一種粘附血小板的三維微支架復(fù)合多孔金屬支架的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種具有仿生三維微支架的3D打印醫(yī)用多孔金屬支架，具體涉及一種在三維微支架表面附著血小板層使其具有生物活性的多孔金屬支架。
【背景技術(shù)】
[0002]鈦合金作為生物醫(yī)用金屬功能材料之一，在人體外科植入物中得到廣泛應(yīng)用，如口腔種植體、骨缺損修補(bǔ)材料、假關(guān)節(jié)植入體等。其具有無(wú)毒、質(zhì)輕、良好生物相容性和耐腐蝕性以及具有與人體皮質(zhì)骨更為匹配的彈性模量。而由于鈦合金表面的生物惰性，不利于成骨細(xì)胞生長(zhǎng)，因此多孔及表面涂層修飾鈦合金支架受到越來(lái)越多的關(guān)注。但現(xiàn)有的機(jī)械加工技術(shù)很難制備出均勻大小一致的微米級(jí)別聯(lián)通孔隙。
[0003]3D打印的出現(xiàn)讓人們重新認(rèn)識(shí)了鈦合金，通過CT等掃描數(shù)據(jù)的處理，由計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)構(gòu)建，可以將鈦合金打印成符合需求的個(gè)性化多孔連通復(fù)雜結(jié)構(gòu)，不僅給骨長(zhǎng)入提供了空間，也因?yàn)槎嗫捉Y(jié)構(gòu)降低了鈦合金的彈性模量，實(shí)現(xiàn)了與正常骨組織彈性模量的匹配，且不必?fù)?dān)心降解時(shí)間與機(jī)體需求的不匹配，成為了 3D打印在骨科發(fā)展的重要方向。
[0004]然而，現(xiàn)有3D打印技術(shù)制作出的多孔鈦合金材料，孔隙直徑約300-2000 μ m，對(duì)于平均直徑10-20 μm的細(xì)胞來(lái)說，顯得過于空曠。且細(xì)胞只能延附孔壁攀附生長(zhǎng)，不能實(shí)現(xiàn)在整個(gè)孔洞內(nèi)三維層次生長(zhǎng)，未能充分有效利用多孔鈦內(nèi)部的空間。既往很多研宄側(cè)重點(diǎn)在于利用酸堿腐蝕、電鍍等方法表面修飾多孔鈦金屬或表面負(fù)載生物活性因子，很少有研宄重點(diǎn)將多孔支架內(nèi)部二維空間改造為三維空間。而我們猜想若能在多孔鈦的每一個(gè)孔洞中，搭建一個(gè)仿生三維微支架，將給細(xì)胞的增殖、分化提供一個(gè)良好的環(huán)境。
[0005]人體來(lái)源的血小板含有豐富的細(xì)胞因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子(I3DGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等。多項(xiàng)體外研宄證實(shí)，血小板的濃度與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增殖和I型膠原蛋白的產(chǎn)生成正相關(guān)。富血小板血漿(PRP)是血小板濃縮物，其可以釋放多種細(xì)胞因子，在促進(jìn)骨修復(fù)、血管生成、軟組織生成等方面發(fā)揮重要作用。而現(xiàn)在臨床上，富血小板血漿在口腔科種植體及心臟瓣膜移植術(shù)等方面已成熟應(yīng)用。另一方面，血小板凍干保存技術(shù)已在市場(chǎng)及臨床中應(yīng)用，其可以做到常溫長(zhǎng)期有效保存，對(duì)血小板活性并無(wú)太大影響，而將血小板再次水化后可緩慢激活釋放內(nèi)部生長(zhǎng)因子。將血小板融合入3D打印多孔鈦合金支架則可使鈦合金具有多種生物活性，其血小板來(lái)源的生物因子更接近人體需要量，有研宄表明血小板纖維化可在一定程度上達(dá)到緩釋效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種粘附血小板的三維微支架復(fù)合多孔金屬支架，所述粘附血小板的三維微支架復(fù)合多孔金屬支架包括多孔金屬支架、位于所述多孔金屬支架內(nèi)部的三維微支架、以及粘附在所述三維微支架上的血小板。本發(fā)明的粘附血小板的三維微支架復(fù)合多孔金屬支架既克服了多孔金屬支架缺乏生物活性的缺陷，同時(shí)克服了生物可降解材料機(jī)械強(qiáng)度不夠?qū)е聭?yīng)用范圍小的缺陷。另外，本發(fā)明的目的還在于提供了粘附血小板的三維微支架復(fù)合多孔金屬支架的制備方法。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:
[0008]本發(fā)明提供了一種粘附血小板的三維微支架復(fù)合多孔金屬支架，所述粘附血小板的三維微支架復(fù)合多孔金屬支架包括多孔金屬支架、位于所述多孔金屬支架內(nèi)部的三維微支架、以及粘附在所述三維微支架上的血小板。所述三維微支架的孔徑為80-200 μ mo
[0009]進(jìn)一步，本發(fā)明的多孔金屬支架可以是多孔鈦合金支架、多孔純鈦支架、多孔不銹鋼支架、多孔鈷合金支架。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述多孔金屬支架是多孔鈦合金支架。
[0010]進(jìn)一步，本發(fā)明的所述三維微支架可以由高分子材料和/或生物陶瓷制備而成。
[0011]高分子材料可以是膠原、明膠、絲素蛋白、玉米蛋白、藻酸鹽、殼聚糖、透明質(zhì)酸鈉、海藻酸鈉、硫酸葡聚糖、肝素鈉、硫酸軟骨素或硫酸角質(zhì)素中的一種或幾種。生物陶瓷可以是納米羥基磷灰石、磷酸三鈣或者磷酸鈣中的一種或幾種。
[0012]在本發(fā)明的具體的實(shí)施方案中，所述三維微支架是由明膠制備而成。
[0013]進(jìn)一步，本發(fā)明使用的血小板是由富血小板血漿凍干而成。
[0014]本發(fā)明還提供了上述粘附血小板的三維微支架復(fù)合多孔金屬支架的制備方法，所述制備方法包括:
[0015](I)制備多孔金屬支架；
[0016](2)利用高分子材料和/生物陶瓷在步驟(I)制備的所述多孔金屬支架內(nèi)部制備三維微支架形成三維微支架復(fù)合多孔金屬支架；
[0017](3)將富血小板血漿粘附到步驟(2)制備的所述三維微支架中。
[0018]進(jìn)一步，步驟(I)中所述多孔金屬支架利用3D打印技術(shù)制備而成，3D打印技術(shù)包括選擇性激光燒結(jié)技術(shù)(SLS)、選擇性激光熔融技術(shù)(SLM)、電子束熔融技術(shù)(EBM)，上述技術(shù)制備的多孔金屬支架孔徑為100 μπι-2000 μπι，彈性模量小于lOGPa。
[0019]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，步驟(I)的具體操作為:
[0020]a、將CT圖像導(dǎo)入Mimics或CAD等三維圖像軟件，得到目標(biāo)骨組織的三維圖像，平均孔柱為100-1000 μm、孔徑為300-3000 μm，以正六面體、正十二面體結(jié)構(gòu)單位充填、擴(kuò)展該圖像，得到個(gè)性化的多孔連通三維數(shù)字模型；
[0021]b、采用EOS M280金屬材料3D打印機(jī)，依據(jù)設(shè)計(jì)模型打印多孔金屬支架。
[0022]優(yōu)選地，目標(biāo)骨組織的三維圖像的平均孔柱為300 μm、孔徑為1000 μπι。
[0023]優(yōu)選地，以正十二面體結(jié)構(gòu)單位充填、擴(kuò)展三維圖像，得到個(gè)性化的多孔連通三維數(shù)字模型。
[0024]優(yōu)選地，上述多孔金屬支架以鈦合金(T1-6A1_4V)為原料制備。
[0025]步驟⑵制備三維微支架可以使用高分子材料，包括但不限于，膠原、明膠、絲素蛋白、玉米蛋白、藻酸鹽、殼聚糖、透明質(zhì)酸鈉、海藻酸鈉、硫酸葡聚糖、肝素鈉、硫酸軟骨素或硫酸角質(zhì)素。
[0026]步驟(2)制備三維微支架可以使用生物陶瓷，包括但不限于，納米羥基磷灰石、磷酸三鈣或者磷酸鈣。
[0027]步驟(2)制備三維微支架可以使用上述高分子和生物陶瓷的組合。
[0028]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，步驟(2)制備三維微支架使用的是明膠。
[0029]骨組織工程中使用的三維多孔支架根據(jù)采用的材料不同，制備方法也有所不同，制備方法包括:高溫?zé)Y(jié)法、相分離法/冷凍干燥法、顆粒/微球/纖維-堆積粘結(jié)法及模板層壓法、交聯(lián)凝膠化法、自固化/聚合-溶出法、靜電紡絲技術(shù)、氣體發(fā)泡技術(shù)/超臨界流體法、溶液澆注-粒子瀝濾法、溶液涂覆-致孔劑分解技術(shù)、快速成型技術(shù)等。其中，交聯(lián)凝膠化法主要是通過各種物理化學(xué)交聯(lián)的方法使高聚物發(fā)生凝膠化，然后再利用如冷凍干燥法或者真空干燥法等技術(shù)除去溶劑制備多孔支架。常見的化學(xué)交聯(lián)法包括戊二醛交聯(lián)法、碳化二亞胺交聯(lián)、酰疊氮法、賴氨酸交聯(lián)法。常見的物理交聯(lián)法包括脫水加熱、高能輻射、光氧化。
[0030]優(yōu)選地，本發(fā)明的三維微支架的制備采用的是物理交聯(lián)法；更優(yōu)選地，本發(fā)明的三維微支架的制備采用的是熱交聯(lián)法。
[0031]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，步驟(2)的具體操作為:將明膠顆粒加入去離子水中充分溶解，使其終濃度為1.5-20% ;取上述明膠溶液，加入適量氯化鈉固體，混合后灌注到步驟(I)制備的多孔金屬支架中并冷凍干燥；采用熱交聯(lián)方式處理后，用蒸餾水洗氯化鈉，并再次干燥，獲得三維微支架復(fù)合多孔金屬支架。
[0032]優(yōu)選地，步驟⑵的具體操作為:將明膠顆粒加入去離子水，在37°C，300r/min的磁力攪拌器中2h至徹底溶解，終濃度為1.5-20% ;取上述明膠溶液5ml，加入Ig氯化鈉固體，混合后灌注到步驟(I)制備的多孔金屬支架中并冷凍干燥；在180°C下熱交聯(lián)24h后，用蒸餾水洗氯化鈉，并再次干燥，獲得三維微支架復(fù)合多孔金屬支架。
[0033]優(yōu)選地，明膠溶液的終濃度為3-5 %。
[0034]進(jìn)一步，所述步驟(3)的具體操作為:將步驟(2)制備的所述復(fù)合多孔金屬支架經(jīng)EOG滅菌后，在超凈臺(tái)內(nèi)滴加富血小板血漿，使血漿完全浸潤(rùn)所述復(fù)合多孔金屬支架，并封入滅菌袋中，再次凍干。
[0035]目前，國(guó)際上尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化的富血小板血漿的提取方法。按其制備程序，可以分為一次離心法、二次離心法、三次離心法。大量的實(shí)驗(yàn)證明，二次離心法的提取率最高，在臨床上也應(yīng)用最廣。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，富血小板血漿的提取方法為:
[0036](I)用裝有抗凝劑的真空采血針采靜脈血10ml，用2000r/min離心lOmin，分兩層，上層為富含血小板溶液，移出全部上清液及下層懸浮物Imm至空離心管中。
[0037](2)再次離心2000r/min，1min,移除3/4上清液，得到沉淀物及1/4上清液，吹打后得到混勻的富血小板血漿。
[0038]本發(fā)明還提供了上述粘附血小板的三維微支架復(fù)合多孔金屬支架在制備骨組織工程材料中的應(yīng)用。
[0039]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0040]1、本發(fā)明的復(fù)合多孔金屬支架可提供細(xì)胞最佳生長(zhǎng)環(huán)境，拋棄了傳統(tǒng)觀念中金屬支架的設(shè)計(jì)必須滿足最適合細(xì)胞生長(zhǎng)孔徑的限制，盡可能將其制備成大孔洞和高孔隙率結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)了金屬的最少化和骨長(zhǎng)入量的最大化；而內(nèi)部三維微支架則不再受首先滿足力學(xué)強(qiáng)度的限制，盡可能采用最利于骨生長(zhǎng)的材料，營(yíng)造出結(jié)構(gòu)疏松、具有細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)、適合細(xì)胞攀附生長(zhǎng)的三維微支架，為細(xì)胞提供最好的生長(zhǎng)微環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)兩者的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。
[0041]2、本發(fā)明的三維微支架的制備采用熱交聯(lián)方法，較以往使用EDC、戊二醛交聯(lián)劑的化學(xué)交聯(lián)方法相比，沒有化學(xué)毒性，與此同時(shí)形成相差無(wú)幾的級(jí)聯(lián)孔洞。
[0042]3、本發(fā)明的復(fù)合多孔金屬支架中的三維微支架中粘附的血小板是經(jīng)富血小板血漿凍干處理后獲得的，可在常溫下長(zhǎng)久保存，遇水水化后可緩慢激活釋放細(xì)胞因子，使其具備一定的生物活性。
[0043]4、本發(fā)明使用的血小板來(lái)源方便，可采用自身或同種同型血小板，較同種異體骨來(lái)說沒有免疫排斥性。
【附圖說明】
[0044]圖1顯示使用3D打印技術(shù)制備的多孔鈦合金支架；
[0045]圖2顯示明膠三維微支架的電鏡掃描圖；
[0046]圖3顯示多孔鈦合金支架孔洞中的明膠三維微支架；
[0047]圖4顯示粘附血小板的明膠三維微支架的電鏡掃描圖。
【具體實(shí)施方式】
[0048]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋