一種魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑及其制備與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開一種魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑及其制備與應(yīng)用，屬于殺滅魚類寄生蟲藥物技術(shù)領(lǐng)域。該復(fù)方制劑由下列原料藥按重量百分比制成：苦參20～40％，白薇60～80％。該復(fù)方制劑的制備方法是將各原料藥分別干燥后粉碎，過篩，得各原料藥干粉；將所得原料藥干粉按重量百分比組成，混合，再加入95％的乙醇，浸泡提取2次，得到總提取液；將所得總提取液減壓濃縮，所得濃縮液干燥至恒重，得到魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑。本發(fā)明的中草藥復(fù)方制劑具有易分解，無殘留及對環(huán)境和人安全的優(yōu)點，降低了白薇粗提物的毒性，提高了苦參抗小瓜蟲的藥效，其成本大大降低，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及推廣，在水產(chǎn)上具有廣闊應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑及其制備與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于殺滅魚類寄生蟲藥物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)是一種全球分布的寄生纖毛蟲，主要寄生于淡水魚的皮膚、鰓和鰭，引起小瓜蟲病，又稱“白點病”，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。目前主要通過化學藥物來防治小瓜蟲病，但是化學藥物存在污染環(huán)境和危害人類健康的風險，尤其是在孔雀石綠被禁用后，市場上缺少有效防治小瓜蟲病的藥物。中草藥植物具有易分解，無殘留及對環(huán)境和人安全的優(yōu)點，具有開發(fā)成安全高效綠色漁藥的前景。目前，已發(fā)現(xiàn)部分抗小瓜蟲的植物種類，其中，從白薇中分離鑒定了迄今為止殺小瓜蟲效果最好，且安全性高的活性化合物直立白薇苷C，然而該活性化合物在白薇中的含量僅為
0.0031%，成本太高，難以商業(yè)化，而白薇的酒精粗提物可以大大降低成本，同時也有良好的殺小瓜蟲活性，但是白薇酒精粗提物的毒性較高，連續(xù)用低于最低殺小瓜蟲成蟲濃度(8mg/L)的白薇粗提物治療患小瓜蟲病的草魚7天，全部魚中毒死亡。另一種中藥苦參也具有抗多子小瓜蟲作用，雖然其粗提物的毒性低，但殺小瓜蟲活性也較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑。該中草藥復(fù)方制劑低毒、易分解、對環(huán)境友好。
[0004]本發(fā)明另一目的在于提供所述的魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑的制備方法。
[0005]本發(fā)明再一目的在于提供所述的魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
[0007]—種魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑，該中草藥復(fù)方制劑由下列原料藥按重量百分比制成:苦參(Sophora f lavescens)20?40%，白薇(Cynanchum atratum)60?80%。
[0008]優(yōu)選地，苦參(Sophoraflavescens)30%，白薇(Cynanchum atratum)70%。
[0009]所述的苦參產(chǎn)于浙江，所述的白薇產(chǎn)于安徽。
[0010]所述的魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑的制備方法，包括如下步驟:
[0011](a)將各原料藥分別干燥后粉碎，過篩，得各原料藥干粉；
[0012](b)將步驟(a)所得原料藥干粉按重量百分比組成，混合，再加入95%乙醇，浸泡提取2次，得到總提取液；
[0013](c)將步驟(b)所得總提取液減壓濃縮，所得濃縮液干燥至恒重，得到魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑。
[0014]步驟(a)中所述的干燥是在烘箱中于55?65°C烘干；
[0015]步驟(a)中所述的過篩的目數(shù)為40?60目，優(yōu)選為50目。
[0016]步驟(b)中所述的95%乙醇的體積為各原料藥干粉混合物的重量的10?15倍，優(yōu)選為1倍。
[0017]步驟(b)中所述的浸泡的溫度為室溫，所述的浸泡的時間為18?36h，優(yōu)選為24h。
[0018]步驟(c)中所述的減壓濃縮的溫度為70?80°C;
[0019]步驟(c)中所述的干燥的條件是在烘箱中55?65°C下干燥。
[0020]所述的魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑在制備殺滅多子小瓜蟲的飼料添加劑或飼料中的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明的原理是:該中草藥復(fù)方中的每一種中草藥都具有殺滅多子小瓜蟲的功能。據(jù)報道，苦參其根部用于治療病毒性肝炎、病毒性心肌炎、腸胃出血和皮膚疾病，如濕疹、陰道炎和牛皮癬等，還具有退熱、抗腫瘤和抗心肌衰弱等生物功能。日本學者已經(jīng)證明苦參堿和氧化苦參堿具有殺滅刺激隱核蟲的抗寄生蟲效果，張其中等人也報道了苦參粗提物抗多子小瓜蟲活性。
[0022]白薇為蘿蘑科鵝絨藤屬植物直立白薇或蔓生白薇的干燥根。白薇具有抗煙草花葉病毒、抗炎、治療失憶癥和抑制乙酰膽堿酶等功能。張其中等人已經(jīng)報道了白薇中的直立白薇苷C具有特別好的殺小瓜蟲活性。
[0023]因此，將白薇和苦參兩種中藥配合組成復(fù)方，該復(fù)方既有良好的抗小瓜蟲活性，毒性又低，商業(yè)化前景廣闊。
[0024]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果:
[0025](I)本發(fā)明的中草藥復(fù)方制劑，一方面，克服了孔雀石綠和汞制劑禁用藥物毒性大，殘留高，具有“三致”作用的缺點，具有易分解，無殘留，對環(huán)境和人安全的優(yōu)點，另一方面，也降低了白薇粗提物的毒性，提高了苦參抗小瓜蟲的藥效，大大降低了成本，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及推廣。該復(fù)方具有預(yù)防與治療多子小瓜蟲病的作用，在水產(chǎn)上具有廣闊應(yīng)用前景。
[0026](2)本發(fā)明的制作工藝簡單易行，工廠和個體養(yǎng)殖者都可制備出符合要求的制劑。
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0028]實施例中用到的寄主模型魚為草魚(Ctenopharyngodon idellus)，來源于廣州市花都區(qū)五星村魚苗場。寄生蟲模型為多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multif iliis)，來源于廣州市花地灣花鳥魚蟲市場。
[0029]實施例1:苦參與白薇對多子小瓜蟲幼蟲的殺滅作用
[0030](I)中草藥乙醇浸膏的制備:將苦參和白薇分別置于55°C烘箱中干燥后粉碎，過50目篩，分別得到干粉;將50g苦參和白薇分別放于中藥材提取罐中，再加入500mL 95%的乙醇，室溫浸泡提取24h，重復(fù)2次，得到總提取液;將總提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進一步減壓濃縮，所得濃縮液置于55 °C烘箱中干燥至恒重。
[0031 ] (2)中草藥藥液的配制:分別稱取乙醇浸膏3.84mg放于1.5mL的EP管中，用含0.10ADMSO的蒸餾水進行溶解，配成2560mg/L的藥物原液，儲存于4 °C冰箱備用。
[0032](3)幼蟲活性檢測:將含有大約600個多子小瓜蟲幼蟲的10yL水溶液加入96孔板的各孔中，另外加入10(^1^不同濃度的藥液，使最終濃度為128、64、32、16、12、8、4、2和01!^/L，每個濃度設(shè)置3個平行，實驗溫度控制在23±0.5°(:。4倍顯微鏡下統(tǒng)計4h內(nèi)幼蟲的死亡時間。
[0033]結(jié)果顯示:苦參和白薇乙醇粗提物殺滅多子小瓜蟲幼蟲的最低濃度分別為8和16mg/L，全部致死時間分別為13(^P124min。
[0034]實施例2:苦參與白薇聯(lián)用藥敏試驗
[0035](I)中草藥乙醇浸膏的制備同實施例1。
[0036](2)中草藥藥液的配制同實施例1。
[0037](3)根據(jù)苦參和白薇乙醇浸膏對多子小瓜蟲感染性幼蟲活性實驗的結(jié)果，分別以其MIC開始進行兩倍濃度梯度稀釋，每種中草藥稀釋4個濃度梯度。采用棋盤交叉法，每種復(fù)方最終檢測濃度為16個濃度梯度。同時以2MIC、MIC、1/2MIC和不加藥的0.1 %DMS0的蒸餾水作為對照組，進行離體殺滅幼蟲實驗。中草藥聯(lián)用實驗以FIC指數(shù)作為聯(lián)用藥敏實驗的判定依據(jù)。FIC指數(shù)=(聯(lián)用后A藥的MIC值/聯(lián)用前A藥的MIC值)+ (聯(lián)用后B藥的MIC值/聯(lián)用前B藥的MIC值)，判斷標準:FIC指數(shù)<0.75時，為協(xié)同作用;FIC指數(shù)=1時，為累加作用；KFIC指數(shù)<2時，為無關(guān)作用;FIC指數(shù)多2時，為拮抗作用。FIC指數(shù)越小，協(xié)同作用越強，若FIC指數(shù)<0.5，則認為兩藥有顯著協(xié)同作用。
[0038]結(jié)果顯示:苦參與白薇聯(lián)用后所得FIC值為I，表明具有累加作用。
[0039]實施例3:中草藥復(fù)方對多子小瓜蟲幼蟲的殺滅作用
[0040](I)中草藥復(fù)方乙醇浸膏的制備:苦參120g，白薇280g，總重量400g，置于中藥材提取罐中，再加入4L 95%的乙醇，室溫浸泡提取24h，重復(fù)2次，得到總提取液;將總提取液在旋蒸儀中進一步減壓濃縮，所得濃縮液置于55°C烘箱中干燥至恒重，得到魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑。
[0041 ] (2)中草藥復(fù)方藥液的配制:稱取乙醇浸膏3.84mg放于1.5mL的EP管中，用20yL無水乙醇促溶，然后用蒸餾水配成2560mg/L的藥物原液，儲存于4°C冰箱備用。以最高濃度藥液中的無水乙醇含量(0.13%)作為標準，配制含0.13%無水乙醇的對照組處理液。
[0042](3)幼蟲活性檢測:將含有大約600個多子小瓜蟲幼蟲的10yL水溶液加入96孔板的各孔中，另外加入10yL不同濃度的藥液，使最終濃度為128、64、32、16、12、8、4、2、1、0.5和Omg/L，每個濃度設(shè)置3個平行，實驗溫度控制在23±0.5°(:。4倍顯微鏡下統(tǒng)計4h內(nèi)幼蟲的死亡時間和第4h幼蟲的死亡率，計算出EC5Q。計算公式如下:
[0043]死亡率(% ) = (1-實驗組幼蟲個數(shù)/對照組幼蟲個數(shù))X 100%。
[0044]結(jié)果顯示:中草藥復(fù)方在12mg/L濃度下，115min能夠使感染性幼蟲100%致死，并且隨著藥物濃度的增加，致死時間變短。
[0045]實施例4:中草藥復(fù)方對多子小瓜蟲成蟲的殺滅作用
[0046](I)中草藥復(fù)方乙醇浸膏的制備同實施例3。
[0047](2)中草藥復(fù)方藥液的配制同實施例3。
[0048](3)成蟲活性檢測:將含有大約60個成蟲的200yL的水溶液加入24孔板的各孔中，隨后加入200yL不同濃度的藥液，使最終濃度為128、64、32、16、12、8、4、2、1、0.5和Omg/L，每個濃度設(shè)置3個平行。4倍顯微鏡下記錄5h內(nèi)成蟲的死亡時間和第5h的死亡率，計算出半數(shù)有效濃度(EC5q)。接著將24孔板靜置于23±0.5°C溫度條件下，統(tǒng)計6h各孔存活成蟲形成的包囊個數(shù)，經(jīng)過17h，包囊釋放出感染性幼蟲，統(tǒng)計平均每個包囊釋放出感染性幼蟲的數(shù)量，計算公式如下:
[0049]死亡率(%) = (1-實驗前成蟲個數(shù)/實驗后成蟲個數(shù))X 100% ;
[0050]平均每個包囊釋放出感染性幼蟲數(shù)=各孔感染性幼蟲數(shù)/各孔的包囊數(shù)。
[0051 ] 結(jié)果顯示:12mg//L濃度下的中草藥復(fù)方在202min內(nèi)可全部殺滅多子小瓜蟲成蟲，并且隨著濃度升高，全部致死時間變短。8mg/L的中草藥復(fù)方5h內(nèi)的殺蟲率為85%，并且能夠完全抑制形成的包囊釋放出感染性幼蟲。
[0052]實施例5:中草藥復(fù)方對多子小瓜蟲包囊的殺滅作用
[0053](I)中草藥復(fù)方乙醇浸膏的制備同實施例3。
[0054](2)中草藥復(fù)方藥液的配制同實施例3。
[0055](3)包囊活性檢測:將含有大約60個成蟲的200yL水溶液加入24孔板各孔中，而后將24孔板靜置于23 ± 0.5 °C溫度條件下6h，待全部形成包囊并統(tǒng)計各孔包囊個數(shù)，然后加入20(^1^不同濃度的藥液，使最終濃度為128、64、32、16、12、8、4、2、1和011^/1，每個濃度設(shè)置3個平行。在23±0.5°C條件下靜置16h，待全部包囊釋放出感染性幼蟲后，統(tǒng)計每個包囊平均釋放出幼蟲的數(shù)量。
[0056]平均每個包囊釋放出感染性幼蟲數(shù)=各孔感染性幼蟲數(shù)/各孔的包囊數(shù)。
[0057]結(jié)果顯示:中草藥復(fù)方濃度在8mg/L及以上，能夠完全抑制包囊釋放出感染性幼蟲。另外，隨著藥物濃度的降低，平均每個包囊釋放出的感染性幼蟲數(shù)增加。
[0058]實施例6:低濃度中草藥復(fù)方對多子小瓜蟲幼蟲感染力的影響
[0059](I)中草藥復(fù)方乙醇浸膏的制備同實施例3。
[0060](2)中草藥復(fù)方藥液的配制:根據(jù)實施例3的方法，配制成16、8、4、2和Omg/L的藥液各50mL。
[0061 ] (3)取大約含有100000個感染性幼蟲的1mL蟲液加入50mL燒杯中，再加入1mL藥液，混勻，使最終濃度為8、4、2、I和Omg/L的藥液，然后在23 ± 0.5 °C靜置Ih。取150尾健康草魚隨機平均分配到15個水族箱中(事先準備15個裝有4L曝氣自來水的水族箱，每個水族箱10尾魚)。將被藥液處理過的感染性幼蟲倒入各水族箱中，讓平均每條魚10000只感染性幼蟲感染草魚，每一處理濃度設(shè)置3個平行。感染2h后，每個水族箱的曝氣自來水體積加至10L，由充氧栗供氧，實驗溫度保持在23±0.5°C。每天觀察草魚的存活情況，如有死魚及時撈出，以免影響水質(zhì)。實驗第七天，用150mg/L的麻醉劑(MS-222)(Sigma)麻醉草魚，記錄每尾草魚體表的白點數(shù)，并統(tǒng)計感染率和感染強度。
[0062]感染率=(體表有白點的魚數(shù)/總魚數(shù))X100% ;
[0063]感染強度=體表白點總數(shù)/體表有白點的魚數(shù)。
[0064]結(jié)果顯示:8mg/L的中草藥復(fù)方能顯著阻止多子小瓜蟲感染草魚，且感染強度僅為3.8±4.0。處理濃度在4mg/L時感染強度和感染率與對照相比差異顯著。表明，低濃度的中草藥復(fù)方能降低多子小瓜蟲幼蟲的感染能力。
[0065]實施例7:中草藥復(fù)方預(yù)防和治療小瓜蟲病效果
[0066](I)中草藥復(fù)方乙醇浸膏的制備同實施例3。
[0067](2)中草藥復(fù)方藥液的配制:稱取5g的中草藥復(fù)方乙醇浸膏，根據(jù)實施例3，配制成10000、50000、25000 和 Omg/L 的藥液各 50mL。
[0068](3)選擇輕度感染的草魚(體表白點數(shù)為37± 13.6)隨機分配到21個含有60L曝氣自來水的10L水族箱中，每個水族箱5尾已感染小瓜蟲草魚。隨后向每個水族箱中加入10尾健康草魚混養(yǎng)。溫度保持在23±0.5°C。隨后向水族箱中加入上述配制的原藥液，混勻，使最終濃度為5、4、2和Omg/L，每個濃度設(shè)置3個平行。實驗期間，每天加入與第一天體積相同的原藥液，觀察魚的存活情況(如有死魚，及時撈出，以免影響水質(zhì))，隨機麻醉(150mg/L MS-222)3尾患病草魚，計數(shù)其體表白點數(shù)。若無白點，所對應(yīng)濃度的實驗組停止用藥，記錄治療時間，用150mg/L的麻醉劑(MS-222) (Sigma)麻醉全部草魚，記錄每尾草魚體表的白點數(shù)，統(tǒng)計感染率、感染強度和存活率。在實驗第8天，全部實驗組停止加藥，并統(tǒng)計感染率、感染強度和存活率，同時更換50 %無藥液的新鮮曝氣自來水。在第25天，記錄存活草魚體表的白點數(shù)，并統(tǒng)計各實驗組的感染率、感染強度和存活率。計算公式如下:
[0069]感染率(％)=(體表有白點的魚數(shù)/總魚數(shù))X 100% ;
[0070]感染強度=體表白點總數(shù)/體表有白點的魚數(shù)；
[0071 ] 存活率(% )=(實驗后存活魚數(shù)/總魚數(shù))X 100%。
[0072]結(jié)果顯示:中草藥復(fù)方在5mg/L濃度下，藥物累加治療8天，預(yù)防與治療多子小瓜蟲病，實驗組已感染草魚與未感染草魚的感染率和感染強度均為0，存活率均為100%。藥物在4mg/L濃度下，未感染魚的感染率為0，被感染魚的感染率下降到73.3%，且感染強度與對照組相比，顯著降低。
[0073]實施例8:中草藥復(fù)方對魚的急性毒性實驗
[0074](I)中草藥復(fù)方乙醇浸膏的制備同實施例3。
[0075](2)中草藥復(fù)方藥液的配制同實施例7。
[0076](3)預(yù)實驗:中草藥復(fù)方使草魚24h全部致死的濃度為190mg/L，96h不發(fā)生死亡的濃度 90mg/L。
[0077]事先18個裝有1L曝氣自來水的水族箱，每個水族箱放10尾健康草魚，溫度控制在
23± 0.5 °C，并由充氧栗供氧。在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，再設(shè)置170、130、100和Omg/L，每個濃度3個平行重復(fù)，進行急性毒性實驗。實驗期間，隨時觀察各濃度組實驗魚的中毒情況，如發(fā)現(xiàn)草魚中毒死亡，立即撈出，以免破壞水質(zhì)，影響實驗結(jié)果。記錄在24、48、72、和96h各個濃度組，草魚的死亡數(shù)量。根據(jù)草魚死亡數(shù)及死亡時間，計算24h、48h、96h半致死濃度(LC5q)和對草魚的安全濃度。
[0078]結(jié)果顯示:中草藥復(fù)方對草魚24、48、96h的半致死濃度(LC5q)分別為164.2mg/L，152.5mg/L，136.9mg/L;對草魚安全濃度為39.5mg/L。中草藥復(fù)方安全濃度是其預(yù)防與治療濃度的8倍左右，對魚絕對安全。
[0079]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑，其特征在于:該中草藥復(fù)方制劑由下列原料藥按重量百分比制成:苦參(Sophora f Iavescens)20?40%，白薇(Cynanchumatratum)60?80%。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑，其特征在于:該中草藥復(fù)方制劑由下列原料藥按重量百分比制成:苦參30%，白薇70%。3.權(quán)利要求1或2所述的魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (a)將各原料藥分別干燥后粉碎，過篩，得各原料藥干粉； (b)將步驟(a)所得原料藥干粉按重量百分比組成，混合，再加入95%乙醇，浸泡提取2次，得到總提取液； (c)將步驟(b)所得總提取液減壓濃縮，所得濃縮液干燥至恒重，得到魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于: 步驟(a)中所述的干燥是在烘箱中于55?65°C烘干。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于: 步驟(a)中所述的過篩的目數(shù)為40?60目。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于: 步驟(b)中所述的95%乙醇的體積為各原料藥干粉混合物的重量的10?15倍。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于: 步驟(b)中所述的浸泡的溫度為室溫，所述的浸泡的時間為18?36h。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于: 步驟(c)中所述的減壓濃縮的溫度為70?80°C。9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于: 步驟(c)中所述的干燥的條件是在烘箱中55?65°C下干燥。10.權(quán)利要求1或2所述的魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復(fù)方制劑在制備殺滅多子小瓜蟲的飼料添加劑或飼料中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K36/489GK106038682SQ201610569132
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月18日
【發(fā)明人】張其中, 林德杰
【申請人】暨南大學