專利名稱：用于治療哺乳類動(dòng)物癌癥的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于治療癌癥的藥物領(lǐng)域，特別涉及針對(duì)蛋白激酶Cα(PKCα)的癌癥治療的化療藥品。
研究人員發(fā)現(xiàn)一種名為蛋白激酶C的酶系家族與多種癌癥相關(guān)。這個(gè)酶系家族包括至少11種同功酶。該家族中的特別一員被命名為蛋白激酶C阿爾法、縮寫為PKCα。
研究者們報(bào)告在人乳腺腫瘤中PKCα活性有所增高(NG et．a(chǎn)l，Science，2832085-2089)，在前列腺癌中PKCα的表達(dá)顯著增加(Comford et．a(chǎn)l，Am．J．Pathol．154137-144)。研究者還報(bào)告人類黑色素細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移需有PKCα(Demis et．a(chǎn)l，Cancer Lett．12865-70)；腦瘤的進(jìn)行性增生也與PKCα有關(guān)(Shen et．a(chǎn)l．，Mol．Pharmacol．55396-402)。許多癌癥研究者具有的普遍性共識(shí)是--一些最危險(xiǎn)的癌癥可以用針對(duì)PKCα的化療藥物或特別設(shè)計(jì)寡核苷酸片段來進(jìn)行治療。
最近，Muller等人被授于一項(xiàng)專利，美國專利號(hào)No．5．744，460。其中公開了一項(xiàng)針對(duì)PKCα的癌癥治療方案。這項(xiàng)方案中利用了反義寡核酸技術(shù)，并結(jié)合了化療藥物。在授與Benett等人的美國專利(No．5，882，927，No．5，885，970)中，也公開。了他們使用的是以PKCα為目標(biāo)的反義寡核苷酸鏈。幾項(xiàng)利用PKCα抑制劑治療癌癥的專利發(fā)明被頒發(fā)給Heath等人，這些專利中包括美國專利NO．5，843，935。美國專利NO．5，723，456是把針對(duì)PKC的酶作為治療癌癥方法的另一個(gè)癌癥治療的例子，Schwart等人所獲的美國專利NO．5，281，072中建議用化療藥物以力圖降低PKC活性。上述所列各項(xiàng)專利中的公開文本是從參考文獻(xiàn)中獲得后收編于此處的。
化合物G6976，是一種已知的PKCα抑制劑，由Calbiochem公司和Alexis公司生產(chǎn)(這兩家公司均在加州圣地哥市設(shè)有辦公機(jī)構(gòu))。G6976可寫作C24H18N4O，其分子式見圖l，該專利申請(qǐng)人在Molecular Cellular Biology，173418-3428中報(bào)告，根據(jù)不同種實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，G6976可以防止由TPA誘導(dǎo)PKCα的降解，它是一個(gè)更特殊的PKCα抑制劑。
本發(fā)明的目的是提出將G6976或其衍生物應(yīng)用于癌癥治療方案中，它可以防止癌細(xì)胞生成。殺死癌細(xì)胞或減低癌細(xì)胞的生長率?？蓮V泛用于多種癌癥治療中，用G6976或其衍生物單獨(dú)進(jìn)行，也可以與先有技術(shù)化療藥物或放射療法結(jié)合使用還可對(duì)某些癌癥的高危人群作為預(yù)防性藥物使用。使癌癥治療達(dá)到更好的效果。
本發(fā)明提出一種用于治療哺乳類動(dòng)物癌癥的化合物，其特征在于，所說的化合物為G6976或者其衍生物。
本發(fā)明所說的哺乳動(dòng)物是人。
所說的癌癥可包括乳癌、白血病、肺癌、骨癌、皮膚癌、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌以及其它癌癥。
所說的的化合物可根據(jù)不同的癌癥采用相應(yīng)的常規(guī)治療方法，例如可是直接注射入腫瘤組織的，或直接注射入哺乳動(dòng)物血流的或是口服的，或是針對(duì)PKCα的，是與先有技術(shù)化療藥物組合給藥的，或是針對(duì)PKCα的，是與放射治療配合進(jìn)行的。
所說的化合物還可是用于癌癥高危人群的一種預(yù)防癌癥的藥物。
本發(fā)明為癌癥治療提供了一種化療方案的藥物。在這個(gè)治療方案中G6976或者其衍生物用于哺乳動(dòng)物的癌癥治療。G6976或其衍生物針對(duì)PKCα活性。實(shí)驗(yàn)資料顯示G6976對(duì)于治療乳癌，白血病。肺癌，骨癌及皮膚癌均有效。這些治療可以用G6976或其衍生物單獨(dú)進(jìn)行，也可以與化療藥物或放射療法結(jié)合使用，在一個(gè)優(yōu)選的具體化的實(shí)驗(yàn)中G6976作為一個(gè)預(yù)防性藥物用于癌癥治療，它可以防止癌細(xì)胞生成。
附圖簡要說明

圖1為G6976的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
圖2為用本發(fā)明G6976治療人類乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-468)的結(jié)果。
圖3為用本發(fā)明G6976治療人類乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-453)的結(jié)果。
圖4為用本發(fā)明G6976處理HL60急性早幼粒白血病細(xì)胞的結(jié)果。
圖5為用本發(fā)明G6976處理肺癌細(xì)胞治療的結(jié)果。
圖6為用本發(fā)明G6976處理骨肉瘤細(xì)胞治療的結(jié)果。
圖7為用本發(fā)明G6976處理A431人類類表皮樣癌細(xì)胞的處理結(jié)果。
圖8為用本發(fā)明G6976阻止EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞癌變的結(jié)果。
下面詳述優(yōu)選的具體化實(shí)驗(yàn)本發(fā)明可結(jié)合各圖來進(jìn)行描述。幾種不同的癌細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行生長，然后用G6976進(jìn)行試驗(yàn)并記錄結(jié)果。具體實(shí)驗(yàn)及結(jié)果如下所述。
細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)使用了下述癌細(xì)胞，它們是由美國位于Rockville，MD的類型培養(yǎng)庫(American Type Culture Collection)提供的MDA-MB-468人類乳癌細(xì)胞。
MDA-MB-453人類乳癌細(xì)胞。
A431人類類表皮樣癌細(xì)胞。
U-2 OS人類骨肉瘤細(xì)胞。
3Y1大鼠纖維母細(xì)胞過分表達(dá)表皮生長因子受體(EGFR)這些細(xì)胞均培養(yǎng)于Dulbecco的改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)液(DMEM)中，培養(yǎng)液中添加有10％的小牛血清。
小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(NCI-H1048)非小細(xì)胞型肺細(xì)胞(NCI-H2342)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞在含2mmL-谷氨酰胺的培養(yǎng)基RPMIl640中生長，培養(yǎng)基中還含有1．58／L的碳酸氫鈉，4．5g/L的葡萄糖，10mMHEPES，1．0mM的丙酮鹽鈉和5％的胎牛血清。非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞于RPMIl640培養(yǎng)基中生長培養(yǎng)基中添加有5％胎牛血清，5ug／ml胰島素，10ug／ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，30nM硒化鈉，10nM氫化可的松，10nMβ雌二醇，10mMHEPES以及2mML-谷氨酰胺。
HL60人類急性早幼粒白血病細(xì)胞生長于PRMI1640培養(yǎng)基中，其只含10％熱滅活的胎牛血清(FBS)。
為在軟瓊脂中生長這些細(xì)胞，把1×103數(shù)量的細(xì)胞懸于上層瓊脂中(含20％牛血清，0．38％瓊脂，余下為DMEM)，然后鋪于已經(jīng)硬化的底層瓊脂上--如Qureshi等在Biochem．Biophys．Res．Commun．192969-975中所報(bào)告的。
實(shí)驗(yàn)物品G6976自Calbiochem公司獲得。
細(xì)胞存活率試驗(yàn)細(xì)胞接種后過24小時(shí)，然后對(duì)它們或者用G6976進(jìn)行處理，或者不予處理。此后定期收集細(xì)胞并用臺(tái)盤離排除方法試驗(yàn)其生存率評(píng)估。方法見CY Chen等人在J．Bioc．Chem．27316700-16709的描述。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果乳癌用G6976治療人類乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-468和MDA-MB-453)的結(jié)果見圖2和圖3，培養(yǎng)基中含有大約5×105數(shù)量的細(xì)胞，用0．0，0．5，1．0及2．0微摩爾的G6976進(jìn)行處理于4天后進(jìn)行存活細(xì)胞計(jì)數(shù)。如圖2所示，在用1微摩爾G6976處理時(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù)減至約1×105，而用2．0微摩爾G6976處理時(shí)則減至約0．3×105以下。在另一個(gè)如圖3所示的實(shí)驗(yàn)中，乳腺癌細(xì)胞用2．0微摩爾G6976處理，以24小時(shí)為間隔進(jìn)行測量。存活細(xì)胞的濃度每經(jīng)過24小時(shí)就下降一半。圖2和圖3的誤差條為根據(jù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)估計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)誤。
白血病用G6976處理HL60急性早幼粒白血病細(xì)胞的結(jié)果見圖4。兩個(gè)5×105細(xì)胞樣本中的一份用2．0微摩爾G6976處理，存活細(xì)胞于4日后計(jì)數(shù)。在第4天時(shí)未處理樣本中的細(xì)胞增長近乎10倍達(dá)到5×106而存活細(xì)胞在經(jīng)治療的樣本減少至0．2×105以下。
肺癌用G6976處理肺癌細(xì)胞治療的結(jié)果如圖5所示，小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞各制備2份樣本每份5×105左右細(xì)胞。兩類細(xì)胞各取一份樣本用G6976處理，于第4天計(jì)數(shù)存活細(xì)胞。在未處理的樣本癌細(xì)胞幾乎增長了10倍，而在經(jīng)過處理的樣本計(jì)數(shù)幾乎減少至原來的數(shù)量的0．5倍以下。
骨癌骨肉瘤細(xì)胞治療的結(jié)果如圖6所示。約5×105細(xì)胞樣本兩份中的一份用2微摩爾G6976進(jìn)行處理，存活細(xì)胞于第4天進(jìn)行計(jì)數(shù)。在第4日未經(jīng)處理的樣本中細(xì)胞數(shù)增長了近8倍，達(dá)到4×106數(shù)量，而存活細(xì)胞在經(jīng)處理的樣本減少至約原來的計(jì)數(shù)的一半。
皮膚癌A431人類類表皮樣癌細(xì)胞的處理結(jié)果見圖7。兩份約5×105細(xì)胞樣本中的一份用2微摩爾G6976進(jìn)行處理，每24小時(shí)計(jì)數(shù)存活細(xì)胞一次，連續(xù)4天。在第4天在未經(jīng)處理的樣本中細(xì)胞數(shù)增長了大約24倍，幾乎達(dá)到1．2×107，而在經(jīng)處理的樣本中存活細(xì)胞大約增長了一倍。
EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞癌變圖8顯示G6976阻礙由表皮生長因子(EGF)造成的細(xì)胞癌變的效果。過度表達(dá)EGF受體的3Y1細(xì)胞，在用100納摩爾EGF處理24小時(shí)后，就顯示出變異的形態(tài)學(xué)特征。用250納摩爾G6976和EGF共同處理可以完全阻止EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞癌變，而單用G6976處理沒有出現(xiàn)對(duì)于3Y1 EGFR細(xì)胞的毒性效應(yīng)。
G6976阻止EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞癌變由其能夠抑制錨定非癌變性的細(xì)胞增長得到進(jìn)一步的證實(shí)。如圖8所示，把含有1×103過度表達(dá)EGF受體的3YI細(xì)胞懸于軟瓊脂中，一份樣本不予處理，一份用100納摩爾EGF處理，一份用100納摩爾EGF和250納摩爾G6976處理，還有一份樣本用250納摩爾G6976處理，上述每一種情況，細(xì)胞的克隆形成率都在懸細(xì)胞于軟瓊脂三周后確定。G6976阻止了EGF誘發(fā)的克隆形成。
對(duì)于正常細(xì)胞無顯著毒性效果本發(fā)明人在正常細(xì)胞(其中包括大鼠3Y1纖維母細(xì)胞)試驗(yàn)GO6976，其使用了上述實(shí)驗(yàn)中的藥物濃度未發(fā)現(xiàn)有明顯的毒性效果。在上述類型的細(xì)胞中，毒性效果在用5微摩爾治療時(shí)開始出現(xiàn)。
人類及動(dòng)物治療上述試驗(yàn)清楚地表明G6976對(duì)于不同種類的人類癌細(xì)胞有強(qiáng)大的細(xì)胞殺死效應(yīng)，它還可以抑制其它種類的人類癌細(xì)胞。根據(jù)EGF試驗(yàn)顯示其能阻礙EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，G6976還可以用于多種癌癥的預(yù)防。由于它在有效對(duì)抗癌細(xì)胞的濃度時(shí)對(duì)正常細(xì)胞并無毒性作用，所以G6976是一種非常有價(jià)值的化療藥物。它可以在許多眾所周知的目前用于化療的方法中使用。例如它可以直接注射入腫瘤組織，注射于血流中，口服，或用膏片敷于皮膚上。所選擇的劑量應(yīng)當(dāng)是足以構(gòu)成有效的治療但不至于過高而造成不能接受的副作用。在治療中和治療后一段時(shí)間對(duì)癌癥的狀態(tài)以及病人的健康最好應(yīng)進(jìn)行密切地監(jiān)測。
盡管上述例子中描述了G6976作為一種化療藥品用于治療不同種癌癥的有效性，但這些并非本項(xiàng)發(fā)明預(yù)想的局限，這個(gè)化合物在所有的測試過的癌細(xì)胞中都能殺死癌細(xì)胞或減低癌細(xì)胞的生長率。因此，很明顯，在治療有PKCα表達(dá)水平或活性增高的那些尚未試驗(yàn)過的癌細(xì)胞中它也會(huì)有效，諸如前列腺癌細(xì)胞，胰腺癌細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞。G6976的衍生物中凡能有效抑制PKCα者也應(yīng)對(duì)癌癥治療有效。而且，因?yàn)镚6976可防止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，所以它也理應(yīng)作為一種預(yù)防性藥物有效，特別是那些對(duì)某些癌癥的高危人群。
權(quán)利要求
1．一種用于治療哺乳類動(dòng)物癌癥的化合物，其特征在于，所說的化合物為G6976或者其衍生物。
2．如權(quán)利要求1所述的用于治療哺乳類動(dòng)物癌癥的化合物，其特征在于，所說的哺乳動(dòng)物是人。
3．如權(quán)利要求l所述的用于治療哺乳類動(dòng)物癌癥的化合物，其特征在于，所說的癌癥是乳癌、白血病、肺癌、骨癌、皮膚癌、前列腺癌、黑色素瘤或胰腺癌之一種。
4．如權(quán)利要求1所述的用于治療哺乳類動(dòng)物癌癥的化合物，其特征在于，所說的化合物為用于癌癥高危人群的一種預(yù)防癌癥的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于治療癌癥的藥物領(lǐng)域,涉及一種用于治療人類癌癥如乳癌、白血病、肺癌、骨癌、皮膚癌、前列腺癌、黑色素瘤和胰腺癌的化合物,其化合物為Go6976或者其衍生物,本發(fā)明可以防止癌細(xì)胞生成,殺死癌細(xì)胞或減低癌細(xì)胞的生長率,可用Go6976或其衍生物單獨(dú)進(jìn)行,也可以與先有技術(shù)化療藥物或放射療法結(jié)合使用:還可對(duì)某些癌癥的高危人群作為預(yù)防性藥物使用,使癌癥治療達(dá)到更好的效果。
文檔編號(hào)A61K31/404GK1283456SQ99125118
公開日2001年2月14日 申請(qǐng)日期1999年11月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月9日
發(fā)明者呂志民 申請(qǐng)人:呂志民