放射性綴合法
【專利說明】放射性綴合法
[0001] 本申請為分案申請，原申請的申請日為2011年12月1日，申請?zhí)枮?201180057989. 4 (PCT/EP2011/071506)，發(fā)明名稱為"放射性綴合法"。 發(fā)明領域
[0002] 本發(fā)明涉及用于體內(nèi)成像的放射性藥物領域，具體而言涉及用放射性同位素標記 生物靶向分子的方法。本發(fā)明的方法特別適于與自動合成儀一起使用。亦提供可用于所述 方法的呈無菌形式的前體，以及包含這類前體的盒（cassette)。
[0003] 發(fā)明背景 WO 2004/080492 Al公開了用于生物靶向載體的放射性氟化的方法，所述方法包括使 式（I)化合物與式（Π )化合物反應：
或者， 使式（ΠΙ)化合物與式（IV)化合物反應： 其中：
Rl為醛部分、酮部分、受保護的醛（例如縮醛）、受保護的酮（例如縮酮），或者諸如二 醇或N端絲氨酸殘基等官能團（functionality)，可使用氧化劑將所述官能團迅速而有效 地氧化成醛或酮； R2為選自伯胺、仲胺、輕胺、肼、酰肼、氨基氧基（aminoxy)、苯肼、氨基脲和氨基硫脲的 基團，以及優(yōu)選為肼、酰肼或氨基氧基； R3為選自伯胺、仲胺、羥胺、肼、酰肼、氨基氧基、苯肼、氨基脲或氨基硫脲的基團，以及 優(yōu)選為肼、酰肼或氨基氧基； R4為醛部分、酮部分、受保護的醛（例如縮醛）、受保護的酮（例如縮酮），或者諸如二 醇或N端絲氨酸殘基等官能團，可使用氧化劑將所述官能團迅速而有效地氧化成醛或酮； 以分別得到式（V)或（VI)綴合物：
其中 X 為-CO-NH-、-NH-、- 0-、-NHCONH-或-NHCSNH-，以及優(yōu)選為、-NH-或-ο- ;Y 為Η、烷基或芳基取代基；以及 式（II)、（IV)、（V)和（VI)化合物中的接頭基團選自
其中： η為0-20的整數(shù)； m為1-10的整數(shù)； P為〇或1的整數(shù) Z為0或S。
[0004] Poethko 等[J. Nucl. Med.，45(5)，892-902 (2004)]公開了使用放射性同位素 18F放射性標記肽的方法，其中將氨基氧官能化的肽與[18F]-氟苯甲醛縮合以得到具有如下 肟醚鍵合的標記肽：
Schottelius 等[Bioconj. Chem.，19 (6)，1256-1268 (2008)]進一步發(fā)展了 Poethko 等的方法。Schottelius等使用氨基氧官能化肽，其中用y^Boc (Boc =叔丁氧羰基）保護 基保護氨基氧基的胺。在[18F]-氟苯甲醛存在下，在酸性pH (pH = 2)于75 °C經(jīng)由，Boc 基團的脫保護來原位生成所需的氨基氧官能化肽。Schottelius等使用5倍摩爾過量的Boc 保護的前體，因為在所述反應條件下脫保護不是定量的。
[0005] Mezo等[J. P印t. Sci.，17，39-46 (2010)]描述了與Boc保護的氨基氧官能化肽 的上述肟連接化學相關的一些問題。因此，已知的是，最初形成的自由氨基氧肽可?；捶?應的Boc保護的氨基氧肽，導致不合乎需要的副產(chǎn)物。亦已知的是，官能化肽的自由氨基氧 基對羰基化合物的反應性很高。所以，可與存在于反應混合物中或任何后續(xù)純化步驟中的 任何外來醛或酮發(fā)生不必要的縮合。這類醛或酮可以是痕量的存在于所用溶劑中的丙酮， 或者甲醛（例如來自增塑劑）。對于抗癌藥與肽的綴合和[ 18F]-氟苯甲醛與肽的綴合二者， Mezo等關注于解決此問題。Mezo等通過在作為'羰基捕獲劑'的十倍摩爾過量的自由（氨 基氧）乙酸（Aoa)存在下，進行Boc-氨基氧肽的脫保護來解決所述問題。然后將脫保護的 氨基氧基-肽和過量的Aoa凍干并在4 °C儲存。臨近肟連接反應之前，將凍干混合物復溶， 并通過HPLC或S印-Pak +C18柱分離過量的Aoa。Mezo等提供了其中利用此技術將非放射 性（即19F) 4-氟苯甲醛與氨基氧官能化的促生長素抑制素肽綴合的實例。Mezo等未提供 關于18F-放射性標記的任何數(shù)據(jù)。
[0006] 因此對于放射性標記肽及其它生物靶向分子的改進方法仍有需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了經(jīng)由氨基氧官能團放射性標記生物靶向分子（BTM)的改進方法。本 發(fā)明提供了保護基途徑，所述途徑克服了先有技術中公認的雜質(zhì)問題，而無需： (i) '羰基捕獲劑'以及在4 °C長期儲存； (ii) 強酸性條件以去除展Boc氨基氧保護的保護基； (iii)使用過量展Boc氨基氧保護的起始材料。
[0008] 選項⑴對于放射性標記目的而言并非合意的，因為必須事先完全去除過量的羰 基捕獲試劑以防止涉及所述羰基捕獲劑的副反應。所述去除步驟需要制備性色譜法或類似 方法。另外，對于在4 °C儲存前體的需要較不理想。
[0009] 先有技術亦教導，可使用Boc保護的氨基氧前體--選項（ii)。所述方法的問題 在于Boc脫保護需要強酸性條件，例如95%含水三氟乙酸（TFA)或25-50% TFA/有機溶劑 (例如DCM)，二者均在室溫下。一些出版物亦建議在60-75 °C加熱。所述強酸和/或加熱 可能破壞生物靶向分子。亦需要用附加步驟去除過量的強酸一一通常通過蒸發(fā)TFA，其可 為費時的。然而，三氟乙酸亦可生成不會經(jīng)由蒸發(fā)去除的鹽一一以及通常需要研磨來去除。 本發(fā)明的方法在室溫下僅使用含水稀酸（例如2. 5%含水TFA或0.0 lM含水鹽酸）或者在 60°C僅使用0. 1%含水TFA便實現(xiàn)完全脫保護。所述條件與BTM更相容，并且避免了對于附 加純化步驟的需要。
[0010] 第三，先有技術教導，應使用5倍摩爾過量的Boc保護的氨基氧BTM前體--選項 (iii)。這是因為Boc脫保護不完全并且其對于消耗全部[18F]-氟苯甲醛反應物而言很重 要。所述方法對于放射性藥物目的而言為不合乎需要的，因為存在于產(chǎn)物中的任何過量的 未標記BTM前體很可能會與放射性標記的BTM競爭體內(nèi)生物目的位點，并因此具有抑制所 需成像劑攝取的風險。因此，在使用前有必要從放射性標記的產(chǎn)物中去除過量的非放射性 前體。相比之下，本發(fā)明的方法允許在溫和條件下有效完全的脫保護，由此不需要使用過量 的受保護的起始材料。
[0011] 本發(fā)明的受保護BTM具有阻抑在脫保護和放射性標記期間的過度酰化的優(yōu)勢。
[0012] 鑒于本發(fā)明的方法需要更少步驟，以及避免了對先有技術的一些色譜純化步驟的 需要，其亦更有效且更遵從自動化一一例如使用自動合成儀。
[0013] 本發(fā)明的保護基的又一個優(yōu)勢在于其在中性和堿性pH下穩(wěn)定并且在高達50%含 水乙酸溶液中穩(wěn)定，由此可用0. 1 %含水乙酸作為流動相采用HPLC色譜法來純化受保護的 前體。因此，使用本發(fā)明的方法保護的BTM可在多種條件下純化，所述條件可針對BTM的穩(wěn) 定性定制。
[0014] 發(fā)明詳沐 在第一方面，本發(fā)明提供用于放射性標記生物靶向分子的方法，所述方法包括： (i) 提供式（IA)或（IB)的受保護化合物
[BTM] -X1 (IA) Q-[接頭]-X1 (IB) (ii) 將步驟（i)的式（IA)或（IB)的受保護化合物脫保護，分別得到式（IIA)或（IIB) 氨基氧化合物；
[BTM]-O-NH2 (IIA) Q-[接頭]-O-NH2 (IIB) (iii) 縮合： (a) 式（IIA)氨基氧化合物與式（IIIA)羰基化合物 Q-[接頭]-(C=O)Y1 (ΠΙΑ);或 (b) 式（IIB)氨基氧化合物與式（IIIB)羰基化合物，
[BTM] - (C=O)Y1 (IIIB) 分別得到式（IVA)或（IVB)的放射性標記綴合物：
[BTM] -O-N= (CY1)-[接頭]-Q (IVA)
[BTM] - (CY1) =N-O-[接頭]-Q (IVB) 其中：
[BTM]為生物靶向分子； X1為下式受保護的氨基氧基：
其中R1和R2獨立選自C i_3烷基、C i_3氟烷基或C 4_6芳基； Q為包含適于體內(nèi)PET或SPECT成像的放射性同位素的基團； Y1為Η、(ν6烷基或C4_1Q芳基，
[接頭]為接頭基團。
[0015] 術語"放射性標記"具有其常規(guī)意義，即其中將放射性同位素與BTM (在本文情況 下）共價連接的過程。
[0016] 術語"生物靶向部分"（BTM)意指這樣的化合物，其在給予之后被選擇性吸收或在 體內(nèi)定位于哺乳動物身體的特定部位。這類部位例如可能牽涉于特定的疾病狀態(tài)或者表明 器官或代謝過程如何運作。
[0017] 術語"脫保護"具有其在化學和/或放射化學領域中的常規(guī)意義，即保護基的去 除。術語"保護基"或P ep意指抑制或阻抑不合乎需要的化學反應的基團，但是將其設計成 具有足夠的反應性使得其可在不修飾分子的剩余部分的足夠溫和的條件下從討論中的官 能團上切除。脫保護之后獲得所需產(chǎn)物。保護基的使用在ieciire Croop1S i/? 有機合成中的保護基），第 4 版，Theorodora W. Greene 和 Peter G. Μ· Wuts, [Wiley Blackwell, (2006)]中闡述。
[0018] 術語"氨基氧基"具有其常規(guī)意義，是指式-0-順 2、優(yōu)選式-〇12-0_順2的取代基。
[0019] 術語"包含放射性同位素的基團"意指官能團包含放射性同位素，或者將放射性 同位素作為附加物質(zhì)連接。當官能團包含放射性同位素時，這意味著化學結(jié)構(gòu)已含有討論 中的化學元素，并且該元素的放射性同位素以顯著超過所述同位素的天然豐度水平的水平 存在。同位素的這類升高水平或富集水平適當為討論中的同位素的天然豐度水平的至少5 倍、優(yōu)選至少10倍、最優(yōu)選至少20倍；以及理想上為討論中的同位素的天然豐度水平的至 少50倍，或者以其中討論中的同位素的富集水平為90-100%的水平存在。這類官能團的實 例包括具有升高水平的 18F使得18F原子在化學結(jié)構(gòu)之內(nèi)的氟烷基。當放射性同位素為射電 金屬，例如99mTc、 68Ga或64Cu時，"附加物質(zhì)"通常會是螯合劑。當所述放射性同位素為放射 性碘時，那么如本領域已知，所述附加物質(zhì)會是苯基或乙烯基，以使碳-碘鍵對體內(nèi)代謝脫 碘穩(wěn)定。
[0020] 術語"PET"和"SPECT"具有其在放射性藥物領域中的常規(guī)意義，分別是指正電子 發(fā)射斷層掃描和單光子發(fā)射斷層掃描。
[0021] 術語"接頭基團"意指式-㈧m-的二價基團，其中每個A獨立地為-CR2-、-CR=CR-、 -C Ξ C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、