生物活性植物化妝品組合物及其生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及來源于植物細(xì)胞汁的膜和細(xì)胞漿級(jí)分的生物活性植物化妝品組合物。本發(fā)明也涉及制備這些生物活性植物化妝品組合物的方法和這些組合物在多種化妝品制劑中的用途和作為局部皮膚化妝品應(yīng)用的用途。
【專利說明】生物活性植物化妝品組合物及其生產(chǎn)方法
與相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0001]此申請(qǐng)是在2008年5月7日提交的美國專利申請(qǐng)系列號(hào)12/116，924的部分繼續(xù)案，所述美國專利申請(qǐng)系列號(hào)12/116，924是在2003年I月24日提交的美國專利申請(qǐng)系列號(hào)10/351，910，在2008年10月28日公布的現(xiàn)在的美國專利號(hào)7，442，391的分案，所述美國專利號(hào)7，442，391要求在2002年I月25日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/351，886的優(yōu)先權(quán)益，其公開以其整體引入本文作為參考。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及生物活性植物化妝品組合物及其生產(chǎn)方法及其用途。
發(fā)明背景
[0003]在過去幾十年間，化妝品工業(yè)已接受在多種化妝品制劑和產(chǎn)品中使用植物和植物產(chǎn)品。盡管此趨勢(shì)預(yù)計(jì)將持續(xù)，就需要更精煉和質(zhì)量更高的植物成分，所述成分一致地展示對(duì)化妝品工業(yè)和消費(fèi)者有吸引力的特征。這些有吸引力的生物活性特征中的一些包括抗炎活性和抗氧化劑活性。著色、安全性、相容性和延長的貨架期也是來源于植物成分的化妝品制劑的有價(jià)值的特征。
[0004]化妝品工業(yè)已整體加強(qiáng)了對(duì)開發(fā)和銷售“天然”化妝品制劑的支持力度，所述化妝品制劑使用目前工業(yè)上現(xiàn)有的多種單一或摻合的植物成分。此方法與基于合成成分的方法不同，在于允許化妝品工業(yè)從原料成分開發(fā)具有一致的產(chǎn)品完整性、性能和保質(zhì)期的化妝品。使用植物成分的一大主要阻礙是成分，特別是有關(guān)生物活性植物成分的性能和穩(wěn)定性的不一致性?，F(xiàn)在使用的作為化妝品制劑成分的許多生物活性植物化妝品成分展示了效力喪失、氣味偏差、不想要的著色變深和不理想的沉淀。這些負(fù)面屬性增加了從生物活性植物成分制造的最終產(chǎn)品相關(guān)的微生物污染和增殖、穩(wěn)定性和安全性考慮的風(fēng)險(xiǎn)。
[0005]為了保證質(zhì)量、安全性和一致性，化妝品工業(yè)對(duì)用于化妝品制劑的所有引入原料已開發(fā)和實(shí)施了多種標(biāo)準(zhǔn)操作程序和嚴(yán)格的規(guī)范控制。大多數(shù)(如果不是全部)現(xiàn)有的植物提取物不能遵從化妝品工業(yè)日益增加的控制和一致性參數(shù)。目前的植物提取方法限制了產(chǎn)品規(guī)范參數(shù)，留下許多質(zhì)量、性能和相容性的可變窗口。另外，現(xiàn)有的提取方法不能傳遞在植物細(xì)胞內(nèi)存在的全部活性譜。因此，由于用于生物活性植物化妝品成分的提取方法的不足，不能實(shí)現(xiàn)基于植物的化妝品制劑的全部潛能。
[0006]用于從植物中提取生物活性成分的許多現(xiàn)有方法涉及對(duì)植物組織或?qū)υ摻M織中含有的目的生物活性成分，或?qū)Χ呔泻Φ募夹g(shù)。此外，許多現(xiàn)有的提取和分離方法得到含有生物或化學(xué)污染物的粗植物提取物，所述污染物能夠引起生物活性效力的喪失、增加的細(xì)胞毒性和縮短的貨架期。此外，為了得到更精煉的植物提取物，現(xiàn)有的提取方法經(jīng)常需要使用苛刻的化學(xué)溶劑。
[0007]因此，存在對(duì)用于提取生物活性植物組合物的方法的需要，所述方法保留組合物的生物活性并從不同批次中得到一致的產(chǎn)品。此外，在化妝品工業(yè)中需要能夠滿足有關(guān)貨架期、細(xì)胞毒性、質(zhì)量和性能的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的植物組合物。[0008]本發(fā)明涉及克服本領(lǐng)域的這些缺陷。
發(fā)明概述
[0009]本發(fā)明涉及生物活性植物化妝品組合物，其包括(I)來源于從新鮮植物生物質(zhì)提取的細(xì)胞汁的膜級(jí)分和(2)穩(wěn)定劑。膜級(jí)分具有抗蛋白水解活性，細(xì)胞生長抑制活性，和/或抗蛋白水解和細(xì)胞生長抑制活性。抗蛋白水解活性是由于至少一種蛋白酶的抑制，并且細(xì)胞生長抑制活性是由于至少一種細(xì)胞類型的增殖抑制。
[0010]本發(fā)明也涉及適于對(duì)哺乳動(dòng)物局部應(yīng)用的生物活性植物化妝品制劑。所述生物活性植物化妝品制劑包括化妝可用的載體和化妝有效量的上述生物活性植物化妝品組合物。 [0011]本發(fā)明也涉及抑制哺乳動(dòng)物皮膚組織中的抗炎活性的方法。此方法涉及對(duì)皮膚組織應(yīng)用有效增強(qiáng)皮膚組織中的抗蛋白水解活性的量的上述生物活性植物化妝品組合物。
[0012]本發(fā)明也涉及使哺乳動(dòng)物皮膚組織中的細(xì)胞紊亂正常化的方法。此方法涉及對(duì)皮膚組織應(yīng)用有效抑制不想要的皮膚細(xì)胞過度增殖的量的上述生物活性植物化妝品組合物。
[0013]本發(fā)明也涉及制備生物活性植物化妝品組合物的方法，其涉及提供已從新鮮植物生物質(zhì)提取的植物細(xì)胞汁。然后在有效將其分離為膜級(jí)分和細(xì)胞汁上清的條件下處理植物細(xì)胞汁。在有效得到穩(wěn)定的生物活性植物化妝品組合物的條件下轉(zhuǎn)化膜級(jí)分，所述生物活性植物化妝品組合物展示抗蛋白水解，細(xì)胞生長抑制活性，和/或抗蛋白水解和細(xì)胞生長抑制活性，其中抗蛋白水解活性是由于至少一種蛋白酶的抑制，并且細(xì)胞生長抑制活性是由于至少一種細(xì)胞類型的增殖抑制。
[0014]本發(fā)明也涉及由上面剛剛描述的方法制備的生物活性植物化妝品組合物。
[0015]本發(fā)明也涉及適于對(duì)哺乳動(dòng)物局部應(yīng)用的生物活性植物化妝品制劑。所述制劑包括化妝可用的載體和化妝有效量的上面剛剛描述的生物活性植物化妝品組合物。
[0016]本發(fā)明也涉及抑制哺乳動(dòng)物皮膚組織中的抗炎活性的方法，所述方法通過對(duì)皮膚組織應(yīng)用有效增強(qiáng)皮膚組織中的抗蛋白水解活性的量的上述生物活性植物化妝品組合物。
[0017]本發(fā)明還涉及使哺乳動(dòng)物皮膚組織中的細(xì)胞紊亂正常化的方法，涉及對(duì)皮膚組織應(yīng)用有效抑制不想要的皮膚細(xì)胞過度增殖的量的具有細(xì)胞生長抑制活性的生物活性植物化妝品組合物。
[0018]本發(fā)明也涉及包含由上述方法制備的膜級(jí)分的生物活性植物化妝品組合物。
[0019]本發(fā)明也涉及生物活性植物化妝品組合物，其包括(I)來源于從新鮮植物生物質(zhì)提取的細(xì)胞汁的細(xì)胞漿(cell serum)級(jí)分，其中所述細(xì)胞漿級(jí)分具有抗氧化劑活性，細(xì)胞生長刺激活性，和/或抗氧化劑和細(xì)胞生長刺激活性，和(2)穩(wěn)定劑。所述細(xì)胞生長刺激活性是由于至少一種細(xì)胞類型的增殖刺激。
[0020]本發(fā)明也涉及適于對(duì)哺乳動(dòng)物局部應(yīng)用的生物活性植物化妝品制劑，其包括化妝可用的載體和化妝有效量的上面剛剛描述的生物活性植物化妝品組合物。
[0021]本發(fā)明還涉及增強(qiáng)哺乳動(dòng)物皮膚組織中的抗氧化劑活性的方法，所述方法涉及對(duì)哺乳動(dòng)物皮膚組織應(yīng)用有效增加皮膚組織中的抗氧化劑活性的量的上述生物活性植物化妝品制劑。
[0022]本發(fā)明也涉及刺激哺乳動(dòng)物皮膚組織中的細(xì)胞增殖的方法，所述方法涉及對(duì)皮膚組織應(yīng)用有效刺激皮膚組織中的成纖維細(xì)胞的增殖的量的上述生物活性植物化妝品制劑。
[0023]本發(fā)明也涉及制備生物活性植物化妝品組合物的方法，所述方法涉及提供已從新鮮植物生物質(zhì)提取的植物細(xì)胞汁。然后在有效將其分離為膜級(jí)分和細(xì)胞汁上清的條件下處理植物細(xì)胞汁。在有效將細(xì)胞汁上清分離為細(xì)胞質(zhì)級(jí)分和細(xì)胞漿級(jí)分的條件下加工細(xì)胞汁上清。在有效得到細(xì)胞漿級(jí)分濾液的條件下精煉細(xì)胞漿級(jí)分。在有效得到穩(wěn)定生物活性植物化妝品組合物的條件下穩(wěn)定細(xì)胞漿級(jí)分濾液，所述生物活性植物化妝品組合物展示抗氧化劑活性，細(xì)胞生長刺激活性，或抗氧化劑和細(xì)胞生長刺激活性。
[0024]本發(fā)明也涉及由上面剛剛描述的方法制備的穩(wěn)定的生物活性植物化妝品組合物。
[0025]本發(fā)明也涉及適于對(duì)哺乳動(dòng)物局部應(yīng)用的生物活性植物化妝品制劑，其包括化妝可用的載體和化妝有效量的由上述方法制備的生物活性植物化妝品組合物。
[0026]本發(fā)明也涉及增強(qiáng)哺乳動(dòng)物皮膚組織中的抗氧化劑活性的方法。此方法涉及對(duì)皮膚組織應(yīng)用有效增加皮膚組織中的抗氧化劑活性的量的上述生物活性植物化妝品組合物。
[0027]本發(fā)明還涉及刺激哺乳動(dòng)物皮膚組織中的細(xì)胞增殖的方法。此方法涉及對(duì)皮膚組織應(yīng)用有效刺激皮膚組織中的成纖維細(xì)胞的增殖的量的上述生物活性植物化妝品組合物。
[0028]用于制備生物活性植物化妝品組合物的方法相比現(xiàn)有方法的優(yōu)勢(shì)在于，其得到的植物提取物捕獲了植物細(xì)胞中含有的全部活性譜。然后能夠?qū)⑦@些提取物分離為細(xì)胞漿或膜組分，同時(shí)仍然保持每種組分內(nèi)含有的生物活性。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的組合物具有比其他傳統(tǒng)植物提取物可證明的對(duì)皮膚更安全的細(xì)胞毒性譜。另外，本發(fā)明的組合物滿足化妝品工業(yè)的微 生物要求。因此，由于一致性、質(zhì)量、安全性、貨架期和有關(guān)抗炎和抗氧化劑能力的顯著的生物活性效力，本發(fā)明的生物活性植物化妝品組合物是現(xiàn)有的植物化妝品成分的顯著改進(jìn)。
[0029]本發(fā)明的生物活性植物化妝品組合物展示了對(duì)化妝品工業(yè)有價(jià)值的抗炎和抗氧化劑活性。此外，生物活性植物化妝品組合物的細(xì)胞毒性譜符合化妝品成分的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，并展示了作為局部皮膚化妝品有利水平的細(xì)胞增殖刺激活性和一定的細(xì)胞生長抑制活性。本發(fā)明的制備生物活性植物化妝品成分的方法可用于多種植物以得到一致、穩(wěn)定和高質(zhì)量的生物活性植物化妝品組合物。
[0030]本發(fā)明的生物活性植物化妝品組合物滿足有關(guān)化妝品原料成分的微生物要求的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求所有活性和非活性成分(即化妝品制劑的所有賦形劑)不是其在化妝品產(chǎn)品的完成的制劑組合物中的貢獻(xiàn)。通常，這些完成的制劑組合物具有防腐系統(tǒng)，所述系統(tǒng)預(yù)防可能對(duì)產(chǎn)品的完整性有風(fēng)險(xiǎn)的微生物污染。在檢測(cè)防腐系統(tǒng)的保護(hù)強(qiáng)度的一個(gè)工業(yè)使用標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行28天的挑戰(zhàn)試驗(yàn)，在此期間在產(chǎn)品中接種微生物，觀察所述產(chǎn)品是否經(jīng)受住這些處理，不被污染。另外，在化妝品工業(yè)中，詳細(xì)檢查每種成分以確保微生物水平不過高以至于當(dāng)產(chǎn)品沒有最佳保藏時(shí)導(dǎo)致產(chǎn)品后續(xù)污染或?qū)Ξa(chǎn)品的貨架期構(gòu)成危險(xiǎn)。
[0031]特別地，工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)學(xué)“在化妝品領(lǐng)域中活性成分的微生物要求規(guī)定，可接受每克或每毫升最高100個(gè)微生物的總微生物計(jì)數(shù)。此外樣品(IOg)必須不含大腸桿菌(Escherichia col i)、白色念珠菌(Candida albicans)、假單胞菌屬物種(Pseudomonas sp.)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ”(G.A.Nowak,“CosmeticPreparations, ” Verlag fur Chem.，Augsburg, 1: 126 (1985),其全部公開內(nèi)容引入本文作為參考)。本發(fā)明的生物活性植物化妝品組合物滿足上述要求，并且因此對(duì)完成的化妝品制劑組合物不構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)。[0032]本發(fā)明的生物活性植物化妝品組合物具有高度有價(jià)值的關(guān)于皮膚的生物活性屬性，包括，例如抗炎和抗氧化劑活性，以及細(xì)胞增殖刺激特征。眾所周知，在新生和死亡的皮膚細(xì)胞之間存在平衡。在年輕和健康的皮膚中可見皮膚的最佳狀態(tài)(即通常在年齡25歲以下的人中可見)。在此年齡以前，皮膚細(xì)胞處于調(diào)控狀態(tài)并處于良好平衡的更新系統(tǒng)；從最深的基底層長出，并最終增殖(即，從皮膚深層上升)至頂部(即我們?nèi)庋劭梢姷膶?。此細(xì)胞流出的平衡是更新平衡的一部分。隨著成年人的衰老此平衡喪失，在新細(xì)胞長出后增殖速率變慢。增加或刺激細(xì)胞增殖的概念是基于恢復(fù)在“較年輕”皮膚中可見的最佳平衡。這已導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞增殖刺激物例如類視黃醇和ΑΗΑ(α-羥基酸)的關(guān)注。這些成分基本上通過刺激作用模式增加增殖率，由于加速的細(xì)胞增殖導(dǎo)致更平滑、看起來更年輕的皮膚。本發(fā)明的生物活性植物化妝品組合物，特別是來源于細(xì)胞漿級(jí)分的組合物，展示了刺激細(xì)胞增殖的能力。[0033]在更復(fù)雜的方式中，增加的皮膚增殖是傷口愈合和皮膚病況的關(guān)鍵。在某些皮膚病況中，皮膚增殖傾向于過度增殖狀態(tài)。這些病況近似并發(fā)展為疾病態(tài)，使其自身在皮膚上顯現(xiàn)。例如牛皮蘚、濕疹和頭皮屑的病況都是過度增殖的病癥。于是，皮膚細(xì)胞生長抑制劑是明顯和建議的減緩增殖速率的方法，以使速率正?；?。多種本發(fā)明的生物活性植物化妝品組合物，特別是來源于膜級(jí)分的組合物展示了這些細(xì)胞抑制屬性。
[0034]許多原因?qū)е缕つw上出現(xiàn)炎癥。這通常與損傷有關(guān)，現(xiàn)在專家們開始理解微炎癥(micro-1nflammation)的級(jí)聯(lián)效應(yīng)。皮膚的此微炎癥能夠由刺激性成分例如肥阜和細(xì)胞毒性成分，普通的紫外光例如最低限度的陽光，和在更激烈的方式下由強(qiáng)烈暴露于陽光導(dǎo)致。最近，炎癥在皮膚衰老中的作用已被更清楚地理解并提示為形成自由基的間接途徑，自由基的作用明確涉及膜脂氧化。因此，抗炎劑是重要的化妝品成分，但監(jiān)管限制將其限制為作為藥物使用。然而，本發(fā)明的生物活性植物化妝品組合物，特別是來源于膜級(jí)分的組合物，展示了抗炎屬性。
[0035]抗氧化劑的作用對(duì)營養(yǎng)和化妝品產(chǎn)品已變得越來越重要?？寡趸瘎┭舆t、防御和幫助修復(fù)氧化降解的不利影響。在植物界中，大自然已提供了防御多種氧化因素的天然抗氧化劑。本發(fā)明的生物活性植物化妝品組合物，特別是來源于細(xì)胞漿級(jí)分的組合物，證明了這些抗氧化劑活性。
附圖簡(jiǎn)述
[0036]圖1是示意圖，其說明了用于制備本發(fā)明的生物活性植物化妝品組合物的方法的一個(gè)實(shí)施方案。
發(fā)明詳述
[0037]本發(fā)明涉及來源于植物的膜級(jí)分或細(xì)胞漿級(jí)分的生物活性植物化妝品組合物。本文中使用的術(shù)語“膜來源的化妝品組合物”一般指來源于植物的膜級(jí)分的本發(fā)明的生物活性植物化妝品組合物。術(shù)語“漿來源的化妝品組合物” 一般指來源于植物的細(xì)胞漿級(jí)分的本發(fā)明的生物活性植物化妝品組合物。
[0038]本發(fā)明也涉及用于生產(chǎn)本發(fā)明的生物活性植物化妝品組合物的方法，以及使用組合物的方法。
膜來源的化妝品組合物
[0039]本發(fā)明的膜來源的化妝品組合物包括(I)來源于從新鮮植物生物質(zhì)提取的細(xì)胞汁的膜級(jí)分和(2)穩(wěn)定劑。膜級(jí)分具有抗蛋白水解活性，細(xì)胞生長抑制活性，和/或抗蛋白水解和細(xì)胞生長抑制活性。抗蛋白水解活性是由于至少一種蛋白酶的抑制，并且細(xì)胞生長抑制活性是由于至少一種細(xì)胞類型的增殖抑制。適用于本發(fā)明的穩(wěn)定劑的實(shí)例包括乳化劑、防腐劑、抗氧化劑、聚合物及其混合物。 [0040]在本發(fā)明的一個(gè)方面，膜來源的化妝品組合物具有針對(duì)例如絲氨酸蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶的蛋白酶組的抗蛋白水解活性。絲氨酸蛋白酶的實(shí)例包括嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和胰蛋白酶抑制劑。基質(zhì)金屬蛋白酶的實(shí)例是明膠酶B。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，蛋白酶的抑制是可逆的。因?yàn)榻z氨酸蛋白酶在以受控水平存在時(shí)具有某些積極生理作用，使用可逆抑制劑將不影響這些正常的酶促功能。可逆抑制將不會(huì)引起不可逆抑制劑能夠?qū)е碌膶?duì)防御和修飾機(jī)制不理想的長期修飾。
[0041]本發(fā)明的膜來源的化妝品組合物具有范圍為約0.1和約25.0 μ g干物質(zhì)/ml之間的IC5tl值的抗蛋白水解效力。在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語“IC5(I值”代表實(shí)現(xiàn)50%的蛋白酶抑制所需的在膜級(jí)分中含有的干物質(zhì)濃度。
[0042]本發(fā)明的膜來源的化妝品組合物具有范圍為約25和500 μ g干物質(zhì)/ml之間的NRU50值的細(xì)胞生長抑制活性效力。在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語“NRU5(i值”代表將細(xì)胞類型的活力降低至50%所需的膜級(jí)分中的干物質(zhì)濃度。由于膜來源的化妝品組合物的增殖抑制的細(xì)胞類型的實(shí)例是成纖維細(xì)胞。
[0043]本發(fā)明的膜來源的化妝品組合物可來源于所有植物類型的膜級(jí)分。可用作本發(fā)明中新鮮植物生物質(zhì)源的合適的植物的實(shí)例包括來自以下科的植物:菊科、豆科、唇形科和禾本科。特別地，已經(jīng)過檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)適于作為新鮮植物生物質(zhì)源的具體植物的實(shí)例包括，但不限于，紅車軸草(Trifolium pratense)、蓮(Nelumbo nucifera)、金蓋花(Calendulaofficinalis)、紫花苜猜(Medicago sativa)、薰衣草(Lavandula angustifolia)、鼠尾草(Salvia officinalis)和大麥(Hordeum vulgare)。膜來源的化妝品組合物可來源于植物的花組織(例如，紅車軸草、蓮、金盞花)和/或來源于葉和莖組織(例如，紅車軸草、蓮、鼠尾草)。
[0044]在一個(gè)實(shí)施方案中，來源于植物細(xì)胞汁的膜級(jí)分構(gòu)成膜來源的化妝品組合物的約0.5和約95之間的重量百分比。
[0045]本發(fā)明的膜來源的化妝品組合物能夠具有以下具體物理化學(xué)值:(1)約0.1和30%之間的非揮發(fā)性殘留物值；⑵約0.5和2.0g/cm3之間的比重值；(3)約300和50，OOOcps之間的粘度值；和(4)約2.5和9.5之間的pH值。
[0046]本發(fā)明也涉及適于對(duì)包括人的哺乳動(dòng)物局部應(yīng)用的生物活性植物化妝品制劑，其中所述制劑包括化妝可用的載體和化妝有效量的膜來源的化妝品組合物。用于本發(fā)明的合適的化妝可用載體的實(shí)例包括親水霜基底、親水乳液基底、親水表面活性劑基底、疏水霜基底、疏水乳液基底，和疏水表面活性劑基底。在制劑的一個(gè)實(shí)施方案中，膜來源的化妝品組合物以范圍為制劑總重量的約0.001%和約90%之間的量存在。
[0047]本發(fā)明也涉及抑制哺乳動(dòng)物皮膚組織中的抗炎活性的方法，所述方法涉及對(duì)皮膚組織應(yīng)用有效增強(qiáng)皮膚組織中的抗蛋白水解活性的量的膜來源的化妝品組合物。
[0048]本發(fā)明也涉及使哺乳動(dòng)物皮膚組織中的細(xì)胞紊亂正常化的方法。此方法涉及對(duì)皮膚組織應(yīng)用有效抑制不想要的皮膚細(xì)胞過度增殖的量的膜來源的化妝品組合物。漿來源的化妝品組合物
[0049]本發(fā)明的漿來源的化妝品組合物包括(I)來源于從新鮮植物生物質(zhì)提取的細(xì)胞汁的細(xì)胞漿級(jí)分，其中所述細(xì)胞漿級(jí)分具有抗氧化劑活性，細(xì)胞生長刺激活性，和/或抗氧化劑和細(xì)胞生長刺激活性，和(2)穩(wěn)定劑。所述細(xì)胞生長刺激活性是由于至少一種細(xì)胞類型的增殖刺激。適用于本發(fā)明的穩(wěn)定劑的實(shí)例包括防腐劑和抗氧化劑。用于本發(fā)明的合適的防腐劑包括山梨酸鉀、苯甲酸鈉、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉和檸檬酸。用于本發(fā)明的合適的抗氧化劑的實(shí)例是偏亞硫酸氫鈉。
[0050]在一個(gè)實(shí)施方案中，漿來源的化妝品組合物的抗氧化劑活性包括超氧化物清除活性和中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)抑制活性。漿來源的化妝品組合物具有范圍為約50和190 μ g干物質(zhì)/ml之間的ICR5tl值的超氧化物清除效力。在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語“ ICR50值”代表抑制50%的細(xì)胞色素C還原所需的在細(xì)胞漿級(jí)分中含有的干物質(zhì)的濃度。細(xì)胞漿來源的化妝品成分具有范圍為約1.0和125 μ g干物質(zhì)/ml之間的細(xì)胞生長刺激效力和約110和190%之間的NRU值，其中“NRU值”代表細(xì)胞活力。漿來源的化妝品組合物以約1.0和5.0 μ g干物質(zhì)/ml之間抑制呼吸爆發(fā)，并以約120和180 μ g干物質(zhì)/ml之間刺激呼吸爆發(fā)。漿來源的化妝品組合物具有引起呼吸爆發(fā)的雙相調(diào)節(jié)的能力，所述呼吸爆發(fā)來自佛波醇十四酸酯乙酸酯(phorbol myristate acetate)刺激的中性粒細(xì)胞。
[0051 ] 由于漿來源的化妝品組合物被刺激增殖的細(xì)胞類型的實(shí)例包括成纖維細(xì)胞。
[0052]本發(fā)明的漿來源的化妝品組合物可來源于所有植物類型的細(xì)胞漿級(jí)分。可用作本發(fā)明中新鮮植物生物質(zhì) 源的合適植物的實(shí)例包括來自以下科的植物:菊科、豆科、唇形科和禾本科。特別地，已經(jīng)過檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)適于作為新鮮植物生物質(zhì)來源的具體植物的實(shí)例包括，但不限于，紅車軸草、蓮、金盞花、紫花苜蓿、薰衣草、鼠尾草和大麥。漿來源的化妝品組合物可來源于植物的花組織(例如，紅車軸草、蓮、金盞花)和/或來源于葉和莖組織(例如，紅車軸草、蓮、大麥、薰衣草、紫花苜蓿和鼠尾草)。
[0053]在一個(gè)實(shí)施方案中，來源于植物細(xì)胞汁的細(xì)胞漿級(jí)分構(gòu)成漿來源的化妝品組合物的約I和約10之間的重量百分比。
[0054]本發(fā)明也涉及適于對(duì)哺乳動(dòng)物局部應(yīng)用的生物活性植物化妝品制劑，其包括化妝可用的載體和化妝有效量的漿來源的化妝品組合物。合適的化妝可用載體的實(shí)例包括，但不限于親水霜基底、親水乳液基底、親水表面活性劑基底、疏水霜基底、疏水乳液基底和疏水表面活性劑基底。在一個(gè)實(shí)施方案中，漿來源的化妝品組合物以范圍為化妝品制劑總重量的約0.001%和95%之間的量存在。
[0055]本發(fā)明還涉及增強(qiáng)哺乳動(dòng)物皮膚組織中的抗氧化劑活性的方法，其包括對(duì)皮膚組織應(yīng)用有效增加皮膚組織中的抗氧化劑活性的量的漿來源的化妝品組合物。
[0056]本發(fā)明也涉及刺激哺乳動(dòng)物皮膚組織中的細(xì)胞增殖的方法，其包括對(duì)皮膚組織應(yīng)用有效刺激皮膚組織中的細(xì)胞增殖的量的漿來源的化妝品組合物。
制備生物活性植物化妝品組合物的全過程
[0057]通過示例，下面參考圖1描述制備本發(fā)明的生物活性植物化妝品組合物的全過程。如圖1所示，收獲、收集和洗滌新鮮植物2以得到新鮮植物生物質(zhì)。對(duì)此新鮮植物生物質(zhì)進(jìn)行研磨、浸潰和沖壓4以得到植物細(xì)胞汁6和濾餅(preSS-Cake)8。然后使植物細(xì)胞汁6過濾通過尼龍網(wǎng)布10以得到經(jīng)過濾的植物細(xì)胞汁12。將經(jīng)過濾的植物細(xì)胞汁12暴露于微波處理14以凝結(jié)植物細(xì)胞汁12。冷卻凝結(jié)的植物細(xì)胞汁16，然后對(duì)其進(jìn)行離心18以得到膜級(jí)分20和植物細(xì)胞汁上清30。如下所述，使用膜級(jí)分20制備膜來源的生物活性植物化妝品組合物28 ( 即，膜來源的化妝品組合物)。如下所述，使用植物細(xì)胞汁上清30制備細(xì)胞漿來源的生物活性植物化妝品組合物52 (即，漿來源的化妝品組合物)。
[0058]為了生產(chǎn)生物活性植物化妝品組合物28，將膜級(jí)分20摻入聚合物基質(zhì)22并用制備的聚合物、防腐劑和抗氧化劑穩(wěn)定24。然后中和穩(wěn)定的膜級(jí)分26以得到膜來源的生物活性植物化妝品組合物28。
[0059]為了生產(chǎn)生物活性植物化妝品組合物52，對(duì)植物細(xì)胞汁上清30進(jìn)行等電沉淀32以得到含有細(xì)胞質(zhì)級(jí)分36和細(xì)胞漿級(jí)分38的混合物。為了從細(xì)胞質(zhì)級(jí)分36中分離細(xì)胞漿級(jí)分38，對(duì)混合物進(jìn)行離心34。然后對(duì)細(xì)胞漿級(jí)分38進(jìn)行微波處理以引起凝結(jié)42。依賴于植物來源，在微波處理前，首先調(diào)節(jié)細(xì)胞漿級(jí)分38的pH。在凝結(jié)42后，然后冷卻混合物44，接著過濾46以得到細(xì)胞漿濾液48。用防腐劑和抗氧化劑穩(wěn)定50細(xì)胞漿濾液48以得到細(xì)胞漿來源的生物活性植物化妝品組合物52。
制備膜來源的化妝品組合物的方法
[0060]在一個(gè)實(shí)施方案中，制備膜來源的化妝品組合物的方法如下。此方法涉及提供已從新鮮植物生物質(zhì)提取的植物細(xì)胞汁。然后在有效將其分離為膜級(jí)分和細(xì)胞汁上清的條件下處理植物細(xì)胞汁。得到的膜級(jí)分具有抗蛋白水解活性，細(xì)胞生長抑制活性，或抗蛋白水解和細(xì)胞生長抑制活性。然后在有效得到穩(wěn)定的生物活性植物化妝品組合物的條件下轉(zhuǎn)化膜級(jí)分，所述生物活性植物化妝品組合物展示抗蛋白水解，細(xì)胞生長抑制活性，或抗蛋白水解和細(xì)胞生長抑制活性，其中抗蛋白水解活性是由于至少一種蛋白酶的抑制，并且細(xì)胞生長抑制活性是由于至少一種細(xì)胞類型的細(xì)胞生長的抑制。
[0061 ] 植物細(xì)胞汁可從所有植物類型提取?？捎米鞅景l(fā)明中新鮮植物生物質(zhì)源的合適植物的實(shí)例包括但不限于來自以下科的植物:菊科、豆科、唇形科和禾本科。特別地，已經(jīng)過檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)適于作為新鮮植物生物質(zhì)源的具體植物的實(shí)例包括，但不限于，紅車軸草、蓮、金盞花、紫花苜蓿、薰衣草、鼠尾草和大麥?？墒褂弥参锏亩喾N部分。例如，可使用許多植物類型的莖和葉組織。對(duì)其他植物，可使用花作為用于本發(fā)明的植物細(xì)胞汁源。例如，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案使用紅車軸草、蓮或金盞花的花組織用于植物細(xì)胞汁的提取。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用紅車軸草、蓮或鼠尾草的葉和莖組織。
[0062]可使用多種提取技術(shù)提取植物細(xì)胞汁。然而，所述提取技術(shù)應(yīng)得到保存植物的生物活性組分的植物細(xì)胞汁。
[0063]制備用于提取植物細(xì)胞汁的植物生物質(zhì)的示例方法涉及收獲、收集和洗滌新鮮植物。用于制備新鮮植物生物質(zhì)的適于遵循的步驟包括，例如下述步驟:(1)保存植物細(xì)胞的內(nèi)在水分含量；(2)優(yōu)化在收獲地上植物組織期間使用的切割高度；(3)在收獲期間(例如，在切割地上植物組織期間)保留植物的完整性；(4)使植物生物質(zhì)生物降解的環(huán)境影響和時(shí)間因素最小化；和(5)在加工前(例如，在研磨和浸潰前)清潔植物生物質(zhì)。下面討論這些步驟的每一個(gè)。
[0064]保存內(nèi)在水分含量:進(jìn)行的切割應(yīng)避免由于水分損失的萎蔫。最佳條件是維持和保存天然水分含量的條件。
[0065]最佳和優(yōu)選的切割高度:應(yīng)在地上至少若干厘米處切割植物，以限制在收集的生物質(zhì)中的土壤和其他殘?jiān)牧?。例如，可在大于或等于地?厘米的高度處切割任意給定植物源(例如，紫花苜蓿、大麥、薰衣草或鼠尾草)的所有可用的葉和莖生物質(zhì)。如果使用花組織作為植物生物質(zhì)源，在提取植物細(xì)胞汁前從整株植物上分離花。
[0066]在收獲期間保存植物完整性:可通過切割植物的地上莖和葉組織收獲植物生物質(zhì)。以避免或最小化切碎、搗碎、壓碎或其他類型植物損傷的方式進(jìn)行切割。在由于所需設(shè)備類型不可能避免切碎的大規(guī)模工業(yè)收獲中，小心地使能夠?qū)е略谑占闹参镏械奈⑸锷L、水分損失、氧化、聚合、異構(gòu)化和水解過程(即，不想要的分解代謝過程)加劇的損傷最小化。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過手工切割和收集薰衣草和鼠尾草全植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用收獲設(shè)備切割紫花苜蓿和大麥組織。在該情況下，每種植物的最低地上切割高度大于或等于5厘米。此外，在切割期間和切割后特別注意使損傷最小化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過手工收集金盞花全植物，然后分離花用于進(jìn)一步加工。
[0067]使降解的環(huán)境影響和時(shí)間因素最小化:應(yīng)使切割的植物材料至加工設(shè)施的遞送時(shí)間和生物質(zhì)在陽光、高溫和其他負(fù)面環(huán)境因素下的暴露最小化，以避免上述不想要的降解過程。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，紫花苜蓿和大麥從切割時(shí)到進(jìn)一步加工的遞送時(shí)間不超過30分鐘。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)經(jīng)歷長距離運(yùn)輸?shù)闹参镞M(jìn)行切割后程序，所述切割后程序涉及立即將植物生物質(zhì)置于含有冷凍凝膠包裝的袋子的泡沫聚苯乙烯冷卻器中，以幫助在過夜遞送至加工設(shè)施期間維持新鮮和天然水分含量。對(duì)來自薰衣草、金盞花和鼠尾草的植物生物質(zhì) 進(jìn)行這些程序。也可使用實(shí)現(xiàn)上述效果的其他切割后程序。
[0068]在研磨和浸潰前的清潔步驟:一旦收獲了植物組織，就進(jìn)行在進(jìn)一步加工前的洗滌步驟以去除土壤顆粒和來自植物的其他殘?jiān)?。在避免引起?xì)胞汁從生物質(zhì)釋放，導(dǎo)致?lián)p傷，或去除有價(jià)值的組分的條件下使用短時(shí)間的低壓沖洗完成洗滌。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用小于或等于lkg/cm2的水壓在少于或等于5分鐘內(nèi)完成植物生物質(zhì)的洗滌。殘留水洗不合任何綠色或黃色的色素，這表明沒有隨后的損傷。從經(jīng)洗滌的生物質(zhì)中去除過量的水以維持干物質(zhì)含量接近天然水平。
[0069]在如上述收獲了植物組織生物質(zhì)后，進(jìn)行植物組織生物質(zhì)的進(jìn)一步加工以得到植物細(xì)胞汁。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)收獲的植物組織生物質(zhì)進(jìn)行研磨、浸潰和沖壓以提取細(xì)胞內(nèi)含物，即，細(xì)胞汁，和以將其與主要含有細(xì)胞壁的富含纖維的壓濾餅分離。
[0070]合適的加工方案的實(shí)例涉及下述步驟。可使用錘式粉碎機(jī)研磨植物以在短時(shí)間內(nèi)得到小尺寸的植物組織顆粒而不顯著增加生物質(zhì)的溫度。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用改良的錘式粉碎機(jī)在少于或等于10秒的處理時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生最大尺寸小于或等于0.5厘米的經(jīng)浸潰的植物顆粒，其中生物質(zhì)溫度的增加小于或等于5 V。
[0071]如上所述，使經(jīng)磨碎和浸潰的植物生物質(zhì)的暴露最小化以避免不想要的分解代謝過程的影響。在植物生物質(zhì)的研磨和浸潰后盡可能快地開始植物細(xì)胞汁的提取及其與壓濾餅的分離。在短時(shí)間內(nèi)加工植物生物質(zhì)而不顯著增加溫度。在一個(gè)實(shí)施方案中，在研磨和浸潰后立即使用水平連續(xù)螺旋壓力機(jī)(Compact Press “CP-6”,Vincent Corporation,FL)沖壓植物生物質(zhì)。圓錐體上的壓力維持在24kg/cm2的水平，螺桿轉(zhuǎn)速為12rpm，溫度增加小于或等于5°C。
[0072]最初的細(xì)胞汁通常含有小纖維顆粒，所述顆粒能夠吸收有價(jià)值的細(xì)胞汁組分并堵塞軟管和泵。應(yīng)通過過濾或低速離心去除上述顆粒。例如，在本發(fā)明的方法中使用植物細(xì)胞汁以前，使在沖壓步驟后產(chǎn)生的最初的細(xì)胞汁過濾通過四層尼龍纖維。
[0073]一旦提取了植物細(xì)胞汁，就在下述過程中處理植物細(xì)胞汁，所述過程涉及(I)進(jìn)行“膜級(jí)分凝結(jié)步驟”以得到凝結(jié)的細(xì)胞汁混合物和(2)對(duì)凝結(jié)的細(xì)胞汁混合物進(jìn)行“膜級(jí)分分離步驟”以得到膜級(jí)分和細(xì)胞汁上清。在一個(gè)實(shí)施方案中，膜級(jí)分凝結(jié)步驟包括使細(xì)胞汁去穩(wěn)定化以得到凝結(jié)的細(xì)胞汁混合物。可使用多種去穩(wěn)定化技術(shù)實(shí)現(xiàn)去穩(wěn)定化，包括例如，溫度處理、電膜處理和化學(xué)處理。用于本發(fā)明的合適的溫度處理可包括(I)將細(xì)胞汁提取物加熱至誘導(dǎo)膜級(jí)分凝結(jié)所需的處理溫度(例如，至約45和70攝氏度之間的溫度)和
(2)將細(xì)胞汁冷卻至有效允許從所述細(xì)胞汁上清中進(jìn)一步定量分離所述膜級(jí)分的溫度(例如，至約30至45攝氏度的溫度)。在實(shí)現(xiàn)去穩(wěn)定化后，進(jìn)行膜級(jí)分的分離步驟。此步驟包括，例如，使用包括過濾和離心的分離技術(shù)將凝結(jié)的細(xì)胞汁混合物分離為膜級(jí)分和細(xì)胞汁上清。
[0074]在本領(lǐng)域中通常稱作“蛋白質(zhì)-維生素濃縮物”的新鮮得到的膜級(jí)分是具有植物原料來源特異性的濃郁顏色和特定氣味的糊劑。膜級(jí)分主要由植物綠色部分中存在的葉綠體或大多由花中存在的有色體為代表。膜級(jí)分的組成主要包括磷脂、膜蛋白、葉綠素和類胡蘿卜素。膜級(jí)分的干燥導(dǎo)致利用膜級(jí)分作為化妝品成分所需的許多有價(jià)值的性能的不可逆喪失。如果不干燥，不穩(wěn)定的膜級(jí)分則迅速轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)烈和非特征氣味的深色不可分散和不溶的聚集物。因此，這些材料不可用作化妝品成分。下面描述的程序允許將新鮮得到的膜級(jí)分轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定和活性的化妝品成分。
[0075]—旦從細(xì)胞汁上清中分離膜級(jí)分，就在膜級(jí)分聚集前對(duì)膜級(jí)分進(jìn)行制劑過程，所述過程包括以下步驟:(I)進(jìn)行“穩(wěn)定化步驟”以得到經(jīng)穩(wěn)定化的膜級(jí)分組分；(2)對(duì)經(jīng)穩(wěn)定化的膜級(jí)分組分進(jìn)行“聚合物基質(zhì)摻入步驟”以得到膜級(jí)分基質(zhì)；和(3)對(duì)膜級(jí)分基質(zhì)進(jìn)行“中和步驟”以得到本發(fā)明的膜來源的化妝品組合物。
[0076]在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定化步驟包括混合非離子型乳化劑和至少一種抗氧化劑以及膜級(jí)分以得到經(jīng)穩(wěn)定化的膜級(jí)分組分。在聚合物基質(zhì)摻入步驟中，將經(jīng)穩(wěn)定化的膜級(jí)分組分摻入聚合物基質(zhì)以得到膜級(jí)分基質(zhì)。用于本發(fā)明的合適的聚合物包括，例如，至少一種聚合物乳化劑和至少一種防腐劑。然后對(duì)膜級(jí)分基質(zhì)進(jìn)行中和步驟，所述步驟包括調(diào)節(jié)膜級(jí)分基質(zhì)的pH至2.5和6.5之間的范圍，得到在本申請(qǐng)中描述的膜來源的化妝品組合物。
[0077]在另一個(gè)實(shí)施方案中，如下進(jìn)行膜來源的化妝品組合物的穩(wěn)定以得到約100克組合物:
(a)膜級(jí)分的穩(wěn)定化包括其與非離子型乳化劑聚山梨醇酯80(吐溫80)和抗氧化劑(Tenox4)的混合。例如，劇烈混合20克新鮮的膜級(jí)分直至均質(zhì)和3.5克吐溫80和0.1克TenoX4( 丁基羥基茴香醚和丁基羥基甲苯的在油中的溶液)，同時(shí)避免在混合時(shí)曝氣。
(b)聚合物乳化劑，丙烯酸酯類/C10-C30丙烯酸酯交聯(lián)聚合物的分散劑的制備:例如，在69.2克溫?zé)岬娜ルx子水中分散0.9克Pemulen TR-2并使用溫和攪拌混合至均一，避免曝氣。平行地在單獨(dú)的容器中組合5克甘油和I克Phenonip (苯氧乙醇(和)對(duì)羥基苯甲酸甲酯(和)對(duì)羥基苯甲酸丁酯(和)對(duì)羥基苯甲酸乙酯(和)對(duì)羥基苯甲酸丙酯的混合物)并混合至均勻。在溫和攪拌下，組合含有Pemulen和甘油的相與Phenonip并混合至均勻。
(c)將膜級(jí)分摻入聚合物基質(zhì):例如，將含有膜級(jí)分、吐溫80和TenoX4的相加入含有Pemulen、甘油和Phenonip的相并劇烈攪拌混合，同時(shí)避免曝氣。
(d)產(chǎn)品的中和:例如，用18%的氫氧化鈉(NaOH)水溶液中和含有膜級(jí)分和其他組分的批次并劇烈混合以產(chǎn)生具有pH = 5.0+0.4的均勻系統(tǒng)。
[0078]得到的多相產(chǎn)品是不透明的凝膠，其顯示的性能完全滿足化妝品成分的所有要求。發(fā)現(xiàn)在多相化妝品成分中的防腐劑和抗氧化劑的最佳組成對(duì)所有植物源非常類似，并且可有效使用Pemulen和Carbopol的不同組合。穩(wěn)定性研究提示，通過所述方法從膜級(jí)分生產(chǎn)的化妝品成分在8°C穩(wěn)定至少4-6月，維持物理化學(xué)完整性和活性 。
制備漿來源的化妝品組合物的方法
[0079]本發(fā)明也涉及制備展示抗氧化劑活性，細(xì)胞生長刺激活性，或抗氧化劑和細(xì)胞生長刺激活性的漿來源的化妝品組合物的方法。所述方法包括提供已從新鮮植物生物質(zhì)提取的植物細(xì)胞汁，這已在有關(guān)膜來源的化妝品組合物的上文中描述。然后在有效將植物細(xì)胞汁分離為膜級(jí)分和細(xì)胞汁上清的條件下處理植物細(xì)胞汁。此步驟也和有關(guān)膜來源的化妝品組合物的上文中描述的相同。在有效將細(xì)胞汁上清分離為細(xì)胞質(zhì)級(jí)分和細(xì)胞漿級(jí)分的條件下加工細(xì)胞汁上清。在有效得到細(xì)胞漿級(jí)分濾液的條件下精煉細(xì)胞漿級(jí)分，所述細(xì)胞漿級(jí)分濾液具有抗氧化劑活性，細(xì)胞生長刺激活性，或抗氧化劑和細(xì)胞生長刺激活性。在有效得到穩(wěn)定的生物活性植物化妝品組合物的條件下穩(wěn)定化細(xì)胞漿級(jí)分濾液，所述生物活性植物化妝品組合物展示抗氧化劑活性，細(xì)胞生長刺激活性，或抗氧化劑和細(xì)胞生長刺激活性。
[0080]植物細(xì)胞汁可從所有植物類型提取?？捎米鞅景l(fā)明中新鮮植物生物質(zhì)源的合適植物的實(shí)例包括但不限于來自以下科的植物:菊科、豆科、唇形科和禾本科。特別地，已經(jīng)過檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)適于作為新鮮植物生物質(zhì)源的具體植物的實(shí)例包括，但不限于，紅車軸草、蓮、金盞花、紫花苜蓿、薰衣草、鼠尾草和大麥。
[0081]如上所述，一旦將植物細(xì)胞汁分離為膜級(jí)分和細(xì)胞汁上清，就對(duì)細(xì)胞汁上清進(jìn)行加工步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述加工步驟包括(I)進(jìn)行“細(xì)胞質(zhì)級(jí)分沉淀步驟”以得到包括細(xì)胞質(zhì)級(jí)分和細(xì)胞漿級(jí)分的細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞漿混合物，和(2)進(jìn)行“細(xì)胞漿分離步驟”以分離細(xì)胞質(zhì)級(jí)分與細(xì)胞漿級(jí)分。細(xì)胞質(zhì)級(jí)分主要包括白色可溶性蛋白質(zhì)；在03植物中，這些蛋白質(zhì)主要由酶核酮糖二磷酸羧化酶組成。細(xì)胞漿含有低分子量可溶性組分。
[0082]細(xì)胞質(zhì)級(jí)分沉淀步驟可包括使用合適的沉淀技術(shù)，包括例如，等電滴定和電滲析誘導(dǎo)細(xì)胞汁上清內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)級(jí)分的沉淀。在一個(gè)實(shí)施方案中，等電滴定包括將細(xì)胞汁上清的pH調(diào)節(jié)為在約2.5和6.5之間。使用合適的分離技術(shù)，包括例如過濾和離心的技術(shù)誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞漿混合物分離為細(xì)胞質(zhì)級(jí)分和細(xì)胞漿級(jí)分。例如，通過利用5.0N鹽酸(HCl)調(diào)節(jié)為pH = 4.0的滴定方法誘導(dǎo)沉淀。
[0083]評(píng)估細(xì)胞質(zhì)級(jí)分完全分離的定量標(biāo)準(zhǔn)是在隨后的濾液或上清中缺乏可檢測(cè)水平的高分子量蛋白質(zhì)和/或缺乏核酮糖二磷酸脫羧酶。例如，可在冷凍離心中以大于或等于3，OOOg大于或等于20分鐘分離沉淀的細(xì)胞汁上清,并且在具有pH = 4.0的細(xì)胞楽:中實(shí)現(xiàn)缺乏具有大于或等于10，000的分子量的蛋白質(zhì)。
[0084]通常將細(xì)胞漿稱為“棕色汁”，盡管最初此澄清液體具有淡黃色和輕微的特征氣味。在數(shù)小時(shí)內(nèi)，不穩(wěn)定的細(xì)胞漿不可逆地轉(zhuǎn)化為具有大量沉淀物和強(qiáng)烈非特征氣味的深棕色懸浮液。因此，“棕色汁”不能用作化妝品成分。下述程序允許精煉細(xì)胞漿(棕色汁)以得到穩(wěn)定和有活性的化妝品成分。這是通過從細(xì)胞漿中去除引起導(dǎo)致不想要的沉淀產(chǎn)生和顏色和氣味惡化的不可逆轉(zhuǎn)化的主要成分實(shí)現(xiàn)。此程序包括:pH調(diào)節(jié)、熱處理、冷卻、真空過濾和穩(wěn)定化。一些特定的程序團(tuán)(regiment procedures)可根據(jù)植物來源細(xì)胞衆(zhòng)而變化。應(yīng)該注意，此程序必須在完成細(xì)胞漿和細(xì)胞質(zhì)級(jí)分的分離后立即使用。 [0085]一旦產(chǎn)生了細(xì)胞漿級(jí)分，就對(duì)其進(jìn)行精煉過程。此精煉過程包括(I)進(jìn)行“溫度處理步驟”以得到凝結(jié)的細(xì)胞漿級(jí)分，和(2)進(jìn)行澄清步驟以得到細(xì)胞漿級(jí)分濾液。用于本發(fā)明的合適的溫度處理步驟包括(I)將細(xì)胞漿級(jí)分加熱至誘導(dǎo)細(xì)胞漿級(jí)分內(nèi)凝結(jié)所需的加熱溫度，和(2)立即將細(xì)胞漿級(jí)分冷卻至有效允許進(jìn)一步定量分離所述細(xì)胞漿級(jí)分濾液的溫度。在一個(gè)實(shí)施方案中，加熱溫度為在約80和約95攝氏度之間，并且將被加熱的細(xì)胞漿級(jí)分冷卻到至少低至約15攝氏度的溫度。用于本發(fā)明的合適的澄清步驟包括澄清凝結(jié)的細(xì)胞漿級(jí)分以得到細(xì)胞漿級(jí)分濾液，其中所述澄清包括例如過濾和離心的澄清技術(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，過濾可包括真空過濾凝結(jié)的細(xì)胞漿級(jí)分以得到細(xì)胞漿級(jí)分濾液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在溫度處理步驟前，將細(xì)胞漿級(jí)分的PH合適地調(diào)節(jié)至約3.0和4.0之間。
[0086]在產(chǎn)生了細(xì)胞漿濾液后，就對(duì)其進(jìn)行上述穩(wěn)定化步驟以得到漿來源的化妝品組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定化步驟包括在至少一種防腐劑和至少一種抗氧化劑的混合物中孵育細(xì)胞漿級(jí)分濾液以得到經(jīng)穩(wěn)定化的細(xì)胞漿級(jí)分濾液。用于本發(fā)明的合適的防腐劑包括例如，山梨酸鉀、苯甲酸鈉、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉和檸檬酸。用于本發(fā)明的合適的抗氧化劑的實(shí)例是偏亞硫酸氫鈉。
[0087]在一個(gè)實(shí)施方案中，可如下進(jìn)行細(xì)胞漿的穩(wěn)定化:
(a)例如，對(duì)從鼠尾草和金盞花得到的、通過利用5.0N鹽酸(HCI)調(diào)節(jié)至pH = 3.0的滴定法誘導(dǎo)的細(xì)胞漿進(jìn)行PH調(diào)節(jié)。這樣的調(diào)節(jié)對(duì)從紫花苜蓿、大麥和薰衣草得到的細(xì)胞漿不是必需的。
(b)對(duì)從所有可用的植物源得到的細(xì)胞漿進(jìn)行熱處理。例如，在溫度探針控制下將細(xì)胞漿暴露于微波處理。持續(xù)此處理直到溫度達(dá)到90°C。溫度探針指示誘導(dǎo)不想要的成分的完全凝結(jié)所需的點(diǎn)。一旦誘導(dǎo)了凝結(jié)，立即將被處理的細(xì)胞汁冷卻至10°C。
(c)能夠通過過濾或離心澄清凝結(jié)的細(xì)胞衆(zhòng)。例如，可通過雙層Whatman2號(hào)濾器真空過濾凝結(jié)的細(xì)胞衆(zhòng)。丟棄沉淀物，并將濾液用于進(jìn)一步加工。
(d)濾液的穩(wěn)定化包括的加入特定防腐劑和抗氧化劑并孵育所述混合物直到實(shí)現(xiàn)其完全的穩(wěn)定化(通常需要大于或等于30分鐘的充分混合)。
[0088]經(jīng)穩(wěn)定化的細(xì)胞漿濾液顯示了完全滿足化妝品成分所有要求的性能。穩(wěn)定性研究提示，通過這些方法從細(xì)胞漿生產(chǎn)的化妝品成分在室溫穩(wěn)定至少10-12個(gè)月(即，它們維持物理化學(xué)完整性和活性)。
實(shí)施例
實(shí)施例1
來源于紫花苜猜(Medicago sativa)細(xì)胞衆(zhòng)級(jí)分的化妝品植物成分101的制備
[0089]生物質(zhì)的制備。收獲足夠量的新鮮紫花苜蒂(MedicaRo sativa)植物生物質(zhì)(即，莖和葉組織)以得到約IOOkg干物質(zhì)。經(jīng)計(jì)算，新鮮紫花苜蓿植物生物質(zhì)中的干物質(zhì)水平為15.75%，需要收獲約635kg新鮮紫花苜蓿植物生物質(zhì)以得到IOOkg干物質(zhì)。注意保存植物生物質(zhì)的內(nèi)在水分含量和避免由于水分損失而萎蔫。在地上至少5厘米處切割植物以限制在收集的植物生物質(zhì)中的土壤和其他殘?jiān)牧?。以避免或最小化切碎、搗碎和壓碎植物的方式進(jìn)行切割。在切割后不多于60分鐘將收獲的植物遞送至加工。這樣做是為了最小化植物生物質(zhì)暴露于陽光、高溫和其他負(fù)面環(huán)境因素。在進(jìn)一步加工前進(jìn)行洗滌步驟以去除土壤顆粒和來自植物的其他殘?jiān)?。通過在< lkg/cm2水壓下洗滌< 5分鐘收獲的植物完成此洗滌步驟。殘留水洗物不含任何綠色色素，表明合適的水壓和洗滌持續(xù)時(shí)間。從洗滌后的生物質(zhì)中去除過量的水。
[0090]植物生物質(zhì)的研磨、浸漬和沖壓。在收獲、收集和洗滌植物生物質(zhì)后，然后對(duì)植物進(jìn)行研磨、浸潰和沖壓以提取細(xì)胞內(nèi)含物(即，植物細(xì)胞汁)并將其與富含纖維的壓濾餅分離。使用錘式粉碎機(jī)研磨紫花苜蓿生物質(zhì)以在短時(shí)間內(nèi)得到合適的小尺寸的植物組織顆粒并且不顯著增加生物質(zhì)的溫度。將錘式粉碎機(jī)設(shè)定為在< 10秒的處理時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生< 0.5厘米的經(jīng)浸潰的植物顆粒的最大尺寸。這僅導(dǎo)致<5°C的生物質(zhì)溫度的增加。使用水平連續(xù)螺旋壓力機(jī)(Compact Press“CP-6”,Vincent Corporation,FL)從植物生物質(zhì)中提取植物細(xì)胞汁。將螺旋壓力機(jī)圓錐體上的壓力維持在24kg/cm2的水平，螺桿轉(zhuǎn)速為12rpm，溫度僅增加<5°C。此處理得到壓濾餅和植物細(xì)胞汁。最初的植物細(xì)胞汁含有小纖維顆粒，通過過濾通過4層尼龍纖維或通過使用低速離心將所述顆粒去除。
[0091] 分離膜級(jí)分與細(xì)胞汁。將濾過的植物細(xì)胞汁暴露于使用溫度探針控制的微波處理。持續(xù)此處理直到細(xì)胞汁的溫度達(dá)到60°C。一旦誘導(dǎo)凝結(jié)，將經(jīng)處理的細(xì)胞汁立即冷卻至40°C。使用大于或等于3，000g，大于或等于20分鐘的離心實(shí)現(xiàn)膜級(jí)分與凝結(jié)的細(xì)胞汁的分離。這得到膜級(jí)分(沉淀物)和含有細(xì)胞質(zhì)級(jí)分和細(xì)胞漿級(jí)分(即，低分子量可溶性組分)的細(xì)胞汁上清。將細(xì)胞汁上清用于進(jìn)一步加工以得到化妝品植物成分101。保存膜級(jí)分用于制備對(duì)應(yīng)物膜來源的化妝品組合物。
[0092]分離細(xì)胞質(zhì)級(jí)分與細(xì)胞汁上清。為了分離出細(xì)胞質(zhì)級(jí)分，對(duì)細(xì)胞汁上清進(jìn)行等電沉淀。使用利用5.0N鹽酸(HCI)使細(xì)胞汁上清的pH變?yōu)?.0的滴定法誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)級(jí)分的沉淀。通過大于或等于3，000g,大于或等于20分鐘的離心實(shí)現(xiàn)沉淀的細(xì)胞質(zhì)級(jí)分與細(xì)胞漿的分離。這得到細(xì)胞漿(上清)，其能夠進(jìn)一步精煉以得到植物化妝品成分101。
[0093]處理細(xì)胞漿以產(chǎn)生化妝品植物成分101。細(xì)胞漿的精煉包括以下步驟:熱處理、冷卻、過濾和穩(wěn)定。在分離細(xì)胞漿和細(xì)胞質(zhì)級(jí)分后立即進(jìn)行精煉。將細(xì)胞漿暴露于使用溫度探針控制的微波處理。持續(xù)此處理直到細(xì)胞漿的溫度達(dá)到90°C。一旦誘導(dǎo)凝結(jié)，將經(jīng)處理的細(xì)胞衆(zhòng)立即冷卻至10°c。將凝結(jié)的細(xì)胞衆(zhòng)真空過濾通過雙層Whatman2號(hào)濾器。丟棄沉淀物，并將得到的細(xì)胞漿濾液用于進(jìn)一步處理(即，穩(wěn)定化)。通過加入防腐劑和抗氧化劑并孵育混合物直至完全溶解來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞漿濾液的穩(wěn)定。使用的防腐劑和抗氧化劑包括下述:0.1 %山梨酸鉀、0.1 %苯甲酸鈉、0.1 %對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉和0.2%偏亞硫酸氫鈉。此制備導(dǎo)致18.1kg干物質(zhì)產(chǎn)量(或約340升)的化妝品植物成分101的產(chǎn)生，將其用于其物理化學(xué)和生物活性特性的表征?；瘖y品植物成分101的推薦儲(chǔ)存條件包括在避光的密封容器中在15和25°C之間的溫度儲(chǔ)存。
實(shí)施例2
來源于紫花苜猜(Medlicago sativa)細(xì)胞衆(zhòng)級(jí)分的化妝品植物成分101的產(chǎn)品規(guī)格
[0094]根據(jù)在實(shí)施例1中的上述方法制備化妝品植物成分101。如下所述進(jìn)行化妝品植物成分101的分析以測(cè)定其多種物理化學(xué)、微生物、細(xì)胞毒性和生物活性特征?；瘖y品植物成分101是澄清液體，其具有淡黃色和輕微的特征氣味。在載體介質(zhì)中未加入溶劑(即甘油、油或水)。
[0095]表1總結(jié)了化妝品植物成分101的物理和化學(xué)數(shù)據(jù)。
表1.物理和化學(xué)數(shù)據(jù)
【權(quán)利要求】
1.生物活性植物化妝品組合物，所述組合物包含: 來源于從新鮮植物生物質(zhì)提取的細(xì)胞汁的細(xì)胞漿級(jí)分濾液，所述細(xì)胞漿級(jí)分濾液具有抗氧化劑活性，細(xì)胞生長刺激活性，和/或抗氧化劑和細(xì)胞生長刺激活性，其中所述新鮮植物生物質(zhì)來自植物源，所述植物源選自由蓮花(蓮(Nelumbo nucifera))和紅三葉草(紅車軸草(Trifolium pratense))組成的組；和 穩(wěn)定劑，其中所述細(xì)胞生長刺激活性是由于至少一種細(xì)胞類型的增殖刺激， 其中根據(jù)以下步驟所述細(xì)胞漿級(jí)分濾液來源于細(xì)胞汁: 提供植物細(xì)胞汁，所述植物細(xì)胞汁是已從新鮮植物生物質(zhì)中提取的； 在有效將植物細(xì)胞汁分離為膜級(jí)分和細(xì)胞汁上清的條件下處理植物細(xì)胞汁； 在有效將細(xì)胞汁上清分離為細(xì)胞質(zhì)級(jí)分和細(xì)胞漿級(jí)分的條件下加工細(xì)胞汁上清；和 在有效得到細(xì)胞漿級(jí)分濾液的條件下精煉細(xì)胞漿級(jí)分，其中所述精煉包括對(duì)細(xì)胞漿級(jí)分進(jìn)行溫度處理步驟以得到凝結(jié)的細(xì)胞漿級(jí)分，和澄清凝結(jié)的細(xì)胞漿級(jí)分以得到細(xì)胞漿級(jí)分濾液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的生物活性植物化妝品組合物，其中所述穩(wěn)定劑選自由防腐劑和抗氧化劑組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的生物活性植物化妝品組合物，其中所述防腐劑選自由山梨酸鉀、苯甲酸鈉、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉和檸檬酸組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的生物活性 植物化妝品組合物，其中所述抗氧化劑是偏亞硫酸氫鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的生物活性植物化妝品組合物，其中所述抗氧化劑活性選自由超氧化物清除活性和嗜中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)抑制活性組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的生物活性植物化妝品組合物，其中所述細(xì)胞漿級(jí)分濾液包含所述生物活性植物化妝品組合物的約I和約10之間的重量百分比。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的生物活性植物化妝品組合物，其中所述生物活性植物化妝品組合物具有范圍為約50和約190 μ g干物質(zhì)/ml之間的ICR5tl值的超氧化物清除效力，其中所述ICR50值代表抑制50%的細(xì)胞色素C還原所需的在細(xì)胞漿中含有的干物質(zhì)的濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的生物活性植物化妝品組合物，其中所述細(xì)胞漿級(jí)分濾液具有范圍為約1.0和125 μ g干物質(zhì)/ml之間的細(xì)胞生長刺激效力。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的生物活性植物化妝品組合物，其中所述細(xì)胞漿級(jí)分濾液具有約110和190 %之間的NRU值，其中所述NRU值代表細(xì)胞活力。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的生物活性植物化妝品組合物，其中所述生物活性植物化妝品組合物具有引起來自佛波醇十四酸酯乙酸酯刺激的嗜中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)的雙相調(diào)節(jié)的能力，在于所述組合物以約1.0和5.0 μ g干物質(zhì)/ml之間抑制所述呼吸爆發(fā)，并且以約120和180 μ g干物質(zhì)/ml之間刺激所述呼吸爆發(fā)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的生物活性植物化妝品組合物，其中所述生物活性植物化妝品組合物包含與表38或表39中所示特征基本相同的特征。
12.適于對(duì)哺乳動(dòng)物局部應(yīng)用的生物活性植物化妝品制劑，所述化妝品制劑包含化妝可用的載體和化妝有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的生物活性植物化妝品組合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的化妝品制劑，其中所述化妝可用的載體選自由親水霜基底、親水乳液基底、親水表面活性劑基底、疏水霜基底、疏水乳液基底，和疏水表面活性劑基底組成的組。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的化妝品制劑，其中所述生物活性植物化妝品組合物以范圍為化妝品制劑總重量的約0.001%和約95%之間的量存在。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的生物活性植物化妝品組合物，其中所述植物源是蓮花(蓮(Nelumbo nucifera))。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的生物活性植物化妝品組合物，其中所述植物源是紅三葉草(紅車軸草(Trifolium pratense))。
17.根據(jù)權(quán)利要求12的化妝品制劑，其中所述植物源是蓮花(蓮(Nelumbonucifera))。
18.根據(jù)權(quán)利要求12的化妝品制劑，其中所述植物源是紅三葉草(紅車軸草(Trifolium pratense))。
19.制備生物活性植物化妝品組合物的方法，所述方法包括: 提供植物細(xì)胞汁，所述植物細(xì)胞汁是已從新鮮植物生物質(zhì)提取的，其中所述新鮮植物生物質(zhì)來自植物源，所述植物源選自由蓮花(蓮(Nelumbo nucifera))和紅三葉草(紅車軸草(Trifolium pratense))組成的組； 在有效將植物細(xì)胞汁分離為膜級(jí)分和細(xì)胞汁上清的條件下處理植物細(xì)胞汁； 在有效將細(xì)胞汁上清分離為細(xì)胞質(zhì)級(jí)分和細(xì)胞漿級(jí)分的條件下加工細(xì)胞汁上清； 在有效得到細(xì)胞漿級(jí)分濾液的條件下精煉細(xì)胞漿級(jí)分，所述細(xì)胞漿級(jí)分濾液具有抗氧化劑活性，細(xì)胞生長刺激活性，和/或抗氧化劑和細(xì)胞生長刺激活性，其中所述精煉包括對(duì)細(xì)胞漿級(jí)分進(jìn)行溫度處理步驟以得到凝結(jié)的細(xì)胞漿級(jí)分，和澄清凝結(jié)的細(xì)胞漿級(jí)分以得到細(xì)胞漿級(jí)分濾液；和 在有效得到穩(wěn)定的生物活性植物化妝品組合物的條件下使細(xì)胞漿級(jí)分濾液穩(wěn)定化，所述生物活性植物化妝品組合物展示出所述抗氧化劑活性，細(xì)胞生長刺激活性，或抗氧化劑和細(xì)胞生長刺激活性。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述處理包括: 使植物細(xì)胞汁凝結(jié)以得到凝結(jié)的細(xì)胞汁混合物，和 將凝結(jié)的細(xì)胞汁分離為膜級(jí)分和細(xì)胞汁上清。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述凝結(jié)包括: 使植物細(xì)胞汁去穩(wěn)定化以得到凝結(jié)的細(xì)胞汁混合物，其中所述去穩(wěn)定化是通過熱處理、電膜處理、化學(xué)處理和/或其組合實(shí)現(xiàn)的。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述熱處理包括: 將植物細(xì)胞汁加熱至誘導(dǎo)膜級(jí)分凝結(jié)所需的熱處理溫度，和 將經(jīng)加熱的細(xì)胞汁冷卻至有效允許所述膜級(jí)分與所述細(xì)胞汁上清定量分離的溫度。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述加熱在45至70攝氏度進(jìn)行。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述冷卻在30至45攝氏度進(jìn)行。
25.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述分離通過過濾或離心進(jìn)行。
26.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述加工包括: 對(duì)細(xì)胞汁上清進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)級(jí)分沉淀步驟以得到包含細(xì)胞質(zhì)級(jí)分和細(xì)胞衆(zhòng)級(jí)分的細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞漿混合物，和 分離細(xì)胞質(zhì)級(jí)分與細(xì)胞漿級(jí)分。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述細(xì)胞質(zhì)級(jí)分沉淀步驟通過等電滴定、電滲析和/或其組合進(jìn)行。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述等電滴定包括: 將細(xì)胞汁上清的PH調(diào)節(jié)至約2.5和6.5之間。
29.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述分離通過過濾或離心進(jìn)行。
30.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述溫度處理步驟包括: 將細(xì)胞漿級(jí)分加熱至誘導(dǎo)細(xì)胞漿級(jí)分內(nèi)的凝結(jié)所需的加熱溫度，和 將細(xì)胞漿級(jí)分冷卻至有效允許進(jìn)一步定量分離所述細(xì)胞漿級(jí)分濾液的溫度。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述加熱溫度是80至95攝氏度。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述冷卻是冷卻到至少低至約15攝氏度的溫度。
33.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述澄清通過過濾或離心進(jìn)行。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述過濾包括: 真空過濾凝結(jié)的細(xì)胞漿級(jí)分 以得到所述細(xì)胞漿級(jí)分濾液。
35.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，所述方法還包括: 在所述精煉前立即將細(xì)胞漿級(jí)分的PH調(diào)節(jié)至約3.0至4.0。
36.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述穩(wěn)定化包括: 在至少一種防腐劑和至少一種抗氧化劑的混合物中孵育所述細(xì)胞漿級(jí)分濾液以得到穩(wěn)定的生物活性植物化妝品組合物。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中所述防腐劑選自由山梨酸鉀、苯甲酸鈉、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉，和檸檬酸組成的組。
38.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中所述抗氧化劑是偏亞硫酸氫鈉。
39.根據(jù)權(quán)利要求19的方法,其中所述植物源是蓮花(蓮(Nelumbonucifera))。
40.根據(jù)權(quán)利要求19的方法,其中所述植物源是紅三葉草(紅車軸草(Trifoliumpratense))。
41.通過根據(jù)權(quán)利要求19的方法制備的穩(wěn)定的生物活性植物化妝品組合物。
【文檔編號(hào)】A61Q19/00GK103547253SQ201280019509
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月22日
【發(fā)明者】M·克格諾夫, O·杜瓦-克格諾夫 申請(qǐng)人:阿克佐諾貝爾化學(xué)國際公司