一種豬鏈球菌病二價蜂膠滅活疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物疫苗制備技術領域，具體的說，是關于一種豬鏈球菌病二價蜂膠 滅活疫苗及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 豬鏈球菌病由溶血性鏈球菌感染引起，臨床表現為急性出血性敗血癥、腦膜炎、心 內膜炎、肺炎、關節(jié)炎等。其中豬鏈球菌2型致病性強、流行廣，該型亦是臨床分離頻率最高 的血清型。豬鏈球菌2型是一種重要的人畜共患病病原體，常引起斷奶仔豬或育肥豬突然 死亡；人類感染該菌，可導致腦膜炎，引發(fā)永久性耳聾、敗血癥、心內膜炎，甚至死亡。豬鏈球 菌2型引起的豬鏈球菌病已經對我國的養(yǎng)殖業(yè)和人民健康構成了嚴重的威脅。
[0003] 因此，需要開發(fā)一種豬鏈球菌病疫苗以解決上述問題。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的提供一種豬鏈球菌病二價蜂膠滅活疫苗，該疫苗副作用小，不含內 毒素以及血清中不含雜蛋白，具有較好的免疫安全性。
[0005] 為實現上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：
[0006] 所述抗原為豬鏈球菌2型CVCC3313菌株和豬鏈球菌2型CVCC3307菌株的抗原濃 縮滅活，配苗時每毫升疫苗中各菌株的菌數為2. 0 X IO9CFU~3. 0 X IO9CFU,所述佐劑為蜂 膠乙醇浸出液和黃氏多糖，配苗時每毫升疫苗中蜂膠干物質含量為8mg，所述豬鏈球菌2型 CVCC3313菌株的抗原濃縮液、豬鏈球菌2型CVCC3307菌株的抗原濃縮液、蜂膠乙醇浸出液、 黃氏多糖和注射用水之間的體積比為13~25:15~20:4~6:4~5 :34~61。
[0007] 根據本發(fā)明，所述豬鏈球菌2型CVCC3313菌株和豬鏈球菌2型CVCC3307菌株菌 株抗原液滅活前活菌數在3. OX 109CFU/ml~4. OX 109CFU/ml之間。
[0008] 根據本發(fā)明，所述豬鏈球菌2型CVCC3313菌株和豬鏈球菌2型CVCC3307菌株菌 株的抗原液經4倍超濾濃縮。
[0009] 根據本發(fā)明，所用佐劑為優(yōu)質蜂膠，經乙醇浸提獲得。
[0010] 本發(fā)明還提供一種如上述任一項所述的豬鏈球菌病二價蜂膠滅活疫苗的制備方 法，包括如下步驟：
[0011] 1)蜂膠乙醇浸出液制備：蜂膠在低溫下貯存，使用時先將蜂膠置-15°C冷凍 24-48h，再用冷凍粉碎機磨碎過篩，按1:4的比例加入95%乙醇，在37°C浸提48-72小時， 冷卻、過濾，即得純凈蜂膠乙醇浸出液（透明栗色溶液），浸出液的蜂膠干物質含量不小于 32g/ml ；
[0012] 2)制備生產用菌株：將豬鏈球菌2型CVCC3313菌株和豬鏈球菌2型CVCC3307菌 株菌株進行繁殖制備生產用菌株，并對該生產用菌株進行純粹檢驗；
[0013] 3)制備抗原液：將步驟2)的生產用菌株分別接種到相應的制苗用培養(yǎng)基培養(yǎng)，制 備抗原液；并進行純粹檢驗；
[0014] 4)活菌計數：分別從步驟3)所獲得的兩種抗原液中取樣，對豬鏈球菌2型 CVCC3313菌株和豬鏈球菌2型CVCC3307菌株菌株進行活菌計數，以確定培養(yǎng)的菌數；
[0015] 5)超濾濃縮：將上述兩種滅活的抗原液用超濾儀濃縮4倍，制得抗原濃縮液，制得 抗原濃縮液含菌數在 I. 2X 101(lCFU/ml ~I. 6X 101(lCFU/ml。
[0016] 6)滅活：兩種抗原濃縮液經甲醛滅活制得滅活濃縮抗原液，并進行滅活檢驗；
[0017] 7)疫苗成品完成：分別量取13000ml~25000ml豬鏈球菌2型CVCC3313菌株濃 縮液，量取15000ml~20000ml 2型BHZZ-L4菌株濃縮液，量取4000ml~5000ml黃氏多 糖，量取4000ml~6000ml蜂膠乙醇浸出液，按照每毫升疫苗中含蜂膠干物質8mg的標準量 取蜂膠乙醇浸出液，浸出液的蜂膠干物質含量須不小于32g/ml，用注射用水補充至10萬毫 升；低速2000rpm攪拌15-20min，制得所述豬鏈球菌病二價蜂膠滅活疫苗。
[0018] 根據本發(fā)明，所述豬鏈球菌2型CVCC3313菌株和豬鏈球菌2型CVCC3307菌株菌 株抗原液滅活前活菌數在3. OX 109CFU/ml~4. OX 109CFU/ml之間。
[0019] 根據本發(fā)明，步驟7)的佐劑為蜂膠乙醇浸出液，所選蜂膠經乙醇浸提，制備蜂膠 乙醇浸出液干物質含量彡32g/ml。
[0020] 本發(fā)明的豬鏈球菌病二價蜂膠滅活疫苗，其有益效果是：
[0021] 1、降低豬鏈球菌引起的豬鏈球菌病，提高仔豬的存活率。
[0022] 2、其免疫力高，且使用方便，減少仔豬的豬只應激，不存在散毒的隱患。
[0023] 3、以蜂膠為佐劑，是一種綠色、環(huán)保、安全、有效的新型佐劑，能刺激機體快速、高 效、持久的免疫保護。
[0024] 4、本制品不加硫柳汞等防腐劑，減少外源化學物質的引入，對食品安全性高。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合實施例，對本發(fā)明的豬鏈球菌病二價蜂膠滅活疫苗及其制備方法作進一 步詳細說明。
[0026] 菌種來源
[0027] (1)豬鏈球菌2型CVCC3313菌株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；
[0028] (2)豬鏈球菌2型CVCC3307菌株菌株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0029] 一、蜂膠乙醇浸出液制備
[0030] 蜂膠在低溫下貯存，使用時先將蜂膠置_15°C冷凍24-48h，再用冷凍粉碎機磨碎 過篩，按1:4(W/V)的比例加入95%乙醇，在37°C浸提48-72小時，冷卻、過濾，即得純凈蜂 膠乙醇浸出液，乙醇浸出液為透明栗色溶液，浸出液的蜂膠干物質含量不小于32g/ml。
[0031] 二、制備生產用菌株
[0032] 1、豬鏈球菌2型CVCC3313菌株
[0033] (1) -級種子繁殖：將凍干的豬鏈球菌2型CVCC3313菌株接種于TSA固體培養(yǎng)基， 置37°C培養(yǎng)24小時，然后選取生長良好的菌落，接種TSA固體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)12~16 小時，做為一級種子。
[0034] (2)二級種子繁殖：取豬鏈球菌2型CVCC3313菌株的一級種子接種于TSB液體培 養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)12~16小時，按《中國獸藥典》附錄進行純粹檢驗，合格后作為二級種 子。
[0035] 2、豬鏈球菌2型CVCC3307菌株菌株
[0036] (1) -級種子繁殖：將凍干的豬鏈球菌2型CVCC3307菌株菌株接種于TSA固體培 養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)24小時，然后選取生長良好的菌落，接種TSA固體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng) 12~16小時，做為一級種子。
[0037] (2)二級種子繁殖：取豬鏈球菌2型CVCC3307菌株菌株的一級種子接種于TSB液 體培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)12~16小時，按《中國獸藥典》附錄進行純粹檢驗，合格后作為二 級種子。
[0038] 三、制備抗原液
[0039] 1、豬鏈球菌2型CVCC3307菌株菌株的二級種子液按1 %接種于TSB液體培養(yǎng)基， 置37°C培養(yǎng)12小時；
[0040] 2、豬鏈球菌2型CVCC3313菌株的二級種子液按1 %接種于TSB液體培養(yǎng)基，置 37°C培養(yǎng)12小時。
[0041] 四、純粹檢驗
[0042] 按現行《中國獸藥典》附錄進行純粹檢驗。
[0043] 五、活菌計數
[0044] 分別從所獲得的兩種抗原液中取樣，用血瓊脂平板進行活菌計數，以確定培養(yǎng)的 菌數，將所獲得菌數稀釋到3. 0 X 109CFU/ml~4. 0 X 109CFU/ml之間。
[0045] 六、超濾濃縮
[0046] 將上述兩種滅活的抗原液分別用Milliproe公司的MODEL No. XX814V230超濾儀 4倍濃縮，制得抗原濃縮液含菌數在I. 2 X 101(lCFU/ml~I. 6 X 101(lCFU/ml。
[0047] 七、滅活
[0048] 分別向兩種抗原濃縮液中加入各抗原液液體總量的0. 4 %的甲醛溶液，37°C滅活 48小時，期間每隔6小時攪拌1次，然后取樣按《中國獸藥典》進行滅活檢驗，應無細菌生 長。
[0049] 八、疫苗成品
[0050] 實施例1
[0051] (1)量取13000ml所需的豬鏈球菌2型CVCC3313菌株濃縮滅活液，濃縮后菌數為 I. 6X 101(lCFU/ml，量取17000ml