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用于預(yù)防鉤端螺旋體病的鉤端螺旋體疫苗抗原的制作方法

文檔序號:1073463閱讀:577來源:國知局
專利名稱:用于預(yù)防鉤端螺旋體病的鉤端螺旋體疫苗抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明總體上涉及抗原性制備物,并特別涉及用于在動物體內(nèi)誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答的四種鉤端螺旋體膜蛋白,即激酶、通透酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(mannosyltransferase)和內(nèi)鞭毛素(endoflagellin)。這些蛋白質(zhì)可在免疫學(xué)上作為疫苗用于預(yù)防由這種微生物所致的鉤端螺旋體病?;蛘撸赏ㄟ^檢測這些蛋白質(zhì)、這些蛋白質(zhì)的抗體、或編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷酸的存在來診斷鉤端螺旋體病。
鉤端螺旋體屬的致病性種均為鉤端螺旋體病(一種世界范圍內(nèi)傳播的重要的動物傳染病)的致病因子。該菌為需氧生長的革蘭氏陰性螺旋體。這些細菌有復(fù)雜的營養(yǎng)需求并能利用長鏈脂肪酸作為唯一碳源。鉤端螺旋體均可游動,且其快速、螺旋前進的游動性是其區(qū)別于其他微生物的鑒別特征。鉤端螺旋體均對甲硝唑和5-氟尿嘧啶有抗性,并證實體外增代時間為10-12小時。
所有致病性鉤端螺旋體均屬于問號鉤端螺旋體。最近的DNA同源性研究導(dǎo)致將問號鉤端螺旋體重新劃分為7個致病性鉤端螺旋體種博氏鉤端螺旋體哈德焦牛血清變型(sv hardjobovis)、稻田氏鉤端螺旋體、問號鉤端螺旋體、L.kirshneri、野口氏鉤端螺旋體、圣他羅西亞鉤端螺旋體和韋氏鉤端螺旋體。引起鉤端螺旋體病的致病性鉤端螺旋體種的血清學(xué)顯示,在23個血清型中有超過200個血清變型(“sv”)(Farr,R.W.臨床感染性疾病(Clin.Infect.Dis.)211-8(1995))。有很多血清變型可引起世界范圍的鉤端螺旋體病。問號鉤端螺旋體波摩那血清變型常見于豬的感染,可引起發(fā)燒、黃疸、血紅蛋白尿和腎衰竭。問號鉤端螺旋體哈德焦牛血清變型是牛患病的重要病因,可引起流產(chǎn)和無乳,并使人在長期暴露于感染的牛后有被牛傳染的危險。很多感染動物均無癥狀表現(xiàn)。但這些動物可成為攜帶者并通過其尿液排出鉤端螺旋體。
經(jīng)證實牛的鉤端螺旋體感染有16%的感染率,且菜牛的感染率高于奶牛。公牛的感染率高于母牛。引起牛鉤端螺旋體病的某些血清變型發(fā)病率更高。在最近一次對全美48個州的鉤端螺旋體陽性牛的調(diào)查中發(fā)現(xiàn),84%感染了哈德焦牛血清變型,12%感染了波摩那血清變型,4%感染了流感傷寒血清變型(Miller,D.A.等美國獸醫(yī)研究雜志(Am.J.Vet.Res.)52(11)1761-1765(1991))。
有關(guān)鉤端螺旋體感染的致病原因知之甚少。感染一般通過與感染動物的尿接觸而傳播。感染尿污染的土地和水也可傳播感染,但對鉤端螺旋體在這些情況下能否存活很長時間仍有疑問。22℃或以上的溫度、一定濕度及中性至稍偏堿性環(huán)境有利于鉤端螺旋體在宿主體外的存活。鉤端螺旋體很易被60℃以上的溫度、去污劑、干燥環(huán)境和酸滅活。一旦鉤端螺旋體侵犯宿主,吸附并穿入黏膜上皮細胞的胞間連接是感染的關(guān)鍵步驟。菌血癥(bacteremia)是常見的結(jié)果并是與鉤端螺旋體病有關(guān)的首要病理學(xué)狀況。一旦進入循環(huán)系統(tǒng),該菌可定居在腎臟,引起腎臟的急性或慢性感染。涉及鉤端螺旋體致病機理的一些潛在毒力因子有透明質(zhì)酸酶、尿素酶、溶血素、和磷脂酶。
鉤端螺旋體病由能感染大多數(shù)哺乳動物的致病性鉤端螺旋體引起。致病性鉤端螺旋體的主要天然貯主均為野生哺乳動物,但偶爾也感染其他脊椎動物。此外,已知鉤端螺旋體的好幾個種是海洋哺乳動物(有太平洋港口海豹(Pacific harbor seals))的病原體(Stampler,M.A.等野生動物疾病雜志(J.Wild.Dis.)34(2)407-410(1989))。家畜如狗、牛、豬、綿羊、山羊和馬也是人類感染的主要來源。感染既可以通過與感染動物直接接觸發(fā)生,也可以通過與污染的土地或水間接接觸而發(fā)生。家畜中,由于該病可引起流產(chǎn)、死產(chǎn)、不育、牛奶產(chǎn)量減少和死亡,因而會造成經(jīng)濟損失。
人類鉤端螺旋體病的嚴重性差別很大,主要由感染菌株和宿主的總體健康狀況決定。在美國,各地實驗室對鉤端螺旋體分型能力的提高使得能識別出大量地方性血清變型,以及在不同種動物中的感染范圍。但仍然很少能診斷出人類鉤端螺旋體病。美國每年報道的病例近100例。
由于鉤端螺旋體病在嚙齒類動物和家畜中比較普遍,因此得鉤端螺旋體病的人主要是工作中嚴重暴露于動物或動物產(chǎn)品的人,如污水處理工人、養(yǎng)豬者、獸醫(yī)、屠宰場工人和農(nóng)民(Vinetz,J.M.,傳染病最新觀點(Cur.Opin.Infect.Dis.)10357-361(1997))。易感人群還包括生活在嚙齒類動物大批出沒的地方如都市貧民區(qū)的人,及豢養(yǎng)狗者。男性發(fā)病率較高。目前病例主要見于夏秋兩季的十幾二十歲年輕人。因業(yè)余愛好接觸而感染的情況越來越常見。
由于污染的池塘或緩緩的溪流引起的社群爆發(fā)比較多見。高攻擊率、夏季、年輕人群和動物對水源的接近都是這些爆發(fā)中的大多數(shù)的典型特征。在世界上某些地區(qū),洪水爆發(fā)期間的徑流也有高傳染性。
偶發(fā)病例可能是因直接與感染動物接觸而獲得的??深A(yù)防臨床病兆的家畜疫苗不能阻止鉤端螺旋體的排出。寵物狗是人類偶發(fā)病例的主要病源。動物的腎曲小管貯存有活性鉤端螺旋體,這些鉤端螺旋體可在尿中傳送。無癥狀性尿液排出的持續(xù)時間在不同種動物之間各不相同;人類排出鉤端螺旋體的時間很少超出數(shù)月。
除了與污染的尿發(fā)生直接和間接接觸,其他傳播形式很少見。泌乳動物在乳汁中排放鉤端螺旋體,但幾個小時后,全奶中的鉤端螺旋體即被殺死,已知的人類病例中沒有一例是經(jīng)這種方式發(fā)生的。鉤端螺旋體不排在唾液中,故動物叮咬不是感染的直接來源。
鉤端螺旋體病的發(fā)病機理與其他螺旋體疾病(包括由梅毒密螺旋體引起的梅毒和由布氏疏螺旋體引起的Lyme氏疏螺旋體病(Lymeborreliosis))的十分相似。梅毒和Lyme氏疏螺旋體病均以發(fā)病早期廣泛播散,包括侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)為特征。鉤端螺旋體由于也有這些致病性螺旋體的這種能力,故腦膜炎是鉤端螺旋體病的常見表現(xiàn)。螺旋體感染的另一個特點是在宿主體內(nèi)持續(xù)性感染的能力,就象第三期梅毒和慢性Lyme氏關(guān)節(jié)炎的表現(xiàn)那樣。(深入回顧請參見Baranton,G.和Old,I.G.,巴斯德研究所公告(Bull.Inst.Pasteur)9363-95(1995))。
由于有毒力的鉤端螺旋體既能在環(huán)境中長期存活又能持續(xù)性感染,并可由野生動物和家畜排出,這使得控制鉤端螺旋體病的努力受到阻礙。
鉤端螺旋體膜蛋白因其在細菌性發(fā)病機理中有重要作用而顯得十分重要。對鉤端螺旋體致病機理中涉及的膜蛋白的鑒定不僅對于了解鉤端螺旋體膜蛋白及其與致病機理的關(guān)系有重要意義,而且對于了解其他螺旋體膜蛋白及其在致病機理中的作用也有重要意義。
目前可用的鉤端螺旋體疫苗只產(chǎn)生短期免疫力,且不能針對致病性鉤端螺旋體170個血清變型中的多數(shù)產(chǎn)生交叉保護(Thiermann,等,美國獸醫(yī)協(xié)會雜志(J.Am.Vet.Med.Assoc.)184722(1984))。這些疫苗由滅活的全鉤端螺旋體或經(jīng)完整鉤端螺旋體的顯微鏡凝集測得將產(chǎn)生血清反應(yīng)性的外膜制備物組成。盡管數(shù)個證據(jù)暗示脂多糖樣物質(zhì)(LLS)可能賦予一定程度的保護作用,但這些疫苗制備物中保護性免疫原的天然特征尚未得到結(jié)論性闡述。
就有效感染的治療而言,氧四環(huán)素(土霉素)為首選藥物,并已常規(guī)用于治愈感染和攜帶狀態(tài)。使用菌苗或脂多糖樣成分的多種疫苗制備物經(jīng)應(yīng)用有不同程度的成功。當前疫苗的保護作用傾向于為血清變型特異性并缺乏產(chǎn)生可重復(fù)保護的能力。
本發(fā)明建立在對與鉤端螺旋體致病株相關(guān)的四種鉤端螺旋體膜蛋白(即激酶、通透酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)鞭毛素)的鑒定基礎(chǔ)上。由于螺旋體膜的脆性以及膜蛋白只少量存在的事實,本發(fā)明之前對囊括螺旋體膜蛋白在內(nèi)的膜的報道十分有限。用mRNA扣除雜交法對體內(nèi)表達的基因進行鑒定是鑒別毒力相關(guān)基因的有效方法。本發(fā)明描述了對問號鉤端螺旋體波摩那血清變型在感染的Syrian倉鼠體內(nèi)定居于肝臟期間表達的三種基因的鑒定。本發(fā)明還描述了用ZAP表達文庫從哈德焦牛鉤端螺旋體中鑒別出的第四種基因。本發(fā)明還描述了具有免疫原性、可用于誘導(dǎo)對致病性鉤端螺旋體的免疫應(yīng)答、可作為鉤端螺旋體病診斷指標的四種鉤端螺旋體膜蛋白。


圖1。鉤端螺旋體膜蛋白激酶的全部核苷酸(A)和由此推出的氨基酸序列(B),為pHLE011和pMW43的ORF1。起始密碼子和終止密碼子均表示為黑體下劃線。
圖2。鉤端螺旋體膜蛋白通透酶的全部核苷酸(A)和由此推出的氨基酸序列(B),為pHLE011和pMW310的ORF2。起始密碼子和終止密碼子均表示為黑體下劃線。
圖3。鉤端螺旋體膜蛋白甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的全部核苷酸(A)和由此推出的氨基酸序列(B),為pMW50的ORF3。起始密碼子和終止密碼子均表示為黑體下劃線。
圖4。來自pDFX210的鉤端螺旋體膜蛋白內(nèi)鞭毛素全部核苷酸(A)和由此推出的氨基酸序列(B)。起始密碼子和終止密碼子均表示為黑體下劃線。
本發(fā)明提供來自鉤端螺旋體致病株的膜的四種免疫原性蛋白質(zhì)。這些膜蛋白為激酶、通透酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)鞭毛素。本發(fā)明還包括編碼這些蛋白質(zhì)的四種多核苷酸序列。
本發(fā)明的四種免疫原性蛋白質(zhì)可應(yīng)用于誘導(dǎo)對致病性鉤端螺旋體的免疫應(yīng)答的藥物組合物中。
本發(fā)明包括用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)這些鉤端螺旋體膜蛋白的方法。四種膜蛋白的基因已克隆在隨后將用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的質(zhì)粒載體中。
這四種膜蛋白的細菌性基因很可能衍生自致病性鉤端螺旋體的任意菌株。優(yōu)選蛋白質(zhì)來自問號鉤端螺旋體波摩那血清變型或博氏鉤端螺旋體哈德焦牛血清變型。這些鉤端螺旋體菌株可從例如ATCC(Rockville,Md.)這樣的機構(gòu)獲得。
本發(fā)明提供編碼四種鉤端螺旋體膜蛋白即激酶、通透酶、甘露糖苷轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)鞭毛素的多核苷酸。這些多核苷酸包括編碼這四種蛋白質(zhì)的DNA和RNA序列。當然編碼這四種蛋白質(zhì)之全部或部分的所有多核苷酸,只要它所編碼的多肽表現(xiàn)出天然或全長蛋白質(zhì)的功能,例如誘導(dǎo)抗體或與抗體結(jié)合的能力,就也包括在此。這類多核苷酸包括天然的和有目的改造(如誘變)的多核苷酸。
本發(fā)明的DNA序列可通過多種方法獲得。如,此DNA可用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的雜交操作而得。這些操作包括但不限于1)用探針與基因組文庫雜交以檢測共有的核苷酸序列,和2)用抗體篩選表達文庫以檢測共有的結(jié)構(gòu)特征。
用標記并混合的合成寡核苷酸探針進行雜交程序?qū)τ诤Y選重組克隆十分有用,其中每個探針都可能是包含變性雙鏈DNA異源混合物的雜交樣品中一段特定DNA序列的完全互補體。在這樣的篩選中,雜交優(yōu)選針對單鏈DNA或變性雙鏈DNA進行。通過應(yīng)用嚴謹雜交條件以避免非特異性結(jié)合,有可能通過例如使靶DNA與混合物中與其完全互補的單個探針雜交而使特定DNA克隆放射自顯影(Wallace,等,核酸研究,9879(1981))。
或者,可用針對諸蛋白質(zhì)的抗體篩選某表達文庫而間接得到這四種本發(fā)明的膜蛋白(每種蛋白至少有一個表位)。這些抗體既可以是多克隆也可以是單克隆,它們可用來檢測指示鉤端螺旋體激酶、通透酶、甘露糖苷轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)鞭毛素DNA存在的表達產(chǎn)物。通常按Huynh,等的方法構(gòu)建一個λgt11文庫并進行免疫學(xué)篩選(見分子克隆實踐方案,D.M.Glover編,149(1985))。
也可采用以下方法獲得編碼激酶、通透酶、甘露糖苷轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)鞭毛素的特異性DNA序列1)從基因組DNA中分離一段雙鏈DNA序列,和2)化學(xué)制備DNA序列以提供目的蛋白的必需密碼子。
可用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)從鉤端螺旋體的任意菌株分別獲得或擴增這四種鉤端螺旋體膜蛋白以便隨后克隆并表達編碼這四種蛋白質(zhì)的cDNA(如見美國專利第4,683,202;4,683,195;4,889,818號;Gyllensten等,美國國家科學(xué)院學(xué)報,857652-7656(1988);Ochman等,遺傳學(xué),120621-623(1988);Triglia等,核酸研究,168156(1988);Frohman等,美國國家科學(xué)院學(xué)報,858998-9002(1988);Loh等,科學(xué),243217-220(1989))。相似地,PCR技術(shù)可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員常規(guī)應(yīng)用,以產(chǎn)生本發(fā)明編碼四種鉤端螺旋體膜蛋白中任意一種的部分的多核苷酸片段。
本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的方法可用于構(gòu)建含四種鉤端螺旋體膜蛋白或其片段的編碼序列及相應(yīng)轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)重組/基因重組。見如,由Maniatis等,分子克隆實驗室手冊,冷泉港實驗室,N.Y.,第12章(1982)所述。
多種宿主表達載體系統(tǒng)可用于表達這四種鉤端螺旋體膜蛋白或其片段。這些系統(tǒng)包括但不限于以含有鉤端螺旋體膜蛋白或其片段編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化的微生物如細菌;以含有鉤端螺旋體膜蛋白或其片段編碼序列的重組酵母菌表達載體轉(zhuǎn)化的酵母菌;以含有鉤端螺旋體膜蛋白或其片段編碼序列的重組病毒表達載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng);或以含有鉤端螺旋體膜蛋白或其片段編碼序列的重組病毒表達載體(如腺病毒、痘苗病毒)感染的動物細胞系統(tǒng)。
這些載體的表達因子的長度和特異性各不相同。根據(jù)所用宿主/載體系統(tǒng)的不同,任意數(shù)量的合適轉(zhuǎn)錄和翻譯因子(包括組成型和誘導(dǎo)型啟動子)可應(yīng)用在表達載體中。如,當在細菌系統(tǒng)中克隆時,可用諸如λ噬菌體的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜合在啟動子)之類的啟動子;當在昆蟲細胞系統(tǒng)中克隆時,可應(yīng)用如桿狀病毒多角體蛋白啟動子;當在哺乳動物細胞系統(tǒng)中克隆時,可應(yīng)用如腺病毒晚期啟動子或痘苗病毒7.5K啟動子之類的啟動子。也可應(yīng)用經(jīng)重組DNA技術(shù)或合成技術(shù)產(chǎn)生的啟動子,以轉(zhuǎn)錄插入的鉤端螺旋體膜蛋白或其片段編碼序列。
在酵母菌中,很多含組成型或誘導(dǎo)型啟動子的載體可以使用。此方面的回顧見分子生物學(xué)最新方案,2卷,Ausubel等編,GreenePublish.Assoc.& Wiley Interscience第13章(1988);Grant等,酵母菌的表達和分泌載體,酶學(xué)方法,Wu & Grossman編,Acad.出版社,N.Y.,153卷,516-544頁(1987);Glover,DNA克隆,2卷,IRL出版社,華盛頓特區(qū)Ch.3(1986);Bitter,外源基因在酵母菌中的表達,酶學(xué)方法,Berger & Kimmel等編,Acad.出版社,N.Y.,卷152,673-684頁(1987);酵母屬的分子生物學(xué),Strathern等編,冷泉港出版社,卷1和2(1982)。酵母菌互補試驗中,可將鉤端螺旋體膜蛋白或其片段的cDNA克隆進入因酵母2μ環(huán)的存在而在酵母中自主復(fù)制的酵母附加體質(zhì)粒(YEp)。鉤端螺旋體膜蛋白或其片段中任一個都既可以克隆在組成型酵母菌啟動子如ADH或LEU2之后也可以在誘導(dǎo)型啟動子如GAL之后(酵母菌克隆,第3章,R.Rothstein In;DNA克隆,卷11,實踐方案,DM Glover編,IRL出版社,華盛頓特區(qū)(1986))。構(gòu)建體可包含同源鉤端螺旋體膜蛋白mRNA的或酵母菌基因相應(yīng)的5’和3’非翻譯區(qū)。Yep能以高效率轉(zhuǎn)化并且該質(zhì)粒極其穩(wěn)定?;蚩捎媚艽龠M外源DNA序列整合在酵母菌染色體中的載體。
可用于表達四種鉤端螺旋體膜蛋白或其片段之一的一個特別好的表達系統(tǒng)是昆蟲系統(tǒng)。在這樣的一個系統(tǒng)中,苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)作為載體表達外源基因。該病毒生活在草地夜蛾細胞中。可將鉤端螺旋體膜蛋白或其片段的編碼序列克隆進該病毒的非必需區(qū)(如多角體蛋白基因)中并置于AcNPV啟動子(如多角體蛋白啟動子)的控制之下。多角體蛋白基因的成功插入將導(dǎo)致產(chǎn)生非包含型重組病毒(即缺乏由多角體蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)衣殼的病毒)。這些重組病毒隨后可用于感染草地夜蛾細胞,在其中將表達所插入的基因(如,見Smith等,生物學(xué)雜志,46586(1983);美國專利第4,215,051號)。
如果用腺病毒做表達載體,則可將鉤端螺旋體膜蛋白或其片段的編碼序列與腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合體如晚期啟動子和三聯(lián)前導(dǎo)序列進行連接。隨后可通過體內(nèi)或體外重組插入將這一嵌合基因腺病毒基因組。在病毒基因組的非必需區(qū)(如E1或E3區(qū))插入將產(chǎn)生在感染宿主體內(nèi)有活性并能表達鉤端螺旋體膜蛋白或其片段的重組病毒。(如,見Logan & Shenk,美國國家科學(xué)院學(xué)報813655-3659(1984))?;蛘呖捎枚幻绮《?.5K啟動子(如,見Mackett等,美國國家科學(xué)院學(xué)報,797415-7419(1982);Mackett等,病毒學(xué)雜志,49857-864(1984);Panicali等,美國國家科學(xué)院學(xué)報,794927-4931(1982))。
為了有效翻譯插入的鉤端螺旋體膜蛋白或其片段編碼序列,可能還需要特殊的起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子及其鄰近序列。如果完整的鉤端螺旋體膜蛋白基因組,包括其起始密碼子及鄰近序列都已插入適當?shù)谋磉_載體中,則可能不再需要另外的翻譯控制信號。然而,如果只插入了鉤端螺旋體膜蛋白編碼序列的一部分,則必需提供外源翻譯控制信號,包括ATG起始密碼子。而且,起始密碼子必須與鉤端螺旋體膜蛋白或其片段編碼序列的讀碼框一致,以確保對完整插入物的翻譯。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可以是多種來源的,既可以是天然的也可以是合成的。表達效率可因包含適當?shù)霓D(zhuǎn)錄提高因子,轉(zhuǎn)錄終止子等而增加(參見Bitter等,酶學(xué)方法,153516-544(1987))。
此外,宿主細胞株可選擇能以所希望的特殊形式調(diào)節(jié)插入序列的表達,或?qū)虍a(chǎn)物進行修飾和加工的細胞株。某些啟動子驅(qū)動的表達在有特定誘導(dǎo)物(如,對金屬硫蛋白啟動子而言是鋅和鎘)存在時可增強。因此,可以控制基因工程化鉤端螺旋體膜蛋白或其片段的表達。這一點在所克隆的外源基因蛋白產(chǎn)物對宿主細胞有致死性時將十分重要。而且,對蛋白產(chǎn)物的修飾(如糖基化)和加工(如切割)可能對蛋白質(zhì)的功能十分重要。不同宿主細胞有其特征性的并且是特異性的蛋白質(zhì)翻譯后加工和修飾機制??梢赃x擇合適的細胞系或宿主系統(tǒng)以確保正確修飾和加工所表達的外源蛋白。
含有鉤端螺旋體膜蛋白或其片段編碼序列并能表達具有生物學(xué)活性的鉤端螺旋體膜蛋白或其片段基因產(chǎn)物的宿主細胞可用至少四種常用方法鑒別(a)DNA-DNA雜交;(b)“標記”基因功能的有或無;(c)測量鉤端螺旋體膜蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄子在宿主細胞中的表達以評估轉(zhuǎn)錄水平;以及(d)用免疫學(xué)試驗檢測鉤端螺旋體膜蛋白基因產(chǎn)物或直接測其生物學(xué)活性。
在第一種方法中,插入表達載體中的鉤端螺旋體膜蛋白或其片段編碼序列是否存在,可用包含與如近期所述鉤端螺旋體膜蛋白編碼序列(Goeddert等,1988,美國國家科學(xué)院學(xué)報,854051-4055)或其特殊部分基本同源的核苷酸序列的探針進行DNA-DNA雜交而檢測。
在第二種方法中,重組表達載體/宿主系統(tǒng)可根據(jù)特定“標記”基因功能(如,胸苷激酶活性、抗生素抗性、氨甲碟呤抗性、轉(zhuǎn)化表型、桿狀病毒包含體的形成等)的存在與否進行鑒別和選擇。例如,若鉤端螺旋體膜蛋白或其片段編碼序列插入在載體的標記基因序列之中,則含若鉤端螺旋體膜蛋白或其片段編碼序列的重組體可通過標記基因功能的喪失而鑒別。或者,可將標記基因與鉤端螺旋體膜蛋白或其片段編碼序列串聯(lián),其啟動子與用于控制鉤端螺旋體膜蛋白或其片段編碼序列表達的啟動子相同或不同。因誘導(dǎo)或選擇而有標記物的表達指示鉤端螺旋體膜蛋白或其片段編碼序列有表達。
在第三種方法中,鉤端螺旋體膜蛋白或其片段編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性可用雜交試驗評價。例如,可分離RNA,并用與所述鉤端螺旋體膜蛋白或其片段編碼序列或其特殊部分(Goeddert等,1988,美國國家科學(xué)院學(xué)報,854051-4055)基本同源的探針經(jīng)Northern雜交進行分析?;蛘?,可抽提宿主細胞的全部核酸并與這樣的探針雜交進行分析。
在第四種方法中,可對鉤端螺旋體膜蛋白或其片段產(chǎn)物的表達進行免疫學(xué)評價,如用蛋白印跡、或諸如放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫分析之類的免疫試驗評價。
一旦鑒別出表達鉤端螺旋體膜蛋白或其片段的重組體,就可以對基因產(chǎn)物進行分析。這一點可借助對產(chǎn)物物理特點、免疫學(xué)特點或功能性特點的分析進行。
不管鉤端螺旋體膜蛋白或其片段是由完整基因序列,或基因序列的一部分,還是由兩個或多個連接在一起指導(dǎo)嵌合蛋白生產(chǎn)的基因序列所產(chǎn)生,它們都應(yīng)具有免疫反應(yīng)性。這種反應(yīng)性可用標準的免疫學(xué)技術(shù)如放射免疫沉淀、放射免疫競爭或免疫印跡來證實。
編碼本發(fā)明四種膜蛋白的DNA序列可通過使DNA轉(zhuǎn)染適當?shù)乃拗骷毎隗w外表達?!爸亟M宿主細胞”或“宿主細胞”是載體可在其中增殖并表達其DNA的細胞。該術(shù)語還包括受試宿主細胞的任何子代。應(yīng)理解不是所有子代都與親代細胞相同,因為復(fù)制時有可能發(fā)生突變。但當用到上述術(shù)語時,這類子代都包括在內(nèi)。
本發(fā)明所用術(shù)語“宿主細胞”不僅包括原核細胞,還包括酵母、絲狀真菌這樣的真核細胞,以及植物細胞和動物細胞。術(shù)語“原核”包括可用本發(fā)明四種鉤端螺旋體膜蛋白的基因轉(zhuǎn)化的所有細菌。原核宿主可包括革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌,如大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和枯草芽孢桿菌。
編碼本發(fā)明四種鉤端螺旋體膜蛋白的重組DNA分子可用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所知的任何技術(shù)轉(zhuǎn)化宿主細胞。尤其優(yōu)選用含四種鉤端螺旋體膜蛋白編碼序列之任一種的質(zhì)粒進行原核轉(zhuǎn)化。若宿主為原核細胞,如大腸桿菌,則能攝入DNA的感受態(tài)細胞可通過收獲指數(shù)生長期細胞并隨后用本領(lǐng)域熟知的CaCl2法處理而制備?;蚩捎肕gCl2或RbCl。轉(zhuǎn)化也可在形成了宿主細胞的原生質(zhì)體后進行。
在本發(fā)明中,可將四種鉤端螺旋體膜蛋白編碼序列之任一種插入重組表達載體。術(shù)語“重組表達載體”指已經(jīng)插入或摻入四種鉤端螺旋體膜蛋白基因序列中任一種的本領(lǐng)域所知質(zhì)粒、病毒或其它載體。這類表達載體包含可促進所插入基因序列在宿主中有效轉(zhuǎn)錄的啟動子序列。表達載體一般包含復(fù)制起點、啟動子、以及能對轉(zhuǎn)化細胞進行表型選擇的特定基因。轉(zhuǎn)化的原核宿主可按本領(lǐng)域所知的方法進行培養(yǎng)以獲得細胞的最佳生長。在酵母中表達外源基因的各種穿梭質(zhì)粒已有報道(Heinemann等,自然,340205(1989);Rose等,基因,60237(1987))。能在宿主中表達并復(fù)制的生物學(xué)功能性DNA載體為本領(lǐng)域已知。這類載體可用于插入本發(fā)明DNA序列。
已有制備融合的、可操作連接的基因并在細菌中使之表達的方法,如參見已引入本文做參考的美國專利第4,366,246號。該專利中所述的基因構(gòu)建體及方法可用于在原核宿主中表達四種鉤端螺旋體膜蛋白之任一種。
可用于本發(fā)明的啟動子實例有rec A,trp,lac,tac,和λ噬菌體p[R]或p[L]??捎糜诒景l(fā)明的質(zhì)粒實例如Maniatis等(分子克隆,冷泉港實驗室,1982)所列。
本發(fā)明提供的抗體對四種鉤端螺旋體膜蛋白之任一種有免疫反應(yīng)性。基本上由針對不同表位的匯合單克隆抗體組成的抗體,以及各個單克隆抗體制備物均有提供。單克隆抗體是由含蛋白質(zhì)片段的抗原經(jīng)本領(lǐng)域已知的方法制備而成(Kohler等,自然,256495(1975);分子生物學(xué)最新方案,Ausubel等編,(1989))。
本發(fā)明所用術(shù)語“抗體”包括完整分子及其片段,如Fab,F(xiàn)(ab’)2和能結(jié)合表位決定簇的Fv。這些抗體片段保留了一些與其抗原或受體選擇性結(jié)合的能力,對它們可作如下解釋(1)Fab這種包含抗體分子的單價抗原結(jié)合片段的片段,是用木瓜蛋白酶對完整抗體進行消化而產(chǎn)生的完整輕鏈和一條重鏈的一部分;(2)Fab’這種抗體片段是用胃蛋白酶處理完整抗體、再經(jīng)還原產(chǎn)生的完整輕鏈和重鏈一部分;每個抗體分子可得到兩個Fab’片段;(3)F(ab’)2這種抗體片段是用胃蛋白酶處理完整抗體但不進行還原而產(chǎn)生的;F(ab’)2是以二硫鍵連接兩個Fab’片段形成的二聚體;(4)Fv是包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)并表達為兩條鏈的基因工程化片段;和(5)單鏈抗體(“SCA”)是以適當?shù)亩嚯慕宇^連接輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)形成基因工程化融合的單鏈分子。
制備這些片段的方法本領(lǐng)域已知。(如參見Harlow和Lane,抗體實驗室手冊,冷泉港實驗室,紐約(1988),已引入本文做參考)。
如本文所用,術(shù)語“表位”指抗原表面與抗體互補位結(jié)合的任何抗原性決定簇。表位決定簇通常由分子表面具有化學(xué)活性的基團如氨基酸或糖側(cè)鏈組成,并通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征,以及特定的電荷特征。
可與本發(fā)明四種鉤端螺旋體膜之任一種結(jié)合的抗體可用完整多肽或包含目的小肽的片段作致敏抗原制備而成。
SEQ ID NO1-4的任一種蛋白質(zhì)或其片段也可通過化學(xué)合成這四種蛋白質(zhì)之任一種的氨基酸序列而產(chǎn)生(Goeddert等,美國國家科學(xué)院學(xué)報,854051-4055(1988)),這些氨基酸序列可通過對這四種鉤端螺旋體膜蛋白之任一種的編碼cDNA的克隆和測序預(yù)測。這四種鉤端螺旋體膜蛋白可用本領(lǐng)域已知的標準肽合成法化學(xué)合成。這些方法包括R.Bruce Merrifield發(fā)明的固相法(Erickson和Merrifield,“固相肽合成”,《蛋白質(zhì)》,卷2,H.Neurath &R.Hill(編),Academic出版公司,紐約,255-257頁;Merrifield,“固相肽合成”,科學(xué),242341-347(1986))。在固相法中,氨基酸被逐步添加到與不溶性基質(zhì)如聚苯乙烯珠相連的逐漸延伸的肽鏈上。此法的一個主要優(yōu)點是每一步的目的產(chǎn)物均與可快速過濾和清洗的珠子結(jié)合,從而無須純化中間產(chǎn)物。所有反應(yīng)均在一個容器內(nèi)進行,這樣可以排除重復(fù)轉(zhuǎn)移產(chǎn)物所造成的損失。此化學(xué)肽合成固相法很易自動化,使之有可能以高產(chǎn)率及高純度常規(guī)合成包含約50個殘基的肽(Stewart和Young,固相肽合成,第二版,Pierce化學(xué)公司(1984);Tam等,美國化學(xué)協(xié)會雜志,1056442(1983))。
可由cDNA翻譯或化學(xué)合成得到用于免疫動物的SEQ ID NO1-4中任一種蛋白質(zhì)或其片段,它們可與載體蛋白偶聯(lián)(若有必要)。這類常用的與肽化學(xué)偶聯(lián)的載體包括匙孔蝛血藍蛋白(KLH)、甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破傷風(fēng)類毒素。隨后用偶聯(lián)肽免疫動物(如小鼠、大鼠、或兔子)。
若有必要,可進一步純化多克隆或單克隆抗體,如通過對吸附有引起抗體產(chǎn)生的四種蛋白質(zhì)或其片段的基質(zhì)進行結(jié)合和洗脫而純化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道有免疫學(xué)領(lǐng)域常用的各種技術(shù)可用于純化和/或濃縮多克隆抗體及單克隆抗體(參見如Coligan等,第9單元,免疫學(xué)最新方案,Wiley Interscience,1991,已引入本文做參考)。
也可以用抗獨特型技術(shù)產(chǎn)生模擬表位的單克隆抗體。如,針對第一單克隆抗體的抗獨特型單克隆抗體在其高變區(qū)中有一個結(jié)合區(qū)是第一單克隆抗體所結(jié)合的表位的“影象”。
對本發(fā)明四種蛋白質(zhì)中任一種的一級氨基酸序列的微小修飾可產(chǎn)生與本文所述天然鉤端螺旋體蛋白基本上功能等價的蛋白質(zhì)。這類修飾可以是有意的(如定向誘變),也可以是自發(fā)的。通過這些修飾產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)只要具有天然的功能(即能與特異于四種鉤端螺旋體膜蛋白之任一種的抗體結(jié)合),即都包括在此。
對四種膜蛋白中任一種的一級氨基酸序列的修飾還包括保守性變異。在此所用術(shù)語“保守性變異”指一個氨基酸殘基由另一個生物學(xué)上相似的殘基替代。保守性變異的實例包括疏水性殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的相互替代;或極性殘基之間的相互替代,如以精氨酸替代賴氨酸、谷氨酸替代天冬氨酸、或谷氨酰氨替代天冬酰氨,等等。術(shù)語“保守性變異”還包括用替代氨基酸替換原來的氨基酸,只要針對該替代型蛋白質(zhì)或其片段產(chǎn)生的抗體與未替代的蛋白質(zhì)或其片段也能發(fā)生免疫反應(yīng)即可。
對本發(fā)明提供的微生物表達蛋白或其片段的分離和純化,可用傳統(tǒng)的方法,包括涉及單克隆或多克隆抗體的制備型層析和免疫學(xué)分離進行。
本發(fā)明進一步包括按所述方法,或本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的其它方法(如用溶源噬菌體轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì),并使某原核生物表達四種鉤端螺旋體膜蛋白激酶、通透酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶或內(nèi)鞭毛素的基因)修飾的任意宿主。用編碼本發(fā)明四種膜蛋白的四種鉤端螺旋體基因中任一種轉(zhuǎn)化的原核生物尤其對可用于免疫動物(如兔子)的多肽的產(chǎn)生十分有用。
在一個實施方案中,本發(fā)明提供可用于在動物體內(nèi)誘導(dǎo)針對致病性鉤端螺旋體的免疫應(yīng)答的藥物組合物,該藥物組合物在制藥學(xué)上可接受的載體中包含免疫學(xué)有效量的四種鉤端螺旋體膜蛋白之任一種蛋白。描述本發(fā)明時用的術(shù)語“免疫學(xué)有效量”,指在動物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對鉤端螺旋體的免疫應(yīng)答所必需的鉤端螺旋體抗原量。本發(fā)明的四種鉤端螺旋體膜蛋白特別可用于使動物的免疫系統(tǒng)致敏,從而產(chǎn)生能改善鉤端螺旋體感染影響的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的四種鉤端螺旋體膜蛋白之任一種可經(jīng)非胃腸道途徑給藥,如注射、快速灌注、鼻咽吸入、皮膚吸收和口服。非胃腸道給藥的藥學(xué)上可接受載體制劑包括無菌的或水性的或非水性的溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的實例有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、和可注射的有機酯如油酸乙酯??捎梅忾]敷裹的載體增加皮膚的滲透性和抗原的吸收。口服給藥的液體藥劑形式常包括內(nèi)有該液體藥劑形式的脂質(zhì)體溶液。懸浮脂質(zhì)體的適當形式包括乳液、懸浮液、溶液、糖漿和含本領(lǐng)域常用惰性稀釋劑的酏劑(如純水)。除了惰性稀釋劑,這類組合物還可包括佐劑、潤濕劑、乳化和懸浮劑、以及增甜劑、調(diào)味劑和加香劑。
含本發(fā)明四種鉤端螺旋體膜蛋白中任一種的抗原制劑還可包括佐劑。佐劑是能非特異性增加特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。通常,佐劑和抗原在呈遞給免疫系統(tǒng)之前先混合,或分別呈遞但進入免疫動物(含人)的同一部位。佐劑根據(jù)其組成可粗分為幾組。
這些組包括油性佐劑(如弗氏完全和不完全佐劑)、礦物鹽(如AlK(SO4)2,AlNa(SO4)2,AlNH4(SO4),硅石,明礬,Al(OH)3,Ca3(PO4)2,高嶺土,和碳)、多核苷酸(如poly IC和poly AU酸)、以及某些天然物質(zhì)(如結(jié)核分枝桿菌的蠟質(zhì)D,和在小棒桿菌、百日咳桿菌及一些布魯氏菌屬成員中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì))。
在另一個實施方案中,提供了在動物(含人)體內(nèi)誘導(dǎo)對致病性鉤端螺旋體的免疫應(yīng)答的方法。當使用多次免疫方案時,相應(yīng)于不同的免疫時間安排有很多不同的技術(shù)??蓪Ρ景l(fā)明的抗原制劑使用不止一次,以增加免疫動物免疫應(yīng)答表達的水平和多樣性。通常,若實行多次免疫,每次免疫將間隔2-4周。預(yù)期在其體內(nèi)產(chǎn)生對鉤端螺旋體的免疫應(yīng)答的受試動物包括豬、牛和人。
通常,施與動物(含人)的本發(fā)明四種鉤端螺旋體膜蛋白之任一種的劑量,將根據(jù)諸如年齡、身體狀況、性別和發(fā)病范圍(若有的話)以及可由本領(lǐng)域一般技術(shù)人員作出調(diào)整的其它變化而有所不同。
本發(fā)明的抗原制劑可給予單劑或多劑,每劑中四種鉤端螺旋體膜蛋白抗原中任一種的劑量約10ug至1,000ug,更優(yōu)選每劑約50ug至700ug抗原,最優(yōu)選每劑約50ug至300ug抗原。當用于免疫治療時,本發(fā)明的單克隆抗體可不做標記或用治療性試劑標記。這些試劑可直接或間接與本發(fā)明的單克隆抗體偶聯(lián)。間接偶聯(lián)的一個實例是應(yīng)用間隔部分。這些間隔部分可以是不溶的或可溶的(Diener等,科學(xué),231148(1986)),并可加以選擇以使藥物在靶位點從單克隆分子中釋放出來??膳c本發(fā)明的單克隆抗體偶聯(lián)用于免疫治療的治療性試劑實例有藥物、放射性同位素、凝集素和毒素。標記或未標記的本發(fā)明單克隆抗體也可與諸如上述的治療性試劑聯(lián)合應(yīng)用。
尤其優(yōu)選的是包含本發(fā)明的單克隆抗體、免疫調(diào)節(jié)劑和其它生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑的聯(lián)合治療。本發(fā)明的單克隆抗體與各種治療性試劑(如上述那些)聯(lián)合應(yīng)用時,單克隆抗體和治療性試劑常基本上同時給予。術(shù)語“基本上同時”指單克隆抗體和治療性試劑的給予時間合理地接近。通常,優(yōu)選先給予治療性試劑,再給予單克隆抗體。如治療性試劑可在給予單克隆抗體的前1至6天給予。治療性試劑的給予可以是每天一次,或考慮諸如病情、病人的狀況和試劑的半衰期等因素而選擇任何間隔期。
本發(fā)明單克隆抗體的給藥劑量將大到足以在改善鉤端螺旋體病癥狀發(fā)作時產(chǎn)生預(yù)期效果。劑量不應(yīng)大到引起副作用(如不希望的交叉反應(yīng)、過敏反應(yīng)等)。一般劑量將根據(jù)受試者的年齡、狀況、性別和患病程度有所變化,并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。在有并發(fā)癥時劑量可由醫(yī)生個人作出調(diào)整。劑量可從約0.1mg/kg至2000mg/kg變化,優(yōu)選約0.1mg/kg至500mg/kg,每天一或多劑,持續(xù)一或數(shù)日。通常,當本發(fā)明的單克隆抗體與治療性試劑聯(lián)合應(yīng)用時,可選用低于體內(nèi)診斷造影所用的劑量。
本發(fā)明的單克隆抗體可經(jīng)注射或輸液進行非胃腸道給藥。本發(fā)明的單克隆抗體可單獨或與效應(yīng)細胞聯(lián)合經(jīng)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、或穿皮給藥。
非胃腸道給藥制劑包括無菌的水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、和可注射的有機酯如油酸乙酯。水性載體包括水、酒精/水溶液、乳液或懸浮液(包括鹽水和緩沖基質(zhì))。非胃腸道載體包括氯化鈉溶液、Ringer’s葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉,乳酸化Ringer’s靜脈內(nèi)載體包括流體和營養(yǎng)補償物、電解質(zhì)補償物(如以Ringer’s葡萄糖為基礎(chǔ)的那些補償物)等等。也可包括防腐劑和其它添加劑,如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等等。
在另一個實施方案中,本發(fā)明提供檢測動物(含人)體內(nèi)致病性鉤端螺旋體相關(guān)性疾病的方法,包括用可與細胞成分結(jié)合的試劑接觸細胞成分。該細胞成分可以是核酸(如DNA或RNA)或蛋白。若成分為核酸,則試劑為核酸探針或PCR引物。若細胞成分為蛋白,則試劑為抗體探針。
探針用如放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬螯合物或酶等可檢測性標記。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員將知曉可用于與抗體結(jié)合的其它適當?shù)臉擞洠蚰苡贸R?guī)實驗確定之。
為了本發(fā)明的目的,可用特異于本發(fā)明四種鉤端螺旋體蛋白中任一種的抗體或核酸探針檢測生物流體或組織中該蛋白(用抗體)或多核苷酸(用核酸探針)的存在。含有四種鉤端螺旋體膜蛋白抗原或多核苷酸中任一種的可測量的任意樣品均可使用。本發(fā)明的優(yōu)選樣品為血液、尿液、腦脊液或內(nèi)皮來源的組織。
若細胞成分為核酸,可能需要在與鉤端螺旋體特異性探針結(jié)合前擴增該核酸。優(yōu)選用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR),但也可用其它核酸擴增操作,如連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核酸序列的擴增(NASBA)。
另一項也有較高靈敏度的技術(shù)是將抗體與低分子量半抗原偶聯(lián)。這些半抗原可隨后用第二反應(yīng)特異地檢測。如常用的半抗原有與抗生物素蛋白反應(yīng)的生物素,或可與特異性抗半抗原抗體反應(yīng)的二硝基苯、吡哆醛和熒光素。
或者,可用本發(fā)明四種鉤端螺旋體膜蛋白中任一種檢測樣品中它們各自的相應(yīng)抗體。本發(fā)明四種鉤端螺旋體膜蛋白尤其適用于免疫試驗中,其中它可在液相中或與固相載體相結(jié)合的形式使用。此外,用于這些試驗中的四種鉤端螺旋體膜蛋白中任一種可用多種方法可檢測性標記。
可應(yīng)用本發(fā)明四種鉤端螺旋體膜蛋白中任一種的免疫試驗實例有直接或間接的競爭或非競爭免疫試驗。這類免疫試驗的實例有放射免疫分析(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗、夾心(immunometric)試驗、沉淀素反應(yīng)、凝膠免疫擴散試驗、凝集試驗、熒光免疫分析、蛋白A免疫分析和免疫電泳分析、蛋白印跡分析。對可與本發(fā)明四種鉤端螺旋體膜蛋白中任一種結(jié)合的抗體的檢測可應(yīng)用正向、逆向、或同時發(fā)生模式進行的免疫試驗,包括免疫組化試驗對生理樣品進行。所用鉤端螺旋體膜蛋白的濃度根據(jù)免疫試驗類型和所用可測性標記的特點不同而不同。但,若不考慮所用免疫試驗的類型,所用鉤端螺旋體膜蛋白的濃度可由本領(lǐng)域一般技術(shù)人員用常規(guī)實驗輕易確定。
本發(fā)明四種鉤端螺旋體膜蛋白中任一種可與很多不同載體結(jié)合,用于檢測能與該蛋白特異性反應(yīng)的抗體的存在。
已知載體的實例有玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龍、直鏈淀粉、天然及修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁石。本發(fā)明所用載體可以是可溶性的或不可溶性的。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知曉可與本發(fā)明四種鉤端螺旋體膜蛋白中任一種結(jié)合的其它適合載體,或能用常規(guī)實驗確定它們。
有很多不同的標記物和標記方法為本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知。可用于本發(fā)明的標記物類型的實例有酶、放射性同位素、膠體金屬、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物。
為本發(fā)明的目的,與本發(fā)明的任一種鉤端螺旋體膜蛋白可結(jié)合的抗體均可能存在于各種生物流體和組織中。含可檢測量的針對四種鉤端螺旋體膜蛋白中任一種的抗體的任何樣品均可使用。一般,樣品為液體(如尿液、唾液、腦脊液、血液、血清等),或固體或半固體(如組織、糞便等)。直接針對本發(fā)明四種鉤端螺旋體膜蛋白中任一種的本發(fā)明單克隆抗體也對體內(nèi)抗原檢測十分有用??蓽y性標記單克隆抗體按診斷有效的劑量給予。術(shù)語“診斷有效”指可測性標記的單克隆抗體的給予量足以實現(xiàn)對該單克隆抗體特異性的四種鉤端螺旋體膜蛋白抗原中任一種進行檢測。
所給可測性標記單克隆抗體的濃度應(yīng)足以使與那些帶有四種鉤端螺旋體膜蛋白中任一種的細胞、體液、或組織的結(jié)合相比于本底可以檢測出來。而且,可預(yù)期該可測性標記單克隆抗體將從循環(huán)系統(tǒng)中快速清除,以便產(chǎn)生最佳目標背景(target-to-background)信號比。
體內(nèi)診斷用的可測性標記單克隆抗體按規(guī)律將根據(jù)諸如動物(含人)的年齡、性別、和疾病程度的不同而不同。單克隆抗體的劑量可在約0.001mg/m2至約500mg/m2之間變化,優(yōu)選約0.1mg/m2至約200mg/m2,更優(yōu)選約0.1mg/m2至約10mg/m2。這類劑量可根據(jù)如是否進行多次注射,以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素進行改變。
體內(nèi)成像時,所提供檢測儀器的類型是選擇放射性同位素時要考慮的主要因素。所選放射性同位素應(yīng)具有所用儀器可檢測的衰減類型。另一項在體內(nèi)成像時選擇放射性同位素要考慮的另一重要因素是,放射性同位素的半衰期將應(yīng)足夠長,以便能在靶位點的最大吸收峰時仍可檢測,但也應(yīng)足夠短,以使宿主接受的有害放射為最小。理想情況是,用于體內(nèi)成像的放射性同位素沒有粒子發(fā)射,但產(chǎn)生大量傳統(tǒng)γ照相機易測得的140-250 key range的光子。
體內(nèi)診斷中,放射性同位素可與免疫球蛋白通過中間官能團直接或間接結(jié)合。常用于將金屬離子性的放射性同位素與免疫球蛋白相結(jié)合的中間官能團均為雙功能螯合劑,如二乙三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)及類似分子??膳c本發(fā)明單克隆抗體結(jié)合的金屬離子的典型實例為111In,97Ru,67Ga,68Ga,72As,89Zr,和201Tl。
本發(fā)明單克隆抗體還可用順磁性同位素標記以進行體內(nèi)診斷,如用在磁共振成像(MRI)或電子自旋共振(ESR)中。一般可應(yīng)用任何傳統(tǒng)的顯示診斷成像方法。常用發(fā)射γ和正電子的放射性同位素進行照相機成像,用順磁性同位素進行MRI。這類技術(shù)中特別有用的因子包括157Gd,55Mn,162Dy,52Cr,和56Fe。
本發(fā)明的單克隆抗體可用于監(jiān)控鉤端螺旋體相關(guān)疾病的改善過程。故通過測量各種體液或組織中本發(fā)明四種鉤端螺旋體膜蛋白之任一或其相應(yīng)抗體的增減,有可能確定為改善疾病而采取的特定治療方案是否有效。
本發(fā)明方法中所用材料最好適合于制備試劑盒。這樣一個試劑盒包含嚴密劃分好的載體,可容納一或多個諸如小瓶、小管之類的容器,每個容器可包含所述方法中所用的一個因子。如,其中一個容器可包含針對四種鉤端螺旋體膜蛋白之任一種的結(jié)合試劑(如抗體)。第二個容器可再包含由該抗體識別的四種鉤端螺旋體膜蛋白之任一種。其組成按所需可為液體或凍干形式。
以下實施例旨在舉例說明本發(fā)明,無意限制。盡管它們是應(yīng)用中的典型,但也可換成本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它操作。
以下實施例描述了對活性鉤端螺旋體感染動物期間產(chǎn)生的四種重要鉤端螺旋體膜蛋白(即激酶、通透酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)鞭毛素)的鑒定。描述了這些基因的克隆和測序方法。顯示了序列分析和同源性研究,進一步說明這些蛋白是致病性鉤端螺旋體的膜蛋白,因此有可能是很好的疫苗。實施例1細菌菌株和生長條件問號鉤端螺旋體波摩那血清變型2966和博氏鉤端螺旋體哈德焦牛血清變型Hb197得自養(yǎng)牛場原始分離的凍存物。所有體外培養(yǎng)的鉤端螺旋體于30℃在PLM-5肉湯中培養(yǎng)。大腸桿菌DH5α在含或不含100μg/ml青霉素或50μg/ml卡那霉素的Luria-Bertani培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在構(gòu)建和擴增基因組小文庫時應(yīng)用大腸桿菌LE392。所有大腸桿菌于37℃培養(yǎng)。某些例中(pDFX210,ORF1),用pL熱休克啟動子實現(xiàn)異源克隆化蛋白質(zhì)在大腸桿菌宿主中的表達。在這些條件下,菌株首先于30℃在2x酵母胰蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)至光密度(695nm)達0.5。然后將培養(yǎng)物移至42℃以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達。問號鉤端螺旋體波摩那血清變型和博氏鉤端螺旋體哈德焦牛血清變型Hb197的動物傳代毒性培養(yǎng)物的動物傳代在Syrian倉鼠中進行,用受感染動物的肝臟勻漿物作為隨后傳代的接種物。將10-1稀釋于Stuart’s培養(yǎng)基或補加了0.1%瓊脂糖的PLM-5中的已感染肝臟勻漿物共0.2cc將用于皮下(問號鉤端螺旋體波摩那血清變型)和腹膜內(nèi)(問號鉤端螺旋體哈德焦牛血清變型)接種倉鼠進行傳代。對肝臟勻漿物涂片進行顯微鏡檢查以證實螺旋體的存在。來自受感染倉鼠肝臟的細菌mRNA的提取和純化受鉤端螺旋體感染的倉鼠用CO2施行安樂死,隨后斷頸。經(jīng)尸檢收獲肝臟并用冰冷的PBS洗兩次。將肝臟重新懸浮于10ml PBS(室溫),再加入等量的溶于50mM檸檬酸鈉,0.1%十二烷基硫酸鈉中的4M異硫氰酸胍。將該懸浮液于冰上溫育并間或旋轉(zhuǎn)直至組織明顯分離。迅速加入水飽和酚(pH5.2)促進DNA的清除。將該混合物旋轉(zhuǎn)1分鐘,再于室溫下10,000xg離心30分鐘。含核酸的水相用TRIS緩沖的苯酚(pH8.0)∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提兩次。向這一主要含RNA的水相加入3M乙酸鈉(pH4.5)0.1倍體積和95%乙醇2.5倍體積進行沉淀并于-20℃過夜。核酸將沉淀成團,進行清洗。為進一步去除剩余DNA,在3M乙酸鈉(pH6.0)5ml中抽提沉淀團。重復(fù)抽提直至核酸沉淀透明。RNA的質(zhì)量和數(shù)量通過檢測254nm/280nm和260nm/230nm的光吸收值比率進行分光光度計測定。
用oligo dT纖維素層析柱,采用FastTrack mRNA分離盒(Invitrogen Corporation)按廠家說明書稍作修改,從制備物中獲得真核mRNA。簡單說,將RNA制備物的NaCl濃度用5M NaCl調(diào)至0.5M。再向制備物加入已用試劑盒中的結(jié)合緩沖液1ml預(yù)平衡的oligodT 50mg?;旌衔镉谑覝販赜?0分鐘,期間多次輕輕混合。然后將oligo dT纖維素在2,000Xg離心10分鐘使之沉淀。含細菌mRNA的上清取出后加入乙酸鈉(pH4.5)0.1倍體積、95%乙醇2.5倍體積進行沉淀,并于-20℃過夜。將細菌mRNA以這種狀態(tài)保存直至需要時。
于30℃溫育培養(yǎng)96小時后從增殖的PLM-5菌株分離細菌總RNA。通過刮取從瓊脂上取出細菌細胞,并在冰冷PBS中洗4次。按上述分離RNA,但不進行oligo dT纖維素抽提。cDNA合成以分離自受感染肝臟或PLM-5培養(yǎng)物的細菌mRNA作為模板,用禽成髓細胞瘤病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和RiboClone cDNA合成系統(tǒng)(Promega Corporation,Madison,WI.USA)按廠家說明合成雙鏈DNA。新合成的cDNA用不含DNA酶的RNA酶于37℃處理30分鐘,用苯酚∶氯仿∶異戊醇抽提一次,并沉淀。第二條鏈按廠家說明在第一條鏈合成后迅速合成。
由PLM-5培養(yǎng)細菌衍生的cDNA用BioNick標記系統(tǒng)(BRL生命技術(shù)公司,Gaithersburg,MD.)按廠家說明進行生物素化。
在用于扣除雜交的制備物中,將雙鏈cDNA制備物于95℃溫育5分鐘,再在冰浴中快速冷凍??鄢s交利用扣除雜交技術(shù)分離本發(fā)明的四種鉤端螺旋體基因(Utt,E.A.等,加拿大微生物學(xué)雜志41152-156(1995)))。當有兩種細胞類型,其一表達特定RNA而另一不表達時,則可用此技術(shù)分離所述的特定mRNA。本發(fā)明測定,在活性鉤端螺旋體感染倉鼠模型期間特定鉤端螺旋體基因會打開和表達。當鉤端螺旋體在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時,這四種基因不表達。用鉤端螺旋體感染倉鼠的肝臟(“靶或Vir+細胞)的mRNA作為底物,用于制備相應(yīng)于所有表達基因的一套cDNA分子。為去除對靶細胞無特異性的序列,將cDNA制備物與培養(yǎng)鉤端螺旋體(Vir細胞)的mRNA盡可能雜交。此步驟從cDNA制備物中去除兩種細胞共有的所有序列。去除與其它mRNA雜交的所有cDNA序列后,所剩cDNA均與靶細胞的mRNA雜交,以證實它們代表編碼序列。這些克隆包含特異于Vir+細胞mRNA的序列。
扣除雜交時,將肝臟抽提物(Vir+)的變性的體內(nèi)細菌cDNA共50μg與PLM-5培養(yǎng)物(Vir-)的變性并生物素化的cDNA 250μg在含20mM TRIS,0.6M NaCl,2mM EDTA,和0.2%十二烷基硫酸鈉(終濃度)的雜交緩沖液中雜交。雜交于70℃恒溫進行48小時。1∶4的兩種cDNA比例將有助于確保所有共有轉(zhuǎn)錄種形成cDNA雜交體。
將雜交混合物與鏈親和素包被的順磁珠(Dynal公司)一起溫育將選擇性除去所有雙鏈生物素化cDNA雜交體。將Dynal鏈親和素珠共200μl置于1.5ml eppendorf試管中,用2X Dynal結(jié)合緩沖液(10mM TRIS(pH7.5),1mM EDTA,2.0M NaCl)洗3次。接著將磁珠重新懸浮于2X結(jié)合緩沖液200μl中,并向其中加入等體積的扣除雜交混合物。于室溫在85rpm的搖床上搖15分鐘。溫育后,按Dynal的說明書經(jīng)磁性抽提去除順磁珠結(jié)合的生物素化cDNA雜交體。加入3M乙酸鈉(pH 5.3)0.1倍體積和異丙醇0.8倍體積沉淀所剩上清中的核酸。
上清中保留的cDNA產(chǎn)物可能代表了肝臟中生長和PLM-5中生長的問號鉤端螺旋體之間在基因表達上的差異。這些產(chǎn)物在后文稱為扣除產(chǎn)物??鄢s交產(chǎn)物的擴增雙鏈cDNA扣除產(chǎn)物用Sau3A進行限制性內(nèi)切核酸酶酶解,再與串聯(lián)21體PCR引物接頭連接。對帶有Sau3A位點的接頭AUS 1(5’GATCGGACGGTGAATTCTCGAGAGTG3’)和接頭AUS 2(5’GACACTCTCGAGAATTCACCGTCC3’)均磷酸化,再在與扣除產(chǎn)物連接之前加熱至94℃并冷卻至室溫(25℃)以便退火。AUS 2互補引物在隨后的PCR擴增中使用。PCR反應(yīng)條件是10mM Tris-HCl(pH8.0),50mMKCl,2.5mM MgCl,10mM四種dNTP,1 pmole AUS 2,和Taq DNA聚合酶10個單位(均為終濃度)。反應(yīng)總體積為100μl。使用的是Perkin-Elmer Cetus 9600型熱循環(huán)儀,用以下程序,并有快速溫度變化94℃,60秒;37℃,30秒;55℃,60秒;共35個循環(huán)。差異表達的基因組位點的分離和鑒定用質(zhì)粒pUC18和pGEMT EASY作載體向大腸桿菌DH5α克隆。所有小文庫的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、電穿孔、質(zhì)粒分離、限制性內(nèi)切核酸酶酶解、及其它基因操作,都按標準方法進行(Maniatis等,1982)。
將PCR扣除產(chǎn)物直接克隆進pGEMT-EASY載體(Promega)。在X-Gal氨芐青霉素Luria Bertani平板上篩選陽性克隆,克隆插入物經(jīng)DNA測序分析(Advanced Genetics Analysis Corporation,Minneapolis,MN)。用BLAST算法通過序列數(shù)據(jù)庫檢索鑒定DNA序列。一個克隆pHLE001顯示與多種細菌膜結(jié)合組氨酸激酶基因有同源性。因扣除產(chǎn)物代表部分基因,故此克隆用Genius系統(tǒng)(BoehreingerMannheim Biochemicals,Indianapolis,IN,USA)按廠家說明標記上地高辛(DIG)。然后以扣除產(chǎn)物作為探針,用于問號鉤端螺旋體波摩那血清變型(波摩那鉤端螺旋體)基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR1酶解后的Southern雜交中。pHLE001探針與一個1200bp的片段雜交。制備800bp至2,500bp大小范圍內(nèi)的一個EcoR1基因小庫,并用于回收上述1,200bp片段。將此片段克隆進質(zhì)粒pUC18,命名為pHLE011。此克隆后經(jīng)測定為包含ORF1和ORF2。
用不同蛋白表達載體表達所鑒定的各種ORF,使表達水平足以進行小批量蛋白純化和疫苗保護作用研究。
用Vectorette策略(Genosys,Woodlands,TX.)進行其它克隆過程。用該策略搜索EcoR1 Vectorette基因庫并找到基因的剩余部分。簡單地說,根據(jù)測序已知的部分設(shè)計特異性引物,使之搜索原PCR產(chǎn)物的上游和下游。該策略最終將擴增扣除作用衍生的多個PCR引物所限定的片段。這些克隆子及其推測的特點總結(jié)見表1。
所克隆的1200bp插入物的DNA序列分析用Sanger的雙脫氧鏈終止法在Applied Biosystems的自動DNA測序儀上完成。
用DNASTAR程序進行的pHLE011的DNA序列分析顯示有兩個開放讀框(ORF)。這些命名為ORF1,ORF2和ORF3的閱讀框分別由603bp,1131bp,618bp組成。
表1本研究中所鑒定的扣除雜交克隆子克隆 載體插入物大小 序列pHLE011pUC18 1200bp ORF1/ORF2pMW43 pFLEX10 1100bp ORF1pMW310 pFLEX10 1150bp ORF2pMW48 pFLEX10 680bp ORF3Vectorette文庫的構(gòu)建和篩選按廠家說明應(yīng)用Vectorette PCR(Genesys公司)以嘗試分離各ORF的所剩部分。簡單地說,設(shè)計ORF1 5’端的PCR引物以延伸其上游。設(shè)計ORF2 3’端的PCR引物以延伸其下游。按廠家說明,用PvuII,HindIII,Hpa I,Rsa I,EcoR I,Ssp I,Dra I,或Mfe I限制性酶解問號鉤端螺旋體基因組DNA,再與特異性Vectorette引物結(jié)合位點在末端相連,產(chǎn)生Vectorette文庫。用上述文庫進行Vectorette PCR,產(chǎn)生不同長度的幾種產(chǎn)物。利用特異性產(chǎn)物的DNA序列分析對比序列并使ORF2和截短形式ORF1得以完整化??鄢寺「爬ㄓ诒?。λZAP噬菌體基因組文庫的構(gòu)建和篩選用ZAP表達載體構(gòu)建博氏鉤端螺旋體哈德焦牛血清變型的Bam HI全基因組文庫,作為Stratagene(La Jolla,CA,USA)的商業(yè)文庫包。內(nèi)鞭毛素便由此文庫鑒別而得。
按廠家說明用大腸桿菌XL1-Blue MRF’測定文庫滴度和擴增。出現(xiàn)空斑后,將在IPTG 5μM中預(yù)浸泡的干尼龍濾膜(Nytran)置于平板上,37℃倒置培養(yǎng)過夜。
過夜培養(yǎng)后,將平板置于4℃冷藏1小時。然后揭起濾膜,用PBST洗3次。再將濾膜于PBST/3%脫脂牛奶中室溫溫育1小時進行封閉。封閉過的濾膜在PBST中洗3次,向每張濾膜加入1∶5,000稀釋于PBST中的免疫兔抗血清。將第一抗體與濾膜一起于37℃溫育3小時。然后將濾膜用PBST洗3次,每次5分鐘,再加入1∶5,000稀釋的第二抗體,即堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗兔抗體。濾膜于37℃溫育2小時。與第二抗體溫育后,濾膜先用PBST洗1次,再用PBS洗兩次,每次均5分鐘。將濾膜于BCIP溶液中室溫浸泡1分鐘顯示出陽性空斑。λZAP噬菌體文庫克隆的分離和鑒定共有14個空斑與免疫兔抗血清強烈反應(yīng)。將每一個這樣的陽性噬菌體轉(zhuǎn)換成噬菌粒并轉(zhuǎn)化進大腸桿菌XLOR細胞,以便進行質(zhì)粒分離和擴增。每一個這樣的克隆及其插入物大小概括于表2。
陽性空斑經(jīng)切出并用廠家提供的方法體內(nèi)轉(zhuǎn)換為噬菌粒。
表2本研究中所鑒定的λZAP表達文庫克隆克隆載體 插入物大小ORFpDFX210 pFLEX10 900bp 內(nèi)鞭毛素Northern分析細菌RNA樣品以來自pHLE011的32P標記的3.2kb克隆片段為探針進行Northern雜交分析。進行Northern雜交的所有探針都用Multiprime DNA標記盒(Amersham Internations Pic,Amersham,UK)按廠家說明標記上32P。雜交條件為5X SSC,50%甲酰胺,0.02%SDS,0.1%N-肉桂酰肌氨酸,2%剪切的鮭精DNA,和20mM馬來酸鈉(pH7.5)。雜交于42℃進行16小時。嚴謹洗滌條件為2X SSC,0.1%SDS室溫洗2次,每次5分鐘,和0.5X SSC,0.1%SDS于55℃洗2次,每次洗15分鐘。信號經(jīng)放射自顯影顯示。DNA序列分析用LARK(The Woodlands,Texas,USA)的ABI 200 PRISM系統(tǒng)(染料中止劑)對所選克隆進行雙鏈雙向DNA序列分析。DNA和一級序列分析對三個扣除雜交克隆的DNA序列分析鑒別出三個主要開放讀框(ORF)。原扣除克隆pHLE011包含兩個部分ORF,名為ORF1和ORF2。應(yīng)用這些部分序列,采用Vectorette PCR使ORF1和ORF2完整化,隨后將它們亞克隆進pFLEX10中,分別產(chǎn)生pMW43(圖1)和pMW310(圖2))的序列補充完整。對另一個扣除克隆pHLE004的DNA序列分析鑒別出另一個名為ORF3的主要ORF。該部分序列用于設(shè)計VectorettePCR的引物。這使ORF3序列變得完整(圖3)。
三個ORF的一級序列都用DNASTAR軟件包推斷出來。所推得的三個ORF的一級序列分別鑒別出分子量為41,000Da,43,000Da,25,000Da的推定蛋白。內(nèi)鞭毛素基因的完整ORF經(jīng)證實長為849bp。所推得一級序列是含283個氨基酸,分子量經(jīng)計算為32,000的一種蛋白質(zhì)。序列數(shù)據(jù)庫分析通過生物技術(shù)國家中心(NCBI)BLAST電子郵箱服務(wù)器的序列數(shù)據(jù)庫對這四種鉤端螺旋體序列進行相似性研究。利用BLASTn和BLASTx序列分析推算法,以期鑒別出DNA和一級序列的同源性。推得的基因同源性概括于表3。表3本研究鑒別的克隆化潛在抗原的BLAST數(shù)據(jù)庫同一性克隆 基因 同源性pMW43 ORF1 膜激酶pMW310 ORF2 膜通透酶pMW50 ORF3 甘露糖基轉(zhuǎn)移酶pDFX210內(nèi)鞭毛素 內(nèi)鞭毛素實施例2Syrian倉鼠鉤端螺旋體病攻擊模型用一至四月齡不等的雌性Syrian倉鼠進行細菌傳代和攻擊。波摩那血清變型攻擊模型倉鼠用含活菌(相差顯微鏡測定)的肝臟勻漿物0.2ml經(jīng)皮下進行感染。細菌稀釋率從1∶1000(4×105個細菌/ml)至1∶10(4×107個細菌/ml)不等。
為進行哈德焦牛血清變型攻擊,用含活菌(相差顯微鏡測定)的肝臟勻漿物0.5ml經(jīng)腹膜內(nèi)途徑感染倉鼠。細菌稀釋率從1∶1000(4×105個細菌/ml)至1∶10(4×107個細菌/ml)不等。
含活性鉤端螺旋體的倉鼠肝臟組織尸檢后經(jīng)手術(shù)切出,操作如下將約1克組織置于玻璃dounce勻漿器內(nèi)。然后向組織中加入補加有0.1%瓊脂糖的PLM-5共9ml。再將組織勻漿成一致的稠度。這代表10-1稀釋的細菌。所有后續(xù)稀釋都用PLM-5稀釋劑完成。重組蛋白表達根據(jù)所用表達載體的不同,用PL啟動子質(zhì)粒表達蛋白時以熱休克進行誘導(dǎo),用lacZ啟動子質(zhì)粒表達蛋白時以IPTG誘導(dǎo)。所有蛋白質(zhì)的表達均在培養(yǎng)于2X酵母胰蛋白胨肉湯(2X YT肉湯)的大腸桿菌DH5α(lacZ)或大腸桿菌LE392(PL)中進行。
簡單地說,用lacZ表達的培養(yǎng)物于37℃培養(yǎng)直至光密度(695nm)達0.4至0.5。通過加入IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷)1mM誘導(dǎo)重組蛋白。根據(jù)所希望的蛋白產(chǎn)量,使溫育繼續(xù)進行2至12小時。
使用PL啟動子系統(tǒng)的構(gòu)建體于30℃培養(yǎng)直至光密度(695nm)達0.4至0.5。通過將培養(yǎng)溫度變成42℃并繼續(xù)培養(yǎng)2至4小時而進行重組蛋白的誘導(dǎo)。于4℃在8,000xG離心15分鐘實現(xiàn)細菌細胞的收獲。兩次通過壓強為20,000psi的French壓力倉而裂解細胞。細菌碎片在20,000xG離心去除,上清貯于-20℃?zhèn)溆谩?br> 蛋白抽提物按標準方法經(jīng)SDS-PAGE進行分析(ref)。實驗性疫苗抗原在倉鼠鉤端螺旋體病模型中的保護效應(yīng)數(shù)據(jù)來自攜帶pHLE011的重組克隆的蛋白抽提物在波摩那血清變型感染模型中保護了6只倉鼠中的4只(67%)免受致死性感染。pMW43(只包含pHLE011的ORF1)的純化重組蛋白在波摩那血清變型感染模型中保護了6只倉鼠中的2只(33%)免受致死性感染。pDFX210的純化重組蛋白對波摩那血清變型感染未提供任何保護作用。這些抗原中每一個在哈德焦牛血清變型感染模型中的保護潛能正在研究中。表4概括了所有受試抗原的疫苗攻擊結(jié)果。
為進行實驗性免疫接種,動物均間隔兩周兩次接種實驗性抗原約5μg兩次。末次接種兩周后,這些動物用每種血清變型按上文概述的過程進行攻擊。
表4所選抗原在Syrian倉鼠鉤端螺旋體病攻擊模型中對致死性鉤端螺旋體攻擊的保護潛能抗原克隆 來源 波摩那保護性哈德焦牛保護性pHLE011 扣除文庫 67% -pMW43ORF1(pHLE011) 33% -pDFX210 噬菌體文庫0% 100%
序列表<110>Pfizer產(chǎn)品公司<120>用于預(yù)防鉤端螺旋體病的鉤端螺旋體疫苗抗原<130>PC10463<140><141><160>8<170>PatentIn 2.0版本<210>1<211>201<212>PRT<213>氨基酸<400>1Met Arg Ser Val Gln Glu Lys Asn Glu Leu Ile Gln Glu Ile His His1 5 10 15Arg Val Arg Asn Asn Leu Gln Val Ile Ser Gly Leu Val Glu Met His20 25 30Ser Gly Ser Gly Lys Glu Asn Leu Gln Ile Ile Leu Ser Asp Phe Gln35 40 45Asn Arg Ile Leu Ala Ile Ser Glu Val His Asn Tyr Leu Tyr Lys Ser50 55 60Glu Asn Tyr Phe Glu Ile Asp Phe Val Glu Val Met Asp Lys Ile Ile65 70 75 80Leu Asn Leu Ser Tyr Arg Leu Gly Lys Arg Ser Ile Lys Ile Glu Thr85 90 95Glu Ala Glu Ser Thr Phe Leu Arg Ile Glu Asn Ala Ile Pro Cys Ala100 105 110Met Ile Phe Asn Glu Leu Leu Ser Asn Ser Leu Lys His Ala Phe Arg115 120 125Ser Glu Lys Gly Thr Val Gln Ile Ser Phe Arg Lys Lys Gly Asp Lys130 135 140Tyr Tyr Leu Gln Val Ser Asp Asn Gly Ser Gly Ile Lys Asp Phe Lys145 150 155 160Ile Trp Ser Lys Pro Lys Thr Ala Gly Phe Thr Leu Ile Gln Ile Leu165 170 175Thr Lys Gln Ile Lys Gly Arg Phe Gln Ile Phe Ser Glu Gly Gly Phe180 185 190Thr Ala Val Leu Glu Phe Asn Ser Ile195 200<210>2<211>377<212>PRT<213>氨基酸<400>2Met Lys Phe Ser Gly Leu Thr Asn His Ile Tyr Lys Asp Arg Asp Tyr1 5 10 15Leu Thr Arg Asn Arg Ala Phe His Leu Phe Ile Phe Asn Val Val Ser20 25 30Leu Leu Leu Gly Leu Ser Val Asn Phe Tyr Val Trp Phe Val Lys Gly35 40 45Asp Leu Leu Arg Pro Gly Phe Leu Ile Ile Met Leu Ala Ser Ala Val50 55 60Ser Leu Phe Phe Leu Leu Arg Lys Lys Phe Glu Leu Ala Leu Arg Ile65 70 75 80Ile Leu Ile Ala Ser Val Ile Ala Val Ser Val Gly Trp Phe Phe Gly85 90 95Leu Ser Gln Gly Asn Ser Pro Leu Asp Glu Gly Asn Lys Asn Ile Val100 105 110Leu Ala Ile Phe Ile Met Ile Phe Leu Tyr Phe Ala Asn Val Lys Arg115 120 125Thr Leu Leu Ile Ala Val Tyr Cys Phe Val Leu Ile Phe Met Glu Glu130 135 140Leu Leu Met Gln Gln Ile His Glu Ser Ile His Met Ala Asp Arg Ile145 150 155 160Ala Leu Phe Phe Met Phe Ser Val Ile Ser Ile Ile Ala Val Arg Thr165 170 175Leu His Gly Ser Ile Glu Glu Lys Asn Glu Leu Ile Gln Glu Ile His180 185 190His Arg Val Arg Asn Asn Leu Gln Val Leu Ser Gly Leu Val Glu Met195 200 205His Ser Asp Ser Asp Gln Gly Asn Leu Arg Asn Ile Leu Ser Asp Phe210 215 220Gln Asn Arg Ile Leu Ala Ile Ser Glu Val His Asn Tyr Leu Tyr Lys225 230 235 240Ser Glu Asn Tyr Phe Asp Ile Asp Phe Ser Glu Val Ile Glu Arg Ile245 250 255Ile Ala Asn Leu Ile His Lys Phe Gly Lys Gln Ser Val Lys Ile Glu260 265 270Asn Leu Thr Glu Gln Ile Phe Leu Arg Ile Glu Tyr Ala Ile Pro Cys275 280 285Ala Met Ile Phe Ser Glu Leu Leu Ser Asn Ser Leu Lys His Ala Phe290 295 300Ser Ser Asp Met Gly Lys Ile Val Ile Arg Phe His Lys Glu Gly Asn305 310 315 320Lys Tyr Arg Leu Gln Ile Glu Asp Asn Gly Ser Gly Ile Ser Asp Ser325 330 335Lys Thr Trp Leu Lys Pro Lys Thr Ser Gly Phe Lys Leu Ile Gln Leu340 345 350Leu Thr Arg Gln Ile Lys Gly Asp Phe Gln Ile Leu Ser Asp Ser Gly355 360 365Ser Ile Ala Val Leu Glu Phe Tyr Thr370 375<210>3<211>205<212>PRT<213>氨基酸<400>3Met Phe Asn Phe Ser Gln Tyr Leu Thr Asn Gly Phe Glu Arg Phe Pro1 5 10 15Lys Ile Glu Lys Ser Lys Ser Lys Ile Lys Lys Ile Ile Phe Val Gly20 25 30Arg Ile Thr Pro Asn Lys lys Gln Asp Asp Leu Ile Arg Leu Ala Phe35 40 45Ala Tyr Lys Ser Ile Ile Ser Asp Gln Phe Gln Phe Tyr Leu Ala Gly50 55 60Phe Ser Ser Lys Glu Leu Tyr Leu Tyr Arg Glu Glu Leu Glu Arg Met65 70 75 80Leu Asp Phe Tyr Asp Leu Arg Lys Asn Val Leu Ile Thr Gly Phe Leu85 90 95Ser Asp Leu Glu Leu Asn Ser Leu Tyr Gln Glu Ala Asp Ala Phe Val100 105 110Ser Met Ser Glu His Glu Gly Phe Cys Val Pro Leu Ile Glu Ala Met115 120 125Ile Tyr Arg Ile Pro Ile Leu Ala Phe Ser Gly Gly Ala Val Ser Glu130 135 140Thr Leu Asn Gly Ala Gly Val Leu Phe Lys Glu Lys Asn Phe Pro Asn145 150 155 160Leu Ala Ile Leu Leu Asn Lys Ile Leu Thr Asp Val Ser Phe Gln Asn165 170 175Gln Ile Leu Thr Gly Gln Asp Leu Arg Leu Asn Glu Phe Lys Lys Thr180 185 190Asp Tyr Lys Ser Val Leu Arg Lys Ala Leu Glu Ile Ile195 200 205<210>4<211>283<212>PRT<213>氨基酸<400>4Met Ile Ile Asn His Asn Leu Ser Ala Val Asn Ser His Arg Ser Leu1 5 10 15Lys Phe Asn Glu Leu Ala Val Asp Lys Thr Met Lys Ala Leu Ser Ser20 25 30Gly Met Arg Ile Asn Ser Val Ala Asp Asp Ala Phe Gly Leu Ala Val35 40 45Ser Glu Lys Leu Arg Thr Gln Ile Asn Gly Leu Arg Gln Ala Glu Arg50 55 60Asn Thr Glu Asp Gly Met Ser Phe Ile Gln Thr Ala Glu Gly Phe Leu65 70 75 80Glu Gln Thr Ser Asn Ile Ile Gln Arg Ile Arg Val Leu Ala Ser Arg85 90 95Pro Arg Met Val Ser Gln Gln Arg Lys Ile Ala Ser Leu Gly Arg Trp100 105 110Glu Val Leu Cys Ala Gly Gly Pro Lys Ser His Arg Ile Ala Ser Gln115 120 125Ala Glu Phe Ile Ser Ser Ser Phe Leu Gly Ala Ile Arg Lys Arg Phe130 135 140Thr Gly Arg Val His Val Val Ser Tyr Gly Ala Glu Arg Lys Ser Ala145 150 155 160Arg Glu Ile Leu Gln Arg Pro Glu Cys Phe Glu Ser Pro Glu Ala Cys165 170 175Lys Ala Asp Gly Arg Pro Ile Ala Ile Ser Ser Pro Glu Glu Ala Asn180 185 190Asp Val Ile Gly Leu Ala Asp Ala Ala Leu Thr Arg Ile Met Lys Gln195 200 205Arg Ala Asp Met Gly Ala Tyr Tyr Asn Arg Leu Glu Tyr Thr Ala Lys210 215 220Gly Val Met Gly Ala Tyr Glu Asn Met Gln Ala Ser Glu Ser Arg Ile225 230 235 240Arg Asp Ala Asp Met Ala Glu Glu Val Val Ser Leu Thr Thr Lys Gln245 250 255Ile Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala Met Leu Ala Gln Ala Asn Met Lys260 265 270Pro Asn Ser Val Leu Lys Leu Leu Gln His Ile275 280<210>5<211>603<212>DNA<213>核苷酸<400>5ATGCGATCCG TTCAAGAAAA GAACGAATTG ATACAAGAAA TTCATCATAG AGTTAGAAAT 60AATCTTCAGG TAATTTCCGG TTTAGTGGAA ATGCATAGTG GGTCTGGTAA AGAGAATCTG 120CAAATCATAT TATCCGATTT TCAAAATCGT ATATTAGCAA TATCTGAAGT TCATAATTAT 180TTATATAAGT CCGAAAATTA TTTCGAAATC GATTTTGTCG AGGTGATGGA TAAGATTATT 240CTAAATCTTT CTTATAGATT GGGAAAACGT TCGATCAAGA TAGAAACTGA AGCTGAGTCT 300ACTTTTTTAA GAATCGAAAA TGCGATTCCT TGTGCTATGA TTTTCAACGA ATTGTTATCC 360AATTCTTTAA AACACGCTTT TCGTTCGGAA AAAGGAACCG TTCAAATTTC GTTTCGAAAA 420AAAGGAGATA AATATTACCT TCAAGTTTCT GACAATGGTT CAGGAATCAA GGATTTTAAA 480ATTTGGTCCA AACCGAAAAC GGCTGGTTTC ACTTTGATAC AAATATTAAC AAAACAGATT 540AAAGGTCGTT TTCAAATTTT CTCTGAAGGC GGTTTTACTG CGGTTTTAGA GTTCAACTCA 600ATC 603<210>6<211>1131<212>DNA<213>核苷酸<400>6ATGAAATTTT CAGGATTAAC CAATCATATT TATAAAGACA GGGATTATCT TACTCGAAAT 60AGGGCGTTCC ATCTTTTCAT TTTTAATGTG GTGTCGCTTT TATTGGGTTT ATCTGTGAAT 120TTTTATGTTT GGTTTGTGAA AGGTGATCTA TTACGTCCTG GTTTTTTAAT CATCATGCTT 180GCATCTGCAG TCTCTCTGTT TTTTTTATTG AGAAAAAAAT TTGAATTGGC TCTCAGAATT 240ATTTTGATCG CAAGTGTAAT TGCTGTTAGC GTTGGTTGGT TTTTTGGACT TTCTCAGGGA 300AATTCTCCTT TGGACGAAGG GAATAAAAAT ATTGTTTTAG CTATATTTAT TATGATTTTC 360TTATATTTTG CAAATGTAAA GCGAACTCTT CTAATTGCGG TTTACTGTTT TGTTTTGATT 420TTTATGGAAG AGCTTTTAAT GCAACAAATT CATGAATCTA TTCACATGGC TGATCGAATC 480GCTCTATTTT TCATGTTTTC TGTAATTTCG ATTATCGCCG TAAGAACTCT TCATGGATCG 540ATTGAAGAAA AGAACGAATT GATACAAGAA ATTCATCATA GAGTTAGAAA TAATCTTCAG 600GTTCTTTCCG GTTTAGTAGA AATGCATAGT GATTCTGATC AAGGGAATCT TAGGAATATA 660TTATCTGATT TTCAAAATCG TATATTAGCA ATATCTGAAG TTCATAATTA TTTATATAAG 720TCCGAAAATT ATTTCGACAT AGATTTTTCA GAAGTGATTG AAAGAATCAT TGCAAATCTC 780ATTCATAAAT TTGGTAAACA ATCTGTAAAA ATAGAAAATT TAACGGAACA GATTTTTTTA 840AGAATCGAAT ATGCGATTCC TTGTGCTATG ATTTTTAGTG AACTTTTATC TAATTCTTTA 900AAACATGCGT TTTCTTCGGA TATGGGGAAA ATTGTCATTC 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TCATCTCT618<210>8<211>849<212>DNA<213>核苷酸<400>8ATGATTATCA ATCACAACCT GAGCGCGGTG AATTCTCACC GTTCTCTAAA GTTCAACGAG 60CTTGCTGTGG ACAAGACGAT GAAGGCTTTG TCTTCCGGTA TGCGGATCAA TTCCGTGGCG 120GACGACGCTT TCGGACTCGC GGTTTCTGAA AAGCTAAGAA CGCAGATCAA CGGTCTGCGT 180CAGGCCGAAA GAAACACCGA AGACGGGATG AGCTTCATTC AAACTGCCGA GGGTTTCCTC 240GAACAGACGT CGAACATCAT TCAGAGAATC CGGGTGCTTG CATCCAGACC TCGAATGGTT 300TCTCAGCAAC GAAAGATTGC ATCTTTGGGC AGGTGGGAAG TATTGTGCGC TGGTGGACCA 360AAGTCCCACC GAATCGCTTC TCAAGCTGAA TTTATAAGTT CAAGCTTTTT AGGGGCAATT 420CGCAAAAGGT TCACGGGTCG GGTCCATGTG GTTTCATATG GGGCCGAACG AAAATCAGCG 480AGAGAGATTT TACAGCGGCC CGAATGCTTC GAAAGCCCTG AAGCTTGTAA AGCGGACGGG 540AGACCGATCG CGATTTCTTC TCCGGAAGAA GCCAACGATG TTATCGGTTT AGCGGATGCG 600GCTCTTACGA GGATCATGAA GCAGAGAGCG GATATGGGGG CTTATTACAA TAGGCTCGAG 660TATACCGCAA AAGGGGTGAT GGGTGCATAT GAAAATATGC AAGCATCGGA ATCCAGAATT 720CGGGACGCCG ATATGGCGGA GGAAGTTGTC TCGCTGACCA CAAAACAAAT ACTCGTTCAG 780AGTGGTACGG CAATGTTAGC GCAGGCAAAT ATGAAACCGA ATTCGGTTCT CAAGCTTCTG 840CAGCATATC 849
權(quán)利要求
1.一種分離的鉤端螺旋體膜激酶蛋白,其中包含SEQ ID NO1的氨基酸序列或其片段或其保守性變異體。
2.一種分離的鉤端螺旋體膜通透酶蛋白,其中包含SEQ IDNO2的氨基酸序列或其片段或其保守性變異體。
3.一種分離的鉤端螺旋體膜甘露糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白,其中包含SEQ ID NO3的氨基酸序列或其片段或其保守性變異體。
4.一種分離的鉤端螺旋體膜內(nèi)鞭毛素蛋白,其中包含SEQ IDNO4的氨基酸序列或其片段或其保守性變異體。
5.一種鉤端螺旋體膜激酶多核苷酸序列,其中包含SEQ IDNO5的序列或其片段或其保守性變異體。
6.一種鉤端螺旋體膜通透酶多核苷酸序列,其中包含SEQ IDNO6的序列或其片段或其保守性變異體。
7.一種鉤端螺旋體膜甘露糖基轉(zhuǎn)移酶多核苷酸序列,其中包含SEQ ID NO7的序列或其片段或其保守性變異體。
8.一種鉤端螺旋體膜內(nèi)鞭毛素多核苷酸序列,其中包含SEQ IDNO8的序列或其片段或其保守性變異體。
9.一種多核苷酸序列,其包含選自基本上由下述組成之組的多核苷酸序列的開放讀框SEQ ID NO5,SEQ ID NO6,SEQ ID NO7和SEQ ID NO8或它們的片段或它們的保守性變異體。
10.至少12個核苷酸長的一對單鏈DNA引物,其可用于檢測任意致病性鉤端螺旋體菌株中編碼鉤端螺旋體膜蛋白的多核苷酸序列,這對引物選自由SEQ ID NO5的1-301位核苷酸和302-603位核苷酸組成的組,其中這些引物在聚合酶鏈式反應(yīng)中的應(yīng)用導(dǎo)致合成包含來自任意鉤端螺旋體致病株之鉤端螺旋體膜蛋白編碼基因的全部或至少12個連續(xù)核苷酸的DNA。
11.至少12個核苷酸長的一對單鏈DNA引物,其可用于檢測任意致病性鉤端螺旋體菌株中編碼鉤端螺旋體膜蛋白的多核苷酸序列,這對引物選自SEQ ID NO6的1-566位核苷酸和567-1131位核苷酸,其中這些引物在聚合酶鏈式反應(yīng)中的應(yīng)用導(dǎo)致合成包含來自任意鉤端螺旋體致病株之鉤端螺旋體膜蛋白編碼基因的全部或至少12個連續(xù)核苷酸的DNA。
12.至少12個核苷酸長的一對單鏈DNA引物,其可用于檢測任意致病性鉤端螺旋體菌株中編碼鉤端螺旋體膜蛋白的多核苷酸序列,這對引物選自SEQ ID NO7的1-309位核苷酸和310-618位核苷酸,其中這些引物在聚合酶鏈式反應(yīng)中的應(yīng)用導(dǎo)致合成包含來自任意鉤端螺旋體致病株之鉤端螺旋體膜蛋白編碼基因的全部或至少12個連續(xù)核苷酸的DNA。
13.至少12個核苷酸長的一對單鏈DNA引物,其可用于檢測任意致病性鉤端螺旋體菌株中編碼鉤端螺旋體膜蛋白的多核苷酸序列,這對引物選自SEQ ID NO8的1-424位核苷酸和425-849位核苷酸,其中這些引物在聚合酶鏈式反應(yīng)中的應(yīng)用導(dǎo)致合成包含來自任意鉤端螺旋體致病株之鉤端螺旋體膜蛋白編碼基因的全部或至少12個連續(xù)核苷酸的DNA。
14.一種檢測鉤端螺旋體病原體的方法,包括以下步驟(a)從感染了該病原體的動物,或從病原體本身分離DNA;(b)用至少一個下述引物經(jīng)聚合酶鏈式反應(yīng)擴增該DNA,其中所述引物具有的序列與選自基本上由下述組成之組的序列中至少12個連續(xù)核苷酸相同SEQ ID NO5的核苷酸、SEQ ID NO6的核苷酸、SEQ ID NO7的核苷酸和SEQ ID NO8的核苷酸;和(c)通過顯示聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的產(chǎn)物而檢測鉤端螺旋體病原體。
15.一種分離編碼鉤端螺旋體病原體之膜蛋白的多核苷酸序列的方法,包括以下步驟(a)從感染了該病原體的動物,或從病原體本身分離DNA;(b)用至少一個下述引物經(jīng)聚合酶鏈式反應(yīng)擴增該DNA,其中所述引物具有的序列與選自基本由下述組成之組的序列中至少12個連續(xù)核苷酸相同SEQ ID NO5的核苷酸、SEQ ID NO6的核苷酸、SEQID NO7的核苷酸和SEQ ID NO8的核苷酸;和(c)分離聚合酶鏈式反應(yīng)擴增的產(chǎn)物。
16.一種可用于在動物中誘導(dǎo)對致病性鉤端螺旋體的免疫應(yīng)答的藥物組合物,其中在藥學(xué)可接受的載體中含有免疫原性有效量的,選自基本上由激酶、通透酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)鞭毛素組成之組的鉤端螺旋體膜蛋白。
17.一種對疑有鉤端螺旋體病的動物其鉤端螺旋體病臨床診斷的確證方法,包括進行一項試驗以測定動物體液或組織中是否有選自激酶、通透酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)鞭毛素的一種鉤端螺旋體膜蛋白或其片段,其中該試驗包括使得自該動物的體液或組織樣品與可特異性結(jié)合鉤端螺旋體膜蛋白或其片段的抗體,或可特異性結(jié)合鉤端螺旋體膜蛋白的Fab片段相接觸,其中鉤端螺旋體膜蛋白或其片段的存在情況證實了對鉤端螺旋體病的臨床診斷。
18.權(quán)利要求17的方法,其中該試驗包括一項選自下組的試驗放射免疫分析、酶聯(lián)免疫吸附試驗、夾心試驗、沉淀素試驗、凝膠免疫擴散試驗、凝集試驗、熒光免疫分析、蛋白A免疫試驗、免疫電泳試驗和Western印跡試驗。
全文摘要
提供四種抗原性制備物,每種均包含一種不同的鉤端螺旋體蛋白,所述蛋白可免疫學(xué)性用于鉤端螺旋體所致鉤端螺旋體病的疫苗中。本發(fā)明還提供編碼這四種蛋白質(zhì)的多核苷酸以及可與這四種蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體以及用于診斷鉤端螺旋體病。
文檔編號A61P31/04GK1257872SQ9912650
公開日2000年6月28日 申請日期1999年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月22日
發(fā)明者D·A·迪爾威斯特, E·A·尤特, M·S·威利 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司
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