一種五子衍宗方總多糖的提取方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種五子衍宗方總多糖的提取方法及其在保護(hù)肝損傷上的應(yīng)用，屬于 生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 五子衍宗方作為我國(guó)傳統(tǒng)中草藥配方，由車(chē)前子、覆盆子、五味子、構(gòu)杞子、寃絲子 五味藥組成，性平味甘的構(gòu)杞子和性平味甘的寃絲子作君藥，補(bǔ)肝腎之陽(yáng)，五味子和覆盆子 作為臣藥，性溫，味甘而酸，五味子有生血之功，覆盆子能滋精，兩藥均為溫性，不熱不燥，起 溫和泌精滋腎之用，車(chē)前子是該藥方中唯一的味甘性微寒之成分，作為佐藥，起利尿固精之 效，同時(shí)可瀉腎中虛火，W其微寒之性對(duì)藥方中其他藥物的溫性略起制約作用。
[0003] 五子衍宗方補(bǔ)腎益精，填精補(bǔ)髓，疏利腎氣，種耐衍宗，被歷代醫(yī)家所推崇，因?qū)δ?性不育癥有較好的療效，被譽(yù)為"古今種子第一方。多用于治療男性泌尿生殖系統(tǒng)疾病，同 時(shí)也用于治療婦科疾病和脂肪肝等疾病，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)也有作用。具有延緩衰老、 增強(qiáng)免疫等多種藥理作用。 陽(yáng)004]環(huán)憐酷胺（cyclo地OS地amide,CTX)是一種臨床常用的抗腫瘤藥物，廣泛用于治 療各種實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)疾病，該藥作為最常用的燒化劑抗腫瘤藥，進(jìn)入體內(nèi)后，在肝微粒 體酶催化下分解產(chǎn)生燒化作用很強(qiáng)的產(chǎn)物，能對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，抑制細(xì)胞增殖、 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡。但是其在抑制腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)影響人體正常細(xì)胞的增殖、分化， 從而導(dǎo)致多種副作用，除骨髓抑制、屯、臟毒性、生殖系統(tǒng)毒性等，還有肝臟毒性，可導(dǎo)致肝損 傷，引起肝細(xì)胞巧死，此外本品還具有顯著的免疫抑制作用。 陽(yáng)0化]現(xiàn)代藥理研究顯示，五子衍宗方能改善生殖功能、增強(qiáng)免疫功能、抗氧自由基損 傷，可用于治療男性泌尿生殖系統(tǒng)疾病、婦科疾病、脂肪肝等疾病，具有延緩衰老、增強(qiáng)免疫 等多種藥理作用。且隨著AD發(fā)病率的升高和治療藥物的匿乏，五子衍宗方對(duì)MCI的有效干 預(yù)使其具有作為AD治療候選藥物的發(fā)展前景。五子衍宗丸的藥理作用是相當(dāng)廣泛的，但對(duì) 神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、糖代謝等作用還需進(jìn)一步完善，對(duì)抗炎抑菌、循環(huán)系統(tǒng)及抗腫瘤方面 的藥理作用未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，對(duì)此尚待研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 在上述文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，本發(fā)明通過(guò)化療藥物CTX造模，與此同時(shí)，用不同劑量 的五子衍宗方總多糖作為治療藥物，處理動(dòng)物后檢測(cè)其肝組織形態(tài)學(xué)變化，血清常規(guī)檢查， 肝臟SOD活力和MDA含量，驗(yàn)證五子衍宗方總多糖對(duì)CTX所致的肝損傷有保護(hù)作用。
[0007] 本發(fā)明包括了中藥配方五子衍宗方中總多糖提取的優(yōu)化工藝，及其總多糖對(duì)環(huán)憐 酷胺所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用。 陽(yáng)00引藥品與試劑
[0009]五子衍宗方由40g寃絲子、40g構(gòu)杞子、5g五味子、20g覆盆子、lOg車(chē)前子組成， 均由宜昌本草堂大藥房提供；CTX購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (Alaninetransaminase，ALT)、天冬氨酉辯專氨酉每（Aspartatetransaminase，AST)、超氧化 物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD)、丙二醒（Malondialdehyde，MDA)試劑盒購(gòu)自南京 建成生物工程公司。儀器
[0010] ZNHW型智能恒溫電熱套由鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)；循環(huán)水多用真空 累由西安泰康生物科技有限公司生產(chǎn)；低溫冷卻液循環(huán)累由鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司生 產(chǎn)；EYELA油浴鍋由上海愛(ài)朗儀器有限公司制造；包埋機(jī)；離屯、機(jī)；酶標(biāo)儀；萬(wàn)分之一天平。
[0011] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0012]SPF級(jí)Ba化/C雄性小鼠，8周齡，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中屯、提供。分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度 (20±2)°C，相對(duì)濕度55%~65%，1化光照，曬齒類(lèi)動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲水。五子衍宗方 總多糖的提取方法
[0013] 1.稱取干燥粉碎的構(gòu)杞子，寃絲子，五味子，覆盆子，車(chē)前子，加入75%乙醇，浸泡 過(guò)夜，用雙層濾布過(guò)濾，將過(guò)濾后的濾渣置于60°C烘箱中揮干乙醇；干燥后，加蒸饋水，沸 水浴回流提取1.化，雙層濾布過(guò)濾，濾渣重復(fù)提取一次，過(guò)濾后合并兩次濾液，于80°C水浴 濃縮，將濃縮液在氯仿與正下醇W體積比4:1的混合液中反復(fù)脫蛋白，萃取后水層離屯、，上 清液水浴濃縮后加入95 %乙醇，終體積分?jǐn)?shù)為75 %，再放入4°C冰箱中醇沉過(guò)夜，然后W 480化/min離屯、lOmin，濾渣依次用無(wú)水乙醇、丙酬、乙酸各洗兩次，通風(fēng)楓干燥，得褐色粉 末，即五子衍宗方總多糖提取物。
[0014] 動(dòng)物分組
[0015] 取健康雄性ba化/c小鼠36只，隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、五子衍宗 方總多糖低劑量組、總多糖高劑量組，每組9只。
[0016] 肝組織損傷造模及動(dòng)物處理
[0017] 總多糖低、高劑量組提前3天給藥，第3天開(kāi)始，除正常對(duì)照組注射等量生理鹽水 夕F，其余各組均腹腔注射CTX50mg/kg造模，每隔2天給1次，共10次，給藥組繼續(xù)給藥。最 后一次注射CTX后，禁食不禁水，12小時(shí)后處死小鼠。肝組織形態(tài)學(xué)觀察
[0018] 每只小鼠取同一部位肝組織，甲醒固定，石蠟包埋，切片，肥染色后用顯微鏡觀察 其肝組織形態(tài)學(xué)變化。
[0019] 肝臟指數(shù)
[0020] 末次給藥12h后稱小鼠重量，小鼠處死后取出肝臟稱重，用肝臟重量除W小鼠體 重，計(jì)算得到肝臟指數(shù)。
[0021] 血清生物化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)
[0022] 各組小鼠眼眶采血，靜置30min，離屯、后取上清，按照AST、ALT試劑盒進(jìn)行操作，檢 測(cè)血清AST和ALT活性。
[0023] 抗氧化指標(biāo)檢測(cè)
[0024] 取各組小鼠肝組織，冰浴條件下用生理鹽水洗凈，再加4°C生理鹽水勻漿制10 % 肝組織勻漿液，4°C條件下用3500r/min離屯、，離屯、后取上層清液，每次離屯、lOmin，直至離 屯、后下層無(wú)沉淀。按照SOD和MDA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，檢測(cè)肝組織SOD活力和MDA含量。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0025]數(shù)據(jù)W平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差（X+巧表示，組間差異采用t-檢驗(yàn)，P<0. 05表示差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[00%] 采用本發(fā)明的技術(shù)方案得到的五子衍宗丸總多糖可顯著減輕CTX所致的肝細(xì)胞 的損傷程度。其機(jī)制可能與提高了體內(nèi)抗氧化酶的活性和自由基清除劑水平，保護(hù)機(jī)體免 受氧自由基的攻擊有關(guān)。五子衍宗方總多糖對(duì)肝損傷有保護(hù)作用。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為五子衍宗方總多糖對(duì)小鼠肝臟指數(shù)的影響，注：沖<0. 05 ;*沖<0. 01 (與正常 對(duì)照組比較）；胖<0. 05, #胖<0. 01 (與模型對(duì)照組比較）。
[0028] 圖2為各組小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察，其中，A為正常對(duì)照組，B為模型對(duì)照組，C 為總多糖低劑量組，D為總多糖高劑量組。
【具體實(shí)施方式】 陽(yáng)〇29] 實(shí)施例1
[0030] 稱取干燥的構(gòu)杞子160g，寃絲子160g，五味子20g，覆盆子80g，車(chē)前子40g，裝入 大燒瓶，加入75%乙醇化，浸泡過(guò)夜，用雙層濾布過(guò)濾，除去五子衍宗方中溶于醇的物質(zhì)， 將過(guò)濾后的濾渣置于60°C烘箱中揮干乙醇。干燥后，加2.化蒸饋水，沸水浴回流提取1.化， 雙層濾布過(guò)濾，濾渣重復(fù)提取一次，過(guò)濾后合并兩次濾液，于80°C水浴濃縮至約1500mL， Sevag法（氯仿