專利名稱：光葉合歡抗癌藥物及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗癌藥物，特別是涉及一種含有植物光葉合歡提取物的抗癌藥物組合物及其制備。
迄今臨床使用的抗癌藥物有環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、絲裂霉素、順鉑、喜樹堿、長春新堿、紫杉醇等。但在癌癥治療中，固型癌(實(shí)體瘤)對各種抗癌藥物特別容易產(chǎn)生耐藥性。因此，對可治療固型癌(實(shí)體瘤)的新型抗癌藥物需求極為迫切。
光葉合歡系豆科含羞草亞科合歡屬植物，學(xué)名Albiza lucidior Nielsen(中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會，中國植物志，科學(xué)出版社，1988年，北京，第39卷，第56～70頁)。中藥合歡皮系同屬植物合歡Albizia julibrissin Durazz的干燥樹皮，具有解郁、和血、寧心、消癰腫的功用，合歡的花和花蕾具有與合歡皮類似的功用[江蘇新醫(yī)學(xué)院，中藥大辭典，上海人民出版杜，1977年，上冊，第937～938頁]。合歡及其同屬植物大葉合歡、亮葉合歡、驅(qū)蟲合歡、鐵銹合歡、托葉合歡、香須樹、南洋楹、白格等多種植物的活性成分及其生物活性已有很多報(bào)道(鄒坤等，國外醫(yī)藥植物藥分冊，1997年第12卷第5期，200～206頁)。但作為同屬植物的光葉合歡卻一直未作藥用，也未見任何有關(guān)研究報(bào)道。
本發(fā)明的目的是發(fā)掘光葉合歡抗癌尤其抗固型癌的用途，研制一類含有光葉合歡的抗癌藥物以及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑和細(xì)胞周期抑制劑。
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)光葉合歡具有抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞周期等抗癌作用，可將光葉合歡提取物與可藥用載體和/或賦形劑組合，制成一類新的抗癌藥物以及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑和細(xì)胞周期抑制劑。尤其本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)的光葉合歡對固型癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，可使其被制成治療實(shí)體瘤有效的抗癌新藥。
以下詳細(xì)說明本發(fā)明將光葉合歡用不同極性的有機(jī)溶劑或水提取。將提取液過濾，濃縮，得到各種提取物。有機(jī)溶劑可以是甲醇，乙醇，丙醇，丁醇等醇類，也可以是二氯甲烷，氯仿等鹵代烷類，乙酸乙酯，乙酸丁酯等酯類或丙酮等。
生物活性試驗(yàn)試驗(yàn)采用人慢性骨髓性白血病細(xì)胞K562細(xì)胞株、人組織淋巴瘤細(xì)胞U937細(xì)胞株、人急性早幼粒白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞株、人大腸癌細(xì)胞HCT-15細(xì)胞(固型癌細(xì)胞)株以及小鼠乳腺癌溫敏細(xì)胞tsFT210細(xì)胞株。各種細(xì)胞均用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(每毫升含100微克青霉素和100微克鏈霉素)傳代，在通入5％二氧化碳的動物細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，K562、U937、HL-60及HCT-15等人癌細(xì)胞在37℃下，tsFT210細(xì)胞則在32℃下培養(yǎng)。
活性試驗(yàn)采用四甲基偶氮唑鹽(略稱MTT)法、細(xì)胞及其核內(nèi)染色體的形態(tài)學(xué)特征檢測法、細(xì)胞顆粒粒度分布檢測法、DNA梯狀帶的凝膠電泳檢測法以及流式細(xì)胞術(shù)等分子細(xì)胞生物學(xué)手段，檢測藥物對癌細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期的直接影響和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用。為了解藥物對癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)理，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)以及細(xì)胞微生理感應(yīng)檢測法(Cytosensor Microphysiometry)，探討了藥物對凋亡相關(guān)基因bcl-2轉(zhuǎn)錄信號系統(tǒng)的影響以及癌細(xì)胞在完整活細(xì)胞狀態(tài)下對藥物的反應(yīng)特點(diǎn)。陽性藥物使用目前臨床治療固型癌效果最佳的順鉑。
生物活性試驗(yàn)測得的有關(guān)數(shù)據(jù)采用組間t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
生物活性試驗(yàn)結(jié)果表明，光葉合歡的各提取物對受試癌細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡作用以及對細(xì)胞周期的選擇性阻斷作用，各提取物的最低有效終濃度在6.25～25微克/毫升之內(nèi)。有關(guān)誘導(dǎo)凋亡機(jī)理的初步研究結(jié)果表明，光葉合歡誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的機(jī)理與順鉑不同，凋亡相關(guān)基因bcl-2轉(zhuǎn)錄信號系統(tǒng)不介導(dǎo)光葉合歡誘發(fā)的癌細(xì)胞凋亡過程，提示光葉合歡可能通過作用于細(xì)胞膜上的死亡受體或通過影響細(xì)胞代謝的某一環(huán)節(jié)誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡。
實(shí)施例光葉合歡提取物的制備取光葉合歡的干燥莖皮100克，用1000ml溶劑反復(fù)提取三次，合并提取液，過濾后，減壓蒸餾濃縮，得光葉合歡提取物。所用溶劑和產(chǎn)物重量如下
以上提取物分別用于下述有關(guān)生物活性試驗(yàn)。
1.對人癌細(xì)胞株K562、U937、HL-60細(xì)胞增殖的抑制活性試驗(yàn)樣品均用80％甲醇配制成10mg/ml的母液，存于-20℃冰箱中，臨試驗(yàn)時(shí)用80％甲醇稀釋成2mg/ml濃度或所需不同濃度的溶液供用。陽性對照藥順鉑(cisplatin，簡稱cDDP；Sigma公司產(chǎn)品)用二甲基亞砜(以下簡稱DMSO)配制成2mg/ml的母液，存于-20℃冰箱中，在每次試驗(yàn)前臨時(shí)用無菌雙蒸水稀釋成1mg/ml的溶液，供試驗(yàn)使用。MTT(Signma公司產(chǎn)品)用磷酸緩沖生理鹽水(Phosphate-Buffered Saline，以下簡稱PBS)溶液配成5mg/ml濃度的溶液，存于-20℃冰箱中備用。
取對數(shù)生長期細(xì)胞，用新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成密度為2×105個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞液，將此細(xì)胞液接種到96孔板中，每孔分注100μl，置于5％CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)4小時(shí)，每孔加入受試樣品液或陽性對照順鉑溶液各5μl，每種樣品或順鉑均設(shè)兩個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)復(fù)孔空白對照，于二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)。每孔加入5mg/ml的MTT液10μl，于二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4小時(shí)，4℃、2000rpm離心5分鐘，吸去上清后，每孔加入100μl DMSO，37℃孵育約10分鐘，待結(jié)晶溶解完全后，用定時(shí)微量振蕩器振蕩約1分鐘，利用酶標(biāo)儀測定各孔于570nm處的光密度(以下稱OD)值。
取每一種樣品復(fù)孔OD值的平均值，按如下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率抑制率＝(OD空白-OD樣品)/OD空白×100％結(jié)果見表1及表2。表1 光葉合歡三種提取物(終濃度100μg/ml)對癌細(xì)胞增殖的抑制活性
表2 光葉合歡提取物ALN對K562細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制活性<
>***組間t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果，與空白組比較有顯著性差異(P＜0.001)
表1和表2中所示結(jié)果表明，光葉合歡的各提取物對受試的K562、U937、HL-60等人癌細(xì)胞均有很好的抗癌活性，而且，ALN對K562細(xì)胞的作用呈良好的量效關(guān)系，用NDST軟件計(jì)算結(jié)果，ALN對K562細(xì)胞的半數(shù)抑制增值濃度(IC50)為29.04±12.67μg/ml。
2.光葉合歡提取物ALN誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征光葉合歡的含水醇提取物ALN和陽性對照藥物cDDP，分別用80％甲醇和DMSO配制成10mg/ml的溶液備用。熒光試劑Hoechst 33258(從Sigma公司購入)用PBS溶液配制成5μg/ml濃度的溶液，冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?br> 取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)液(含10％滅活小牛血清，100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素)稀釋成密度為2×105個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞液，將細(xì)胞液接種于12孔板中，每孔分注1毫升，于5％二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4小時(shí)后，隨機(jī)分組加樣，每孔加入5μl樣品液，平行設(shè)陽性對照cDDP和空白對照，于5％二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)所需時(shí)間。
相差光學(xué)顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征檢測從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出用藥物處理不同時(shí)間后的細(xì)胞，直接置于顯微鏡下，目鏡×物鏡(10×20)條件下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征變化。
熒光顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征檢測將藥物處理不同時(shí)間的K562細(xì)胞從12孔板中分別移至Eppendorf離心管中，4℃、2000rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞，加入0.5％KCl溶液500μl，室溫靜置15分鐘后，4℃、2000rpm離心5分鐘，吸去上清，加入甲醇-乙酸(3∶1)的固定液100μl，4℃固定10分鐘，同法離心，吸去部分上清，將細(xì)胞滴于載玻片上，待稍干燥后，滴加一滴Hoechst 33258溶液，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察，照相。
結(jié)果相差光學(xué)顯微鏡下觀察，50μg/ml ALN及50μg/ml順鉑處理的K562細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)隨藥物處理的時(shí)間發(fā)生明顯的變化，初始細(xì)胞有胞體鄒縮、“出芽(blebbing)”現(xiàn)象，隨著作用時(shí)間的加長，觀測到細(xì)胞呈胞膜裹著的許多雪花狀小泡，最終形成許多散在的凋亡小體。藥物處理24小時(shí)后，ALN組中細(xì)胞產(chǎn)生的凋亡小體占絕對多數(shù)，視野中的正常細(xì)胞明顯減少。Hoechst33258染色后熒光顯微鏡下檢測也給出平行結(jié)果，ALN及順鉑處理組細(xì)胞中可觀測到許多凋亡細(xì)胞特征性的散在的細(xì)胞核DNA熒光斑點(diǎn)。用50μg/mlALN及50μg/ml順鉑處理24小時(shí)的K562細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33258染色后熒光顯微鏡下檢測的結(jié)果，與對照組相比，順鉑及ALN處理組細(xì)胞中可見許多凋亡細(xì)胞DNA的特征性熒光斑點(diǎn)，而且，ALN組幾乎所有細(xì)胞都已發(fā)生了凋亡。
3.光葉合歡提取物ALN誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡作用的顆粒粒度分布法檢測將用藥物處理不同時(shí)間后的K562細(xì)胞從12孔板中分別移至Eppendorf離心管中，4℃、2000rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞，各組細(xì)胞分別用生理鹽水稀釋相同倍數(shù)，用Coulter Multisizer II型全自動顆粒粒度分析儀(美國Coulter公司產(chǎn)品)，檢測細(xì)胞體積大小分布；檢測采用相同虹吸體積的檢測方法，每次檢測的細(xì)胞液體積為500微升。
結(jié)果用庫爾特全自動顆粒粒度分析儀，對粒徑分布進(jìn)行分析，能有效地檢測細(xì)胞凋亡情況，當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞體積開始縮小，后期形成小的細(xì)胞碎片即凋亡小體，使細(xì)胞大小分布移向小顆粒一端。本實(shí)驗(yàn)中，正常K562細(xì)胞群多數(shù)分布在10～20μm區(qū)間內(nèi)，而藥物處理后的細(xì)胞，由于發(fā)生凋亡，形成了凋亡小體，小于8μm的小顆粒的分布明顯增多，此區(qū)間小顆粒占總體顆粒數(shù)的比值可用于考察凋亡小體的生成率。
本實(shí)驗(yàn)中，K562細(xì)胞經(jīng)光葉合歡提取物ALN及順鉑分別處理不同時(shí)間后，10～20μm區(qū)間內(nèi)正常細(xì)胞計(jì)數(shù)占總顆粒計(jì)數(shù)的百分?jǐn)?shù)及小于8μm的凋亡小體顆粒計(jì)數(shù)占總顆粒計(jì)數(shù)的百分?jǐn)?shù)分別歸納如表3和表4所示。表3藥物處理不同時(shí)間后的K562細(xì)胞中正常細(xì)胞占總顆粒計(jì)數(shù)的百分?jǐn)?shù)<
>星號表示與對照組比較有顯著性差異**P＜0.001***P＜0.001表4 藥物處理不同時(shí)間后的K562細(xì)胞中凋亡小體占總顆粒計(jì)數(shù)的百分?jǐn)?shù)
星號表示與對照組比較有顯著性差異**P＜0.01***P＜0.001表3和表4的結(jié)果表明，光葉合歡提取物ALN 50μg/ml處理6～24小時(shí)均能明顯地誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡，處理12小時(shí)誘導(dǎo)凋亡達(dá)高峰，而且，ALN的誘導(dǎo)凋亡作用比同劑量的順鉑還要強(qiáng)而迅速。
4.光葉合歡提取物ALN誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡作用的瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)生一系列生化學(xué)變化，其中DNA發(fā)生規(guī)律性降解并在瓊脂糖凝膠電泳中呈梯狀帶，是凋亡所特有的現(xiàn)象，也是細(xì)胞凋亡生化學(xué)檢測的重要指標(biāo)之一。因此，用DNA瓊脂糖凝膠電泳法，考察了光葉合歡含水醇提取物ALN作用于K562細(xì)胞及固型癌HCT-15人大腸癌細(xì)胞時(shí)引起的DNA規(guī)律性降解的情況。
細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理固型癌HCT-15細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(內(nèi)含100U/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素)傳代，在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HCT-15細(xì)胞，用胰酶(GIBCO公司產(chǎn)品)消化后，再用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成密度為2×105個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞液，并接種于6孔板中，每孔分注3ml，在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4小時(shí)后，隨機(jī)分組加樣，每孔分別加入樣品液或陽性對照藥物順鉑溶液各15μl，在5％CO2培養(yǎng)相中37℃培養(yǎng)24小時(shí)。另外，K562細(xì)胞的培養(yǎng)及藥物處理過程，除不用胰酶消化外基本與HCT-15細(xì)胞相同。
細(xì)胞處理及瓊脂糖凝膠電泳分別收集藥物處理后的HCT-15及K562細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液[100mM Tris-HCl(pH8.5)，5mM EDTA，0.2M NaCl，0.2％SDS含終濃度為0.2mg/ml的蛋白酶K]，37℃靜置過夜，加入5M NaCl溶液至NaCl的終濃度1.5M，4℃下12000rpm離心15分鐘，去除蛋白質(zhì)等大分子沉淀，取上清液，加入無水乙醇至乙醇終濃度75％，于4℃靜置4小時(shí)，4℃、12000rpm離心15分鐘，吸去上清，取沉淀即DNA，加入適量TE[Tris-HCl和EDTA(乙二胺四乙酸)]緩沖液溶解，加入1mg/ml的RNAase使終濃度達(dá)200μg/ml，37℃靜置2小時(shí)，加入適量DNA電泳加樣緩沖液[10mMEDTA(pH8.0)，1％(w/v)瓊脂糖，0.25％溴酚藍(lán)，40％蔗糖]，點(diǎn)樣于2％瓊脂糖凝膠中，70V電泳1小時(shí)。用5μg/ml溴化乙啶液染色10分鐘后，在紫外透射反射儀下檢測，并利用電泳凝膠自動成像系統(tǒng)拍照。
結(jié)果用50μg/ml ALN處理K562細(xì)胞及HCT-15細(xì)胞24小時(shí)，提取細(xì)胞DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，均檢測到細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)由于DNA的規(guī)律性降解而形成的梯狀帶。結(jié)果表明，光葉合歡不僅能誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡，而且也能誘導(dǎo)固型癌HCT-15細(xì)胞發(fā)生凋亡。
5.光葉合歡提取物ALN誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡及對細(xì)胞周期抑制作用的流式細(xì)胞術(shù)分析在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，使DNA發(fā)生有規(guī)律的廣泛降解、斷裂，DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生劇變，最終形成含有不同大小的DNA斷片的凋亡小體，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)可以檢測細(xì)胞體DNA的這種變化。另外細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的關(guān)系非常密切，細(xì)胞凋亡往往發(fā)生在細(xì)胞周期中的某一環(huán)節(jié)。FCM法可以同時(shí)檢測凋亡以及細(xì)胞周期的變化情況，所以利用FCM法探討了光葉合歡含水醇提取物ALN作用后的癌細(xì)胞的變化情況。(1)ALN對K562細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡及細(xì)胞周期抑制作用材料和儀器碘化丙啶(Propidium Iodide略稱PI，Sigma公司產(chǎn)品)；庫爾特EPICS XL型四色流式細(xì)胞儀(美國Coulter公司產(chǎn)品)。
樣品液的配制受試藥物ALN樣品用80％甲醇配制成20mg/ml、10mg/ml及5mg/ml的溶液，陽性藥物順鉑用DMSO配制成10mg/ml溶液備用。
方法和結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，用新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液(含20％胎牛血清，100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素)稀釋成密度為2×105個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞液，接種于12孔板中，每孔分注2ml，于通入5％CO2的培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4小時(shí)，隨機(jī)分組加樣，每孔分別加入不同濃度的樣品液或陽性對照藥物順鉑溶液各10μl，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所需不同時(shí)間。
細(xì)胞處理和流式細(xì)胞術(shù)分析將12孔板中的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至Eppendorf離心管中，離心收集藥物處理后的K562細(xì)胞，PBS洗后，用70％乙醇固定過夜，4℃、7000rpm離心15分鐘，吸去上清，加入1mg/ml的RNA酶A溶液200μl，37℃消化30分鐘，PBS洗滌，離心5分鐘，吸去上清，加入5mg/ml的碘化丙啶試液200μl，4℃染色30分鐘，用PBS適量稀釋后，用流式細(xì)胞儀在汞激光激發(fā)波長488nm下進(jìn)行分析，每份標(biāo)本至少檢測三萬個(gè)細(xì)胞。
結(jié)果用ALN處理細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。終濃度為25、50及100μg/ml的ALN均能明顯地誘發(fā)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡，作用12及24小時(shí)后，K562細(xì)胞的凋亡百分率與相應(yīng)時(shí)間的空白組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，存在明顯的時(shí)間依賴性和劑量依賴性(參見表5)，而且，ALN(25μg/ml，24小時(shí))誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用比陽性對照藥物順鉑(50μg/ml，24小時(shí))還要強(qiáng)。另外，ALN對K562細(xì)胞的細(xì)胞周期也有一定的影響，低劑量(25μg/ml作用6及12小時(shí))及短時(shí)間作用(50及100μg/ml作用6小時(shí))，使G2/M期細(xì)胞增多，但隨著作用時(shí)間加長，主要呈現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
表5 ALN處理K562細(xì)胞引起細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果
星號表示與對照組比較有顯著性差異**P＜0.001***P＜0.001(2)對tsFT210細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)及細(xì)胞周期抑制作用樣品液的配制ALN樣品用80％的甲醇配制成10mg/ml的溶液，陽性藥物紫杉醇用甲醇配制成1.5mg/ml溶液備用。
細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理取對數(shù)生長期的tsFT210細(xì)胞，用新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液(含10％胎牛血清，100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素)稀釋成密度為2×105個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞液，接種于12孔板中，每孔分注1ml。每孔細(xì)胞液中分別加入樣品液或陽性對照藥物紫杉醇溶液各10μl，于5％CO2培養(yǎng)相中32℃培養(yǎng)17時(shí)間。
細(xì)胞處理和流式細(xì)胞術(shù)分析將12孔板中的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至Eppendorf離心管中，4℃、3000rpm離心3分鐘，收集藥物處理后的細(xì)胞，每管加PBS液1毫升，振蕩，4℃、3000rpm離心3分鐘，吸去上清，加入5mg/ml的碘化丙啶試液(含濃度為1mg/ml的RNA酶A)300μl，4℃染色30分鐘后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
結(jié)果終濃度為100μg/ml的ALN使大部分tsFT210細(xì)胞被阻斷在細(xì)胞周期的G2/M期上，同時(shí)也使少部分細(xì)胞發(fā)生凋亡。
6.光葉合歡提取物ALN對bcl-1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響細(xì)胞凋亡是一個(gè)基因調(diào)控的過程，其間有P53，bcl-2，c-myc及bax等多種基因和蛋白的參與和表達(dá)，其中bcl-2基因編碼一個(gè)26KD的細(xì)胞內(nèi)膜蛋白，該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和核膜。多種放、化療因素誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡都伴有bcl-2蛋白表達(dá)水平的下降，表明bcl-2基因表達(dá)系統(tǒng)與誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡相關(guān)聯(lián)。TR-PCR法可以通過檢測基因轉(zhuǎn)錄的mRNA量的變化，間接反映相應(yīng)蛋白表達(dá)量的變化，因此，利用TR-PCR法考察了ALN在誘發(fā)HCT-15細(xì)胞凋亡的過程中，對bcl-2基因轉(zhuǎn)錄mRNA水平的影響。(1)材料和儀器試劑30次反應(yīng)包裝的總RNA提取試劑盒(博大公司產(chǎn)品)，RT-PCR反應(yīng)試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)，bcl-2上下游引物(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)儀器Gene Amp PCR system 9700型PCR儀(美國PE公司產(chǎn)品)，F(xiàn)200AX4 06CM型制冰機(jī)(Cole-Parmer公司)。
樣品液的配制ALN樣品用80％甲醇分別配制成20mg/ml和10mg/ml的溶液，陽性藥物順鉑用DMSO配制成10μl/ml的溶液備用。(2)方法和結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理取對數(shù)生長期HCT-15細(xì)胞，胰酶消化后，用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(內(nèi)含100U/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素)稀釋成密度為2×105個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞液，接種于10cm培養(yǎng)皿中，每孔8ml，在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4小時(shí)后，隨機(jī)分組加樣，每孔加入樣品液40μl，同時(shí)設(shè)陽性對照順鉑和空白對照，在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)。
總RNA的提取按試劑盒說明提取總RNA，具體操作如下收集藥物處理后的HCT-15細(xì)胞，放入1.5ml Eppendorf離心管中，加入1ml Trizol(酸性異硫氰酸胍)試劑，用Vortex旋渦振蕩器充分振蕩混勻，冰浴靜置5分鐘，加入350μl氯仿，充分振蕩，稍靜置出現(xiàn)分層后，隨即于4℃、12000rpm離心15分鐘。將上清(水相)轉(zhuǎn)移至另一支1.5ml Eppendorf管中，加入等體積4℃預(yù)冷的異丙醇混勻，-20℃放置1小時(shí)，4℃、12500rpm離心20分鐘，取沉淀即總RNA，加入0.25ml 75％乙醇洗滌一次，去乙醇，真空抽干，然后加入0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯)水40μl溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 總RNA濃度測定及質(zhì)量評價(jià)冰上解凍所提取的總RNA，取5μl用超純水稀釋一定倍數(shù)，以超純水為背景blank，利用酶標(biāo)儀檢測260nm及280nm處的OD值。計(jì)算OD260/OD280值，來評價(jià)總RNA的質(zhì)量及純度，以O(shè)D260/OD280接近于2者為最好。另外，濃度為40mg/ml的總RNA溶液的OD260等于1，因此，可按公式[總RNA的濃度(mg/ml)＝OD260×40×稀釋倍數(shù)]來計(jì)算總RNA的濃度，并由此計(jì)算每微升總RNA相當(dāng)于多少微升總RNA溶液。
反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)反應(yīng)原料如下
反應(yīng)原料中補(bǔ)加0.1％DEPC水至總體積45μl，分裝為三管，每管15μl，每管分別加入1μg量的總RNA模板，再補(bǔ)加水至20μl，轉(zhuǎn)移到PCR儀上反應(yīng)，反應(yīng)條件如下48℃ 45min，94℃ 2min，(94℃ 30sec，60℃ 1min，68℃ 2min)×40次循環(huán)，68℃ 7min，4℃(soak)
反應(yīng)產(chǎn)物cDNA的檢測取10μl反應(yīng)產(chǎn)物，加入5μl 2×DNA電泳加樣緩沖液[10mM EDTA(pH8.0)，1％(w/v)瓊脂糖，0.25％溴酚藍(lán)，40％蔗糖]，全部點(diǎn)樣于2％瓊脂糖凝膠上，70V電泳1.5小時(shí)，紫外透射反射儀檢測并照相。
試驗(yàn)結(jié)果總RNA的濃度測定及質(zhì)量評價(jià)ALN實(shí)驗(yàn)中提取的總RNA稀釋261倍后，利用酶標(biāo)儀檢測260nm及280nm處的OD值，OD260/OD280比值均在2附近(參見表6)，表明所提取的總RNA質(zhì)量較好，可以進(jìn)行下一步的RT-PCR反應(yīng)。
表6總RNA濃度及質(zhì)量測評結(jié)果
RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用50μg/ml ALN處理HCT-15細(xì)胞的RT-PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在300bp處出現(xiàn)與空白組同樣的條帶(反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物cDNA)，條帶寬度基本相同，而cDDP 50μg/ml處理的HCT-15細(xì)胞未檢測到300bp處的cDNA。
7.光葉合歡提取物ALN對細(xì)胞代謝的影響細(xì)胞每時(shí)每刻都在進(jìn)行物質(zhì)和能量代謝，代謝過程中產(chǎn)生H+。H+主要來源于糖酵解產(chǎn)生的乳酸及呼吸產(chǎn)生的二氧化碳。在體外培養(yǎng)條件下，糖酵解的碳源主要是葡萄糖，而呼吸過程中的碳源則主要是谷氨酸和丙酮酸鹽。代謝產(chǎn)生的乳酸及二氧化碳由載體蛋白以離子的形式轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜外或者被動擴(kuò)散到細(xì)胞膜外，最終形成H+。微生理感應(yīng)儀(Cytosensor Microphysiometer)通過Biosensor可直接檢測H+濃度的變化情況即細(xì)胞外的酸化率ECAR，以此反映細(xì)胞代謝狀況，提供活細(xì)胞即時(shí)動態(tài)反應(yīng)信息。因此，為了確切地反映癌細(xì)胞在藥物作用下的真實(shí)情況，用微生理感應(yīng)儀在完整的活細(xì)胞狀態(tài)下，直接檢測了ALN對HCT-15大腸癌細(xì)胞的作用特點(diǎn)。(1)材料和儀器儀器Cytosensor Microphysiometer(美國molecular device公司)。
試劑RPMI-1640培養(yǎng)液，不含有碳酸氫鈉和血清(低緩沖能力)。
樣品液的配制受試樣品ALN和陽性對照藥物順鉑分別用80％甲醇和DMSO配制成10mg/ml的溶液備用。臨試驗(yàn)時(shí)，用running buffer(低緩沖能力RPMI-1640培養(yǎng)液)稀釋成終濃度為50μg/ml的樣品緩沖液供用。(2)方法和結(jié)果方法取對數(shù)生長期K562細(xì)胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)液(含20％小牛血清，100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素)稀釋成密度為2×105個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞液，每一個(gè)Capsule cup中加入1ml細(xì)胞液，于二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后，輕輕放上spacer及insert，insert內(nèi)加滿runningbuffer(低緩沖能力RPMI-1640培養(yǎng)液)使之下沉，將此cell cup放入sensorchamber(預(yù)先加入1ml running buffer，37℃預(yù)熱)內(nèi)，開機(jī)檢測，開始開啟running buffer沖洗，待RATE DATA基線平穩(wěn)后，切換成含藥緩沖液沖洗，檢測藥物對細(xì)胞外酸化率的變化，酸化率以加藥前的酸化率的百分?jǐn)?shù)表示(即加藥前為100％)。
結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，50μg/ml的ALN和順鉑均能降低HCT-15細(xì)胞的細(xì)胞外酸化率(ECAR)，即細(xì)胞代謝率。陽性藥順鉑作用4.23小時(shí)后，ECAR降至最低值15.9％，而ALN則作用0.62小時(shí)后，ECAR即降至最低值3.0％，之后繼續(xù)給藥，二者的ECAR均保持平穩(wěn)，不再變化?？傊珹LN的作用要比順鉑即快又強(qiáng)，ALN(50μg/ml)＞cDDP(50μg/ml)。
權(quán)利要求
1.一種抗癌藥物組合物，其特征是該組合物含有有效量的光葉合歡提取物及可藥用載體和/或賦形劑。
2.權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征為所述光葉合歡提取物的制備方法是，用有機(jī)溶劑、含水有機(jī)溶劑或水提取光葉合歡的干燥莖皮，并將提取液過濾、濃縮而成。
3.權(quán)利要求2所述的藥物組合物的制備方法中，所述有機(jī)溶劑是醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有植物光葉合歡提取物的抗癌藥物及其制備方法。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)光葉合歡具有抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞周期等抗癌作用,尤其對固型癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。將光葉合吹提取物與可藥用載體和/或賦形劑組合,可以制成一類新的抗癌藥物以及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑和細(xì)胞周期抑制劑。
文檔編號A61P35/00GK1259377SQ99124998
公開日2000年7月12日 申請日期1999年12月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月27日
發(fā)明者蔡兵, 崔承彬, 張華鳳, 李文欣, 曲戈霞, 姚新生, 吳春福 申請人:北京生物醫(yī)藥研究所