源自唾液的端粒豐度的量度和樣本收集裝置的制造方法
【專利說明】源自唾液的端粒豐度的量度和樣本收集裝置
[0001] 本申請是申請日為2012年12月28日，申請?zhí)枮?01280068992.0,發(fā)明名稱為"源自 唾液的端粒豐度的量度和樣本收集裝置"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請的交叉引用
[0003] 本申請要求2011年12月31日提交的美國臨時專利申請61 /582，261的優(yōu)先日權(quán)益， 運(yùn)個臨時專利申請的內(nèi)容W全文引用的方式并入本文中。
[0004] 關(guān)于聯(lián)邦政府資助研究的聲明
[0005] 無。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 端粒是染色體末端的結(jié)構(gòu)，其特征為核巧酸序列的重復(fù)(TTAGGG)n。人端粒(染色 體末端的保護(hù)"帽"）的縮短是細(xì)胞老化的自然現(xiàn)象(C.B.Harley等人,Pfeture，1990,345: 458-460)。在人中，縮短可W由遺傳因素和環(huán)境因素來加速，包括多種形式的應(yīng)激，如氧化 損傷、生化應(yīng)激物、慢性炎癥和病毒感染化pel，E. S.等人，Proc.化tl. Acad. Sci . USA，2004， 101(49): 17312-5)。端粒長度提供了干細(xì)胞和免疫系統(tǒng)衰老的量度，并且預(yù)測壽命、疾病風(fēng) 險W及身體響應(yīng)某些藥物的潛力。
[000引端粒在非常短的時候變得功能不良，從而觸發(fā)DNA損傷反應(yīng)，運(yùn)種DNA損傷反應(yīng)常 常W細(xì)胞和組織功能損失而告終，并且最終導(dǎo)致大范圍的疾病和早期死亡。短端粒已經(jīng)與 W下各者聯(lián)系起來:癌癥風(fēng)險(Willeit，P.等人，JAMA，2010,304(1 ):69-75)、各種纖維化 (Wiemann等人，F(xiàn)ASEB Journal ,2002,16(9) :935-982 ; Cronkhite ,J.T.等人， Am. J. Resp. Crit. (^ire Med2008,178:729-737)、糖尿病（Salpea ,K.和Humphries , S.E., Atherosclerosis,2010,209(1) :35-38), W及眾多其它病狀。在越來越多的研究中，端粒豐 度或端粒酶活性的變化也已經(jīng)與疾病風(fēng)險或結(jié)果相關(guān)聯(lián)(Bautista ,C.V.等人,Colorectal Dis. ,2010年9月27日；Panossian,L.A.等人，Neurobiol.Aging,2003,24(1) :77-84)。
[0009]端粒的獨(dú)特之處在于其可W由端粒酶、生活方式和環(huán)境因素動態(tài)地改變。端粒縮 短用作運(yùn)些暴露的累積量度，并且繼而，短端粒的存在得出了關(guān)于疾病風(fēng)險W及對某些藥 物和介入的可能響應(yīng)運(yùn)兩者的信息。（Steer ,S.E.等人,4]1]1.化611111.013.,2007,66(4):476-480;N jajou,0.T.等人，J.Gerontol.A.Biol.Sci. Med.Sci.,2009,64(8):860-4; Rrouilette等人，2007)。
[0010] 已經(jīng)開發(fā)出多種方法來現(xiàn)慢基因組DNA中的端粒長度，包括DNA印跡(Kimura,M.等 人，Nature Protocols , 2010,5:1596-1607)、Q-FISH(Rufe;r,N.等人，Nat. Biotechnol., 1998，16: 743-747)、流式FI細(xì)（Baerlocher，G.M.等人，切tomet巧，2002，47 :89-99)，W及 qPCR(Cawthon，R.M. ,Nucleic.Acids Res. ,2002,30(10) :e47)。所有運(yùn)些方法都可W用于 臨床環(huán)境中W監(jiān)測健康狀況并且允許醫(yī)師開立適合個別患者需要的預(yù)防性或治療性介入。 [0011]唾液的特征為含有免疫細(xì)胞，如朗格漢斯細(xì)胞化angerhans cell)、淋己細(xì)胞、嗜 中性粒細(xì)胞、粒細(xì)胞；W及非免疫細(xì)胞，如上皮細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。（參看例如，化al Iacombe, S.J.和化 glikJ.R.，Adv.Dental Res.，2006，19:29-35;Nishita 等人，BMC Medical Research Methodology,2009,9:71;Aps等人，Clinica Qiimica Acta 321,2002,35-41)。 所有運(yùn)些細(xì)胞類型都含有可W測定端粒長度的基因組DM樣本。
[0012] W下參考文獻(xiàn)設(shè)及用于唾液收集的裝置。
[OOU]美國專利5,910,122(D'Angelo)設(shè)及一種唾液收集器。根據(jù)D'Angelo,通過將海綿 構(gòu)件放到患者的口腔中來收集唾液樣本用于體液成分分析。運(yùn)個海綿構(gòu)件W類似于橡皮奶 嘴(pacifier nipple)的方式形成。唾液被吸收起來。然后，將唾液從海綿構(gòu)件排擠到吸管 中?？蒞將過濾器放置在海綿構(gòu)件與吸管之間，通過所述過濾器來清潔唾液并且通過僅使 分子量低于截止重量的物質(zhì)通過而W分子量選擇性方式制備唾液。在已經(jīng)將唾液轉(zhuǎn)移到收 集吸管中之后將整體單元拆卸，并且將收集吸管緊密地封閉起來W供進(jìn)一步處理。
[0014] 美國專利6,022,326(Ta化m等人)設(shè)及一種用于唾液的自動或半自動收集的方法 和裝置，其在桿上具有接口管。根據(jù)化turn等人，桿經(jīng)由軟管連接到接口部分。唾液通過抽吸 被運(yùn)輸?shù)窖b置中。去除主體空氣并且在收集室中收集唾液。對于揮發(fā)性組分的收集，對空氣 流量、真空、管道直徑和長度W及收集時間加 W控制和限制，W減少揮發(fā)性組分的損失。
[0015] 美國專利7,482, Iie(Birnboim)設(shè)及用于從唾液中保存并提取核酸的組合物和方 法。根據(jù)Birnboim，組合物包括馨合劑、變性劑、用W將組合物的抑值維持在DNA和/或RNA所 需的范圍內(nèi)的緩沖劑。組合物還可W包括還原劑和/或抗微生物劑。提及使用本發(fā)明的組合 物從唾液中保存并分離核酸的方法W及用于本發(fā)明的組合物的容器。
[0016] 美國專利8,221，381(Muir等人)設(shè)及一種用于可釋放地儲存物質(zhì)的容器系統(tǒng)。根 據(jù)Muir等人，運(yùn)種容器系統(tǒng)包括具有樣本儲存室的小瓶W及用于刺穿蓋罩中的膜的刺穿構(gòu) 件，所述膜密封蓋罩中的儲集器內(nèi)的物質(zhì)直到運(yùn)個膜被所述刺穿構(gòu)件刺穿。容器系統(tǒng)任選 地包括漏斗。還提供了一種用于運(yùn)種容器系統(tǒng)的方法和試劑盒。
[0017] 美國專利申請2004/0082878 (Baldwin等人)設(shè)及一種口液收集和轉(zhuǎn)移裝置，其包 括收集裝置和測試盒。根據(jù)Baldwin等人，收集裝置包括框架或底架，W及吸收墊，所述吸收 墊用于吸收口液并且被緊固在框架部分的周圍，其中框架部分從所述墊突出。可伸縮蓋子 蓋住吸收工具并且具有用于口液進(jìn)入W與吸收墊接觸的孔口。帽蓋蓋住從吸收墊突出的框 架部分。帽蓋和蓋子閉鎖在一起W包圍框架和吸收墊。運(yùn)種裝置還包括呈具有Lm)的電路形 式的液體足量指示器，當(dāng)吸收工具已經(jīng)吸收了預(yù)定體積的口液時，運(yùn)個電路處于通路狀態(tài)。 測試盒具有收集室W允許收集裝置插入到測試盒中。使用測試條用于測試口液中分析物的 存在。收集裝置相對于測試盒位于收集室內(nèi)的固定位置處，在所述位置中吸收墊受到受控 程度的壓縮，從而將預(yù)定體積的口液從吸收墊轉(zhuǎn)移到測試條。
[0018] 美國專利申請2004/0082878(Cur巧等人)設(shè)及一種用于可釋放地儲存物質(zhì)的樣本 接收裝置。根據(jù)Cur巧等人，運(yùn)種樣本接收裝置包括蓋罩，所述蓋罩具有用于保留物質(zhì)的儲 集器和密封儲集器內(nèi)的物質(zhì)的可刺穿屏障；W及b)漏斗，所述漏斗用于接收樣本并且被設(shè) 置成用于由蓋罩封閉。所述漏斗被設(shè)置成用于可釋放地附接到樣本接收器W使得樣本可W 被提供給漏斗并且通過漏斗中的通道傳送到樣本接收器中。此外，漏斗包括一個或多個用 于切割可刺穿屏障的切割肋條W使得在切割可刺穿屏障后物質(zhì)從儲集器中釋放，流經(jīng)漏斗 中的通道并且進(jìn)入到樣本接收器中W與樣本混合。提及一種用于收集并儲存生物分子的試 劑盒。
[0019] 背景中的陳述不一定意味著認(rèn)可所引用的參考文獻(xiàn)中的特征描述。 發(fā)明概要
[0020]本發(fā)明提供了一種樣本收集裝置，例如唾液收集裝置，使用方法，W及測定端粒豐 度的量度的方法和使運(yùn)些量度與健康量度相關(guān)聯(lián)的方法。
[0021 ]在一個方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含：（a)容器，所述容器具有開口并且 適于經(jīng)由所述開口接收液體樣本；（b)蓋子，所述蓋子被設(shè)置成可逆地密封所述開口； W及 (C)捕獲裝置，所述捕獲裝置被設(shè)置成引入到所述容器中，其中所述捕獲裝置被設(shè)置成選擇 性地結(jié)合第一類型的細(xì)胞并且基本上不結(jié)合第二細(xì)胞類型的細(xì)胞。
[0022] 在一個實(shí)施方案中，捕獲裝置基本上結(jié)合至少一種除淋己樣細(xì)胞和/或骨髓細(xì)胞 W外的細(xì)胞。
[0023] 在另一個實(shí)施方案中，第一類型的細(xì)胞被祀向W供移出并且第二類型的細(xì)胞被祀 向W供分析。
[0024] 在另一個實(shí)施方案中，第一類型的細(xì)胞包括上皮細(xì)胞并且第二類型的細(xì)胞包括骨 髓細(xì)胞和淋己樣細(xì)胞中的至少一種。
[0025] 在另一個實(shí)施方案中，蓋子被設(shè)置為螺旋蓋或彈扣蓋。
[0026] 在另一個實(shí)施方案中，蓋子可逆地或不可逆地附接到容器。
[0027] 在另一個實(shí)施方案中，捕獲裝置包括桿。
[0028] 在另一個實(shí)施方案中，捕獲裝置結(jié)合上皮細(xì)胞上的表面分子。
[0029] 在另一個實(shí)施方案中，表面分子為化-CAM。
[0030] 在另一個實(shí)施方案中，捕獲裝置包括包含捕獲部分的粒子，所述捕獲部分結(jié)合祀 細(xì)胞。
[0031] 在另一個實(shí)施方案中，容器包括第一區(qū)室和第二區(qū)室，其中：第一區(qū)室和第二區(qū)室 由可破裂屏障彼此隔開;第一區(qū)室被設(shè)置成從容器中的開口接收液體樣本;第二區(qū)室是封 閉的并且含有細(xì)胞裂解溶液;并且其中所述容器被設(shè)置成使得破壞可破裂屏障使第一區(qū)室 中的樣本溶液與第二區(qū)室中的裂解溶液混合。
[0032] 在另一個實(shí)施方案中，容器包括具有開口端和封閉端的小瓶，其中第一區(qū)室被安 置成較接近于開口端并且第二區(qū)室被安置成較接近于封閉端，并且其中可破裂屏障包括小 瓶中的隔片。
[0033] 在另一個實(shí)施方案中，捕獲裝置被設(shè)置為包括墊圈的桿，其中所述墊圈被設(shè)置成 當(dāng)將桿插入到容器的開口中時防止所述桿的尖端刺穿可破裂屏障。
[0034] 在另一個實(shí)施方案中，容器被設(shè)置成使得對所述容器的手動擠壓破壞可破裂屏 障。
[0035] 在另一個實(shí)施方案中，第一區(qū)室包含非變性溶液。
[0036] 在另一個實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包含用于捕獲裝置的容器。
[0037] 在另一個實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包含第二捕獲裝置，所述第二捕獲裝置包括 第二結(jié)合部分，所述第二結(jié)合部分結(jié)合除上皮細(xì)胞W外的細(xì)胞并且基本上不結(jié)合骨髓細(xì)胞 或淋己樣細(xì)胞。
[0038] 在另一個方面，本發(fā)明提供了一種方法，其包括:將唾液引入到容器中；W及從容 器中的唾液中移出上皮細(xì)胞，其中至少一種選自骨髓細(xì)胞和淋己樣細(xì)胞的細(xì)胞類型被保留 在容器中的唾液中。
[0039] 在一個實(shí)施方案中，唾液由受試者通過從口中吐出、流出或滴下而引入到容器中。
[0040] 在另一個實(shí)施方案中，移出上皮細(xì)胞包括向容器中的唾液中引入被設(shè)置成結(jié)合上 皮細(xì)胞的捕獲裝置，使上皮細(xì)胞結(jié)合到捕獲裝置，W及從容器中移出結(jié)合有上皮細(xì)胞的捕 獲裝置。
[0041] 在另一個實(shí)施方案中，捕獲裝置包含結(jié)合劑，運(yùn)種結(jié)合劑結(jié)合上皮細(xì)胞上的表面 分子。
[0042] 在另一個實(shí)施方案中，表面分子是化-CAM。
[0043] 在另一個實(shí)施方案中，運(yùn)種方法進(jìn)一步包括:在移出上皮細(xì)胞之后，使容器中被保 留的細(xì)胞裂解。
[0044] 在另一個實(shí)施方案中，容器包括被設(shè)置成接收唾液的第一區(qū)室和包含裂解溶液的 第二區(qū)室，其中第二區(qū)室由可破裂屏障與第一區(qū)室隔開并且其中使被保留的細(xì)胞裂解包括 破壞所述屏障W使裂解溶液與唾液混合。
[0045] 在另一個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在使細(xì)胞裂解之前密封容器。
[0046] 在另一個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括:從容器中的唾液中移出細(xì)菌細(xì)胞。
[0047] 在另一個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括:將被移出的上皮細(xì)胞引入到第二容 器中。
[0048] 在另一個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使第二容器中的上皮細(xì)胞裂解。
[0049] 在另一個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在使上皮細(xì)胞裂解之前洗涂被移出的 上皮細(xì)胞。
[0050] 在另一個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括向容器中的唾液中引入被設(shè)置成結(jié)合 除上皮細(xì)胞W外的第二細(xì)胞的第二捕獲裝置，使第二細(xì)胞結(jié)合到第二捕獲裝置，W及從容 器中移出結(jié)合有上皮細(xì)胞的第二捕獲裝置。
[0051] 在另一個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括:從容器中的唾液中移出免疫細(xì)胞的 子組。
[0052] 在另一個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使容器中的唾液與非變性溶液混合。
[0053] 在另一個方面，本發(fā)明提供了一種方法，其包括:將唾液引入到容器中；用具有結(jié) 合上皮細(xì)胞的部分的捕獲粒子捕獲容器中的唾液中的上皮細(xì)胞，其中至少一種選自骨髓細(xì) 胞和淋己樣細(xì)胞的細(xì)胞類型在容器中的唾液中保持呈游離狀態(tài)。
[0054] 在一個實(shí)施方案中，捕獲粒子是磁響應(yīng)粒子并且運(yùn)種方法進(jìn)一步包括用磁力隔離 結(jié)合到捕獲粒子的上皮細(xì)胞。
[0055] 在另一個方面，本發(fā)明提供了一種方法，其包括測定來自唾液樣本的細(xì)胞上的端 粒豐度的量度，其中運(yùn)些細(xì)胞基本上不含上皮細(xì)胞。
[0056] 在另一個方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含：（a)容器，所述容器具有開口并 且適于接收液體樣本；（b)蓋子，所述蓋子被設(shè)置成可逆地密封所述開口； W及（C)捕獲粒 子，所述捕獲粒子具有結(jié)合部分，所述結(jié)合部分結(jié)合上皮細(xì)胞，但基本上不結(jié)合骨髓細(xì)胞和 淋己樣細(xì)胞中的至少一種。
[0057] 在另一個方面，本發(fā)明提供了一種方法，其包括:測定來自受試者樣本的源自唾液 的細(xì)胞中的端粒豐度的量度；W及使所述量度與W下各者相關(guān)聯(lián)：（1)健康量度；（2)病理狀 態(tài)的風(fēng)險；（3)端粒疾病;或(4)藥物響應(yīng)性。
[0058] 在一個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括:將唾液引入到容器中；W及用具有結(jié)合 上皮細(xì)胞的部分的捕獲粒子捕獲容器中的唾液中的上皮細(xì)胞，其中至少一種選自骨髓細(xì)胞 和淋己樣細(xì)胞的細(xì)胞類型在容器中的唾液中W源自唾液的細(xì)胞形式保持呈游離狀態(tài)。
[0059] 在另一個實(shí)施方案中，受試者樣本包括針對淋己樣細(xì)胞和/或骨髓細(xì)胞富集的唾 液。
[0060] 在另一個實(shí)施方案中，端粒豐度的量度是相對豐度的量度。
[0061] 在另一個實(shí)施方案中，相對豐度的量度是相對于總受試者基因組DNA的豐度的端 粒DNA的豐度。
[0062] 在另一個實(shí)施方案中，相對豐度的量度是相對于基因組參考序列的豐度的端粒 DNA的豐度。
[0063] 在另一個實(shí)施方案中，基因組參考序列是單拷貝參考核巧酸序列（例如，人0-球蛋 白）或非端粒重復(fù)DNA(例如，Alu重復(fù)或著絲粒重復(fù)）的豐度。
[0064] 在另一個實(shí)施方案中，端粒豐度的量度是絕對豐度。
[0065] 在另一個實(shí)施方案中，其中絕對豐度是W端粒序列的長度測量的。
[0066] 在另一個實(shí)施方案中，測定端粒豐度的量度包括通過qPCR、DNA印跡、核酸測序、原 位雜交或流式FISH測量樣本中的平均端粒長度。
[0067] 在另一個實(shí)施方案中，測量是W相對巧光單位(RFU)或通過PicoGreeiT貨來檢測 的。
[006引在另一個實(shí)施方案中，源自唾液的細(xì)胞主要是來自一個唾液腺。
[0069] 在另一個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使所述量度與健康量度相關(guān)聯(lián)。
[0070] 在另一個實(shí)施方案中，健康量度是知覺應(yīng)激的健康狀況調(diào)查評分。
[0071] 在另一個實(shí)施方案中，病理狀態(tài)的風(fēng)險是疾病風(fēng)險。
[0072] 在另一個實(shí)施方案中，疾病是老齡化疾病。
[0073] 在另一個實(shí)施方案中，老齡化疾病選自由屯、血管疾病、糖尿病、癌癥、肝纖維化和 抑郁組成的組。
[0074] 在另一個實(shí)施方案中，老齡化疾病是屯、血管疾病并且其中低于群體中的平均值的 量度與增加的屯、血管疾病風(fēng)險相關(guān)聯(lián)或預(yù)測增加的屯、血管疾病風(fēng)險。
[0075] 在另一個實(shí)施方案中，所述方法包括使群體的兩個或=個最低=分位數(shù)中的端粒 豐度的量度與相較于運(yùn)個群體的最高=分位數(shù)中的量度顯著較高的屯、血管疾病風(fēng)險相關(guān) 聯(lián)。
[0076] 在另一個實(shí)施方案中，老齡化疾病風(fēng)險進(jìn)一步與從血液樣本中測定的端粒豐度的 量度相關(guān)聯(lián)。
[0077] 在另一個實(shí)施方案中，運(yùn)個群體與受試者是年齡匹配的。
[0078] 在另一個實(shí)施方案中，所述方法包括使所述量度與端粒疾病相關(guān)聯(lián)。
[0079] 在另一個實(shí)施方案中，端粒疾病選自由先天性角化不良、肺纖維化、再生障礙性貧 血和間質(zhì)性肺炎組成的組。
[0080] 在另一個實(shí)施方案中，運(yùn)種方法包括使運(yùn)個量度與藥物響應(yīng)性相關(guān)聯(lián)。
[0081] 在另一個實(shí)施方案中，藥物選自他汀類(statin),其中短端粒長度與藥物響應(yīng)性 相關(guān)聯(lián);或伊美司他(imetelstat)(GRN16化），其中長端粒長度與藥物響應(yīng)性相關(guān)聯(lián)。
[0082] 在另一