Cephaloziellin B 在制備治療卵巢癌藥物中的應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化合物CephaloziellinB的新用途，具體涉及CephaloziellinB在 制備治療卵巢癌藥物中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] Rui-JuanLi等人首次分離純化出化合物CephaloziellinB，并將成果發(fā) 表在著名天然產(chǎn)物雜志（SecondaryMetabolitesfromtheChineseLiverwort Cephaloziellakiaeri，J.Nat.Prod.，2013, 76,1700-1708)〇
[0003]目前尚未有該化合物關(guān)于治療卵巢癌的活性報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種CephaloziellinB的醫(yī)藥用途。
[0005] 上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0006] CephaloziellinB在制備治療卵巢癌藥物中的應用，所述CephaloziellinB化學 結(jié)構(gòu)式如下，
[0007]
[0008] 進一步地，所述卵巢癌為SK0V3。
【具體實施方式】
[0009] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容。
[0010] 實施例1:CephaloziellinB的分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0011] CephaloziellinB的制備方法同文獻報道的制備方法（BioactiveLimonoidand TriterpenoidConstituentsofTurraeapubescens，J.Nat.Prod. ，2013,76,1166-1174)〇
[0012] 結(jié)構(gòu)確證：白色結(jié)晶（甲醇），熔點156-158°C。根據(jù)HR-ESI-MS可知分子式為 C20H2205,不飽和度為 10。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)SH(ppm，DMS0-d6,600MHz) :H-l(2.07，m)， H-l(l. 89,dd，J= 15. 6,7. 2)，H-2(2. 42,m)，H-2(2. 58,m)，H-3(6. 91，br，s)，H-6(4. 59， dd，J= 11. 4,7. 8)，H-7(2. 28,dd，J= 12. 5,7. 8)，H-7(l. 80,dd，J= 12. 0)，H-10(l. 98， m)，H-ll(3.01，dd，J= 13.2,7.8)，H-ll(2.00，m)，H-12(5.30，t，J= 8.4)，H-14(6.47，br， s)，H-15(7. 35,br，s)，H-16(7. 46,br，s)，H-17(l. 20,s)，H-19(l. 31，s)，H-20(5. 50,s); 核磁共振碳譜數(shù)據(jù)Sc(ppm，DMS0-d6,600Hz) : 19.1 (CH2,1-C)，24.0 (CH2, 2-C)，138.4 (CH， 3-C)，132. 9 (C，4-C)，40. 1 (C，5-C)，84. 7 (CH，6-C)，42. 0 (CH2, 7-C)，72. 6 (C，8-C)，60. 5 (C， 9-C)，45. 9 (CH，10-C)，38. 0 (CH2,11-C)，74. 7 (CH，12-C)，128. 9 (C，13-C)，109. 1 (CH，14-C)， 143. 6 (CH，15-C)，139. 8 (CH，16-C)，24. 6 (CH3, 17-C)，169. 8 (C，18-C)，30. 1 (CH3,19-C)， 101. 0(CH，20-C)。結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)與文獻報道一致，因此可以確定本發(fā)明制備的化合物即為 文獻報道的CephaloziellinB。
[0013] 實施例2:CephaloziellinB的藥理作用試驗
[0014] -、材料和儀器
[0015] 人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細胞株SK0V3由蘭州大學的醫(yī)學實驗中心提供。通用 RPMI-1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清）培養(yǎng)。C印haloziellinB自制，HPLC歸一化純度大于 98%。RPMI-1640培養(yǎng)液、四甲基偶氮挫藍（MTT)、二甲基亞砜（DMS0)、L-谷氨酰胺購于科 昊生物工程有限公司。胰蛋白酶購于美國Sigma公司。胎牛血清購于杭州四季青生物工程 材料有限公司。十二院基磺酸鈉（SDS)購于西安周鼎生物技術(shù)有限責任公司。HER2(FITC 標記）購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。酸化HER2(FITC標記）購于北京博奧森生物技 術(shù)有限公司。青霉素、鏈霉素購于華北制藥廠。
[0016] C02培養(yǎng)箱（Heraeus，BB5060UV)，德國倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，CK-40)，日本熒 光顯微鏡（OLYMPUS0PTICAL，AX80,日本），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），酶標分 析儀（BI0-TEK公司，美國），低溫高速離心機（Beckman-Coulter公司，德國），EpicsXL流 式細胞儀（Beckman-Coulter公司，德國），R-3850型自動臺式滅火器（山東新華醫(yī)療器械 股份有限公司），DHG-9245A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海-恒科技有限公司），KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），數(shù)顯恒溫水浴箱（上海梅香儀器有限公 司），BS400S電子分子天平（北京賽多利斯天平有限公司），08-2恒溫磁力攪拌器（上海天 平儀器廠），TDL-5普通離心機（上海安亭科學儀器廠），低溫冰箱（日本三洋公司），電子 制冰箱（日本三洋公司），細胞凍存管（上海生工生物工程有限公司），96孔板（科昊生物 工程有限公司）。
[0017] 二、試驗方法
[0018] 1、細胞培養(yǎng)
[0019] 1.1細胞復蘇
[0020] 將凍存管迅速從液氮中取出后立即放入37°C溫水中，輕輕晃動凍存管，使凍存物 盡快溶解，將其放入超凈工作臺中，將其內(nèi)的細胞懸液移入離心管，再向離心管中加入10 倍RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清），離心，800rpm/min，離心5~10min，棄上清，細胞 沉淀中加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，輕搖均勻，置37°C、5%C02濃度的培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)。并注明細胞名稱及日期。
[0021] 1.2細胞傳代培養(yǎng)
[0022] 待SK0V3細胞長至80~90%培養(yǎng)瓶時，棄去原有的培養(yǎng)液，并用配好的PBS洗兩 遍；用0. 25%的胰酶消化，放在倒置顯微鏡下觀察，當見細胞回縮、細胞間隙增大、形態(tài)變 圓時棄去消化液，加入一定量的培養(yǎng)液中和胰酶消化液，并用吸管輕輕吹打已經(jīng)消化過的 細胞.，使其脫離培養(yǎng)瓶，800rpm/min離心5min，棄上清；顯微鏡下在計數(shù)板上進行細胞計 數(shù)，按1:3比例傳代，分裝至培養(yǎng)瓶中，再次補充適量培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。注意嚴格無菌操 作，每天觀察細胞生長情況。
[0023] 1. 3細胞凍存
[0024] 取對數(shù)生長期的細胞以0.25%的胰蛋白酶消化后離心，PBS洗2次，在低速離心機 上lOOOrpm離心5min，棄上清液，加入lmL于-20°C下預冷的含DMS0的細胞凍存液，用吸管 吹打均勻后移入凍存管中，用封口膜封口標記后放入4°C靜置30min，之后-20°C放置2h后 轉(zhuǎn)入-80°C。一個月內(nèi)使用的細胞可保存于_80°C中，長期保存者24h后應由-80°C移入液 氮中。細胞的復蘇與凍存應遵循的原則為慢凍快融。
[0025]2、四甲基偶氮藍（MTT)實驗
[0026] (1)選擇對數(shù)生長期的細胞（生長80-90 % )時，用配好的0.25 %胰酶將細胞 消。化好以后，輕輕地吹打制成單細胞懸液，調(diào)整的最終的細胞濃度為8X104/mL;(2)取 3個96孔板，每個時間點1板，100yL/孔，每孔細胞數(shù)為104做好分組標志；(3)細胞貼 壁后分組，設(shè)空白組（不接種細胞）、對照組（只含等量溶劑）及實驗組（加不同濃度的 C印haloziellinB，其終濃度分別為0? 1、1、10、20、30和60ymol/L)，每組設(shè)6個復孔； ⑷37°C、5%⑶廉件下分別培養(yǎng)24、48和72h; (5)時間到后，吸去上清液后每孔加5g/L的 MTT10yL; (6)培養(yǎng)4h后加入10yLDMS0,在多功能微板測試系統(tǒng)上以490nm波長測定各 孔光密度0D值；（7)藥物對細胞抑制率的計算：<