一種單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法。將人肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細胞H292細胞與不同濃度的抗EGFR單抗孵育，加入細胞計數(shù)染色試劑CCK-8，用酶標讀數(shù)儀測定活細胞染色的吸光值，試驗數(shù)據(jù)采用計算機程序處理，計算抗EGFR樣品相對于抗EGFR標準品的生物學(xué)活性。本發(fā)明所采用的檢測細胞H292細胞株對于不同親和力的抗體均適用，細胞培養(yǎng)時間短，需要的細胞數(shù)量較少；而且本發(fā)明改進了MTT比色法的染色液，改用CCK-8染色液，產(chǎn)物的溶解度較好，不需要進一步的溶解處理，加入染色液后可以在不同的時間檢測結(jié)果，顯色結(jié)果穩(wěn)定，質(zhì)量更可控。該方法測定的生物學(xué)活性與臨床療效相關(guān)，符合FDA相關(guān)的技術(shù)要求。
【專利說明】一種單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗體的生物學(xué)活性測定【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地說涉及重組抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]表皮生長因子受體(Epithelialgrowth factor receptor,EGFR)是一種糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受體，廣泛分布于哺乳動物上皮細胞、成纖維細胞、膠質(zhì)細胞、角質(zhì)細胞等細胞表面，其信號通路在細胞的生長、增殖和分化等生理過程中發(fā)揮重要的作用(HanleySC, Assouline-Thomas B, Makhlin J, et al.J Endocrinol,2011,211 (3):231_239)。研究表明，EGFR與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細胞凋亡的抑制有關(guān)，在許多實體腫瘤中存在EGFR的高表達或異常表達，因此可將EGFR作為腫瘤治療的靶點(Kim H，Kim SH, Kim MJ, et al.J Immunother, 2011, 34 (4):372-381 ；0h M, Lee JY, Shin DH, etal.Cancer Sci，2011，102 (3):597_604)。
[0003]單克隆抗體的生物學(xué)活性測定是重組生物制品質(zhì)量控制的重要評價參數(shù)，關(guān)系到單克隆抗體的治療效果。一般將體外細胞增殖抑制方法測得的生物學(xué)活性稱為單抗的效價。
[0004]早在1963年，Slater就發(fā)現(xiàn)了線粒體中的脫氫酶(如琥珀酸脫氫酶、心肌黃酶)可將四甲基偶氮唑鹽(MTT)的唑環(huán)打開，生成藍色的產(chǎn)物甲濯(formazan)。根據(jù)這個原理，Mosmann (Mosmann T.J Tmmunol Methods, 1983, 65:55)于 1983 年創(chuàng)立了 MTT 檢測法，此法在測定細胞的存活和增殖方面非常有效，因為這種顏色的變化僅僅發(fā)生在活的細胞中，并且甲I!的形成量與活細胞數(shù)和功能狀態(tài)是成比例的。目前，MTT測定法已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于多種生長因子如表皮生長因子、腫瘤壞死因子、白細胞介素-2等的檢測工作中。
[0005]目前通用的重組抗人EGFR抗體生物學(xué)活性的測定方法，是采用DiFi細胞或者MDA-MB-468細胞的增殖/WST比色法，均采用改進的MTT染色的方法。該法依據(jù)抗EFGR抗體對這些細胞的生長具有抑制作用，DiFi細胞或者MDA-MB-468細胞株的生長狀況因重組抗EGFR抗體的生物學(xué)活性的不同而異，以此檢測抗EGFR抗體的生物學(xué)活性。其測定法分別為:
[0006](I)DiFi細胞增殖比色法:DiFi細胞株用完全培養(yǎng)液于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)，1640完全培養(yǎng)基重懸細胞，胎盤藍染色，鏡下計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至2 X IO5個/ml，100 μ I/孔，振蕩器混勻5分鐘后，將96孔板置37°C、5%C02孵箱孵育90-102小時，孵育結(jié)束前將CellTiter96Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay MTS 試劑盒中的 PMS和MTS融化并平衡至室溫后，取IOOul PMS加入2mlMTS中，混勻，加入細胞培養(yǎng)板，20ul/孔，37°C、5%C02孵育2小時。孵育結(jié)束后，加入10%SDS15ul/孔終止顯色，490nm波長測定吸光度，結(jié)果使用SoftmaX5.0軟件分析(張峰等，DiFi細胞增殖抑制法測定抗表皮生長因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性，第五次全國免疫診斷暨疫苗學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C]，2011年)。[0007](2 ) MDA-MB-468細胞增殖/WST比色法:MDA_MB_468細胞用稀釋液(含0.1g/LPF-68的F12/DMEM培養(yǎng)基)將細胞濃度調(diào)整至(5~8) X IO4個/ mL,加入96孔板，每孔100 μ L，空白對照加入100 μ L稀釋液。用樣品稀釋液(含0.2%FBS的F12 / DMEM培養(yǎng)基)將樣品和參考品預(yù)稀釋至50 μ g/mL,再3倍梯度稀釋至0.023 μ g / mL,加入96孔板，每孔50 μ L，補加40μ LF12/DMEM培養(yǎng)基(含5%FBS)，37°C培養(yǎng)5天，加入30 μ L WST-8顯色液，繼續(xù)孵育4h，以630nm為參比波長，于波長450nm處測定吸光度(A)值。以蛋白濃度為橫坐標，A450值為縱坐標，進行四參數(shù)擬合，得到反“S”型曲線，以半數(shù)有效濃度(EC5tl)表示生物學(xué)活性。將50yg / mL的樣品與參考品等體積混勻，按相同方式稀釋并加樣，測定回收率，按下式計算相對生物學(xué)活性和回收率(陶磊等，人源化抗表皮生長因子受體單克隆抗體質(zhì)控方法的建立，中國生物制品學(xué)雜志，2013年01月第26卷第I期)。
[0008]樣品相對生物學(xué)活性(％)=參考品EC5tl /樣品EC5tlX 100%
[0009]回收率樣品相對生物學(xué)活性(%)=參考品EC5tl /回收率樣品EC5tl X 100%
[0010]
【權(quán)利要求】
1.一種重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法，其特征在于，該方法包含如下步驟: (1)制備特定腫瘤細胞懸液；所述特定腫瘤細胞的細胞膜過度表達表皮生長因子受體； (2)制備不同濃度的重組抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體溶液； (3)特定腫瘤細胞與不同濃度的重組抗人表皮生長因子受體的單抗孵育68-72小時，加入細胞計數(shù)染色試劑CCK-8震蕩混勻，37°C溫育2-4小時； (4)在酶標儀上以630nm為參比波長，于波長450nm處測定吸光度，通過數(shù)據(jù)處理計算抗EGFR樣品相對于抗EGFR標準品的生物學(xué)活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法，其特征在于，所述步驟(I)中特定腫瘤細胞為人肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細胞H292，所述特定腫瘤細胞懸液的密度為6 X IO4-1O X IO4個/mL，優(yōu)選密度為8 X IO4個/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法，其特征在于，所述步驟(2)中的重組抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體為尼妥珠單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗或Zalutumumab的任意一種,所述的重組抗人表皮生長因子受體的單抗溶液樣品或標準品濃度稀釋至300-1000 μ g/mL，優(yōu)選濃度為300 μ g/mL，然后向下5倍或4倍倍比稀釋7個稀釋度。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法，其特征在于，所述重組抗人表皮生長因子受體的單克隆抗體為尼妥珠單抗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法，其特征在于，所述步驟(4)的數(shù)據(jù)處理為使用GraphPad Prism軟件進行數(shù)據(jù)回歸分析，根據(jù)不同對數(shù)濃度下的抑制率計算參考品和樣品的S形曲線間的F值，計算參考品和樣品的半效量濃度IC5tte和IC5Qs。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體的生物學(xué)活性測定方法，其特征在于，所述步驟(4)的數(shù)據(jù)處理為利用GraphPad Prism軟件的四參數(shù)回歸進行處理，當(dāng)參考品和樣品的擬合曲線平行性假設(shè)得到確認(P值>0.05)后，且曲線擬合系數(shù)R2>0.9025(即R>0.95)，使用constrained的曲線最大值、最小值、斜率，計算參考品和樣品的半效量濃度IC5tlr和IC50s。
7.權(quán)利要求1-5所述的重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體生物學(xué)活性測定方法在重組抗人表皮生長因子受體單克隆抗體的質(zhì)控中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N21/31GK103792200SQ201410064974
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月25日
【發(fā)明者】何偉, 劉永清, 喻志愛, 白先宏 申請人:百泰生物藥業(yè)有限公司