一種齲齒疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種疫苗，具體來說涉及一種齲齒疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]齲齒是一種由細(xì)菌感染引起的慢性感染性疾病，存在范圍廣，對健康危害巨大。針對齲齒預(yù)防所采用的措施主要有兩個(gè)方面:加強(qiáng)口腔公共衛(wèi)生和使用防齲疫苗。隨著對齲病危害性認(rèn)識的逐步提高，抗齲疫苗的研究得到越來越多的關(guān)注，并將成為未來有效控制離齒的重要手段。經(jīng)過數(shù)十年的深入研究，變形鏈球菌(SirejO1cocciAS mu tans (S.已被確認(rèn)為主要的致齲病原菌，其致病機(jī)制是:細(xì)菌在牙表面粘附、富集后，代謝產(chǎn)生的乳酸使牙釉質(zhì)脫鈣，進(jìn)而侵害牙本質(zhì)和牙髓形成齲壞。在齲壞形成過程中，變形鏈球菌表面蛋白(PAc)和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTFs)分別在變形鏈球菌粘附和富集過程中起主要作用。在前期研究過程中，我們發(fā)現(xiàn)將PAc作為抗原與大腸桿菌K12株來源的重組鞭毛素進(jìn)行融合表達(dá)(KF-PAc及KFD2-PAC)，可作為齲齒的預(yù)防性疫苗，該研究已獲得中國授權(quán)專利(齲齒疫苗及制備方法，專利號=ZL 201110438088.1，授權(quán)日期:2014年9月)。GTFs具有催化和結(jié)合葡聚糖的功能，其催化功能區(qū)主要位于N端的三分之一處，C端的重復(fù)序列與其葡聚糖結(jié)合功能相關(guān)。本專利在前期工作的基礎(chǔ)上，將GTFs的葡聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Glu)融合在KFD2-PAc的C端，制備了一種新型的重組融合蛋白一KFD2-PAc-Glu。以往的大鼠齲齒模型是在大鼠完成口腔定菌前、后3-5天進(jìn)行免疫干預(yù)，然后評價(jià)保護(hù)效果，因而只能稱為預(yù)防性齲齒疫苗大鼠模型。而本專利建立了一種治療性齲齒疫苗大鼠模型:在大鼠接菌完成后56天(8周)、業(yè)已發(fā)展成齲齒后，再進(jìn)行免疫干預(yù)并評價(jià)治療效果。因?yàn)辇x患是一種慢性疾病、在任何年齡層次均可發(fā)生。因而這種模型更能模擬人體環(huán)境、更好的評價(jià)疫苗的效果。本專利利用這個(gè)治療性齲齒疫苗大鼠模型，系統(tǒng)研究比較了 PAc、KF-PAc、KFD2-PAc-Glu的免疫應(yīng)答效應(yīng)和抗齲保護(hù)效應(yīng)，結(jié)果顯示KFD2-PAc-Glu是相對最好的治療性疫苗，即本發(fā)明所述齲齒疫苗是相對最好的治療性疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種齲齒疫苗，本發(fā)明還提供了一種所述齲齒疫苗的制備方法。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案:一種齲齒疫苗，所述齲齒疫苗是通過將所述變形鏈球菌表面蛋白PAc派生的抗原的DNA序列插入到所述鞭毛素派生的佐劑的DNA序列的下游3’端或替代全部的所述鞭毛素派生的佐劑的DNA序列的高變域，然后與變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶派生的抗原的DNA序列連接后共表達(dá)而成的重組蛋白。
[0005]優(yōu)選地，所述變形鏈球菌表面蛋白PAc派生的抗原的DNA序列由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的部分組成；所述變形鏈球菌表面蛋白PAC派生的抗原的DNA序列包含至少一個(gè)抗原表位。
[0006]優(yōu)選地，所述鞭毛素派生的佐劑的DNA序列由SEQ ID NO: 2組成。
[0007]優(yōu)選地，變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶派生的抗原的DNA序列由SEQ ID NO: 3或SEQID NO:3的部分組成；變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶派生的抗原的DNA序列包含至少一個(gè)抗原表位。
[0008]優(yōu)選地，所述齲齒疫苗DNA序列如SEQ ID NO:4組成。這里所述的齲齒疫苗稱為KFD2-PAc-Gluo
[0009]優(yōu)選地，所述共表達(dá)的方式為原核表達(dá)。
[0010]優(yōu)選地，所述共表達(dá)的載體為pET28a載體。
[0011]本發(fā)明提供了一種上述所述的齲齒疫苗的制備方法，所述制備方法包括以下步驟:
將所述變形鏈球菌表面蛋白PAc派生的抗原的DNA序列插入到所述鞭毛素派生的佐劑的DNA序列的下游3’端或替代全部的所述鞭毛素派生的佐劑的DNA序列的高變域，然后與變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶派生的抗原的DNA序列連接后共表達(dá)出所述齲齒疫苗。
[0012]本發(fā)明還提供了一種齲齒疫苗組合物，所述齲齒疫苗組合物包括上述所述的齲齒疫苗和藥學(xué)上可接受的載體。
[0013]本發(fā)明還提供了上述所述的齲齒疫苗在制備預(yù)防或治療由變形鏈球菌感染引起的齲齒的藥物中的用途。
[0014]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明建立了一種治療性齲齒疫苗的大鼠模型，.以重組變形鏈球菌毒力因子PAc、重組葡糖基轉(zhuǎn)移酶(Glu)為疫苗抗原、重組細(xì)菌鞭毛素蛋白(KF)為粘膜佐劑，系統(tǒng)研究比較了 PAc、KF-PAc、KFD2-PAc-Glu的免疫應(yīng)答效應(yīng)和抗齲保護(hù)效應(yīng)，結(jié)果顯示KFD2-PAc-Glu是相對最好的治療性疫苗。
【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明的實(shí)施例1中的pET28a-KFD2-PAc-Glu質(zhì)粒構(gòu)建的示意圖；
圖2為本發(fā)明的實(shí)施例1中純化了的PAc，KF-PAc和KFD2_PAc_Glu的SDS-PAGE圖；圖3為本發(fā)明的實(shí)施例1中純化了的PAc，KF-PAc和KFD2_PAc_Glu的TLR5激活活性驗(yàn)證；
圖4為本發(fā)明的實(shí)施例1中大鼠齲齒模型的齲壞進(jìn)展圖，(A)大鼠齲齒模型的齲壞進(jìn)展觀察的實(shí)驗(yàn)流程圖；(B)離壞進(jìn)展的凱斯(Keyes)得分:E，釉質(zhì)離；Ds，淺表牙本質(zhì)離；Dm，中度牙本質(zhì)齲；Dx，重度牙本質(zhì)齲；(C)大鼠齲壞進(jìn)展的整體得分=E+Ds+Dm+Dx;數(shù)據(jù)表示為均值均值土標(biāo)準(zhǔn)差；(D)大鼠齲壞進(jìn)展的代表性齲損圖片；
圖5顯示了治療性齲齒疫苗實(shí)驗(yàn)大鼠模型的實(shí)驗(yàn)流程；四組大鼠滴鼻免疫=(I)PBS ;(2)5 微克 PAc ; (3 ) 8.5 微克 KF-PAc; (4)9 微克 KFD2-PAc_Glu ；
圖6為本發(fā)明的實(shí)施例1中四組大鼠磨牙的不同齲壞程度的凱斯(Keyes)得分，數(shù)據(jù)表示為均值均值土標(biāo)準(zhǔn)差；四組大鼠滴鼻免疫:(I) PBS ; (2) 5微克PAc ; (3) 8.5微克KF-PAc; (4)9 微克 KFD2-PAc-Glu ；
圖7為本發(fā)明的實(shí)施例1中四組大鼠齲壞的整體得分，數(shù)據(jù)表示為均值均值土標(biāo)準(zhǔn)差；四組大鼠滴鼻免疫=(I)PBS ; (2) 5微克PAc ; (3) 8.5微克KF-PAc; (4) 9微克KFD2-PAc-Glu ；
圖8為本發(fā)明的實(shí)施例1中相對于PBS組，其他免疫組的防齲保護(hù)力，數(shù)據(jù)表示為均值均值土標(biāo)準(zhǔn)差；
圖9為本發(fā)明的實(shí)施例1中PAc特異性的抗體滴度:A、血清IgG，B、血清IgA，C、唾液IgA;四組大鼠滴鼻免疫:(I)PBS ; (2) 5微克PAc ; (3) 8.5微克KF-PAc; (4) 9微克KFD2-PAc-Glu ;其中數(shù)據(jù)表示為均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差;*，P〈0.05 ;** P〈0.01 ;_，P〈0.001 ；圖10為本發(fā)明的實(shí)施例1中齲齒積分與PAc特異性抗體相關(guān)性分析:A、血清IgG，B、血清IgA, C、唾液IgA -M組大鼠滴鼻免疫:(I) PBS ; (2) 5微克PAc ; (3) 8.5微克KF-PAc;
(4)9微克KFD2-PAc-Glu。其中每個(gè)點(diǎn)代表一只大鼠的數(shù)據(jù)；
圖11為本發(fā)明的實(shí)施例1中Glu特異性的抗體滴度:A、血清IgG，B、血清IgA ;四組大鼠滴鼻免疫=(I)PBS ；(2) 5 微克 PAc ； (3) 8.5 微克 KF-PAc; (4)9 微克 KFD2-PAc_Glu。
【具體實(shí)施方式】
[0016]為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，本發(fā)明中PA和KF-Pac蛋白的表達(dá)，pET28a-KFD2-Pac的建構(gòu)均參照專利申請?zhí)枮?01110438088.1的中國專利。
[0017]實(shí)施例1 一、材料和方法
1、pET28a-KFD2-PAc-Glu 質(zhì)粒構(gòu)建
首先以以表達(dá)變形鏈球菌(S.mutans)毒力因子Glu的質(zhì)粒pGJA-P/VAX為模版，利用 PCR 擴(kuò)增出 Glu 片段，h.游引物為:CGCAAGCTTGAAATGGGCTATCAAGCCAAAG(SEQ ID N0:6)，下游引物為:ACTACTCGAGAATCCGAACTCGTTCTCCAG (SEQ ID NO:7)，分別在上、下游引入了HindIII和XhoI 2個(gè)酶切位點(diǎn)(下劃線處表示酶切位點(diǎn))，然后將片段連入構(gòu)建好的質(zhì)粒pET28a-KFD2-PAc中，其中用于構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-KFD2-Pac的變形鏈球菌表面蛋白Pac派生的抗原的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，鞭毛素派生的佐劑的DNA序列如SEQ ID NO: 2所示，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) star ;挑取陽性克隆進(jìn)行酶切及測序鑒定，將正確的重組質(zhì)粒命名為pET28a-KFD2-PAc-Glu，其中用于構(gòu)建pET28a-KFD2-PAc_Glu的變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶派生的抗原的DNA序列由SEQ ID NO: 3，KFD2_PAc_Glu的DNA序列如SEQ ID NO:4所示，其表達(dá)產(chǎn)物KFD2-PAc-Glu的C-端帶有6聚組氨酸標(biāo)簽，表達(dá)產(chǎn)物KFD2_PAc_Glu的氨基酸序列如SE