一種人工血管及其制備方法
【專利摘要】一種人工血管及其制備方法，屬于器官制造及生物材料技術(shù)領(lǐng)域。該人工血管包括外皮層、成纖維細(xì)胞層、平滑肌細(xì)胞層、內(nèi)皮細(xì)胞層和內(nèi)腔。本發(fā)明利用等離子噴涂、電噴涂、電紡絲、倒模和3D打印綜合技術(shù)實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮層、平滑肌細(xì)胞層、成纖維細(xì)胞層和外皮層在三維空間的有序排布，采用抗凝血因子增強(qiáng)人工血管的抗凝血性，采用生長因子控釋的辦法實(shí)現(xiàn)其中干細(xì)胞的分步誘導(dǎo)分化，并經(jīng)脈動(dòng)反應(yīng)器對(duì)人工血管進(jìn)行培養(yǎng)，使其在結(jié)構(gòu)和功能上模擬天然動(dòng)物血管，為血管移植修復(fù)提供相應(yīng)的替代品，本發(fā)明對(duì)于其他管狀組織和器官，如食管、氣管、輸卵管、膽管、尿道和膀胱等同樣適用。
【專利說明】
_種人工血管及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種人工血管及其制備方法，屬于器官制造及生物材料技術(shù)領(lǐng)域?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，心血管類疾病是全球發(fā)病率、死亡率最高的疾病之一，全球每年約有超過1，700萬人死于心臟疾病。在歐洲發(fā)達(dá)國家心血管類疾病已成為最大的致死原因，每年造成至少200萬人死亡，約占總死亡人數(shù)的40%。僅美國每年的血管移植物就超過140萬例。在我國，隨著當(dāng)代心腦血管疾病的增多，下肢靜脈病發(fā)病率和冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)也逐年增加，僅北京阜外醫(yī)院每年手術(shù)1000例左右，且以20%的速度遞增。我國先天性心臟病的發(fā)病率是6.7%。，每年有數(shù)以萬計(jì)的病人接受手術(shù)治療，其中大多數(shù)需要人工血管和帶有血管通道的瓣膜。臨床上對(duì)人工血管移植物的需求日益突出。隨之而來的問題便是人工血管的制作工藝和移植物的選取。臨床上血管移植物一般應(yīng)具備以下幾個(gè)特性:①良好的血液相容性，無血栓形成。②足夠的力學(xué)性能和抗縫合強(qiáng)度。③良好的生物可降解性和組織再生能力。④溶出物、滲出物及降解物無毒、無免疫排異反應(yīng)。⑤制備方法簡單、材料來源廣泛、價(jià)格低廉。
[0003]目前臨床上血管移植主要采取自體移植或同種異體移植，供體來源受到很大的限制。利用組織工程或3D打印技術(shù)可以制備出一些血管類似物，但此類產(chǎn)品性能均存在著嚴(yán)重的缺陷[Nerem RM，et al.Ann Rev B1med Eng 2001 ;3:225]〇
[0004]如抗縫合強(qiáng)度很差、急慢性栓塞、內(nèi)膜增生、動(dòng)脈瘤形成、易感染等，臨床上還沒有一種滿意的小直徑血管替代產(chǎn)品[Bordenave L, et al.Clin Hemorheol Microcirc 2005 ; 33:227]。例如，美國哥倫比亞大學(xué)的Norotte教授等開發(fā)出了一種基于三維自動(dòng)電腦輔助沉積的生物凝膠球體3D打印技術(shù)，應(yīng)用于無支架的小直徑血管成形，只體現(xiàn)了成形技術(shù)的快速、可重復(fù)和可量化等優(yōu)勢[Norotte C，et al.B1materials, 2009, 30:5970]。美國 Clemson大學(xué)Mironov V等利用改裝的噴墨打印機(jī)將一層基質(zhì)材料上打印一層血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成了類似面包圈的準(zhǔn)三維立體結(jié)構(gòu)[Mironov V，et al.Trends B1technol.，2003; 21:157]。只體現(xiàn)了噴墨打印機(jī)響應(yīng)速度較快，成形精度高、成形速度快，成形材料粘度低等特點(diǎn)。新加坡南洋理工大學(xué)(Nanyang Technological University)的Leong等利用選擇性激光燒結(jié)(Selective laser sintering，SLS)制造血管支架結(jié)構(gòu)，研究了適合于SLS 技術(shù)的聚合物以及其成形結(jié)構(gòu)的特性[Leong KF，et al.B1materials, 2003, 24:2363]，這種支架離人工血管相距甚遠(yuǎn)。又如，美國猶他大學(xué)Skardal等利用FabOhome公司購進(jìn)的儀器打印透明質(zhì)酸溶液并用四面體聚乙二醇四丙烯酸酯交聯(lián)制備血管修復(fù)材料[Skardal A，et al.B1materials, 2010, 31:6173]。美國南卡羅來納醫(yī)科大學(xué)Kasyanov等利用同類設(shè)備FabOCTI打印硅滴和組織塊，模擬腎中分支血管部分[Kasyanov V，et al.Virtual and Physical Prototyping, 2011，6 (4):197]。美國伊利諾伊大學(xué)厄巴納-香檳分校Wu 等人用自制的3D打印設(shè)備先直寫有機(jī)石蠟，然后用環(huán)氧樹脂浸泡形成有分支結(jié)構(gòu)的液體可以進(jìn)出的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[Wu W，et al.Soft Matter, 2010,6:739]。美國賓夕法尼亞大學(xué)Miller等人首先將碳水化合物玻璃打印成網(wǎng)格狀模板，用澆注法復(fù)合載細(xì)胞溶液形成管道狀血液通路[Miller JS，et al.Nature Materials, 2012,11:768]。美國華盛頓大學(xué)zhang等用類似的石刻技術(shù)在天然膠原基質(zhì)中形成內(nèi)皮化微流通道[Zhang Y，et al.PNAS，2012, 109(24):9342]。這些制品從不同角度體現(xiàn)了天然血管的某些特性，但在抗凝血性、抗縫合性、生長修復(fù)能力方面均不能滿足人工血管移植替換要求。其中材料的抗凝血性、抗縫合強(qiáng)度和生長能力是制約各種不同人工血管修復(fù)材料臨床應(yīng)用的主要屏障，也是未來發(fā)展的主要方向。
[0005]利用再生醫(yī)學(xué)原理來構(gòu)建人工血管已經(jīng)成為目前醫(yī)學(xué)和工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。現(xiàn)有的工程技術(shù)，如倒模和三維打印技術(shù)并不能制備可與人體動(dòng)靜脈血管直接相連的可植入型人工血管修復(fù)材料。這些因素促使我們對(duì)各種不同技術(shù)進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，利用復(fù)合多噴頭 3D打印、電噴涂、倒模、電紡絲等綜合技術(shù)實(shí)現(xiàn)各種生物材料，制備與天然血管結(jié)構(gòu)和功能相匹配的人工血管替代物，為大量病患者提供福音。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種人工血管及其制備方法，使其在結(jié)構(gòu)和功能上模擬天然血管，用于各種動(dòng)靜脈管直接移植和替換，達(dá)到修復(fù)再生的目的。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]—種人工血管，其特征在于:所述的人工血管從外至內(nèi)依次包括外皮層、成纖維細(xì)胞層、平滑肌細(xì)胞層、內(nèi)皮細(xì)胞層和內(nèi)腔；所述的外皮層是采用合成高分子溶液經(jīng)等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技術(shù)噴射合而成；所述的成纖維細(xì)胞層、平滑肌細(xì)胞層和內(nèi)皮細(xì)胞層是采用含細(xì)胞的天然高分子溶液經(jīng)倒模技術(shù)灌注或3D打印技術(shù)堆積而成；天然高分子溶液中復(fù)合質(zhì)量百分比為〇.01-1 %的生長因子和抗凝血因子，所述的內(nèi)腔的直徑為〇.l-8mm。
[0009]本發(fā)明所述的一種人工血管，其特征在于:所述的內(nèi)皮細(xì)胞層的厚度為 0? 001-0.2mm ;所述的平滑肌細(xì)胞層的厚度為0? 01-5mm ;所述的成纖維細(xì)胞層的厚度為 0.001-0.2mm〇
[0010]本發(fā)明的上述技術(shù)方案中，其特征在于:所述的成纖維細(xì)胞層、平滑肌細(xì)胞層和內(nèi)皮細(xì)胞層的天然高分子溶液采用質(zhì)量百分比為〇.1?20%的明膠、海藻酸鈉、右旋糖、膠原、纖維蛋白原、活性肽、殼聚糖、透明質(zhì)酸、細(xì)胞外基質(zhì)、瓊酯糖、層粘連蛋白、硫酸軟骨素、 卡拉膠和蛋白多糖溶液中的至少一種；天然高分子溶液中溶劑為磷酸鹽緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)液、生理鹽水、血清和體液中的至少一種；所述外皮層的合成高分子溶液采用質(zhì)量體積百分比為0.1-30%的聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物和聚酯和聚羥基酸酯中的至少一種；合成高分子溶液的溶劑為四乙二醇或1，4-二氧六環(huán)。
[0011]優(yōu)選地，本發(fā)明所述的天然高分子溶液中復(fù)合量百分比為1-10%的凍存因子，在天然高分子溶液中的細(xì)胞密度為1 X 102 7個(gè)/mL。
[0012]本發(fā)明所述的內(nèi)皮細(xì)胞層的天然高分子溶液所含細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞生長因子混合物；平滑肌細(xì)胞層的天然高分子溶液所含細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞，或干細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞生長因子混合物；成纖維細(xì)胞層的天然高分子溶液所含細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，或干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞生長因子混合物；所述的干細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的至少一種。
[0013]本發(fā)明提供了一種所述人工血管的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟:
[0014]1)首先配制質(zhì)量百分比為0.1-20%的天然高分子溶液，在天然高分子溶液中加入質(zhì)量百分比為〇.01-1 %的抗凝血因子；在含有抗凝血因子的天然高分子溶液中分別加入內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、或干細(xì)胞與生長因子混合物，制備成含不同細(xì)胞的天然高分子溶液，其中細(xì)胞在天然高分子溶液中的密度為1 x 102 7個(gè)/mL ;
[0015]2)制備一系列直徑不同的空心圓柱模具，將第一空心圓柱模具外部套上一個(gè)直徑較大的第二空心圓柱模具，兩模具中間留有縫隙，用滴管或注射器將含內(nèi)皮細(xì)胞，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到兩模具間的縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，形成內(nèi)皮細(xì)胞層；
[0016]3)在步驟2)的基礎(chǔ)上去掉第二空心圓柱模具，在內(nèi)皮細(xì)胞層外面套上一個(gè)直徑較大的第三空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟2)的方法將含平滑肌細(xì)胞，或干細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到內(nèi)皮細(xì)胞層和第三空心圓柱模具間的縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，形成平滑肌細(xì)胞層；
[0017]4)在步驟3)的基礎(chǔ)上去掉第三空心圓柱模具，在平滑肌細(xì)胞層外面套上一個(gè)直徑較大的第四空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟2)或3)的方法將含成纖維細(xì)胞，或干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到平滑肌細(xì)胞層和第四空心圓柱模具間的縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，形成成纖維細(xì)胞層；
[0018]5)去掉第一空心圓柱模具和第四空心圓柱模具，利用等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技術(shù)在成纖維細(xì)胞層外面噴涂一層質(zhì)量體積百分比為〇.1-30%的合成高分子溶液，萃取有機(jī)溶劑形成外皮層；
[0019]6)將步驟5)中制備的人工血管放入脈動(dòng)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)盒中，進(jìn)行脈動(dòng)培養(yǎng)， 細(xì)胞培養(yǎng)液從培養(yǎng)盒中通過；在脈動(dòng)培養(yǎng)過程中，在細(xì)胞培養(yǎng)液中依次加入內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、平滑肌細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子，使人工血管中的干細(xì)胞由里向外依次轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，脈動(dòng)頻率控制在每分鐘1-100次。
[0020]本發(fā)明提供的另一種所述人工血管的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟:
[0021]1)首先配制質(zhì)量百分比為0.1-20%的天然高分子溶液，在天然高分子溶液中加入質(zhì)量百分比為0.01-1 %的抗凝血因子；在含有抗凝血因子的中天然高分子溶液中分別加入內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、或干細(xì)胞與生長因子混合物，制備成含不同細(xì)胞的天然高分子溶液，其中細(xì)胞在天然高分子溶液中的密度為1 X 102 7個(gè)/mL ;
[0022]2)采用3D打印技術(shù)從內(nèi)到外逐層打印內(nèi)皮細(xì)胞層、平滑肌細(xì)胞層和成纖維細(xì)胞層，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，并形成中空的圓柱狀三維結(jié)構(gòu)；內(nèi)皮細(xì)胞層為含內(nèi)皮細(xì)胞，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液；平滑肌細(xì)胞層為含平滑肌細(xì)胞，或干細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液；成纖維細(xì)胞層為含成纖維細(xì)胞，或干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液；
[0023]3)利用等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技術(shù)在成纖維細(xì)胞層外面噴涂一層質(zhì)量體積百分比為0.1-30%的合成高分子溶液，萃取有機(jī)溶劑形成外皮層，最終形成具有三維結(jié)構(gòu)的人工血管；
[0024]4)將步驟3)中制備的人工血管放入脈動(dòng)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)盒中，進(jìn)行脈動(dòng)培養(yǎng)， 細(xì)胞培養(yǎng)液從培養(yǎng)盒中通過；在脈動(dòng)培養(yǎng)過程中，在細(xì)胞培養(yǎng)液中依次加入內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、平滑肌細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子，使人工血管中的干細(xì)胞由里向外依次轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，脈動(dòng)頻率控制在每分鐘1-100次。
[0025]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)及突出性效果:①本發(fā)明利用倒模、等離子噴涂、電噴涂、電紡絲或3D打印等綜合技術(shù)實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞和高分子材料在空間的準(zhǔn)確定位，能夠模仿人體血管的結(jié)構(gòu)和功能，實(shí)現(xiàn)了三維尺度上人工血管的構(gòu)建；②通過可控三維應(yīng)力場對(duì)其中的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行訓(xùn)練或培養(yǎng)，促使內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞按某一方向排列，形成不同組織區(qū)域，提高了人工血管的機(jī)械強(qiáng)度，使之在滿足細(xì)胞增殖生長及新陳代謝需要的同時(shí)，具備優(yōu)異的抗凝血功能、抗縫合功能和再生功能，完成了人工血管向天然血管方向的轉(zhuǎn)變，達(dá)到人體動(dòng)靜脈血管修復(fù)再生的目的；③本發(fā)明對(duì)于其他管狀組織和器官，如食管、氣管、輸卵管、膽管、尿道和膀胱等同樣適用?！靖綀D說明】
[0026]圖1為人工血管三維結(jié)構(gòu)示意圖。
[0027]圖1中:101_外皮層；102-成纖維細(xì)胞層；103-平滑肌細(xì)胞層；104-內(nèi)皮細(xì)胞層； 105-內(nèi)腔。
[0028]圖2為脈動(dòng)生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0029]圖2中:1 一培養(yǎng)瓶；2—導(dǎo)管；3 —閥門；4一培養(yǎng)盒；5—活塞壓縮機(jī)構(gòu)；6—控制閥；7—脈動(dòng)栗；8—滑塊；9 一電機(jī)。【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0031]圖1為人工血管三維結(jié)構(gòu)示意圖，所述的人工血管從外至內(nèi)依次包括外皮層101、 成纖維細(xì)胞層102、平滑肌細(xì)胞層103、內(nèi)皮細(xì)胞層104和內(nèi)腔105 ;所述的外皮層101是采用合成高分子溶液經(jīng)等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技術(shù)噴射合而成；所述的成纖維細(xì)胞層 102、平滑肌細(xì)胞層103和內(nèi)皮細(xì)胞層104是采用含細(xì)胞的天然高分子溶液經(jīng)倒模技術(shù)灌注或3D打印技術(shù)堆積而成；天然高分子溶液中復(fù)合質(zhì)量百分比為0.01-1 %的生長因子和抗凝血因子，所述的內(nèi)腔105的直徑為0.1-8_。所述的內(nèi)皮細(xì)胞層的厚度為0.001-0.2_ ; 所述的平滑肌細(xì)胞層的厚度為〇.〇1-5_ ;所述的成纖維細(xì)胞層的厚度為0.001-0.2_。
[0032]所述的成纖維細(xì)胞層、平滑肌細(xì)胞層和內(nèi)皮細(xì)胞層的天然高分子溶液采用質(zhì)量百分比為0.1?20%的明膠、海藻酸鈉、右旋糖、膠原、纖維蛋白原、活性肽、殼聚糖、透明質(zhì)酸、細(xì)胞外基質(zhì)、瓊酯糖、層粘連蛋白、硫酸軟骨素、卡拉膠和蛋白多糖溶液中的至少一種； 天然高分子溶液中溶劑為磷酸鹽緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)液、生理鹽水、血清和體液中的至少一種；所述外皮層的合成高分子溶液采用質(zhì)量體積百分比為〇.1-30%的聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物和聚酯和聚羥基酸酯中的至少一種；合成高分子溶液的溶劑為四乙二醇或1，4-二氧六環(huán)。
[0033] 天然高分子溶液中還可以復(fù)合質(zhì)量百分比為1-10%的凍存因子，在天然高分子溶液中的細(xì)胞密度為1 X 102 7個(gè)/mL。內(nèi)皮細(xì)胞層的天然高分子溶液所含細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞生長因子混合物；平滑肌細(xì)胞層的天然高分子溶液所含細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞，或干細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞生長因子混合物；成纖維細(xì)胞層的天然高分子溶液所含細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，或干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞生長因子混合物；所述的干細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞、 骨髓干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的至少一種。
[0034] 本發(fā)明提供了一種所述人工血管的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟:
[0035] 1)首先配制質(zhì)量百分比為0.1-20%的天然高分子溶液，在天然高分子溶液中加入質(zhì)量百分比為〇.01-1 %的抗凝血因子；在含有抗凝血因子的天然高分子溶液中分別加入內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、或干細(xì)胞與生長因子混合物，制備成含不同細(xì)胞的天然高分子溶液，其中細(xì)胞在天然高分子溶液中的密度為1 X 102 7個(gè)/mL ;
[0036] 2)制備一系列直徑不同的空心圓柱模具，將第一空心圓柱模具外部套上一個(gè)直徑較大的第二空心圓柱模具，兩模具中間留有縫隙，用滴管或注射器將含內(nèi)皮細(xì)胞，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到兩模具間的縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，形成內(nèi)皮細(xì)胞層；
[0037]3)在步驟2)的基礎(chǔ)上去掉第二空心圓柱模具，在內(nèi)皮細(xì)胞層外面套上一個(gè)直徑較大的第三空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟2)的方法將含平滑肌細(xì)胞，或干細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到內(nèi)皮細(xì)胞層和第三空心圓柱模具間的縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，形成平滑肌細(xì)胞層；
[0038]4)在步驟3)的基礎(chǔ)上去掉第三空心圓柱模具，在平滑肌細(xì)胞層外面套上一個(gè)直徑較大的第四空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟2)或3)的方法將含成纖維細(xì)胞，或干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到平滑肌細(xì)胞層和第四空心圓柱模具間的縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，形成成纖維細(xì)胞層；
[0039] 5)去掉第一空心圓柱模具和第四空心圓柱模具，利用等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技術(shù)在成纖維細(xì)胞層外面噴涂一層質(zhì)量體積百分比為〇.1-30%的合成高分子溶液，萃取有機(jī)溶劑形成外皮層；
[0040]6)將步驟5)中制備的人工血管放入脈動(dòng)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)盒中，進(jìn)行脈動(dòng)培養(yǎng)， 細(xì)胞培養(yǎng)液從培養(yǎng)盒中通過；在脈動(dòng)培養(yǎng)過程中，在細(xì)胞培養(yǎng)液中依次加入內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、平滑肌細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子，使人工血管中的干細(xì)胞由里向外依次轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，脈動(dòng)頻率控制在每分鐘1-100次。
[0041] 本發(fā)明提供的第二種所述人工血管的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟:
[0042] 1)首先配制質(zhì)量百分比為0.1-20%的天然高分子溶液，在天然高分子溶液中加入質(zhì)量百分比為0.01-1 %的抗凝血因子；在含有抗凝血因子的中天然高分子溶液中分別加入內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、或干細(xì)胞與生長因子混合物，制備成含不同細(xì)胞的天然高分子溶液，其中細(xì)胞在天然高分子溶液中的密度為1 x 102 7個(gè)/mL ;
[0043]2)采用3D打印技術(shù)從內(nèi)到外逐層打印內(nèi)皮細(xì)胞層、平滑肌細(xì)胞層和成纖維細(xì)胞層，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，并形成中空的圓柱狀三維結(jié)構(gòu)；內(nèi)皮細(xì)胞層為含內(nèi)皮細(xì)胞，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液；平滑肌細(xì)胞層為含平滑肌細(xì)胞，或干細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液；成纖維細(xì)胞層為含成纖維細(xì)胞，或干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液；
[0044]3)利用等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技術(shù)在成纖維細(xì)胞層外面噴涂一層質(zhì)量體積百分比為0.1-30%的合成高分子溶液，萃取有機(jī)溶劑形成外皮層，最終形成具有三維結(jié)構(gòu)的人工血管；
[0045]4)將步驟3)中制備的人工血管放入脈動(dòng)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)盒中，進(jìn)行脈動(dòng)培養(yǎng)， 細(xì)胞培養(yǎng)液從培養(yǎng)盒中通過；在脈動(dòng)培養(yǎng)過程中，在細(xì)胞培養(yǎng)液中依次加入內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、平滑肌細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子，使人工血管中的干細(xì)胞由里向外依次轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，脈動(dòng)頻率控制在每分鐘1-100次。
[0046]圖2為脈動(dòng)生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖，該脈動(dòng)生物反應(yīng)器包括一個(gè)培養(yǎng)瓶1、導(dǎo)管 2、閥門3、培養(yǎng)盒4、活塞壓縮機(jī)構(gòu)5、控制閥6、脈動(dòng)栗7、滑塊8和電機(jī)9 ;其中培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)盒、脈動(dòng)栗由導(dǎo)管連接，營養(yǎng)液從培養(yǎng)盒中通過；人工血管放在培養(yǎng)盒中。
[0047]實(shí)施例1: 一種小直徑血管及其制備方法
[0048]a)分別配制質(zhì)量百分比為0.1%的海藻酸鈉和20%的明膠溶液，將海藻酸鈉和明膠溶液按體積比1:1混合均勻，其中加入1%的抗凝血因子肝素及10%的細(xì)胞凍存因子二甲基亞砜；將內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞分別與該混合液混合，細(xì)胞在藻酸鈉與明膠混合液中的密度為1 X 102個(gè)/mL ;
[0049]b)將步驟a)中各種含細(xì)胞溶液裝載到3D打印設(shè)備的噴頭組件中，逐層打印內(nèi)腔直徑為0.1mm、由內(nèi)向外依次為內(nèi)皮細(xì)胞層、平滑肌細(xì)胞層和成纖維細(xì)胞層的空心圓柱體； 用質(zhì)量百分比為1 %的氯化鈣溶液交聯(lián)海藻酸鈉分子，使三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；
[0050]c)利用等離子噴涂技術(shù)在步驟b)形成的三維結(jié)構(gòu)外部噴涂一層質(zhì)量體積百分比為30%的聚乙烯溶液，萃取有機(jī)溶劑形成外皮層；
[0051]d)將步驟c)制備的人工血管放入脈動(dòng)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)盒中，分別使用含內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、平滑肌細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)液，按每分鐘100次頻率對(duì)人工血管進(jìn)行脈動(dòng)培養(yǎng)，增強(qiáng)細(xì)胞間的連接和抗張強(qiáng)度。
[0052]實(shí)施例2:—種大直徑血管及其制備方法
[0053]a)制備一系列直徑大于6_的空心圓柱模具，分別配制含骨髓干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的纖維蛋白原溶液，其中纖維蛋白原溶液質(zhì)量百分比為5%，細(xì)胞在纖維蛋白原溶液中的密度為1 X 107個(gè)/mL，在骨髓干細(xì)胞溶液中別加入質(zhì)量百分比為1 %的平滑肌細(xì)胞生長因子、1%的抗凝血因子肝素及10%的細(xì)胞凍存因子二甲基亞砜；
[0054]b)將一個(gè)直徑較小的第一空心圓柱模具外套上一個(gè)直徑較大的第二空心圓柱模具，兩模具中間留有縫隙，用滴管將含內(nèi)皮細(xì)胞和肝素的纖維蛋白原溶液注射到兩模具間的縫隙中，利用質(zhì)量百分比為10%凝血酶使其中纖維蛋白原聚合，形成內(nèi)皮細(xì)胞層；
[0055]c)在步驟b)的基礎(chǔ)上去掉第二空心圓柱模具，在內(nèi)皮細(xì)胞層外套上一個(gè)直徑較大的第三空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟b)的方法將含骨髓干細(xì)胞和肝素的纖維蛋白原溶液灌注到內(nèi)皮細(xì)胞層和第三空心圓柱模具間的縫隙中，利用利用質(zhì)量百分比為 10%凝血酶使其中纖維蛋白原聚合，形成平滑肌細(xì)胞層；
[0056]d)在步驟c)的基礎(chǔ)上去掉第三空心圓柱模具，在平滑肌細(xì)胞層外套上一個(gè)直徑較大的第四空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟b)或c)的方法將含成纖維細(xì)胞的纖維蛋白原溶液灌注到平滑肌細(xì)胞層和第四空心圓柱模具間的縫隙中，利用10%凝血酶使其中纖維蛋白原聚合，形成成纖維細(xì)胞層；
[0057]e)去掉第一空心圓柱模具和第四空心圓柱模具，利用電紡絲技術(shù)在成纖維細(xì)胞層外噴涂一層質(zhì)量百分比為〇.1 %聚乳酸_羥基乙酸共聚物合成高分子溶液，萃取有機(jī)溶劑形成外皮層。
[0058]f)將步驟e)制備的人工血管放入脈動(dòng)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)盒中，按每分鐘1次頻率脈動(dòng)培養(yǎng)，增強(qiáng)細(xì)胞間連接和抗張強(qiáng)度；分別讓含內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、平滑肌細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)液。
[0059]實(shí)施例3:—種中等直徑血管及其制備方法
[0060]a)制備一系列直徑在2_6mm間的空心圓柱模具，配制含脂肪干細(xì)胞的膠原溶液， 其中膠原溶液質(zhì)量百分比為1 %，脂肪干細(xì)胞在膠原溶液中的密度為1 X 105個(gè)/mL ;在三組脂肪干細(xì)胞溶液中分別加入質(zhì)量百分比為〇.01%的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、平滑肌細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子、0.01 %的抗凝血因子紫杉醇及1 %的細(xì)胞凍存因子甘油；
[0061]b)將一個(gè)直徑較小的第一空心圓柱模具外套上一個(gè)直徑較大的第二空心圓柱模具，兩模具中間留有縫隙，用滴管將含脂肪干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、紫杉醇和甘油的膠原溶液注射到兩模具間的縫隙中，利用質(zhì)量百分比為1%氫氧化鈉使其中膠原聚合，形成內(nèi)皮細(xì)胞層；
[0062]c)在步驟b)的基礎(chǔ)上去掉第二空心圓柱模具，在內(nèi)皮細(xì)胞層外套上一個(gè)直徑較大的第三空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟b)的方法將含脂肪干細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞生長因子、紫杉醇和甘油的膠原溶液注射到內(nèi)皮層和第三空心圓柱模具間的縫隙中，利用質(zhì)量百分比為1 %氫氧化鈉使其中膠原聚合，形成平滑肌細(xì)胞層；
[0063]d)在步驟c)的基礎(chǔ)上去掉第三空心圓柱模具，在平滑肌細(xì)胞層外套上一個(gè)直徑較大的第四空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟b)或c)的方法將含脂肪干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞生長因子、紫杉醇和甘油的膠原溶液注射到平滑肌細(xì)胞層和第四空心圓柱模具間的縫隙中，利用1%氫氧化鈉使其中膠原聚合，形成成纖維細(xì)胞層；
[0064]e)去掉第一空心圓柱模具和第四空心圓柱模具，利用電紡絲技術(shù)在成纖維細(xì)胞層外噴涂一層質(zhì)量百分比為1%聚氨酯溶液，萃取有機(jī)溶劑形成外皮層。
[0065]f)將步驟e)制備的人工血管放入脈動(dòng)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)盒中，分別讓含內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、平滑肌細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)液按每分鐘80次頻率脈動(dòng)培養(yǎng)，增強(qiáng)細(xì)胞間連接和抗張強(qiáng)度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種人工血管，其特征在于:所述的人工血管從外至內(nèi)依次包括外皮層(101)、成 纖維細(xì)胞層(102)、平滑肌細(xì)胞層(103)、內(nèi)皮細(xì)胞層(104)和內(nèi)腔(105);所述的外皮層 (101)是采用合成高分子溶液經(jīng)等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技術(shù)噴射合而成；所述的成 纖維細(xì)胞層(102)、平滑肌細(xì)胞層(103)和內(nèi)皮細(xì)胞層(104)是采用含細(xì)胞的天然高分 子溶液經(jīng)倒模技術(shù)灌注或3D打印技術(shù)堆積而成；天然高分子溶液中復(fù)合質(zhì)量百分比為 0.01-1%的生長因子和抗凝血因子，所述的內(nèi)腔(105)的直徑為0.1-8mm。2.如權(quán)利要求1所述的一種人工血管，其特征在于:所述的內(nèi)皮細(xì)胞層的厚度為 0? 001-0.2mm ;所述的平滑肌細(xì)胞層的厚度為0? 01-5mm ;所述的成纖維細(xì)胞層的厚度為 0?001-0.2mm〇3.如權(quán)利要求1或2所述的一種人工血管，其特征在于:所述的成纖維細(xì)胞層、平滑肌 細(xì)胞層和內(nèi)皮細(xì)胞層的天然高分子溶液采用質(zhì)量百分比為〇.1?20%的明膠、海藻酸鈉、 右旋糖、膠原、纖維蛋白原、活性肽、殼聚糖、透明質(zhì)酸、細(xì)胞外基質(zhì)、瓊酯糖、層粘連蛋白、硫 酸軟骨素、卡拉膠和蛋白多糖溶液中的至少一種；天然高分子溶液中溶劑為磷酸鹽緩沖液、 細(xì)胞培養(yǎng)液、生理鹽水、血清和體液中的至少一種；所述外皮層的合成高分子溶液采用質(zhì)量 體積百分比為〇.1-30%的聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚乙二 醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物和聚酯和聚羥基酸酯中的至少一種；合成高分子溶液的溶劑 為四乙二醇或1，4-二氧六環(huán)。4.如權(quán)利要求3所述的一種人工血管，其特征在于:天然高分子溶液中復(fù)合質(zhì)量百分 比為1-10%的凍存因子，在天然高分子溶液中的細(xì)胞密度為IX 102 7個(gè)/mL。5.如權(quán)利要求1所述的人工血管，其特征在于:內(nèi)皮細(xì)胞層的天然高分子溶液所含細(xì) 胞為內(nèi)皮細(xì)胞，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞生長因子混合物；平滑肌 細(xì)胞層的天然高分子溶液所含細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞，或干細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞混合物，或干細(xì) 胞與平滑肌細(xì)胞生長因子混合物；成纖維細(xì)胞層的天然高分子溶液所含細(xì)胞為成纖維細(xì) 胞，或干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞生長因子混合物；所述的干細(xì) 胞為間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的至少一 種。6.—種如權(quán)利要求1或2所述人工血管的制備方法，其特征在于該方法包括如下步 驟:1)首先配制質(zhì)量百分比為〇.1-20%的天然高分子溶液，在天然高分子溶液中加入質(zhì) 量百分比為0.01-1 %的抗凝血因子；在含有抗凝血因子的天然高分子溶液中分別加入內(nèi) 皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、或干細(xì)胞與生長因子混合物，制備成含不同細(xì)胞 的天然高分子溶液，其中細(xì)胞在天然高分子溶液中的密度為1 X 102 7個(gè)/mL ;2)制備一系列直徑不同的空心圓柱模具，將第一空心圓柱模具外部套上一個(gè)直徑較大 的第二空心圓柱模具，兩模具中間留有縫隙，用滴管或注射器將含內(nèi)皮細(xì)胞，或干細(xì)胞與內(nèi) 皮細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到兩模具間的 縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，形成內(nèi)皮細(xì)胞層；3)在步驟2)的基礎(chǔ)上去掉第二空心圓柱模具，在內(nèi)皮細(xì)胞層外面套上一個(gè)直徑較大 的第三空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟2)的方法將含平滑肌細(xì)胞，或干細(xì)胞與平 滑肌細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到內(nèi)皮細(xì)胞層和第三空心圓柱模具間的縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚 合，形成平滑肌細(xì)胞層；4)在步驟3)的基礎(chǔ)上去掉第三空心圓柱模具，在平滑肌細(xì)胞層外面套上一個(gè)直徑較 大的第四空心圓柱模具，中間留有縫隙，采用步驟2)或3)的方法將含成纖維細(xì)胞，或干細(xì) 胞與成纖維細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液灌注到 平滑肌細(xì)胞層和第四空心圓柱模具間的縫隙中，利用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交 聯(lián)或聚合，形成成纖維細(xì)胞層；5)去掉第一空心圓柱模具和第四空心圓柱模具，利用等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技 術(shù)在成纖維細(xì)胞層外面噴涂一層質(zhì)量體積百分比為0.1-30%的合成高分子溶液，萃取有機(jī) 溶劑形成外皮層；6)將步驟5)中制備的人工血管放入脈動(dòng)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)盒中，進(jìn)行脈動(dòng)培養(yǎng)，細(xì)胞 培養(yǎng)液從培養(yǎng)盒中通過；在脈動(dòng)培養(yǎng)過程中，在細(xì)胞培養(yǎng)液中依次加入內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、 平滑肌細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子，使人工血管中的干細(xì)胞由里向外依次轉(zhuǎn)化為 內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，脈動(dòng)頻率控制在每分鐘1-100次。7.—種如權(quán)利要求1或2所述人工血管的制備方法，其特征在于該方法包括如下步 驟:1)首先配制質(zhì)量百分比為〇.1-20%的天然高分子溶液，在天然高分子溶液中加入質(zhì) 量百分比為0.01-1%的抗凝血因子；在含有抗凝血因子的中天然高分子溶液中分別加入 內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、或干細(xì)胞與生長因子混合物，制備成含不同細(xì) 胞的天然高分子溶液，其中細(xì)胞在天然高分子溶液中的密度為1 X 102 7個(gè)/mL ;2)采用3D打印技術(shù)從內(nèi)到外逐層打印內(nèi)皮細(xì)胞層、平滑肌細(xì)胞層和成纖維細(xì)胞層，利 用交聯(lián)劑或聚合劑使其中天然高分子交聯(lián)或聚合，并形成中空的圓柱狀三維結(jié)構(gòu)；內(nèi)皮細(xì) 胞層為含內(nèi)皮細(xì)胞，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞生長因子混合物的 天然高分子溶液；平滑肌細(xì)胞層為含平滑肌細(xì)胞，或干細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞 與平滑肌細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液；成纖維細(xì)胞層為含成纖維細(xì)胞，或干細(xì) 胞與成纖維細(xì)胞混合物，或干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞生長因子混合物的天然高分子溶液；3)利用等離子噴涂、電噴涂或電紡絲技術(shù)在成纖維細(xì)胞層外面噴涂一層質(zhì)量體積百分 比為0.1-30%的合成高分子溶液，萃取有機(jī)溶劑形成外皮層，最終形成具有三維結(jié)構(gòu)的人 工血管；4)將步驟3)中制備的人工血管放入脈動(dòng)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)盒中，進(jìn)行脈動(dòng)培養(yǎng)，細(xì)胞 培養(yǎng)液從培養(yǎng)盒中通過；在脈動(dòng)培養(yǎng)過程中，在細(xì)胞培養(yǎng)液中依次加入內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、 平滑肌細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子，使人工血管中的干細(xì)胞由里向外依次轉(zhuǎn)化為 內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，脈動(dòng)頻率控制在每分鐘1-100次。
【文檔編號(hào)】A61F2/06GK105983134SQ201510097472
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年3月5日
【發(fā)明人】劉暢
【申請(qǐng)人】劉暢