%洗脫液，減壓濃縮，噴霧干 燥（約 75〇g)。
[0036] 實施例6 :液相色譜分析
[0037] 供試品溶液配制：取實施例1方法制得的提取物5mg至50ml棕色容量瓶中，加 30ml 35%乙腈水溶液超聲溶解，冷卻至室溫后，繼續(xù)加35%乙腈水溶液定容。
[0038] 分析方法：
[0039] 高效液相色譜儀：Agilent 1260,二元栗；
[0040] 色譜柱：Agilent TC C18 柱（4. 6mmX250mm，5 ym);
[0041] 流動相：A為乙腈，B為0. 1 %甲酸溶液（三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6. 0);
[0042] 梯度洗脫程序：0 ~5min，A 35%;5 ~40min，A 35%-70%;40 ~57min，A 70% -95% ;57 ~65min，A 95% ;流動相流速：1. OmL ? min S檢測波長：240nm ;柱溫：30°C ;進(jìn) 樣量10 y L。
[0043] 對用10批不同產(chǎn)地、批次野菊花和苦參制備的提取物進(jìn)行分析，建立指紋圖譜進(jìn) 行匹配，結(jié)果1~10號峰在10批樣品色譜圖中均出現(xiàn)，且均與周圍色譜峰達(dá)到基線分離。 因此標(biāo)定10個峰為共有指紋峰，據(jù)此建立該提取物的HPLC指紋圖譜，用于控制該提取物的 質(zhì)量。HPLC圖見圖1。
[0044] 實施例7 :野菊花提取物藥理試驗
[0045] 1、材料與試劑：新西蘭大耳白兔，雄性，體重1. 6~2. 5kg。凝血酶和纖維蛋白原 (臨用前配制）為上海生物制品研究所產(chǎn)品。
[0046] 2、樣品的制備：取實施例1制備的野菊花提取物10. 80mg加10%乙醇溶液稀釋成 不同質(zhì)量濃度，命名為野菊花提取物①。同法，分別取實施例2~5制備的野菊花提取物 10. 80mg加10%乙醇溶液稀釋成不同質(zhì)量濃度，命名為野菊花提取物②~⑤。
[0047] 3、體外抗凝血作用：
[0048] (1)對家兔血漿復(fù)鈣時間的影響。家兔耳緣靜脈取血4. 5mL，加至含有38g/L枸 橡酸鈉〇. 5mL的IOmL離心管中，混勾，1000r/min離心10min，取上清液備用。另取96孔 板1個，實驗組每孔加入混合血漿〇. ImL及不同質(zhì)量濃度野菊花提取物①（0. 216、0. 108、 0. 054mg/mL)各0. lmL，對照組加入混合血漿0.1 mL及10%乙醇溶液0. lmL，于37°C溫育 Imin后分別向每孔加入2. 775g/LCaCl2溶液0. lmL，計時，直到檢測到纖維蛋白絲時停止計 時，重復(fù)10次，求平均值，即為血漿復(fù)鈣時間。同法測定野菊花提取物②~⑤。
[0049] (2)對凝血酶時間的影響。同上制備混合血漿，在96孔板加入混合血漿和不同質(zhì) 量濃度野菊花提取物①（0. 216、0. 108、0. 054mg/mL)各0. lmL，37°C溫育3min，再加入已預(yù) 溫的IXlO4IVL凝血酶0. lmL，混勾，記錄血漿凝固所需時間。以10%乙醇溶液為對照，每 組重復(fù)10次，取平均值。同法測定野菊花提取物②~⑤。
[0050] 4、體外抗血栓作用：
[0051] (1)溶栓作用。家兔耳緣靜脈采血置試管中，按體積比1:9加入質(zhì)量濃度為38g/L 枸櫞酸鈉溶液，然后依次加入纖維蛋白原溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 5% ) XaCl2溶液（55. 5g/L) 和凝血酶溶液（1.0 X 105U/L)，加入量為每毫升血中加入纖維蛋白原溶液20 y UCaCl2溶液 10 y L和凝血酶溶液20 y L?；靹?，注入到內(nèi)徑為8mm的玻璃試管中，37°C水浴20min后取 出血栓，切成5mm的小段，放入裝有不同質(zhì)量濃度野菊花提取物①（0. 216、0. 108、0. 054mg/ mL)和10%乙醇溶液各2mL的試管中，37°C溫育，于0、4、12、24、48h分別測定剩余血栓段的 質(zhì)量，計算血栓溶解率，重復(fù)測定10次。同法測定野菊花提取物②~⑤。
[0052]
[0053] (2)對全血凝塊的溶解作用。家兔心臟采血20mL置于表面皿中，2h后自然凝固后 切成0.3cm 3的小塊，用生理鹽水淋洗3遍待用。將不同質(zhì)量濃度野菊花提取物①（0.216、 0. 108、0. 054mg/mL)及10%乙醇溶液各2mL加入不同西林瓶中，每組5小瓶，再向各瓶中隨 機(jī)加入2個血塊，37°C水浴保溫，觀察血塊溶解情況，分別于0、12、24、48h分別測血塊的質(zhì) 量，計算全血凝塊溶解率。同法測定野菊花提取物②~⑤。
[0054]
[0055] 5、結(jié)果：不同質(zhì)量濃度的野菊花提取物①~③均能顯著延長家兔血漿復(fù)鈣時間和 凝血酶時間（見表1，備注：與10%乙醇組比較，各給藥組P < 0. 01);與對照組比較，野菊 花提取物①~③在不同時間點均顯示出較強(qiáng)的溶解全血凝塊的作用，且隨著給藥時間的延 長，全血凝塊溶解率增加（表2~4,備注：與10%乙醇組比較，各給藥組P < 0. 01)。而不 同質(zhì)量濃度的野菊花提取物④和⑤與10%乙醇組比較均沒有顯著性差異，不能延長家兔血 漿復(fù)鈣時間和凝血酶時間（表5)，也不能溶解全血凝塊（表6~7)。
[0056] 結(jié)果表明，本發(fā)明制備的野菊花提取物可以延長家兔血漿復(fù)鈣時間和凝血酶時 間，能促進(jìn)溶解全血凝塊，這種作用是野菊花和苦參共同作用的結(jié)果，二者具有協(xié)同作用， 且這種協(xié)同作用受野菊花與苦參的比例影響。
[0057] 表1野菊花提取物①~③對家兔血漿復(fù)鈣時間和凝血酶時間的影響
[0058]
[0059] 表2野菊花提取物①對體外血栓與全血凝塊的溶解作用
[0060]
[0061] 表3野菊花提取物②對體外血栓與全血凝塊的溶解作用
[0062]

[0071] 實施例8:片劑的制備
[0072] 按實施例1方法先制得提取物，按其與賦形劑重量比為1:8的比例加入賦形劑，制 粒壓片。
[0073] 實施例9 : 口服液的制備
[0074] 按實施例1方法先制得提取物，按常規(guī)口服液制法制成口服液。
[0075] 實施例10 :膠囊劑或顆粒劑的制備
[0076] 按實施例1方法先制得提取物，按其與賦形劑重量比為1:9的比例加入賦形劑，制 成膠囊或顆粒劑。
[0077] 實施例11 :注射液的制備
[0078] 按實施例1方法制得提取物，加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。
[0079] 實施例12 :無菌粉針的制備
[0080] 按實施例1方法先制得提取物，溶于無菌注射用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗 過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿，低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉針劑。
【主權(quán)項】
1. 一種野菊花提取物，其特征在于所述提取物由以下方法制備： 步驟一：以重量計，每100份藥材包括野菊花80~90份和苦參10~20份，混合粉碎； 步驟二：用95 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味； 步驟三：對步驟二濃縮液依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石 油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； 步驟四：正丁醇萃取物用DlOl大孔樹脂富集，先用10%乙醇沖洗10個柱體積除去多 糖，再用70%乙醇洗脫8個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮，噴霧干燥。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的野菊花提取物，其特征在于：所述提取物的液相分析方法 為： 色譜柱：Agilent TC C18 柱（4.6mmX250mm，5iim); 流動相：A為乙腈，B為0. 1 %甲酸溶液（三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6. 0); 梯度洗脫程序： 0 ~5min，A 35% ;5 ~40min，A 35%- 70% ; 40 ~57min，A 70%- 95% ;57 ~65min，A 95% ; 流動相流速：1. OmL ? min S 檢測波長：240nm ;柱溫：30°C ; 進(jìn)樣量IOu L。3. 藥物制劑，其特征在于：所述制劑含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的野菊花提取 物和藥學(xué)上可接受的載體。4. 如權(quán)利要求1所述的野菊花提取物在制備治療血瘀疾病藥物中的應(yīng)用。5. 如權(quán)利要求3所述的藥物制劑在制備治療血瘀疾病藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種野菊花提取物及其治療血瘀疾病的醫(yī)藥用途，屬于中藥領(lǐng)域，具體涉及一種野菊花提取物及含有該提取物的藥物制劑，可以用來制備治療血瘀疾病的藥物。本發(fā)明通過對野菊花的乙醇提取物采用液液萃取初步富集、大孔樹脂除雜后進(jìn)一步富集的方法得到活性組分富集的提取物，具有顯著的抗凝血和抗血栓活性。本發(fā)明提供的液相分析方法可以用于建立該提取物的指紋圖譜，以控制不同批次提取物的批間一致性。
【IPC分類】A61P7/02, A61K36/489
【公開號】CN105079093
【申請?zhí)枴緾N201510540886
【發(fā)明人】林天樣
【申請人】林天樣
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月28日