乳化劑時(shí)，每分鐘釋出1.0μmol可滴定脂肪酸所需的酶量。在pH7-10的范圍內(nèi)，在無(wú)游離Ca++的條件下測(cè)脂解酶的活性，測(cè)定是用底物橄欖油乳液2％PVA溶液(1∶3)在特定pH和40℃下進(jìn)行10分鐘。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，在酸性條件下用氯仿∶甲醇(1∶1)萃取該反應(yīng)混合物，并通過(guò)TLC-FID分析(Iatroscan)測(cè)定反應(yīng)期間所釋放出的脂肪酸。一個(gè)OPID單位(OPDIU)是指每分鐘釋出1.0μmol脂肪酸。在每一次測(cè)試時(shí)均同時(shí)采用10mM EDTA和200mM緩沖液(Tris-HCl緩沖液，pH7和8,pH8、9和10的二乙醇胺緩沖液)。
可以用本領(lǐng)域已知的方法回收所得到的多肽。例如，可以用常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收所述多肽，所述方法包括，但不限于離心、過(guò)濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。然后可以用各種層析方法回收所述多肽，例如，離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析或親和層析等。
可以用各種本領(lǐng)域已知的方法純化本發(fā)明的多肽，所述方法包括，但不限于層析(例如，離子交換層析、親和層析、疏水層析、層析聚焦和大小排阻層析)，電泳方法(例如，制備等電聚焦(IEF))，差示溶解性(例如，硫酸銨沉淀)，或萃取(例如，參見Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden，著，VCH Publishers,New York,1989)。用途可將由本發(fā)明核酸序列編碼的重組多肽用于脂解酶的常見用途中，尤其是在高pH下使用，例如，用于洗衣和洗碟洗滌劑中，專業(yè)和工業(yè)洗滌和皮革加工。
還可將本發(fā)明的脂解酶用于酯交換，以便全面水解脂肪和油，并用于旋光異構(gòu)拆分方法。
通過(guò)下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，不應(yīng)將這些實(shí)施例視為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
實(shí)施例例1基因組DNA提取在32℃下，以250rpm的轉(zhuǎn)速在25ml 0.5％酵母提取物-2％葡萄糖(YEG)培養(yǎng)基中分別讓Absidia griseola NN000987(ATCC20430)、Absidia sporophora-variabilis NN102 427(ATCC 36019)、Absidia grisieola var.iguchii NN 000591(ATCC 20431)、傘枝犁頭霉NN 100062(IFO 8084)、和Absidia blakesleeana NN 100826(NRRL 1304)生長(zhǎng)24小時(shí)。然后通過(guò)用Miracloth(Calbiochem,LaJolla,CA)過(guò)濾從每種培養(yǎng)物中收集菌絲體，并用25ml 10mM Tris-0.1MEDTA(TE)緩沖液洗滌一次。將多余的緩沖液從菌絲體制劑中吸走，然后在液氯中冷凍該制劑。在電動(dòng)咖啡磨中將所述冷凍的菌絲體制劑磨成細(xì)粉，將這些細(xì)粉分別加入裝有20ml TE緩沖液和5ml 20％w/v十二烷基硫酸鈉(SDS)的一次性塑料離心管中。將該混合物輕輕倒轉(zhuǎn)幾次，以確?；旌?，并用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取2次。將乙酸鈉(3M溶液)加入萃取過(guò)的樣品中，使其終濃度達(dá)到0.3M，隨后加入2.5倍體積用冰預(yù)冷的乙醇，以沉淀所述DNA。在15,000xg下將所述管離心30分鐘，以沉淀DNA。讓該DNA沉淀風(fēng)干30分鐘，然后重新懸浮于0.5ml TE緩沖液中。將無(wú)DNase的核糖核酸酶A加入重新懸浮的DNA沉淀中，使其濃度為100μg/ml，然后在37℃下將該混合物培養(yǎng)30分鐘。將蛋白酶K加入每一個(gè)離心管中，并在37℃下再培養(yǎng)1小時(shí)。最后，用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1 v/v/v)將每種樣品萃取2次，然后用乙酸鈉和乙醇沉淀DNA。在真空條件下干燥該DNA沉淀，重新懸浮于TE緩沖液中，并在4℃下保存。例2Absidia griseola NN000987和Absidia griseola var.iguchiiNN000591脂酶基因片段的PCR擴(kuò)增根據(jù)Gormsen等在專利申請(qǐng)DK 95/00424(該申請(qǐng)的內(nèi)容被收作本文參考)所披露的Absidia griseola NN000987脂酶和Absidia griseolavar.iguchii NN000591脂酶的氨基酸序列，用一臺(tái)Applied BiosystemsModel 394 DNA/RNA合成儀，按照生產(chǎn)商提供的說(shuō)明書合成以下寡核苷酸引物，以PCR擴(kuò)增源于Absidia griseola NN 000987和Absidia griseolavar.iguchii NN000591的脂酶基因片段(注R=A或G,I=肌苷，Y=T或C,H=A或T或C，而N=A或T或C或G)。1．正向引物氨基酸序列GluThrGluIleGlnAlaHisThrPhe(序列11)寡核苷酸(+鏈)5’-GARACIGARATHCARGCICAYACITT-3’(序列12)2．反向引物氨基酸序列ProProGlyAlaPheGlyPheLeu(序列13)寡核苷酸(-鏈)5’-ARRAANCCRAAIGCNCCIGGNGG-3’(序列14)以大約1μg的Absidia griseola NN 000987或Absidia griseola var.iguchii NN 000591基因組DNA為模板制備擴(kuò)增反應(yīng)物(100ml)。每一種反應(yīng)物中含有以下成分1μg基因組DNA、40pmol正向引物、40pmol反向引物、dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200mM、1×Taq聚合酶緩沖液(Perkin-Elmer Corp.,Branchburg,NJ)、和5個(gè)單位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer corp.,Branchburg,NJ)。將無(wú)菌礦物油(100μl)鋪層于每一種反應(yīng)混合物上部，在一臺(tái)Perkin-Elmer Model480熱循環(huán)儀上培養(yǎng)所述反應(yīng)混合物，其程序?yàn)檠h(huán)1-95℃下5分鐘，45℃下2分鐘，和67℃下5分鐘；循環(huán)2-30-95℃下2分鐘，45℃下2分鐘，和67℃下2分鐘；并在4℃下浸泡循環(huán)。在1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)上分離所述反應(yīng)產(chǎn)物，并從該凝膠上切除主PCR產(chǎn)物帶，并按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書用β-瓊脂糖酶(New England Biolabs,Beverly,MA)進(jìn)行純化。然后將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pCRⅡ載體(Ivitrogen,San Diego,CA)上，并用lac正向和反向引物(New England Biolabs,Beverly,MA)測(cè)定該DNA序列。
用上述脂酶特異性PCR引物，擴(kuò)增圖1所示的源于Absidia griseolaNN 000987和Absidia griseola var.iguchii NN 000591的大約870bp的脂酶基因片段。DNA序列分析表明，所擴(kuò)增的基因片段編碼相當(dāng)于犁頭霉屬脂酶基因部分。另外，所述DNA序列資料證實(shí)，這兩種基因產(chǎn)物可能相同，并共有與米黑根毛霉脂酶同源的部分。例3基因組DNA的雜交分析通過(guò)Southern雜交(Maniatis等，1982,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York)對(duì)例1中所述的獲自五個(gè)犁頭霉屬菌株的全細(xì)胞DNA樣品進(jìn)行分析。用EcoRⅠ、Asp 718Ⅰ或EcoRⅠ+Asp 718Ⅰ消化大約2-5μg每種DNA樣品，并在1％瓊脂糖凝膠上電泳。在短波長(zhǎng)UV光下對(duì)該凝膠進(jìn)行照像，并在0.5M NaOH-1.5M NaCl中浸泡15分鐘，隨后再在1.5MNaCl-1M Tris-HCl pH8中浸泡15分鐘。按照Davis等所披露的方法(1980,Advanced Bacterial Genetics,A Manual for GeneticEngineering,Cold Spring Harbon Press,Cold Spring Harbor,NewYork)，通過(guò)在20×SSPE(3M NaCl-0.2M NaH2PO4-0.02MNa2EDTA)中進(jìn)行毛細(xì)印跡，將所述凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到NytranO雜交膜(Schleicher&amp;Schuell,Keene,NH)上。用UV Stratulinker(Stratagene,La Jolla,CA)將該DNA交聯(lián)在所述膜上，在45℃下，在以下雜交緩沖液中浸泡該膜2小時(shí)，同時(shí)輕搖5×SSPE、35％甲酰胺(v/v)、0.3％SDS、和200mg/ml變性并剪切過(guò)的鮭測(cè)試DNA。通過(guò)用〔32P〕dCTP(Amersham,Arlington Heights,IL)進(jìn)行切口平移(Maniatis等，1982，同上)對(duì)例2中所述的自Absidia griseola NN000987 PCR-克隆中分離的脂酶特異性探針片段進(jìn)行放射標(biāo)記，以0.1M的終濃度加入NaOH進(jìn)行變性，并以大約為1×106cpm/ml緩沖液的活性加至雜交緩沖液中。在45℃下，在搖動(dòng)水浴中培養(yǎng)該混合物過(guò)夜。培養(yǎng)之后，在45℃下，在含有0.1％SDS的0.2×SSPE中洗滌所述雜交膜1次，然后在相同溫度下在0.2×SSPE(無(wú)SDS)中洗滌2次。在吸水紙上讓該膜干燥15分鐘，然后包封在Saran-WrapTM中，并在-70℃下對(duì)X光膠片曝光過(guò)夜，使用增感屏(Kodak,Rochester,NY)。
用PCR產(chǎn)生的源于Absidia griseola var.iguchii NN 000591的脂酶基因片段探針，在中等嚴(yán)格條件下通過(guò)Southern印跡法對(duì)來(lái)自每一種犁頭霉菌的全細(xì)胞DNA進(jìn)行分析，結(jié)果表明，所試驗(yàn)過(guò)的所有犁頭霉菌的脂酶基因均可與所述探針交叉雜交(圖2)。試驗(yàn)過(guò)的所有菌種在其EcoRⅠ消化產(chǎn)物中還有一個(gè)大約為2.1kb的雜交信號(hào)，只有Absidiasporophora-variabilis NN 102 427例外，它產(chǎn)生的是一個(gè)4kb的雜交信號(hào)帶。另外，似乎試驗(yàn)過(guò)的所有菌種在其基因組中均含有單一拷貝的相關(guān)脂酶基因。例4DNA文庫(kù)及脂酶克隆的鑒定在噬菌體克隆載體1ZipLox(Life Technologies,Gaithersburg,MD)上構(gòu)建富集的基因組DNA文庫(kù)。首先，用EcoRⅠ消化全細(xì)胞DNA，并在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行大小分離。切除大小相應(yīng)于先前在例3中所述的Southern印跡上的觀察到的雜交信號(hào)的遷移DNA片段，并用Prep-a-Gene試劑(BroRad Laboratories,Hercules,CA)從凝膠中洗脫。在上述級(jí)分中DNA片段的大致尺寸如下1.9-2.5kb(Absidiagriseola var.iguchii NN000591),1.9-2.5kb(Absidia blakesleeana NN100826),1.9-2.5kb(傘枝犁頭霉NN 100062)和2.5-4.3kb(Absidiasporophora-variabilis NN 102427)。將洗脫的DNA片段與EcoRⅠ-裂解過(guò)的脫磷酸化λZipLox載體臂(Life Technologies,Gaithersburg,MD)，并用市售包裝提取物(Stratagene,La Jolla,CA)對(duì)該連接混合物進(jìn)行包裝。將包裝的DNA文庫(kù)鋪平板，并在大腸桿菌Y1090ZL細(xì)胞(Life Technologies,Gaithersburg,MD)中擴(kuò)增。每一種文庫(kù)中重組噬菌體的效價(jià)為1.3-5.4×105pfu/ml(無(wú)DNA的背景效價(jià)為1.7-2.0×104pfu/ml)。用源于Absidia griseola NN000987的脂酶特異性PCR片段作探針，通過(guò)噬斑雜交對(duì)一每一種未經(jīng)擴(kuò)增的文庫(kù)的大約15,000-30,000個(gè)噬斑進(jìn)行篩選(Davis等，1980，同上)。在大腸桿菌Y1090ZL細(xì)胞中對(duì)能與所述探針產(chǎn)生強(qiáng)的雜交信號(hào)的噬斑純化2次，然后以pZL1-衍生物形式從所述λZipLox載體上切除脂酶基因。將該重組DNA片段插入所述載體的噬粒pZL1部分，并以自主復(fù)制的pZL1形式回收獲得了所述克隆的插入片段的噬粒，通過(guò)感染大腸桿菌DH 10Bzip細(xì)胞(Life Technologies,Gaithersburg,MD)用體內(nèi)剪切的方法進(jìn)行回收。制備以這種方法分離的脂酶克隆，用Wizard 373 DNA純化試劑盒(Promega Madison,WI)進(jìn)行DNA序列分析。例5脂酶基因的DNA序列分析用一臺(tái)Applied Biosystems Model 373A自動(dòng)DNA測(cè)序儀(Applied Biosystem,Inc.Foster City,CA)對(duì)在例4中所披露的脂酶克隆的雙鏈進(jìn)行DNA測(cè)序，通過(guò)引物行走技術(shù)用染料終止化學(xué)進(jìn)行(Giesecke等(1992,Journal of Virol.Methods 38:47-60))。寡核苷酸測(cè)序引物是按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書在一臺(tái)Applied Biosystems Model 394DNA/RNA合成儀上合成的。
編碼犁頭霉屬脂酶的基因的核苷酸序列如圖3-6(序列1、3、5和7)所示。每個(gè)基因中內(nèi)含子的確定是基于(a)源于肽片段的已知氨基酸序列(Boel等，1988,Lipids 23:701-706),(b)與米黑根毛霉脂酶的推斷氨基酸序列的比較(序列15)(Gurr等，見Kinghorn,J.R.,著，Gene Structure in Eukaryotic Microbes,pp.93-139,IRL Press,Oxford)，和(c)絲狀真菌內(nèi)含子的已知共有序列(Von Heijne,1984,Jorunal of Molecular Biology 173:243-251)。
為了分離編碼反射犁頭霉脂酶的基因，讓反射犁頭霉NN 102427菌株(ATCC 44896)生長(zhǎng)在以西蒙德油(jojoba oil)為誘導(dǎo)成分的最佳培養(yǎng)基上。由上述菌株制備一種cDNA文庫(kù)，并用上述傘枝犁頭霉基因作探針通過(guò)菌落雜交鑒定cDNA克隆。該傘枝犁頭霉基因的序列如圖7所示(序列9)。該脂酶與Absidia sporophora-variabilis脂酶的同源性大約為99％。例6來(lái)自各種犁頭霉菌的脂酶基因的比較這些犁頭霉屬脂酶基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)十分相似，即均由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，如表1所示。外顯子2-6的大小是高度保守的。第一個(gè)外顯子的大小因?yàn)榫幋a所述信號(hào)肽和所述酶的前肽部分的區(qū)域的某種變化而表現(xiàn)出輕度的變動(dòng)性。另外，相應(yīng)外顯子之間核苷酸序列的同源性也很高，其同一性為85-97％。相反，其內(nèi)含子的長(zhǎng)度是可變的，只有傘枝犁頭酶NN 100062和Absidia sporophora-variabilis NN 102 427脂酶基因例外，在其相關(guān)內(nèi)含子之間的序列同源性很低。所述脂酶基因的5′和3′旁側(cè)序列還表現(xiàn)出序列趨異。
表1．源于幾種犁頭霉菌的脂酶基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)
基于推斷的氨基酸序列(序列2、4、6、8和10)，在表2中對(duì)犁頭霉屬脂酶的生化和生物物理特性進(jìn)行了比較。所有4種脂酶都十分相似，表現(xiàn)在均以337-338個(gè)氨基酸的前酶原形式合成，含有17-21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、52-56個(gè)氨基酸的前肽、和264-265個(gè)氨基酸的成熟酶，其非糖基化蛋白的分子量大約為29,000。計(jì)算出的等電點(diǎn)在6.10～6.94間波動(dòng)，堿性最強(qiáng)的是源于Absidia sporophora-variabilis的脂酶。上述計(jì)算出的等電點(diǎn)值遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)中在IEF凝膠上觀察到等電點(diǎn)值(參見Gormsen等的專利申請(qǐng)DK95/00424)，這可能是因?yàn)椴⒎撬袔щ姾傻臍埢霈F(xiàn)在該蛋白的暴露的三維表面上而造成的。
表2．源于幾種犁頭霉菌的預(yù)測(cè)的生化和生物物理特性
如表3和圖8所示，犁頭霉屬脂霉共有延伸的氨基酸序列同源性，彼此之間的同一性為87-96％，而與米黑根毛霉脂酶(序列15)的有限同源性為53-55％，與疏棉狀腐質(zhì)霉脂酶(序列16)的有限同源性為22-24％。
表3．源于犁頭霉菌種、米黑根毛霉和疏棉狀腐質(zhì)霉的脂酶之間的氨基酸序列相似性相似性百分比
從系統(tǒng)發(fā)育角度來(lái)看，犁頭霉屬的脂酶與源于真菌的接合菌綱的其它成員的脂酶最為接近。酵母、細(xì)菌、和哺乳動(dòng)物脂酶以及真菌角質(zhì)酶的相關(guān)性極低(如果有的話)。例7傘枝犁頭霉脂酶基因的表達(dá)將上述傘枝犁頭霉脂酶基因的克隆和核苷酸序列用于該基因的亞克隆，并在曲霉屬宿主中表達(dá)。用PCR方法亞克隆源于分離的基因組克隆NL95A的脂酶基因(沒有其自身的啟動(dòng)子)，使用由所述核苷酸序列設(shè)計(jì)的引物。為了便于將該基因片段亞克隆到被命名為pBANe6(圖9)的表達(dá)載體上，分別將SwaⅠ和PacⅠ限制酶位點(diǎn)引入該基因的5′和3′末端。載體pBANE6含有TAKA啟動(dòng)子、NA2-tpi前導(dǎo)序列和AMG終止子作為調(diào)節(jié)序列。該質(zhì)粒還含有構(gòu)巢曲霉amdS基因作為真菌轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記。將下列引物用于PCR擴(kuò)增正向引物5′-CCCATTTAAATATGCGTTTTTATTCAGTAGTATCAT-3′(序列17)反向引物5′-CTCGGCTTAATTAAAATGGGTTATAAGCAGAGACCAGTG-3′(序列18)
按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書，用Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)進(jìn)行PCR。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠分離，用SwaⅠ和PacⅠ酶裂解，并進(jìn)行凝膠純化。將純化的片段連接到pBANe6載體(已經(jīng)用SwaⅠ和PacⅠ裂解過(guò))，以得到質(zhì)粒pKB2(圖10)，其中，脂酶基因的轉(zhuǎn)錄受TAKA啟動(dòng)子的控制。將該pKB2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5細(xì)胞。分離含有pKB2質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，并制備質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化和在曲霉屬中表達(dá)。
由米曲霉菌株BANe3制備原生質(zhì)體，其中，該宿主菌株的amdS基因缺失。原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化是用先前所公開的方法進(jìn)行的(Christensen等，同上)?；谄鋵⒁阴０纷鳛槲ㄒ话痹吹哪芰x擇能表達(dá)乙酰胺酶的米曲霉轉(zhuǎn)化體。共得到42個(gè)轉(zhuǎn)化體，并在選擇性平板上將孢子純化2次。將孢子純化的轉(zhuǎn)化體用作進(jìn)一步研究。
通過(guò)搖瓶培養(yǎng)篩選脂酶表達(dá)的轉(zhuǎn)化體(125ml的燒瓶中裝有25ml培養(yǎng)基)，所用培養(yǎng)基的每1升體積中含有50g麥芽糖、2.0gMgSO4-7H2O,10g KH2PO4、2.0g K2SO4、2.0g檸檬酸、10g酵母提取物、0.5ml微量金屬溶液和2.0g尿素。該微量金屬溶液每升含有14.3gZnSO4-7H2O、2.5g CuSO4-5H2O、0.5g NiCl2-6H2O、13.8gFeSO4-7H2O、8.5g MnSO4-H2O和3.0g檸檬酸。在進(jìn)行高壓滅菌之前，將該培養(yǎng)基的pH調(diào)至6.5。用新采集的孢子接種燒瓶，并在34℃下以200rpm的轉(zhuǎn)速在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)48小時(shí)后每天測(cè)定培養(yǎng)物中脂酶的活性。由于對(duì)于該脂酶的合適底物的情況一無(wú)所知，通過(guò)以下三種方法測(cè)定酶活性ⅰ)用橄欖油作底物進(jìn)行脂酶平板測(cè)定，ⅱ)用對(duì)-硝基苯丁酸酯作底物進(jìn)行比色分析，和ⅲ)用三丁精(三丁酸甘油酯)進(jìn)行滴定。
用平板培養(yǎng)基進(jìn)行脂酶平板分析，該培養(yǎng)基中含有以下成分0.1MTris pH9.0,0.1M CaCl2、1％Triton X-100,0.5％橄欖油、和2.0％瓊脂糖。對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌，并注入150mm的平皿中，每皿注入50-60ml。在瓊脂糖固化之后，在每個(gè)平板上打15個(gè)孔，并向每個(gè)孔中加入25ml培養(yǎng)液。將來(lái)自未轉(zhuǎn)化的米曲霉菌株BANe3的培養(yǎng)液用作對(duì)照。在37℃下培養(yǎng)所述平板過(guò)夜。根據(jù)孔周圍透明區(qū)域的存在確定轉(zhuǎn)化體中脂酶活性的存在。加入了來(lái)自未轉(zhuǎn)化菌株的培養(yǎng)液的對(duì)照孔不會(huì)出現(xiàn)這種澄清現(xiàn)象，表明脂酶活性僅存在于轉(zhuǎn)化體中。
還用對(duì)-硝基苯丁酸酯作底物測(cè)定脂酶活性。通過(guò)將10ml該化合物加入1.0ml二甲基亞砜(DMSO)和4.0ml 0.1M Tris pH9.0緩沖液中制備對(duì)-硝基苯丁酸酯。將100μl適當(dāng)稀釋的培養(yǎng)液加至每個(gè)孔中。加入100ml對(duì)-硝基苯丁酸酯底物啟動(dòng)反應(yīng)，并在405nm波長(zhǎng)下測(cè)吸收值3-5分鐘。根據(jù)用已知量的疏棉狀腐質(zhì)霉作標(biāo)準(zhǔn)物繪制的曲線計(jì)算酶的活性。未轉(zhuǎn)化的菌株能產(chǎn)生很小的或不產(chǎn)生活性，而不同的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)48小時(shí)后產(chǎn)生脂酶。
通過(guò)基于由脂酶催化的三丁精水解的滴定法進(jìn)一步測(cè)定脂酶活性。通過(guò)在穩(wěn)定pH下用堿滴定跟蹤丁酸的釋放。對(duì)來(lái)自選定轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)液和來(lái)自未轉(zhuǎn)化對(duì)照菌株的培養(yǎng)液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)化的對(duì)照菌株不產(chǎn)生脂酶活性，而轉(zhuǎn)化體能產(chǎn)生可檢測(cè)的脂酶活性。例8Absidia sporophora-variabilis脂酶基因在米曲霉中的表達(dá)將所述原始基因組克隆作為Pwo聚合酶(Boehringer-MannheimBiochemicals,Indianapolis,IN)的模板在PCR反應(yīng)物中擴(kuò)增A.sporophora-variabilis的編碼區(qū)，反應(yīng)物中含有61ml無(wú)菌水、10ml稀釋的模板DNA(大約5ng/ml)、1ml引物1(大約30pmol:dATGATGCATTCTCATTTTGTAGTCTTATTG，序列19)、1ml引物2(大約25pmol:dGCTTAATTAATTATAAACAGAGACCAGTGTTCATGTCAAG，序列20)、16ml dATP、dCTP、dGTP和dTTP混合物(200mmol終濃度)、10ml Pwo緩沖液(10×溶液；Boehringer-Mannheim Biochemicals)和1ml Pwo聚合酶(5單位)。擴(kuò)增條件如下第一輪次在95℃下進(jìn)行5分鐘，45℃下2分鐘，和67℃下5分鐘；第2-30輪次在95℃下進(jìn)行2分鐘，45℃下1分鐘，和67℃下2分鐘；以及在4℃下進(jìn)行的一個(gè)浸泡循環(huán)。用PacⅠ消化擴(kuò)增的脂酶基因片段，并通過(guò)制備瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，切除并用Prep-a-Gene試劑(BioRad Laboratories,Hercules,CA)純化。將純化的片段與用SwaⅠ和PacⅠ裂解過(guò)的pBANe6連接，以得到脂酶表達(dá)載體pRaMB19(圖11)。
然后用標(biāo)準(zhǔn)方法(Christensen等，1988，Bio/Technology 1419-1422)，用pRaMB19轉(zhuǎn)化堿性蛋白酶缺陷型米曲霉宿主JaL142。通過(guò)condiospores將轉(zhuǎn)化菌落純化2次，并通過(guò)在三丁精瓊脂板上劃線測(cè)試脂酶表達(dá)，每1升平板中含有130g麥芽糖糊精，3g MgSO4-7H2O,5g KH2PO4,4g檸檬酸、6g K2SO4、0.5ml微量金屬(如例7中所述)、5g酵母提取物、160ml 1M尿素、35.3ml 1M NaNO3、25g Noble瓊脂和10g三丁精pH4.5。在30℃下培養(yǎng)48小時(shí)后，84個(gè)轉(zhuǎn)化體中的80個(gè)表現(xiàn)在三丁精瓊脂平板上出現(xiàn)獨(dú)特的澄清區(qū)域，表明產(chǎn)生了胞外脂酶活性。在MY50培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)物中對(duì)這些轉(zhuǎn)化體中的10個(gè)進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試，每1升培養(yǎng)基中含有50g麥芽糖糊精、2g MgSO4-7H2O、10gKH2PO4、2g檸檬酸、2g K2SO4、0.5ml微量金屬溶液、10g酵母提取物、2g尿素pH6.0。在37℃下將所述搖瓶培養(yǎng)物培養(yǎng)48小時(shí)，然后用對(duì)-硝基苯丁酸酯作底物按例7所述方法測(cè)定每種培養(yǎng)物的培養(yǎng)濾液的胞外脂酶活性。未轉(zhuǎn)化的對(duì)照細(xì)胞的培養(yǎng)物不能產(chǎn)生可檢測(cè)的脂酶活性，而pRaMB19轉(zhuǎn)化體能產(chǎn)生可檢測(cè)的脂酶活性。
生物材料的保藏按照布達(dá)佩斯條約規(guī)定，已于1996年1月18日將以下生物材料交由NRRL(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center,1815 University Street,Peoria,Illinois,61604)保藏，所給的入藏號(hào)如下
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權(quán)利要求
1．一種編碼一種具有脂酶活性的多肽的分離的核酸序列，該序列選自(a)編碼一種犁頭霉屬菌株的內(nèi)源多肽的核酸序列，該多肽具有序列2、序列4、序列6、序列8或序列10所示的氨基酸序列；(b)一種犁頭霉屬菌株的內(nèi)源核酸序列，它能在中等嚴(yán)格的條件下與(ⅰ)序列1、序列3、序列5、序列7或序列9所示核酸序列或(ⅱ)其任何互補(bǔ)鏈雜交；(c)一種核酸序列，它能在中等嚴(yán)格的條件下與(ⅰ)序列1、序列3、序列5、序列7或序列9所示核酸序列或(ⅱ)其任何互補(bǔ)鏈雜交；(d)一種編碼具有脂酶活性的多肽的核酸序列，該多肽的氨基酸序列與序列2、序列4、序列6、序列8或序列10所示氨基酸序列的同一性至少為65％；(e)(a)、(b)、(c)或(d)的等位形式；和(f)(a)、(b)、(c)或(d)的片段。
2．如權(quán)利要求1的核酸序列，其中，所述核酸序列能在中等嚴(yán)格的條件下與(ⅰ)序列1、序列3、序列5、序列7或序列9所示核酸序列或(ⅱ)其任何互補(bǔ)鏈或片段雜交。
3．如權(quán)利要求2的核酸序列，其中，所述核酸序列能在中等嚴(yán)格的條件下與(ⅰ)序列3、序列5、序列7或序列9所示的核酸序列或(ⅱ)其任何互補(bǔ)鏈雜交。
4．如權(quán)利要求3的核酸序列，其中，所述核酸序列能在中等嚴(yán)格的條件下與序列1所示核酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交。
5．如權(quán)利要求3的核酸序列，其中，所述核酸序列能在中等嚴(yán)格的條件下與序列3所示核酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交。
6．如權(quán)利要求3的核酸序列，其中，所述核酸序列能在中等嚴(yán)格的條件下與序列5所示的核酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交。
7．如權(quán)利要求3的核酸序列，其中，所述核酸序列能在中等嚴(yán)格的條件下與序列7所示的核酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交。
8．如權(quán)利要求3的核酸序列，其中，所述核酸序列能在中等嚴(yán)格的條件下與序列9所示的核酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交。
9．如權(quán)利要求2的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種具有獲自犁頭霉屬的脂酶活性的多肽。
10．如權(quán)利要求9的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種具有獲自Absidia blakesleeala的脂酶活性的多肽。
11．如權(quán)利要求9的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種具有獲自傘枝犁頭霉的脂酶活性的多肽。
12．如權(quán)利要求9的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種具有獲自Absidia griseola的脂酶活性的多肽。
13．如權(quán)利要求9的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種具有獲自Absidia griseola var.iguchii的脂酶活性的多肽。
14．如權(quán)利要求9的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種具有獲自反射犁頭霉的脂酶活性的多肽。
15．如權(quán)利要求9的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種具有獲自Absidia sporophora-variabilis的脂酶活性的多肽。
16．如權(quán)利要求1的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列與序列2、序列4、序列6、序列8和序列10所示氨基酸序列的任一種或其片段的同一性至少為65％。
17．如權(quán)利要求16的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列與序列2、序列4、序列6、序列8和序列10所示氨基酸序列的任一種的同一性至少為70％。
18．如權(quán)利要求17的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列與序列2、序列4、序列6、序列8和序列10所示氨基酸序列的任一種的同一性至少為75％。
19．如權(quán)利要求18的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列與序列2、序列4、序列6、序列8和序列10所示氨基酸序列的任一種的同一性至少為80％。
20．如權(quán)利要求19的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列與序列2、序列4、序列6、序列8和序列10所示氨基酸序列的任一種的同一性至少為85％。
21．如權(quán)利要求20的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列與序列2、序列4、序列6、序列8和序列10所示氨基酸序列的任一種的同一性至少為90％。
22．如權(quán)利要求21的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列與序列2、序列4、序列6、序列8和序列10所示氨基酸序列的任一種的同一性至少為95％。
23．如權(quán)利要求22的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列與序列2所示氨基酸序列的同一性至少為95％。
24．如權(quán)利要求23的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列具有序列2所示的氨基酸序列。
25．如權(quán)利要求24的核酸序列，其中，所述核酸序列如序列1所示。
26．如權(quán)利要求22所示的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列與序列4所示氨基酸序列的同一性至少為95％。
27．如權(quán)利要求26的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列具有序列4所示氨基酸序列。
28．如權(quán)利要求27的核酸序列，其中，所述核酸序列如序列3所示。
29．如權(quán)利要求22的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列與序列6所示氨基酸序列的同一性至少為95％。
30．如權(quán)利要求29的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼序列6所示的氨基酸序列。
31．如權(quán)利要求30的核酸序列，其中，所述核酸如序列5所示。
32．如權(quán)利要求22的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列與序列8所示氨基酸序列的同一性至少為95％。
33．如權(quán)利要求32的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼序列8所示的氨基酸序列。
34．如權(quán)利要求33的核酸序列，其中，所述核酸序列如序列7所示。
35．如權(quán)利要求22的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列與序列10所示氨基酸序列的同一性至少為95％。
36．如權(quán)利要求35的核酸序列，其中，所述核酸序列編碼序列10所示的氨基酸序列。
37．如權(quán)利要求36的核酸序列，其中，所述核酸序列如序列9所示。
38．如權(quán)利要求1的核酸序列，其中，所述核酸序列是一種犁頭霉屬菌株的內(nèi)源序列，并且能在中等嚴(yán)格條件下與序列1所示核酸序列或其互序鏈雜交。
39．如權(quán)利要求1的核酸序列，它包括含于大腸桿菌NRRL B-21520中的質(zhì)粒pZL-NL1上的犁頭霉屬脂酶編碼核酸序列。
40．如權(quán)利要求1的核酸序列，它包括含于大腸桿菌NRRL B-21521中的質(zhì)粒pZL-NL61上的犁頭霉屬脂酶編碼核酸序列。
41．如權(quán)利要求1的核酸序列，它包括含于大腸桿菌NRRL B-21522中的質(zhì)粒pZL-NL95上的犁頭霉屬脂酶編碼核酸序列。
42．如權(quán)利要求1的核酸序列，它包括含于大腸桿菌NRRL B-21523中的質(zhì)粒pZL-NL124上的犁頭霉屬脂酶編碼核酸序列。
43．一種核酸構(gòu)建體，包括權(quán)利要求1所述的核酸序列，該序列可操縱地連接于能指導(dǎo)所述多肽在合適的表達(dá)宿主中表達(dá)的一個(gè)或幾個(gè)控制序列上。
44．一種重組表達(dá)載體，包括權(quán)利要求43所述的核酸構(gòu)建體、一個(gè)啟動(dòng)子、和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。
45．如權(quán)利要求44的載體，還包括一個(gè)選擇標(biāo)記。
46．一種重組宿主細(xì)胞，包括權(quán)利要求43的核酸構(gòu)建體。
47．如權(quán)利要求46的細(xì)胞，其中，所述核酸構(gòu)建體包含于一種載體上。
48．如權(quán)利要求46的細(xì)胞，其中，所述核酸構(gòu)建體被整合到所述宿主細(xì)胞基因組中。
49．如權(quán)利要求46的細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
50．如權(quán)利要求49的細(xì)胞，其中，所述細(xì)菌細(xì)胞是芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬或假單胞菌屬細(xì)胞。
51．如權(quán)利要求46的細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是一種真菌細(xì)胞。
52．如權(quán)利要求51的細(xì)胞，其中，所述真菌細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。
53．如權(quán)利要求52的細(xì)胞，其中，所述絲狀真菌細(xì)胞是小枝頂孢屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、梭孢殼屬、Tolypocladium屬或木霉屬菌種的細(xì)胞。
54．如權(quán)利要求46的細(xì)胞，其中，所述真菌細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
55．如權(quán)利要求54的細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞是假絲酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或Yarrowia屬菌種的細(xì)胞。
56．一種生產(chǎn)具有脂酶活性的多肽的方法，包括(a)在能誘導(dǎo)所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求46所述的宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼具有犁頭霉屬(Absidia)脂酶活性的多肽的分離的核酸序列。本發(fā)明還涉及包括所述核酸序列的核酸結(jié)構(gòu)、載體、和宿主細(xì)胞,以及生產(chǎn)所述多肽的方法。本發(fā)明還涉及含有所述多肽的組合物。
文檔編號(hào)C11D3/38GK1209842SQ97191850
公開日1999年3月3日 申請(qǐng)日期1997年1月21日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月24日
發(fā)明者R·M·伯卡, K·C·伯米納桑, T·桑達(dá)爾 申請(qǐng)人:諾沃諾爾迪斯克生物技術(shù)有限公司, 諾沃挪第克公司