一種本草提取物及其在化妝品中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雪茶提取物，該雪茶提取物中包括縮酚酸類化合物，如鱗片衣酸、羊角衣酸、雪茶素、地茶酸中的任意一種或幾種。本發(fā)明還公開了雪茶提取物的制備方法以及其在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用。該雪茶提取物采用極性溶劑提取法，提取工藝簡單，易于工業(yè)化。本發(fā)明提供的雪茶提取物，具有優(yōu)異的抗衰老性能，以及修復(fù)受損細(xì)胞的能力，此外，還具有優(yōu)良的保濕性能，可以作為復(fù)合型添加劑加入到化妝品中。
【專利說明】
一種本草提取物及其在化妝品中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種本草類提取物及其制備方法和包含該提取物 的化妝品，尤其涉及一種雪茶提取物及其制備方法和在化妝品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 雪茶(Thamnolia vermicularia)，別名地茶、太白茶、地雪茶，是地衣類地茶科植 物。地衣體枝狀，灰白色或白色，高3-7cm，多分叉，常委2-3叉或單支上呈小刺狀分叉，長圓 條形或扁條形。
[0003] 雪茶自古以來就是一種名貴中藥和保健飲品?！毒V目拾遺》中有載："雪茶，出滇南， 色白，久則色微黃，以盈烹渝，清香回勝。土人采得炒焙，以其似茶，色白，故名雪茶。此茶大 能暖胃，若患癆損及失血過多之人，服胃必寒，最忌食茶，惟此茶不忌，烹渝食之，入腹溫 暖。"即認(rèn)為雪茶有清熱生津、醒腦安神、降血壓和降血脂的功效。
[0004] 雪茶生長在海拔數(shù)千米的高山上，分為紅雪茶和白雪茶兩種。其中，白雪茶含有多 種對人體有益的成分，能降血脂血壓、減肥、醒腦潤肺、清熱解暑、生津止咳、清肝明目、滋陰 潤肺等，此外還能清除體內(nèi)垃圾，排出毒素，因此，白雪茶很早就在飲品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣 泛應(yīng)用。申請?zhí)枮?01210190931.1的專利公開了一種復(fù)合雪茶及其制備方法，該復(fù)合雪茶 具有清熱解毒，降高血壓、高血脂、高血糖，以及增加冠狀動(dòng)脈和腦血流量的作用。申請?zhí)枮?201210042650.3的專利公開了一種紅雪茶提取物，該提取物以紅雪茶干燥粗粉為原料，經(jīng) 過水提取、醇沉淀、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解、透析和干燥等步驟制成，該提取物可以用 以防治脂肪肝等疾病。但是，目前還未見到雪茶在化妝品方面應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明以白雪茶為原料，提供一種雪茶提取物，并研究 了該提取物在化妝品領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供的雪茶提取物，所述雪茶提取物包括縮酚酸類化合物。
[0007] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述酚酸類化合物為鱗片衣酸、羊角衣酸、雪茶 素、地茶酸中的任意一種或幾種組合。
[0008] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述酚酸類化合物的質(zhì)量含量為5%_50%，如 8%、45%，優(yōu)選為 10%-35%，如 15%、30%，更優(yōu)選為 18%-25%，如20%等。
[0009] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述雪茶提取物還包括α-雪松醇，所述α-雪松醇 的含量為0-5%，如1 %、3%等。
[0010] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述雪茶提取物可以是水提物、醇提物、油提物、 超臨界CO2提取物中的任意一種或幾種的組合。
[0011] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述醇提物優(yōu)選為乙醇提取物。
[0012] 本發(fā)明的第二個(gè)方面在于提供一種雪茶提取物的制備方法，所述方法包括如下步 驟：
[0013] 步驟1、取粉碎后的雪茶原料，向所述雪茶原料中添加體積為所述雪茶原料10-20 倍的溶媒，在40-80 °C提取多次，合并提取液；
[0014] 步驟2、減壓過濾步驟1中合并后的所述提取液，得到過濾液，并減壓濃縮所述過濾 液，得到所述雪茶提取物。
[0015] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟1中的所述溶媒為極性溶媒或非極性溶媒中 的任意一種或幾種組合，如甲醇、甲醇水溶液、甲醇、乙醇水溶液、乙醚等，優(yōu)選為極性溶媒， 如甲醇水溶液、乙醇水溶液。
[0016] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述雪茶提取物為物理粉碎粉末和/或浸膏。
[0017] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述制備方法包括如下步驟：
[0018] 步驟1、取粉碎后的雪茶原料，以雪茶原料:溶媒=Ig: (5-20)mL比例，在50 °C-120 °(：溫度下提取至少2次，每次提取0.5-10h，提取結(jié)束后混合每次的提取液，得到混合提取 液；
[0019] 步驟2、濃縮所述混合提取液，制備得到所述雪茶提取物。
[0020] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟1中提取雪茶的溶媒為水、甲醇水溶液、乙醇 水溶液、乙醚等中的任意一種或幾種組合。
[0021] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述甲醇水溶液的體積濃度為30%_100%，如 40 %、95 % ;優(yōu)選為50 % -90 %，如60 %、70 %、80 %等，其中體積濃度為100 %時(shí)，所述溶媒即 為無水甲醇。
[0022]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述乙醇水溶液的體積濃度為30%_100%，如 40 %、95 % ;優(yōu)選為50 % -90 %，如60 %、70 %、80 %等，其中體積濃度為100 %時(shí)，所述溶媒即 為無水乙醇。
[0023]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，雪茶的提取條件為0.2-0.8MPa，如0.3MPa、 0 · 6MPa，優(yōu)選為 0 · 4-0 · 5MPa，如0 · 45MPa。
[0024] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，雪茶的提取條件為1 . 2-1.8MPa，如I . 3MPa、 1 · 6MPa，優(yōu)選為 1 · 4-1 · 5MPa，如 1 · 45MPa。
[0025] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述制備方法中，步驟2為，將所述混合提取液第 一次濃縮，得到濃縮液一，所述濃縮液一經(jīng)過層析柱純化多次，第二次濃縮，得到所述橄欖 葉粉末。
[0026] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述純化過程為大孔吸附樹脂純化、硅膠柱吸附 純化中的任意一種或幾種組合。
[0027] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述大孔吸附樹脂純化過程的條件為:溫度為25 。(:-50 °C，優(yōu)選為30 °C -40 °C，所述大孔吸附樹脂的型號為AB-8型、D-101、ADS-5中的任意一 種或幾種。
[0028] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，大孔吸附樹脂吸附后，使用乙醇和/或水的混合溶 液梯度洗脫，所述混合溶液的體積比為乙醇:水=1: (0-10)，優(yōu)選為乙醇:水=1: (1-5)。 [0029]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述洗脫過程中，所述混合溶液的流速為2-4BV/ 11，洗脫溫度為30°050°(：。
[0030]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述硅膠柱吸附純化過程的條件為:25°c-50°c， 三氯甲烷：甲醇:水=(1-3) :(1-5) :(1-2)作為洗脫劑洗脫，所述洗脫劑的流速2-4BV/h，洗 脫溫度為30°C-50°C。
[0031 ]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟2中減壓濃縮后還可以包括干燥步驟。
[0032]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述干燥步驟為噴霧干燥和/或熱空氣干燥。
[0033]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述噴霧干燥過程中，高壓栗在80_120MPa壓力下 將所述過濾液通過霧化器形成100-200μπι的顆粒，與所述顆粒接觸的熱空氣的溫度為60-100°C，接觸時(shí)間為5-50s。
[0034]本發(fā)明的第三個(gè)方面在于提供上述任意一種雪茶提取物的應(yīng)用。
[0035]所述雪茶提取物優(yōu)選為施用于皮膚外表面，更優(yōu)選為應(yīng)用于制備涂覆于皮膚外表 面的制品。
[0036]其中，本發(fā)明所述雪茶提取物應(yīng)用于制備日化用品，優(yōu)選為應(yīng)用于制備化妝品和/ 或護(hù)膚品。
[0037]本發(fā)明的第四個(gè)方面在于提供一種包含上述任意一種雪茶提取物的日化用品，優(yōu) 選為包含上述任意一種雪茶提取物的化妝品和/或護(hù)膚品，更優(yōu)選為所述化妝品和/或護(hù)膚 品中，優(yōu)選為化妝品和/或護(hù)膚品中，還可以包括營養(yǎng)性添加劑。
[0038]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述化妝品和/或護(hù)膚品中，所述雪茶提取物的含 量為0.001%-50%，如0.003%，40%，優(yōu)選為0.005%-30%，如1%、3%、5%、10%、20%等。
[0039] 本發(fā)明提供的雪茶提取物的制備工藝簡單，得到的雪茶提取物具有優(yōu)異的保濕性 能和抗衰老能力，可以作為復(fù)合型添加劑加入到化妝品中，是理想的化妝品添加劑。
【附圖說明】
[0040] 圖1為自然狀態(tài)下雪茶提取物對HDF細(xì)胞I型膠原蛋白分泌的影響；
[0041] 圖2為過氧化氫對細(xì)胞存活率的影響；
[0042] 圖3為雪茶提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞I型膠原蛋白分泌的影響；
[0043] 圖4為雪茶提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞MMP-I分泌的影響；
[0044] 圖5為雪茶提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞丙二醛含量的影響；
[0045] 圖6為雪茶提取物對DPPH自由基去除率的影響；
[0046] 圖7雪茶提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞HAS3含量的影響；
[0047] 圖8為雪茶提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞HA含量的影響；
[0048] 圖9為雪茶提取物對過氧化氫損傷的HaCat細(xì)胞LOR含量的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 雪茶提取物的制備
[0050] 實(shí)施例一
[0051]取干燥的IOkg白雪茶作為原料，去離子水清洗2遍，除雜后粉碎，并過80目篩。向白 雪茶原料中加入體積比為14倍量的70 %乙醇溶液，在75 °C水浴中常壓提取2h，提取結(jié)束后， 再加入原料量10倍量的50%乙醇溶液，75°C水浴中常壓提取2h，提取結(jié)束后合并2次的提取 液，將得到的提取液在5kPa、微沸狀態(tài)下濃縮至4L，得到浸膏，將浸膏保持于4°C，該浸膏即 為雪茶提取物。
[0052]使用C18色譜柱的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析該雪茶提取物(將該雪茶提取物溶解 在無水甲醇中，甲醇用量為雪茶提取物的10倍體積，配制成甲醇溶液），以甲醇:〇.5%甲酸 溶液=75:25作為流動(dòng)相，250nm波長、柱溫25°C。
[0053] 分析可知，該雪茶提取物中，縮酚酸類化合物的質(zhì)量含量10%，鱗片衣酸的質(zhì)量含 量為2%、羊角衣酸質(zhì)量含量2%、雪茶素質(zhì)量含量5%。
[0054] 實(shí)施例二
[0055]取干燥的IOkg白雪茶作為原料，去離子水清洗2遍，除雜后粉碎，并過80目篩。向白 雪茶原料中加入體積比為I 〇倍量的70 %乙醇溶液，在75 °C水浴中常壓提取2h，提取結(jié)束后， 再加入原料量10倍量的50%乙醇溶液，65°C水浴中常壓提取2h，提取結(jié)束后，再加入原料量 10倍量的去離子水，80°C水浴中常壓提取2h，提取結(jié)束后合并3次的提取液，將得到的提取 液在5kPa、微沸狀態(tài)下濃縮至5L。
[0056] 冷卻后，向減壓漏斗上放置兩層濾紙，減壓過濾濃縮液，將濾餅噴霧干燥后得到雪 茶提取物。其中，噴霧干燥器中的條件為：IOOMPa壓力下，將浸膏制成150μπι的微粒，將微粒 通過70°C的熱空氣干燥15s。
[0057] 使用C18色譜柱的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析該雪茶提取物(將該雪茶提取物溶解 在無水甲醇中，甲醇用量為雪茶提取物的10倍體積，配制成甲醇溶液），以甲醇:0.5%甲酸 溶液=75:25作為流動(dòng)相，250nm波長、柱溫25°C。
[0058]分析可知，該雪茶提取物中，縮酚酸類化合物的質(zhì)量含量20%，鱗片衣酸的質(zhì)量含 量為10%、羊角衣酸質(zhì)量含量5%、雪茶素質(zhì)量含量3%。
[0059] 實(shí)施例三
[0060] 取干燥的IOkg白雪茶作為原料，去離子水清洗2遍，除雜后粉碎，并過80目篩。向白 雪茶原料中加入體積比為I〇倍量的70 %甲醇溶液和10倍量的70 %乙醇溶液，在70 °C水浴中 常壓提取2h，提取結(jié)束后，再加入原料量10倍量的50%乙醇溶液，65°C水浴中常壓提取2h， 提取結(jié)束后，再加入原料量10倍量的去離子水，80°C水浴中常壓提取2h，提取結(jié)束后合并3 次的提取液，將得到的提取液在5kPa、微沸狀態(tài)下濃縮至5L。
[0061] 冷卻后，向減壓漏斗上放置兩層濾紙，減壓過濾濃縮液，將濾餅噴霧干燥后得到雪 茶提取物。其中，噴霧干燥器中的條件為：120MPa壓力下，將浸膏制成100μπι的微粒，將微粒 通過70°C的熱空氣干燥30s。
[0062] 使用C18色譜柱的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析該雪茶提取物(將該雪茶提取物溶解 在無水甲醇中，甲醇用量為雪茶提取物的10倍體積，配制成甲醇溶液），以甲醇:0.5%甲酸 溶液=75:25作為流動(dòng)相，250nm波長、柱溫25°C。
[0063] 分析可知，該雪茶提取物中，縮酚酸類化合物的質(zhì)量含量40%，鱗片衣酸的質(zhì)量含 量為25%、羊角衣酸質(zhì)量含量10%、雪茶素質(zhì)量含量3%。
[0064] 實(shí)施例四
[0065]取干燥的IOkg白雪茶作為原料，去離子水清洗2遍，除雜后粉碎，并過30目篩。向白 雪茶原料中加入體積比為15倍量的70 %甲醇溶液和10倍量的70 %乙醚溶液，在70 °C水浴中 1.2MPa下提取2h，提取結(jié)束后，再加入原料量10倍量的50 %乙醇溶液，85°C水浴中1.2MPa提 取2h，提取結(jié)束后，再加入原料量10倍量的去離子水，80 °C水浴中0.8MPa提取2h，提取結(jié)束 后合并3次的提取液，將得到的提取液在5kPa、微沸狀態(tài)下濃縮至5L。
[0066] 冷卻后，將濃縮液使用200目硅膠柱純化，以體積比三氯甲烷：甲醇：水= 3:5:2作 為流動(dòng)相，流動(dòng)相的流速為3BV/h，在25°C下洗脫，將洗脫液濃縮后，再使用200目硅膠柱二 次純化，以體積比三氯甲烷：甲醇:水= 4:2:4作為流動(dòng)相，流動(dòng)相的流速為2BV/h，在25°C下 洗脫，二次洗脫液在5kPa、30°C下蒸發(fā)，去除其中的三氯甲烷和甲醇，靜置12h，向減壓漏斗 上放置兩層濾紙，減壓過濾濃縮液，將濾餅噴霧干燥后得到雪茶提取物。其中，噴霧干燥器 中的條件為：120MPa壓力下，將浸膏制成100μπι的微粒，將微粒通過70°C的熱空氣干燥30s。
[0067] 使用C18色譜柱的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析該雪茶提取物(將該雪茶提取物溶解 在無水甲醇中，甲醇用量為雪茶提取物的10倍體積，配制成甲醇溶液），以甲醇:0.5%甲酸 溶液=75:25作為流動(dòng)相，250nm波長、柱溫25°C。
[0068] 分析可知，該雪茶提取物中，縮酚酸類化合物的質(zhì)量含量50%，鱗片衣酸的質(zhì)量含 量為30%、羊角衣酸質(zhì)量含量10%、雪茶素質(zhì)量含量6%。
[0069] 實(shí)施例五
[0070] 取干燥的白雪茶原料10kg，去離子水清洗2遍，除雜后粉碎，并過30目篩。向白雪茶 原料中加入體積比為15倍量的乙醚，在60°C水浴、I. IMPa壓力下提取2次，每次提取2h。然后 向提取結(jié)束的白雪茶中加入20倍量的80 %甲醇溶液，在70°C、I. IMPa壓力下提取2次，每次 提取2h，提取結(jié)束后合并4次的提取液。
[0071] 向減壓漏斗上放置兩層濾紙，減壓過濾合并后的提取液，得到濾液，將濾液在 5kPa、飽和蒸汽壓下濃縮至4L，將浸膏保持于4°C，該浸膏即為雪茶提取物。
[0072] 取干燥的IOkg白雪茶作為原料，去離子水清洗2遍，除雜后粉碎，并過30目篩。向白 雪茶原料中加入體積比為15倍量的50 %乙醇溶液和10倍量的70 %乙醚溶液，在70 °C水浴中 1.2MPa下提取2h，提取結(jié)束后，再加入原料量10倍量的60 %甲醇溶液，85°C水浴中1.2MPa提 取2h，提取結(jié)束后合并2次的提取液，將得到的提取液在5kPa、微沸狀態(tài)下濃縮至5L。
[0073] 冷卻后，向減壓漏斗上放置兩層濾紙，減壓過濾濃縮液，將濾餅噴霧干燥后得到雪 茶提取物。其中，噴霧干燥器中的條件為：120MPa壓力下，將浸膏制成100μπι的微粒，將微粒 通過70°C的熱空氣干燥30s。
[0074] 使用C18色譜柱的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析該雪茶提取物(將該雪茶提取物溶解 在無水甲醇中，甲醇用量為雪茶提取物的10倍體積，配制成甲醇溶液），以甲醇:0.5%甲酸 溶液=75:25作為流動(dòng)相，250nm波長、柱溫25°C。
[0075] 分析可知，該雪茶提取物中，縮酚酸類化合物的質(zhì)量含量30%，鱗片衣酸的質(zhì)量含 量為15%、羊角衣酸質(zhì)量含量10%、雪茶素質(zhì)量含量5%。
[0076] 對照試驗(yàn)
[0077]稱取IOkg雪茶放入200L的萃取池中，置于轉(zhuǎn)盤上。加入二氯甲烷作為萃取溶劑，在 壓力10.34MPa和60°C溫度下，預(yù)熱Imin，靜態(tài)萃取2h，氮?dú)獯祾?0s。收集萃取液，向萃取液 中加入1 %體積倍量的無水硫酸鈉于〇 tC靜置過夜。過夜后的萃取液在0.7MPa、30 °C蒸發(fā)濃 縮去除大部分二氯甲烷，濃縮液于40°C經(jīng)噴霧干燥得到雪茶提取物。
[0078] 使用C18色譜柱的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析該雪茶提取物(將該雪茶提取物溶解 在無水甲醇中，甲醇用量為雪茶提取物的10倍體積，配制成甲醇溶液），以甲醇:0.5%甲酸 溶液=75:25作為流動(dòng)相，250nm波長、柱溫25°C。
[0079] 分析可知，該雪茶提取物中，縮酚酸類化合物的質(zhì)量含量30%，鱗片衣酸的質(zhì)量含 量為22%、羊角衣酸質(zhì)量含量6%、雪茶素質(zhì)量含量1 %。
[0080] 雪茶提取物對HDF細(xì)胞和HaCat細(xì)胞存活率的影響
[0081] 取對數(shù)生長期、濃度為IO5個(gè)/mL的人HDF細(xì)胞，將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 每孔細(xì)胞液l〇〇yL。最終所鋪的細(xì)胞孔數(shù)取決于樣品數(shù)，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
[0082]將96孔板置于37 °C的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h。
[0083] 將終濃度為lmg/mL、0.1mg/mL和0.01mg/mL的雪茶提取物加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 中，向?qū)φ战M加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液。于37°C、包含5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48h。
[0084] 然后向每孔中加入0.5mg/mL的MTTlOOyL，于37°C、包含5%⑶2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中黑 暗條件下孵育4h。去除上清液，加入150yL DMSO，震蕩以570nm為實(shí)驗(yàn)波長，630nm為參照波 長，檢測吸光度。
[0085]計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果如表1所示：
[0086] 表1，雪茶提取物對HDF細(xì)胞和HaCat細(xì)胞存活率的影響
[0088]以細(xì)胞存活率高于80%為對人HDF細(xì)胞和HaCat細(xì)胞無毒的標(biāo)準(zhǔn)，由表1可知，本發(fā) 明提供的雪茶提取物對人HDF細(xì)胞無毒的最高濃度為0.0 lmg/mL，由表1可知，本發(fā)明提供的 雪茶提取物對人HaCat細(xì)胞無毒的最高濃度為0.01mg/mL，因此，確定雪茶提取物的濃度 0.0 lmg/mL為后續(xù)的試驗(yàn)濃度。
[0089]雪茶提取物的抗衰老性能
[0090]自然狀態(tài)下雪茶提取物對HDF膠原蛋白分泌的影響
[0091]為了考察本發(fā)明提供的雪茶提取物對HDF膠原蛋白分泌的影響，本實(shí)施例將試驗(yàn) 分為空白組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)對照組和標(biāo)準(zhǔn)組。
[0092]取對數(shù)生長期、濃度為IO5個(gè)/mL細(xì)胞，每孔IOOyU于37°C、含有CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)24h，之后取出上清液，以3000rpm的速度離心10min，取上清液。
[0093] 向標(biāo)準(zhǔn)組中加入50yL標(biāo)準(zhǔn)液，向?qū)嶒?yàn)組1中加入IOyL上清液和40yL實(shí)施例三提供 的雪茶提取物的稀釋液，向?qū)嶒?yàn)組2中加入IOyL上清液和40yL實(shí)施例四提供的雪茶提取物 的稀釋液，向?qū)嶒?yàn)對照組中加入IOyL上清液和40yL采用對比實(shí)施例所述方法制備的雪茶提 取物的稀釋液，空白組中不加樣品，分別于37°C孵育lh，并洗板5次，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
[0094]向五組樣品中分別加入生物素標(biāo)記的抗-IgG抗體50yL，于37°C溫育30min，洗滌5 次。
[0095]向五組樣品中分別加入50yL的鏈霉素和素-HRP，輕輕震蕩混勻，于37 °C溫育 30min，洗滌5次。
[0096] 向五組樣品中分別加入顯色劑A和顯色劑B各50yL，輕輕震蕩混勻，于37°C避光孵 育30min，向五組樣品中加入終止液50yL。
[0097]以空白組調(diào)零，在終止反應(yīng)后15min內(nèi)，在450nm波長測量各組的吸光度，結(jié)果如表 2和圖1所示。
[0098]表2，雪茶提取物對HDF細(xì)胞I型膠原蛋白分泌的影響
[0100]膠原蛋白主要包括I型膠原和in型膠原，外界誘導(dǎo)促使真皮細(xì)胞中氧化水平提高 是細(xì)胞損傷的主要因素，氧化水平提高的直接結(jié)果是降低了 I型膠原蛋白的表達(dá)，兩種情況 造成的結(jié)果均為I型膠原蛋白在皮膚中的含量減少，而I型膠原蛋白含量減少是皮膚形成皺 紋的主要原因。由表2可知，向HDF細(xì)胞中添加本發(fā)明提供的濃度為0.01mg/mL雪茶提取物 后，皮膚中的I型膠原蛋白含量分別為空白組的1.04倍和1.18倍，而采用現(xiàn)有技術(shù)制備的雪 茶提取物與空白組中不加入雪茶提取物的I型膠原蛋白含量相差無幾，說明本發(fā)明提供的 雪茶提取物能夠顯著的促進(jìn)I型膠原蛋白的表達(dá)，是潛在的抗老化添加劑。
[0101] 過氧化氫對HDF細(xì)胞存活率的影響
[0102]選取不同濃度的過氧化氫，如50μΜ、100μΜ、200μΜ、400μΜ、600μΜ、800μ]\^Ρ1000μΜ， 與HDF細(xì)胞共同孵育不同時(shí)間，如3h、6h和9h等，采用MTT法檢測不同濃度的過氧化氫對HDF 細(xì)胞存活率的影響。
[0103] 取培養(yǎng)至濃度為IO5個(gè)/mL的HDF細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100yL。于37 °C、含有C〇2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h，每孔做復(fù)孔3個(gè)。
[0104]使用不同濃度的過氧化氫分別孵育造模3h、6h和9h;向每個(gè)樣品孔中加入濃度為 0.5mg/mL的MTT IOOyU于37°C、含有CO2的培養(yǎng)箱中，黑暗條件下孵育4h。
[0105] 去除上清液，向樣品中加入150yL DMS0,震蕩，以570nm為實(shí)驗(yàn)波長，630nm為參照 波長，檢測每個(gè)樣品的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。 Γ"_/? --十每個(gè)樣翁孔的啜光度V
[0106] 細(xì)胞存活率X 1繼瀹
[0107] 測試結(jié)果如圖2所示，人HDF細(xì)胞于濃度為50-800μΜ的過氧化氫共孵育3-9h后，人 HDF細(xì)胞的存活率明顯下降，當(dāng)孵育濃度超過400μΜ時(shí)，細(xì)胞存活率低于50% dOOyM過氧化 氫作用6h后，細(xì)胞存活率降到70 %。
[0108] 雪茶提取物對經(jīng)過過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞存活率的影響
[0109 ] 本測試分為空白組、陰性對照組、陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2和對照實(shí)驗(yàn)組。 [0110] 取培養(yǎng)至密度為IO5個(gè)/mL的HDF細(xì)胞接種于96孔板，每孔IOOyL。于37°C，含有CO2的 培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h。
[0111] 向陽性對照組中加入維甲酸，向?qū)嶒?yàn)組1中加入本發(fā)明實(shí)施例三提供的雪茶提取 物，向?qū)嶒?yàn)組2中加入本發(fā)明實(shí)施例四提供的雪茶提取物，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組中加入對比實(shí)施例 提供的雪茶提取物，空白組和陰性對照組不加樣品。
[0112] 利用過氧化氫損傷建模，并向每孔加入0.5mg/mL的MTT IOOyL，于37 °C、5 %⑶:^的 黑暗條件下孵育4h。去除上清液，加入DMSO 150yL，震蕩檢測吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果 如表3所示。
[0113]表3，雪茶提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞存活率的影響
[0115] 由表3可知，經(jīng)過過氧化氫孵育后，HDF細(xì)胞的存活率降低至70 %，如表3中的陰性 對照組所示。向經(jīng)過氧化氫損傷過的HDF細(xì)胞中加入本發(fā)明實(shí)施例三提供的雪茶提取物后， 人HDF細(xì)胞的存活率達(dá)到80.01 % ;向經(jīng)過氧化氫損傷過的HDF細(xì)胞中加入本發(fā)明實(shí)施例四 提供的雪茶提取物后，人HDF細(xì)胞的存活率達(dá)到77.19%，均高于對照實(shí)驗(yàn)組中的73%，以及 陰性對照組的70%，說明本發(fā)明提供的雪茶提取物相對于現(xiàn)有技術(shù)，能夠更有效修復(fù)過氧 化氫對HDF細(xì)胞的損傷。
[0116] 雪茶提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞I型膠原蛋白分泌的影響
[0117] 本試驗(yàn)分為空白組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、對照試驗(yàn)組、陰性對照組和陽性對照組。
[0118] 取培養(yǎng)至密度為IO5個(gè)/mL的HDF細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔ImU每孔設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。于37 °C，含有CO2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h。
[0119] 空白組、陰性對照組中不加入樣品，實(shí)驗(yàn)組1中加入本發(fā)明實(shí)施例三提供的雪茶提 取物，實(shí)驗(yàn)組2中加入本發(fā)明實(shí)施例四提供的雪茶提取物，對照實(shí)驗(yàn)組加入采用對比實(shí)施例 制備的雪茶提取物，向陽性對照組中加入維甲酸。
[0120] 實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、陽性對照組和對照實(shí)驗(yàn)組利用過氧化氫損傷建模。
[0121] 向每孔中加入0.5mg/mL的MTT IOOyL，于37 °C、5 % CO2的黑暗條件下孵育4h。去除 上清液，加入DMSO 150yL，震蕩檢測吸光度，計(jì)算膠原蛋白含量，結(jié)果如表4和圖3所示：
[0122] 表4,雪茶提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞I型膠原蛋白分泌的影響
[0124]由表4和圖3可知，經(jīng)過過氧化氫損傷后，HDF細(xì)胞I型膠原蛋白分泌量變?yōu)槲磽p傷 時(shí)的72%，如表4中陰性對照組所示。而向經(jīng)過氧化氫損傷過的HDF細(xì)胞中加入維甲酸后， HDF細(xì)胞中I型膠原蛋白的分泌量提高至94%，如表4中陽性對照組所述。而向經(jīng)過過氧化氫 損傷的HDF細(xì)胞中加入本發(fā)明提供的雪茶提取物后，人HDF細(xì)胞中I型膠原蛋白的含量達(dá)到 85%、89%。而向經(jīng)過氧化氫損傷過的HDF細(xì)胞中加入現(xiàn)有技術(shù)制備的雪茶提取物后，人HDF 細(xì)胞中I型膠原蛋白的含量為78%，明顯低于加入本發(fā)明提供的雪茶提取物后人HDF細(xì)胞中 I型膠原蛋白的含量，即本發(fā)明提供的雪茶提取物相對于現(xiàn)有技術(shù)制備的雪茶提取物，具有 優(yōu)良的修復(fù)細(xì)胞損傷的能力，能夠顯著修復(fù)過氧化氫對HDF細(xì)胞造成的損傷，是優(yōu)良的抗衰 老化妝品添加劑。
[0125] 雪茶提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-I)的影響
[0126] 材料與試劑
[0127] 細(xì)胞培養(yǎng)液24孔細(xì)胞培養(yǎng)板
[0128] 細(xì)胞培養(yǎng)箱過氧化氫
[0129] 離心機(jī) ELISA試劑盒 [0130] 測試步驟
[0131 ] 本測試分為標(biāo)準(zhǔn)組、空白組和實(shí)驗(yàn)組。
[0132] 取對數(shù)生長期的濃度為IO5個(gè)/mL的HDF細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔lmL，于37 °C，含有CO 2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。
[0133] 向?qū)嶒?yàn)組1中加入本發(fā)明實(shí)施例三提供的雪茶提取物，向?qū)嶒?yàn)組2中加入本發(fā)明實(shí) 施例四提供的雪茶提取物，向標(biāo)準(zhǔn)組加入標(biāo)準(zhǔn)物，空白組中不添加樣品。
[0134] 誘導(dǎo)建立過氧化氫損傷模型。小心吸取上清液培養(yǎng)基，離心，按照試劑盒說明書， 取IOyL細(xì)胞懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以空白孔調(diào)零，在反應(yīng)終止后15min內(nèi)，用450nm波長測量各孔的 吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的MMP-I的濃度及對應(yīng)的吸光度值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方 程，再根據(jù)樣本的吸光度值，在回歸方程上計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組中MMP-I的濃度。
[0135] 表5，雪茶提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞MMP-I含量的影響
[0137] 由表5和圖4可知，人HDF細(xì)胞經(jīng)過過氧化氫刺激后，HDF細(xì)胞中的MMP-I水平顯著上 升至原來的167%，如表5中陰性對照組所示。加入維甲酸后，MMP-I的值有所降低，如表5中 的陽性對照組所示。而向過氧化氫刺激過的HDF細(xì)胞中加入本發(fā)明提供的雪茶提取物后， MMP-I的含量均降低至100%左右，甚至100%以下，如加入本發(fā)明實(shí)施例四提供的雪茶提取 物后，MMP-I的含量為91 %。而向過氧化氫刺激過的HDF細(xì)胞中加入采用現(xiàn)有技術(shù)制備的雪 茶提取物后，HDF細(xì)胞中MMP-I的含量為130 %，說明本發(fā)明提供的雪茶提取物相對于現(xiàn)有技 術(shù)制備的雪茶提取物具有更明顯的抑制MMP-I的能力。即在氧化應(yīng)激條件下，本發(fā)明提供的 雪茶提取物具有優(yōu)異的抑制MMP-I表達(dá)的能力。
[0138] 雪茶提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞中丙二醛(MDA)的影響
[0139] MDA在酸性條件下加熱時(shí)，可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成紅色產(chǎn)物3，5，5-三 甲基惡唑-2，4-二酮，在532nm處有最大吸收峰。因底物為硫代巴比妥酸(TBA)，故稱此法為 TBA 法。
[0140] 取對數(shù)生長期、濃度為IO5個(gè)/mL的HDF細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2mL，培養(yǎng) 6h.
[0141] 向?qū)嶒?yàn)組1加入經(jīng)新鮮培養(yǎng)基稀釋的本發(fā)明實(shí)施例三制備的雪茶提取物，向?qū)嶒?yàn) 組2加入經(jīng)新鮮培養(yǎng)基稀釋的本發(fā)明實(shí)施例四制備的雪茶提取物，向?qū)φ战M加入經(jīng)新鮮培 養(yǎng)基稀釋的采用對照實(shí)施例制備的雪茶提取物，陽性對照組加入維甲酸，空白組和陰性對 照組不加入樣品。
[0142] 誘導(dǎo)建立過氧化氫損傷模型，以1000 rpm離心10min，收集培養(yǎng)基上清液中的細(xì)胞 及貼壁細(xì)胞，在細(xì)胞沉淀中加入500yL PBS，輕輕顛倒混勻，于4°C下，以2000rpm離心10min， 棄除上清液留存底部沉淀。向沉淀中加入500yL roS，超聲破碎細(xì)胞(400A，5s/次，間隙IOs 反復(fù)3~5次），制備細(xì)胞勻漿；
[0143] 按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將試劑混勻，用保鮮膜將試管口扎緊，用針頭刺孔透 氣，用鍋開蓋煮沸40min，取出后流水冷卻，以4000rpm離心10min，使沉淀完全。取上清液，采 用分光光度法測定532nm波長處的吸光度;利用BCA蛋白檢測試劑盒，按照說明書方法將本 發(fā)明制備的雪茶提取物稀釋適當(dāng)倍數(shù)，測定細(xì)胞中的蛋白質(zhì)含量。
[0144]表6，雪茶提取物對過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞MDA含量的影響
[0146] 由表6和圖5可知，不加入雪茶提取物時(shí)，HDF細(xì)胞中對應(yīng)的MDA含量記為100,過氧 化氫損傷后，MDA濃度快速上升，6h時(shí)MDA含量增加3.5倍至326.34，而加入維甲酸后MDA含量 的增加得到抑制，降低至空白組的2.6倍，向經(jīng)過過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞中加入本發(fā)明實(shí) 施例三提供的雪茶提取物后，MDA含量明顯降低至200左右，采用實(shí)施例四制備的雪茶提取 物以后，MDA含量降低至185,而加入采用現(xiàn)有技術(shù)制備的雪茶提取物后，經(jīng)過氧化氫損傷的 HDF細(xì)胞中MDA的含量為262,本發(fā)明提供的雪茶提取物與現(xiàn)有技術(shù)提供的雪茶提取物相比， 具有更明顯的抑制HDF細(xì)胞中MDA分泌的能力，即本發(fā)明提供的雪茶提取物對人HDF細(xì)胞損 傷具有顯著的修復(fù)作用。
[0147] 雪茶提取物去除自由基的性能
[0148] 1，1_二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，它的穩(wěn)定性 主要來自3個(gè)苯環(huán)的共振穩(wěn)定作用及空間障礙，使夾在中間的氮原子上不成對的電子不能 發(fā)揮其應(yīng)有的電子成對作用。作為一種穩(wěn)定的自由基，其可以清除其他的自由基。目前廣泛 用于定量測定生物試樣和食品的抗氧化能力。此法是根據(jù)DPPH自由基有單電子，在517nm處 有一強(qiáng)吸收，其醇溶液呈紫色的特性。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于與其單電子配對而使 其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)進(jìn)行 快速的定量分析。
[0149] 材料與試劑
[0150] DPPH 無水乙醇
[0151] dd 水 200yL 吸頭
[0152] 96孔板8通道加樣槍
[0153] 酶標(biāo)儀
[0154] 測試步驟
[0155] 用無水乙醇配置0.2mmol/L的DPPH溶液，避光保存，配置0.01mg/mL的表沒食子兒 茶素沒食子酸酯(EGCG)溶液，。
[0156] 向?qū)嶒?yàn)組1添加20uL濃度為0.01mg/mL本發(fā)明實(shí)施例三提供的雪茶提取物溶液和 0.2mmoI/L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白組1中添加180uL無水乙醇與20uL本發(fā) 明提供的雪茶提取物溶液，向標(biāo)準(zhǔn)組中添加180uL DPPH溶液與20uL蒸餾水，每孔設(shè)置至少3 個(gè)復(fù)孔，分別搖勻，室溫下暗處靜置30min，測定各組的吸光度。
[0157] 向?qū)嶒?yàn)組2添加20uL濃度為0.01mg/mL本發(fā)明實(shí)施例四提供的雪茶提取物溶液和 0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白組2中添加180uL無水乙醇與20uL本發(fā) 明提供的雪茶提取物溶液，向標(biāo)準(zhǔn)組中添加180uL DPPH溶液與20uL蒸餾水，每孔設(shè)置至少3 個(gè)復(fù)孔，分別搖勻，室溫下暗處靜置30min，測定各組的吸光度。
[0158] 向?qū)φ赵囼?yàn)組添加20uL濃度為0.01mg/mL采用現(xiàn)有技術(shù)制備的雪茶提取物溶液和 0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白組3中添加180uL無水乙醇與20uL采用 現(xiàn)有技術(shù)制備的雪茶提取物溶液，每孔設(shè)置至少3個(gè)復(fù)孔，分別搖勻，室溫下暗處靜置 30min，測定各組的吸光度。
[0159] 向陽性對照組中添加20uL濃度為0.0 lmg/mL EGCG溶液和0.2mmol/L的DPPH乙醇溶 液180uL至96孔板中，向空白組4中添加180uL無水乙醇與20uLEGCG溶液溶液，每孔設(shè)置至少 3個(gè)復(fù)孔，分別搖勻，室溫下暗處靜置30min，測定各組的吸光度。
[0160] DPPH自由基的清除能力按下式表示：
[0161]
[0162] 其中，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組的DPPH清除率時(shí)，測試樣吸光度分別為實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2的吸光 度，空白組吸光度分別為空白組1、空白組2的吸光度；
[0163] 計(jì)算對照實(shí)驗(yàn)組的DPPH清除率時(shí)，測試樣吸光度為對照實(shí)驗(yàn)組的吸光度，空白組 吸光度為空白組3的吸光度；
[0164] 計(jì)算陽性對照組的DPPH清除率時(shí)，測試樣吸光度為陽性對照組的吸光度，空白組 吸光度為空白組4的吸光度；
[0165] 清除率越大表明抗氧化能力越強(qiáng)，結(jié)果如圖6所示，當(dāng)溶液中不存在DPPH自由基 時(shí)，空白組的DPPH清除率為0，本發(fā)明實(shí)施例三制備的雪茶提取物對DPPH自由基的去除率為 33.62%，本發(fā)明實(shí)施例四制備的雪茶提取物對DPPH自由基的去除率為28.12%，而采用現(xiàn) 有技術(shù)制備的雪茶提取物對DPPH自由基的去除率不足20%，說明相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明 制備的雪茶提取物具有更優(yōu)異的DPPH清除率。
[0166] 雪茶提取物的保濕性能
[0167] 皮膚內(nèi)水分的含量的多少，直接影響皮膚的彈性、光澤度等，皮膚的表皮、真皮、皮 下組織均對皮膚維持水分起著不同的作用。在皮膚保濕過程中，主要有兩種機(jī)制影響皮膚 對水的維持作用：
[0168] I)皮膚作為天然屏障，避免水分流失；
[0169] 皮膚表皮是人的天然屏障，其中透明層、顆粒層和角質(zhì)層對皮膚鎖水能力起到重 要作用。透明層含有磷脂類物質(zhì)和角質(zhì)蛋白，能夠防止水分及電解質(zhì)等透過皮膚。顆粒層的 細(xì)胞排列致密，對貯存水分、防止水分滲透具有重要的作用。角質(zhì)層是由角質(zhì)形成細(xì)的堅(jiān) 韌、有彈性的板層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)充滿了角蛋白。
[0170] 2)皮膚中存在許多保濕因子，吸收和鎖住水分。
[0171] 雪茶提取物對HDF細(xì)胞透明質(zhì)酸合成酶(HAs3)表達(dá)量的影響
[0172] 正常皮膚中，HA主要由HAs合成，HAs主要包括三種，分別為說31、說82、說83，其中 HAs3的催化活性最大，且催化生成小分子量的HA(200-300ku)，而HA是已知的保濕能力最強(qiáng) 的物質(zhì)，因此，皮膚中HAs3的含量提高能夠間接促進(jìn)皮膚的保濕能力。
[0173] 本測試分為空白組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、對照實(shí)驗(yàn)組和標(biāo)準(zhǔn)組。
[0174] 取對數(shù)生長期、濃度為IO5個(gè)/mL的HDF細(xì)胞，將培養(yǎng)的細(xì)胞接種于24孔板中，每孔 細(xì)胞液ImU于37°C、含有CO 2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。
[0175] 向?qū)嶒?yàn)組1細(xì)胞液中加入一定量本發(fā)明實(shí)施例三提供的雪茶提取物，向?qū)嶒?yàn)組2細(xì) 胞液中加入一定量本發(fā)明實(shí)施例四提供的雪茶提取物，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組中加入對比實(shí)施例提 供的雪茶提取物，向標(biāo)準(zhǔn)組中加入標(biāo)準(zhǔn)液，空白組不加樣品。
[0176] 置于37 °C、含有5 %⑶:^及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h;棄除上清液，用 預(yù)冷I3BS沖洗細(xì)胞兩次，在培養(yǎng)孔中加入IOOyL裂解液，冰上裂解細(xì)胞IOmin，收集細(xì)胞裂解 液，以13000rpm離心I Omin，取上清液備用。
[0177] 按照ELISA試劑盒說明書，取細(xì)胞裂解液進(jìn)行試驗(yàn)；
[0178]利用BCA試劑盒檢測不同組別蛋白質(zhì)含量，各組HAs3表達(dá)量采用蛋白量矯正，結(jié)果 如表7和圖7所示。
[0179]表7,雪茶提取物對HAs3表達(dá)的影響
[0181]由表7和圖7可知，添加本發(fā)明提供的雪茶提取物后，人HDF細(xì)胞中HAs3含量比不加 入雪茶提取物中的含量提高27%，說明本發(fā)明提供的雪茶提取物保濕性比現(xiàn)有技術(shù)制備的 雪茶提取物的保濕性好。
[0182] 雪茶提取物對透明質(zhì)酸分泌的影響
[0183]在皮膚真皮層中，透明質(zhì)酸(HA)是含量較多的氨基多糖，HA粘稠度極高且能高比 例地結(jié)合水分子，HA的含量直接影響皮膚中水分的含量。作為皮膚內(nèi)重要的保濕成分，它對 皮膚細(xì)胞的增殖、分化有顯著作用，對維持皮膚細(xì)胞的正常新陳代謝至關(guān)重要。
[0184] 本測試分為空白組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、對照實(shí)驗(yàn)組和標(biāo)準(zhǔn)組。
[0185] 取對數(shù)生長期的濃度為IO5個(gè)/mL的人HDF細(xì)胞，將培養(yǎng)的細(xì)胞接種于24孔板中，每 孔細(xì)胞液ImU于37°C、含有CO 2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。
[0186] 向?qū)嶒?yàn)組1細(xì)胞液中加入本發(fā)明實(shí)施例三提供的雪茶提取物，向?qū)嶒?yàn)組2細(xì)胞液中 加入本發(fā)明實(shí)施例四提供的雪茶提取物，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組細(xì)胞液中加入對比實(shí)施例提供的雪 茶提取物，置于37°C、含有5%C0 2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h;
[0187] 小心收集上清培養(yǎng)基，離心后得到上清液，備用。
[0188] 向標(biāo)準(zhǔn)組中加入50yL標(biāo)準(zhǔn)液，向?qū)嶒?yàn)組1中加入IOyL上清液和40yL本發(fā)明實(shí)施例 三提供的雪茶提取物的稀釋液，向?qū)嶒?yàn)組2中加入IOyL上清液和40yL本發(fā)明實(shí)施例四提供 的雪茶提取物的稀釋液，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組中加入IOyL上清液和40yL對比實(shí)施例提供的雪茶提 取物的稀釋液，空白組中不加樣品，分別于37°C孵育lh，并洗板5次。
[0189] 向五組樣品中分別加入顯色劑A和顯色劑B各50yL，于37°C避光孵育30min，向五組 樣品中加入終止液50yL。
[0190] 以空白組調(diào)零，在終止反應(yīng)后15min內(nèi)，在450nm波長測量各組的吸光光度值，并根 據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞液中HA的含量，結(jié)果如表8和圖8所示。
[0191] 表8，雪茶提取物對HA分泌的影響
[0193] 由表8和圖8可知，添加本發(fā)明提供的雪茶提取物后，人HDF細(xì)胞中HA含量比未加入 雪茶提取物時(shí)，HDF細(xì)胞中HA含量提高了約13%。而加入現(xiàn)有技術(shù)提供的雪茶提取物后，HDF 細(xì)胞中HA含量提高了 5%，說明相對于現(xiàn)在技術(shù)制備的雪茶提取物，本發(fā)明提供的雪茶提取 物能夠明顯促進(jìn)HDF細(xì)胞分泌HA，有效保持細(xì)胞中水分，并進(jìn)而起到保濕的作用。
[0194] 雪茶提取物對兜甲蛋白（LOR)表達(dá)的影響
[0195] 角質(zhì)層是由角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)成的堅(jiān)韌有彈性的板層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)充滿了角蛋白。 角蛋白是非水溶性的硬蛋白，有阻止化學(xué)物質(zhì)內(nèi)滲和體液外滲的作用，其中含量最高的角 蛋白叫做兜甲蛋白，約占角蛋白的80 %，兜甲蛋白的含量會直接影響皮膚水分的流失狀況。
[0196] 本試驗(yàn)通過考察Hacat細(xì)胞兜甲蛋白（LOR)的表達(dá)來考察本發(fā)明提供的雪茶提取 物的保濕性能。本測試分為空白組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、對照試驗(yàn)組和標(biāo)準(zhǔn)組。
[0197] 取對數(shù)生長期的濃度為IO5個(gè)/mL的Hacat細(xì)胞，將培養(yǎng)的細(xì)胞接種于24孔板中，每 孔細(xì)胞液ImU于37°C、含有CO 2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。
[0198] 向?qū)嶒?yàn)組1細(xì)胞液中加入本發(fā)明實(shí)施例三提供的雪茶提取物，向?qū)嶒?yàn)組2細(xì)胞液中 加入本發(fā)明實(shí)施例四提供的雪茶提取物，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組細(xì)胞液中加入對比實(shí)施例提供的雪 茶提取物，置于37°C、含有5%C0 2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h;
[0199] 棄除上清液，用預(yù)冷I3BS沖洗細(xì)胞兩次，在培養(yǎng)孔中加入IOOyL裂解液，冰上裂解細(xì) 胞IOmin，收集細(xì)胞裂解液，以13000rpm離心10min，取上清液備用。
[0200] 按照ELISA試劑盒說明書，取細(xì)胞裂解液進(jìn)行試驗(yàn)；
[0201] 利用BCA試劑盒檢測不同組別蛋白質(zhì)含量，各組LOR表達(dá)量采用蛋白量矯正，結(jié)果 如表9和圖9所示。
[0202]表9,雪茶提取物對LOR表達(dá)的影響
[0204] 由表9和圖9可知，添加本發(fā)實(shí)施例四提供的雪茶提取物后，人HaCat細(xì)胞中LOR含 量比空白組提高31%，而添加采用現(xiàn)有技術(shù)制備的雪茶提取物后，LOR含量僅比空白組提高 12%，這說明本發(fā)明提供的雪茶提取物能夠顯著促進(jìn)LOR的表達(dá)。
[0205] 綜上所述，本發(fā)明提供的雪茶提取物具有顯著的保濕性能和優(yōu)良的抗衰老抗氧化 能力，能夠作為雙重作用的添加劑加入化妝品中。
[0206] 以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種化妝品和/或護(hù)膚品，其特征在于，所述化妝品和/或護(hù)膚品包含雪茶提取物，所 述雪茶提取物的含量為0.001 %-50 %。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化妝品和/或護(hù)膚品，其特征在于，所述雪茶提取物的質(zhì)量含 量為 5 %-50 %。3. -種雪茶提取物，其特征在于，所述雪茶提取物包括縮酚酸類化合物，所述酚酸類化 合物為鱗片衣酸、羊角衣酸、雪茶素、地茶酸中的任意一種或幾種組合。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的雪茶提取物，其特征在于，所述縮酚酸類化合物的質(zhì)量含量為 5-50% 〇5. -種根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的雪茶提取物的制備方法，其特征在于，所述方法包括 如下步驟： 步驟1、取粉碎后的雪茶原料，向所述雪茶原料中添加體積為所述雪茶原料10-20倍的 溶媒，在60-150 °C提取多次，合并提取液； 步驟2、減壓過濾步驟1中合并后的所述提取液，得到過濾液，并減壓濃縮所述過濾液， 得到所述雪茶提取物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟1中雪茶的提取條件為1.2- 1.8MPaS〇.2-〇.8MPa。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述溶媒為甲醇和/或其水溶液、乙醇 和/或其水溶液、乙醚中的至少一種。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟2中減壓濃縮后還包括100-300目 硅膠柱純化，所述硅膠柱純化的條件為25 °C_50 °C，三氯甲烷：甲醇:水=(1-3): (1-5): (1-2)作為洗脫劑洗脫，所述洗脫劑的流速2-4BV/h，洗脫溫度為30°C-5(TC。9. 一種如權(quán)利要求3或4所述雪茶提取物的應(yīng)用，其特征在于，所述雪茶提取物應(yīng)用于 制備涂覆于皮膚外表面的制品。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的雪茶提取物的應(yīng)用，其特征在于，所述制品為化妝品和/或護(hù) 膚品。
【文檔編號】A61Q19/08GK106074263SQ201610520127
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月5日
【發(fā)明人】洪民華, 劉丹, 趙兆, 洪奇, 呂智, 盧艷花, 何浩
【申請人】上海相宜本草化妝品股份有限公司, 華東理工大學(xué)