用于修復子宮內膜損傷的干細胞復合膠原支架試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于修復子宮內膜損傷的干細胞復合膠原支架試劑盒及其制備方法，其由人臍帶間充質干細胞和膠原支架組成。其制備方法包括臍帶間充質干細胞復蘇、臍帶間充質干細胞傳代、臍帶間充質干細胞與膠原支架復合培養(yǎng)的步驟。本發(fā)明試劑盒采用膠原支架臍帶間充質干細胞進行內膜修復，與傳統(tǒng)子宮內膜損傷后修復方法相比具有以下優(yōu)點：膠原支架存在可為臍帶間充質干細胞提供附著位點，使其定位于內膜損傷部位，有利于局部組織修復，提高修復有效性并減低細胞移位帶來的危險性；同時膠原支架可促進細胞分化。
【專利說明】
用于修復子宮內膜損傷的干細胞復合膠原支架試劑盒及其制備方法
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于婦產(chǎn)科學領域，具體設計一種用于修復子宮內膜損傷的干細胞復合膠原支架試劑盒及其制備方法。
【背景技術】
[0002]子宮內膜嚴重損傷時內膜功能性修復障礙，代之以結締組織增生修復，子宮前后壁發(fā)生纖維化，瘢痕形成，臨床上主要表現(xiàn)為宮腔粘連、閉經(jīng)及子宮性不孕等。如何重建這些患者的內膜并使其恢復正常的形態(tài)及功能是當今再生醫(yī)學的難題之一。在研究的過程中，學者們提出過多種不同的治療方式，如宮內節(jié)育器使用，球囊導管，粘連分離術后雌激素或者透明質酸應用等，各種治療方式各有其優(yōu)缺點，縱觀文獻報道的結果，這些治療效果存在爭議并且令人失望。因此，針對子宮內膜損傷亟需新型治療方法。
[0003]隨著多種不同來源的人體干細胞的發(fā)現(xiàn)和鑒定，干細胞的治療應用可能性也在不斷被發(fā)掘，并建立了再生醫(yī)學這個新的醫(yī)學分支，旨在利用干細胞治療目前尚不能用藥物治愈的疾病。
[0004]間充質干細胞(MSCs)為間質組織來源的與骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)生物學性狀相似，具有多向分化潛能的細胞。MSCs是多潛能的成體基質細胞，能分化為多種間質起源的組織，如成骨、軟骨和脂肪細胞，在特殊環(huán)境下，還能橫向分化為肌細胞、神經(jīng)細胞、血管內皮細胞、肝胰細胞等多種其他組織細胞。人臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)即是MSCs的一種。與BM-MSCs相比，UC-MSCs的SH2、CD106和HLA-1表達低，OCT mRNA表達陽性，這說明臍帶UC-MSCs是一種更原始的MSCs群。大量的體外實驗證明，在不同誘導條件下，UC-MSCs不僅可以向多種中胚層來源的組織細胞分化，如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞等，還可以向外胚層和內胚層來源的神經(jīng)元樣細胞和肝細胞樣細胞分化。這提示我們可以利用UC-MSCs進行子宮內膜的修復。
[0005]由于人類子宮空腔結構的特殊性，利用干細胞的治療很難將細胞定位到受損內膜處，細胞易隨著血液、體液等流動發(fā)生組織擴散及損失，其臨床應用的有效性和安全性受到制約，這要求在修復的同時能夠為細胞在局部組織附著提供條件。膠原是細胞外基質的主要成分，其具有來源廣泛、生物相容性良好、可降解、制備工藝簡單等優(yōu)點，同時體內外實驗結果均證實膠原支架可為細胞提供附著位點并且能夠促進細胞的分化。
[0006]在本發(fā)明之前，尚無UC-MSCs修復子宮內膜損傷的相關研究報道。膠原支架作為一種生物材料已經(jīng)SFDA批準應用于臨床皮膚及口腔黏膜修復中，具有良好的生物相容性、可降解性及安全性。
【發(fā)明內容】
[0007]本發(fā)明的目的是用于修復子宮內膜損傷的干細胞復合膠原支架試劑盒，為臍帶間充質干細胞提供附著位點，使其定位于內膜損傷部位，有利于局部組織修復，提高修復有效性并減低細胞移位帶來的危險性。
[0008]—種用于修復子宮內膜損傷的干細胞復合膠原支架試劑盒，由人臍帶間充質干細胞和膠原支架組成。
[0009]所述人臍帶間充質干細胞由中國科學院遺傳所干細胞庫分離與培養(yǎng)，經(jīng)流式細胞術細胞表面抗原鑒定:顯示⑶14、⑶34和⑶45為陰性，⑶29、⑶44和⑶105為陽性，呈現(xiàn)為間質干細胞的特征。
[0010]所述膠原支架由煙臺正海生物技術有限公司提供，已經(jīng)SFDA批準應用于皮膚及口腔黏膜修復。
[0011]所述的嚴重子宮內膜損傷是指各種原因造成的子宮內膜過度損傷，內膜功能性修復障礙，代之以結締組織增生修復，子宮壁發(fā)生纖維化，瘢痕形成。
[0012]本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述用于修復子宮內膜損傷的干細胞復合膠原支架試劑盒的制備方法，其技術方案如下:
[0013]—種用于修復子宮內膜損傷的干細胞試劑盒的制備方法，包括以下步驟:
[0014](I)人臍帶間充質干細胞復蘇:將人臍帶間充質干細胞解凍，加入完全培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中；
[0015](2)人臍帶間充質干細胞傳代:將上述步驟得到的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)，進行傳代；
[0016](3)人臍帶間充質干細胞與膠原支架復合培養(yǎng):將膠原支架剪裁，取上一步得到的臍帶間充質干細胞，胰酶消化后制備單細胞懸液，取細胞懸液均勻滴加到膠原支架上，從而制得用于修復子宮內膜損傷的干細胞試劑盒。
[0017]所述步驟(I)的具體步驟是:取出裝有人臍帶間充質干細胞的凍存管，立即放入水浴中，搖動，使其解凍，將細胞懸液轉移至離心管，加入完全培養(yǎng)液，混合均勻；離心，棄上清；加入DMEM/F12完全培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中。
[0018]所述步驟(I)中，水浴溫度為40°C，離心條件為:常溫、1200rpm，5min。
[0019]所述步驟(2)的具體步驟為:培養(yǎng)每兩天半量換液一次，培養(yǎng)至貼壁細胞90%融合時，進行傳代；吸除培養(yǎng)瓶內的舊培養(yǎng)液；加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，以洗去殘留在瓶內的培養(yǎng)液，吸除磷酸鹽緩沖液(PBS);培養(yǎng)瓶內加入胰酶，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細胞表面；在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞質回縮，細胞間隙增大后，立即加入完全培養(yǎng)液終止消化；反復吹打瓶壁細胞，細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液；將細胞懸液吸入離心管，離心，棄上清；用DMEM/F12完全培養(yǎng)液調整細胞濃度，接種于培養(yǎng)瓶中；置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0020]所述步驟(2)中，離心的條件是:常溫1200rpm，5min。
[0021]所述步驟(2)中，置于37°C、5% CO2、飽和濕度0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0022]所述步驟⑵中，用DMEM/F12完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為2 X 15個細胞/mL。
[0023]所述步驟(3)的具體步驟為:膠原支架剪裁成合適大小，UP面朝下，置于6孔板中，用培養(yǎng)基充分濕潤，適當擠壓去除內部空氣；用無菌紗布將多余培養(yǎng)基吸干；取生長良好的第五代臍帶間充質干細胞，胰酶消化后制備單細胞懸液，計數(shù)并調整細胞濃度；取細胞懸液均勻滴加到膠原支架上，將6孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0024]步驟(3)中，取細胞懸液均勻滴加到膠原支架上，細胞數(shù)量約I X 106/cm2,將6孔板放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15min。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明試劑盒采用膠原支架臍帶間充質干細胞進行內膜修復，與傳統(tǒng)子宮內膜損傷后修復方法相比具有以下優(yōu)點:膠原支架存在可為臍帶間充質干細胞提供附著位點，使其定位于內膜損傷部位，有利于局部組織修復，提高修復有效性并減低細胞移位帶來的危險性；同時膠原支架可促進細胞分化。臍帶間充質干細直接分化為內膜組織或是分泌多種細胞因子促進內膜再生都可參與內膜損傷后修復，達到重建內膜目的。本發(fā)明所用人臍帶間充質干細胞已有商品化產(chǎn)品、膠原支架已經(jīng)SFDA批準應用于皮膚及口腔黏膜修復技術可控，安全性好，有利于干細胞治療嚴重子宮內膜損傷的科學研究，保護實驗動物福利。
【附圖說明】
[0026]圖1為流式細胞術臍帶間充質干細胞表面標記測定；
[0027]圖2為術后8、12周大體組織外觀；
[0028]圖3為術后8、12周離體組織手術區(qū)域HE染色觀察；
[0029]圖4為術后8、12周離體組織手術區(qū)域平滑肌免疫組化染色觀察；
[0030]圖5為術后8、12周離體組織手術區(qū)域腺體免疫組化染色觀察；
[0031]圖6為術后8、12周離體組織手術區(qū)域血管免疫組化染色觀察。
【具體實施方式】
[0032]下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0033]實施例
[0034]用于修復子宮內膜損傷的干細胞復合膠原支架試劑盒，由人臍帶間充質干細胞和膠原支架組成。
[0035]人臍帶間充質干細胞由中國科學院遺傳所干細胞庫分離與培養(yǎng)，經(jīng)流式細胞術細胞表面抗原鑒定:顯示⑶14、⑶34和⑶45為陰性，⑶29、⑶44和⑶105為陽性，呈現(xiàn)為間質干細胞的特征。
[0036]膠原支架由煙臺正海生物技術有限公司提供，已經(jīng)SFDA批準應用于皮膚及口腔黏膜修復。
[0037]嚴重子宮內膜損傷是指各種原因造成的子宮內膜過度損傷，內膜功能性修復障礙，代之以結締組織增生修復，子宮壁發(fā)生纖維化，瘢痕形成。
[0038]上述用于修復子宮內膜損傷的干細胞復合膠原支架試劑盒的制備方法為:
[0039]步驟1，人臍帶間充質干細胞復蘇:取出凍存管，立即放入40°C水浴中，搖動，迅速解凍；將細胞懸液轉移至15mL離心管，加入5mL完全培養(yǎng)液，混勾；離心(常溫1200rpm，5min)，棄上清；加入DMEM/F12完全培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中。
[0040]步驟2，人臍帶間充質干細胞傳代:培養(yǎng)每兩天半量換液一次，培養(yǎng)至貼壁細胞90%融合時，進行傳代；吸除培養(yǎng)瓶內舊培養(yǎng)液；加入PBS lmL，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，以洗去殘留在瓶內的培養(yǎng)液，吸除PBS ;培養(yǎng)瓶內加入胰酶lmL，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細胞表面；在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞質回縮，細胞間隙增大后，立即加入完全培養(yǎng)液ImL終止消化；反復吹打瓶壁細胞，細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液；將細胞懸液吸入離心管，離心(常溫1200rpm，5min)，棄上清；用DMEM/F12完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為2 X 15個細胞/mL，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶5mL ;置37°C、5% CO2、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0041]步驟3，人臍帶間充質干細胞與膠原支架復合培養(yǎng):膠原支架剪裁成合適大小，UP面朝下，置于6孔板中，用培養(yǎng)基充分濕潤，適當擠壓去除內部空氣，用無菌紗布將多余培養(yǎng)基吸干；取生長良好的第五代臍帶間充質干細胞，胰酶消化后制備單細胞懸液，計數(shù)并調整細胞濃度；取適量細胞懸液均勻滴加到膠原支架上，細胞數(shù)量約IX 1fVcm2，將6孔板放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15min。
[0042]采用本發(fā)明制得的試劑盒進行試驗，分別做自然修復組、空白膠原支架修復組、臍帶間充質干細胞膠原支架修復組，進行對照試驗，試驗結果如下:
[0043]圖2-6分別為術后8、12周大體組織外觀、離體組織手術區(qū)域HE染色觀察、離體組織手術區(qū)域平滑肌免疫組化染色觀察、離體組織手術區(qū)域腺體免疫組化染色觀察、離體組織手術區(qū)域血管免疫組化染色觀察。
[0044]圖2中，A、B、C 術后8周；C、D、E 術后12周；其中，A、D 自然修復組；B、E—一空白膠原支架修復組；C、F—一臍帶間充質干細胞膠原支架修復組；
[0045]圖3中，A-D:術后8周；E_H:術后12周；其中，A、E——正常子宮組織；B、F——自然修復組；C、G一一空白膠原支架修復組；D、H臍帶間充質干細胞膠原支架修復組。A-H，20 X，標尺長度為1000 μ m。
[0046]圖4中，A-D:術后8周；E_H:術后12周；其中，A、E——正常子宮組織；B、F——自然修復組；C、G一一空白膠原支架修復組；D、H臍帶間充質干細胞膠原支架修復組。A-H，20 X，標尺長度為1000 μ m。
[0047]圖5 中，A-D、A’ -D’:術后 8 周；E-H、E’-H’:術后 12 周；其中，A、A’、E、E’ ——正常子宮組織；B、B’、F、F’——自然修復組；C、C’、G、G’——空白膠原支架修復組；D、H臍帶間充質干細胞膠原支架修復組。A-H，20X，標尺長度為1000 μm，A’-H’，100X，標尺長度為 500 μπ?ο
[0048]圖6 中，A-D、A’ -D’:術后 8 周；Ε-Η、Ε’-H’:術后 12 周；其中，Α、Α’、Ε、Ε’ ——正常子宮組織；Β、B’、F、F’——自然修復組；C、C’、G、G’——空白膠原支架修復組；D、H臍帶間充質干細胞膠原支架修復組。A-H，20X，標尺長度為1000 μm，A’-H’，100X，標尺長度為 500 μπ?ο
【主權項】
1.一種用于修復子宮內膜損傷的干細胞復合膠原支架試劑盒，其特征在于:由人臍帶間充質干細胞和膠原支架組成。2.一種用于修復子宮內膜損傷的干細胞試劑盒的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)人臍帶間充質干細胞復蘇:將人臍帶間充質干細胞解凍，加入完全培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中； (2)人臍帶間充質干細胞傳代:將上述步驟得到的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)，進行傳代； (3)人臍帶間充質干細胞與膠原支架復合培養(yǎng):將膠原支架剪裁，取上一步得到的臍帶間充質干細胞，胰酶消化后制備單細胞懸液，取細胞懸液均勻滴加到膠原支架上，從而制得用于修復子宮內膜損傷的干細胞試劑盒。3.如權利要求2所述的用于修復子宮內膜損傷的干細胞試劑盒的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)的具體步驟是:取出裝有人臍帶間充質干細胞的凍存管，立即放入水浴中，搖動，使其解凍，將細胞懸液轉移至離心管，加入完全培養(yǎng)液，混合均勻；離心，棄上清；加入DMEM/F12完全培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中。4.如權利要求3所述的用于修復子宮內膜損傷的干細胞試劑盒的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中，水浴溫度為40°C ;離心條件為:常溫，1200rpm，5min。5.如權利要求2所述的用于修復子宮內膜損傷的干細胞試劑盒的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)的具體步驟為:培養(yǎng)每兩天半量換液一次，培養(yǎng)至貼壁細胞90%融合時，進行傳代；吸除培養(yǎng)瓶內的舊培養(yǎng)液；加入磷酸鹽緩沖液，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，以洗去殘留在瓶內的培養(yǎng)液，吸除磷酸鹽緩沖液；培養(yǎng)瓶內加入胰酶，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細胞表面；在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞質回縮，細胞間隙增大后，立即加入完全培養(yǎng)液終止消化；反復吹打瓶壁細胞，細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液；將細胞懸液吸入離心管，離心，棄上清；用DMEM/F12完全培養(yǎng)液調整細胞濃度，接種于培養(yǎng)瓶中；置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6.如權利要求5所述的用于修復子宮內膜損傷的干細胞試劑盒的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中，離心的條件是:常溫，1200rpm，5min。7.如權利要求5所述的用于修復子宮內膜損傷的干細胞試劑盒的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中，置于37°C、5% CO2、飽和濕度0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8.如權利要求5所述的用于修復子宮內膜損傷的干細胞試劑盒的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中，用DMEM/F12完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為2 X 15個細胞/mL。9.如權利要求2所述的用于修復子宮內膜損傷的干細胞試劑盒的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)的具體步驟為:膠原支架剪裁成合適大小，UP面朝下，置于6孔板中，用培養(yǎng)基充分濕潤，適當擠壓去除內部空氣；用無菌紗布將多余培養(yǎng)基吸干；取生長良好的第五代臍帶間充質干細胞，胰酶消化后制備單細胞懸液，計數(shù)并調整細胞濃度；取細胞懸液均勻滴加到膠原支架上，將6孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。10.如權利要求2所述的用于修復子宮內膜損傷的干細胞試劑盒的制備方法，其特征在于:步驟(3)中，取細胞懸液均勻滴加到膠原支架上，細胞數(shù)量約I X 1fVcm2，將6孔板放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15min。
【文檔編號】A61L27/24GK105983133SQ201510051011
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年1月30日
【發(fā)明人】胡婭莉, 薛白, 曹昀, 顏桂軍, 戴建武
【申請人】南京鼓樓醫(yī)院