專利名稱：無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單抗、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單克隆抗體領(lǐng)域，尤其是關(guān)于無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌單克隆抗體及其在臨床治療上的應(yīng)用。
1975年Koehler和Milstein(Nature Vol.256，p495-497)用雜交瘤技術(shù)制備了世界上第一個鼠源單克隆抗體，為生物技術(shù)打開了一個全新的領(lǐng)域，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體技術(shù)也有了很大的發(fā)展，各種整分子的、小分子的、人源化的、雞尾酒的、雙功能的以至抗獨(dú)特性的單克隆抗體均陸續(xù)問世；各種單克隆抗體有各種不同的用途，治療藥用的、診斷藥用的、分析用的、純化用的、檢驗(yàn)用的等。1985年中科院細(xì)胞所謝弘、姚鑫等研制成功抗人肝癌單克隆抗體Hepama-1(實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，Vol.18，p263-270)，這是國際上最早報(bào)道的肝癌的鼠源單克隆抗體之一。
鼠源單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞分泌的，而雜交瘤細(xì)胞的生長和存活必須要有培養(yǎng)液來維持(Gillis S，Henney CS，J Immunol 1981 May，126(5)1978-1984)，而胎牛血清或新生牛血清是培養(yǎng)液的必須成分。
鑒于血清的成分復(fù)雜，每批血清的質(zhì)量不同，如果用來作為生物藥物生產(chǎn)時的重要原料會對藥物的安全帶來問題，多年來人們一直希望能建立一種以無血清無蛋白培養(yǎng)液為基質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)方法。1965年后，經(jīng)過Matsuya，F(xiàn)uve等人的研究，細(xì)胞的無血清培養(yǎng)終于初步成功(MatsuyaY，Tohoku J Exp Med 1965 Jun 25，86(1)84-92；Fuve RM et.al，J Bacteriol1966 Oct，92(4)1150-1153)。并找到了無血清培養(yǎng)基的最關(guān)鍵的成分是胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，乙醇胺，硒等，并于九十年代后，形成以DME/F12或RDF為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的以胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，乙醇胺，硒及各種生長因子等為主要成分的多種無血清培養(yǎng)基系列(Ozturk SS，et al.，J Biotechnol.1990Nov；16(3-4)259-278；Shinohara K，et al.，Agric Biol Chem.1990 Oct，54(10)2599-2603)。但胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，生長因子等依然是蛋白質(zhì)，且胰島素還是一種激素，這對分離目標(biāo)蛋白依然帶來一定的困難。1976年Tsitologiia等首先報(bào)告用一種以無機(jī)成分為主體的無血清無蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)淋巴細(xì)胞獲得成功(Voitenok，Tsitologiia，1976 Mar，18(3)356-360)，嗣后，1984年P(guān)inchuk等用無血清無蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞獲得成功(Pinchuk GV et.al，Eksp Onkol 1984，6(5)74-75)。
但這些培養(yǎng)基大部分只能用作實(shí)驗(yàn)室研究。如所周知，現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化時，生物產(chǎn)品均必須由生物反應(yīng)器中獲得，目前，生物反應(yīng)器分為兩類，一類用于大量生產(chǎn)細(xì)菌的表達(dá)產(chǎn)品，即所謂發(fā)酵罐；另一類則用于大量生產(chǎn)細(xì)胞的分泌產(chǎn)品，即所謂細(xì)胞生物反應(yīng)器。從技術(shù)角度來講，細(xì)胞生物反應(yīng)器的技術(shù)難度較大，成功的報(bào)道不多，Antoine等曾用4L的細(xì)胞生物反應(yīng)器生產(chǎn)昆蟲細(xì)胞Sf-9獲得成功，其細(xì)胞密度達(dá)4～15×106/ml(Antoine et.al.，Biotechnology and Bioengineering，Vol.43，p881-891，1994)。單克隆抗體也是用細(xì)胞生物反應(yīng)器來生產(chǎn)的，1988年我國臺灣學(xué)者M(jìn)eng MH等首先用中空纖維灌注式生物反應(yīng)器生產(chǎn)抗乙型肝炎病毒表面抗原單克隆抗體獲得成功(Meng MH，et al.，Chung Hua MinKuo Wei Sheng Wu Chi Mien I Hsueh Tsa Chih.1988 Aug，21(3)125-140)。1989年美國學(xué)者Heifetz首先以無血清培養(yǎng)液為基質(zhì)，在中空纖維灌注式生物反應(yīng)器中生產(chǎn)抗人纖維結(jié)合素鼠源單克隆抗體獲得成功(HeifetzAH et.al.，Biotechniques 1989 Feb，7(2)192-199)，但其產(chǎn)品的雜蛋白占5％。1991年捷克學(xué)者Franek首先以無血清、無蛋白培養(yǎng)液為基質(zhì)，報(bào)道了在一種實(shí)驗(yàn)室的生物反應(yīng)器中制備的單克隆抗體成功(Franek Fet.al.，Cytotechnology 1991 Sep，7(1)33-38)，但所有這些報(bào)導(dǎo)不但僅只是實(shí)驗(yàn)室型的，也都是斷續(xù)培養(yǎng)型的。迄今，未檢索到以無血清、無蛋白培養(yǎng)液為基質(zhì)，在生產(chǎn)型細(xì)胞生物反應(yīng)器中以連續(xù)培養(yǎng)的方式規(guī)模生產(chǎn)鼠源單克隆抗體的報(bào)道。
目前世界各國所生產(chǎn)的鼠源單抗，無論是整分子還是小分子的，如果不是用無血清、無蛋白條件培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基質(zhì)，無論采用何種生產(chǎn)方法，所獲得的產(chǎn)品均含有程度不等的內(nèi)源性免疫球蛋白(小鼠的或牛的)，這種含有內(nèi)源性免疫球蛋白的產(chǎn)品不但質(zhì)量難以控制并標(biāo)準(zhǔn)化，而且還蘊(yùn)藏著若干不安全的因素。但是，以無血清、無蛋白條件培養(yǎng)液為基質(zhì)，在生物反應(yīng)器中通過高密度培養(yǎng)小鼠雜交瘤細(xì)胞以制備無內(nèi)源性免疫球蛋白的鼠源單克隆抗體因技術(shù)困難未見成功的報(bào)道。
本發(fā)明的目的是提供一類無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單克隆抗體，是在生產(chǎn)型細(xì)胞生物反應(yīng)器中以連續(xù)培養(yǎng)的方式制得的產(chǎn)物，單克隆抗體在抗體蛋白中的組成比可達(dá)100％，可用于制備治療肝癌的藥物。
本發(fā)明的無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單克隆抗體是指絕對不含牛內(nèi)源性免疫球蛋白及小鼠內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單克隆抗體。(圖1是抗牛IgG對雜交瘤細(xì)胞Hepama-1在DXL無血清、無蛋白培養(yǎng)液中培養(yǎng)上清的檢測結(jié)果(sELISA)，證明雜交瘤細(xì)胞Hepama-1培養(yǎng)上清中不存在牛血清IgG)。
一類無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單抗Hepama-1，Hepama-9403，Hepama-9501等是以DXL無血清無蛋白培養(yǎng)液為培養(yǎng)基質(zhì)，采用細(xì)胞生物反應(yīng)器高密度連續(xù)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞而制得的，無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單抗的整分子單抗和由之經(jīng)常規(guī)酶切法制備的構(gòu)成整分子的小分子片段單抗都可用于制備治療肝癌的藥物。
無內(nèi)源性免疫球蛋白肝癌鼠源單克隆抗體的生產(chǎn)工藝分為二步，先用DXL無血清、無蛋白培養(yǎng)液在生物反應(yīng)器中大量生產(chǎn)雜交瘤細(xì)胞，再用專門的色譜方法分離、純化肝癌單克隆抗體。全部工藝均在無菌條件下進(jìn)行。
生產(chǎn)流程步驟(表1)
表1.生產(chǎn)流程步驟流程 說明 環(huán)境清潔度生產(chǎn)細(xì)胞庫 取出Hepama-1細(xì)胞 100,000級↓小量擴(kuò)增 CO2培養(yǎng)箱 100,000級↓大量生產(chǎn) 生物反應(yīng)器 100,000級↓收集培液 培液離心 100,000級↓濃縮 低溫汽化或升華 100,000級↓分離純化 層析↓濃縮 真空低壓低溫 100,000級↓濃度，純度質(zhì)量控制 鼠源DNA100,000級內(nèi)毒素，外源因子↓過濾分裝 100級配制DXL無血清無蛋白培養(yǎng)液其特點(diǎn)是用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液中不含任何血清和蛋白；也就是說，培養(yǎng)液中血清和蛋白的含量均為零。DXL無血清無蛋白培養(yǎng)液配方 毫克/升腺嘌呤 0.1-0.5丙氨酸 5-10氯化鋁 0.0005-0.001偏釩酸銨 0.0005-0.001精氨酸 100-500天冬酰胺 10-50天冬氨酸 5-30氯化鋇 0.001-0.005生物素 0.05-0.5氯化鈣 10-100氯化膽堿 10-100硫酸鉻鉀 0.0005-0.005檸檬酸 10-50瓜氨酸 1-10氯化鈷 0.001-0.005硫酸銅 0.001-0.01半胱氨酸 10-100雙亞油酸卵磷脂 0.1-1雙硬脂酸卵磷脂 0.1-1乙醇胺 1-10乙二胺四乙酸鹽 5-10聚乙二醇 0.5-4硫酸亞鐵 0.5-5原子鐵 2-5黃素腺嘌呤二核苷酸 0.01-0.05葉酸 1-5二氧化鍺0.0001-0.001谷氨酸 10-50谷氨酰胺100-500甘氨酸 1-10葡萄糖 2000-10000組氨酸 10-100次黃嘌呤1-10異亮氨酸100-500亮氨酸 100-500亞油酸 0.01-0.1氯化鋰 5-50賴氨酸 50-500氯化鎂 50-500氯化錳 0.00005-0.0005甲硫氨酸10-50鉬酸0.00005-0.0005MOPS1000-10000肌醇10-50煙酰胺 1-10硝酸鎳 0.0001-0.0005鳥氨酸 1-10草酰乙酸1-10泛酸1-5酚紅1-10苯丙氨酸10-100溴化鉀 0.00005-0.0005氯化鉀 100-500碘化鉀0.00005-0.0005脯氨酸10-100黃體酮0.001-0.01腐胺 0.1-0.5吡哆辛0.1-0.5丙酮酸100-500核黃素0.01-0.05氯化銣0.000005-0.00005絲氨酸10-100氯化銀0.000001-0.00001氯化鈉5000-10000氟化鈉0.001-0.01硝普鈉1-10磷酸氫二鈉100-1000亞硒酸鈉 0.01-0.05精胺 0.1-1氯化亞錫 0.00005-0.0005?；撬?0-50硫辛酸0.08-0.4硫胺素0.1-0.8蘇氨酸8-18胸腺嘧啶 0.2-1.5氯化鈦0.0005-0.004生育素0.05-4色氨酸1-10吐溫800.05-3酪氨酸25-45
纈氨酸 70-120維生素B122-15硫酸鋅 0.6-5用上述配制好的DXL無血清無蛋白培養(yǎng)液培養(yǎng)能分泌肝癌鼠源單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。圖2是雜交瘤細(xì)胞Hepama-1在DXL無血清、無蛋白培養(yǎng)液中的計(jì)數(shù)值，表明在DXL無血清、無蛋白培養(yǎng)液中雜交瘤細(xì)胞的密度不低于在含血清培養(yǎng)液中。
從生產(chǎn)細(xì)胞庫中取出Hepama-1雜交瘤細(xì)胞經(jīng)小量擴(kuò)增，取對數(shù)期前細(xì)胞(接種細(xì)胞密度為A×104/mL)，移入細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)，監(jiān)控工藝條件(溫度30～40℃、轉(zhuǎn)速100-500RPM、pH6.5～7.5、PO20.1-2巴、PCO20.1-2巴、PN20.1-2巴、空氣流量1-5升/小時、壓力1-5巴)，待細(xì)胞生物反應(yīng)器中細(xì)胞長到密度為A×106/ml左右，抗體濃度約為0.5-1mg/ml時，收集培養(yǎng)液，低溫升華法離心濃縮，得到初級產(chǎn)品。
再以HPLC分離純化初級產(chǎn)品，以低壓低溫升華法濃縮產(chǎn)品，同時對產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制，最后經(jīng)過無菌過濾后獲得無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單抗的整分子單抗。
必要時，可用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等按常規(guī)酶切法將無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單抗的整分子單抗制備成無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源小分子單抗Fab或(Fab)2。先將配制好的含酶消化液與相同體積的無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源整分子單抗37℃作用，酶切反應(yīng)終止后，再用pH8.0磷酸緩沖液4℃透析12-20小時，最后再以HPLC分離純化，獲得無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源小分子單抗。
本發(fā)明無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單克隆抗體的質(zhì)量鑒定如下本發(fā)明單抗產(chǎn)品系經(jīng)篩選獲得的抗肝癌雜交瘤細(xì)胞株在無血清無蛋白培養(yǎng)液中所分泌的單克隆抗體，為無菌無病毒無熱原溶液，含單抗?jié)舛葹闃?biāo)示值的80.0-120.0％。無色澄明液體。pH值6.5-7.5(中國藥典1995年版二部附錄VI H)。
無菌 按生物制品規(guī)程(1995年版一部)進(jìn)行檢驗(yàn)，符合規(guī)定。
細(xì)菌內(nèi)毒素 取本品適量，稀釋10倍后依法(中國藥典1995年版二部附錄XI E)檢查，本品每毫升含細(xì)菌內(nèi)毒素小于5Eu。
支原體檢查 經(jīng)直接培養(yǎng)法檢查，符合規(guī)定。
鼠源病毒檢查 按照《人用鼠源性單克隆抗體制備及質(zhì)量控制要點(diǎn)》檢查，符合規(guī)定。
培養(yǎng)液中的殘存鼠源DNA含量經(jīng)地高辛標(biāo)記的小鼠基因組DNA探針斑點(diǎn)雜交法測定，本品殘存鼠源DNA含量每劑不超過100pg。1.經(jīng)橢偏成像生物顯微技術(shù)判定以無內(nèi)源性免疫球蛋白Hepama-1單抗為固相，以肝癌細(xì)胞裂解液為液相，本發(fā)明單抗產(chǎn)品呈陽性(見圖3)。
2.經(jīng)橢偏成像生物顯微技術(shù)判定以抗牛IgG為固相，本發(fā)明單抗產(chǎn)品呈陰性，而含牛內(nèi)源性免疫球蛋白的樣品呈陽性。1.經(jīng)橢偏成像生物顯微技術(shù)判定以無內(nèi)源性免疫球蛋白Hepama-1單抗為固相，以肝癌細(xì)胞裂解液為液相，本發(fā)明單抗產(chǎn)品呈陽性。
2.經(jīng)辣根過氧化物酶組織化學(xué)染色法判定對人體淋巴結(jié)組織切片進(jìn)行染色，以PBS染色陰性為前提，無內(nèi)源性免疫球蛋白Hepama-1單抗染色為陰性(見圖4)，而作為對照的小鼠IgG為陽性(見圖5)。
3.經(jīng)橢偏成像生物顯微技術(shù)判定以無內(nèi)源性免疫球蛋白Hepama-1單抗為固相，以淋巴細(xì)胞裂解液為液相，本發(fā)明單抗產(chǎn)品呈陰性。
4.經(jīng)免疫結(jié)合試驗(yàn)，飽和結(jié)合本發(fā)明單抗產(chǎn)品的肝癌細(xì)胞上清液中不含任何蛋白，也不會有對人肝癌細(xì)胞的任何免疫活性，而飽和結(jié)合有小鼠內(nèi)源性免疫球蛋白的樣品的肝癌細(xì)胞上清液中則仍含有蛋白，仍存在對人肝癌細(xì)胞的免疫活性。采用還原和非還原條件下的SDS-PAGE法測定單克隆抗體純度，免疫球蛋白(單體及二聚體)含量不低于95.0％。采用Bradford法，以卵清蛋白為對照品，測定單克隆抗體含量。每毫升含單克隆抗體2.5mg。采用間接免疫熒光法，以BEL-7402或SMMC-7721肝癌細(xì)胞為抗原，免疫活性不高于2微克/毫升。
本發(fā)明系無內(nèi)源性免疫球蛋白肝癌鼠源單克隆抗體，單克隆抗體在作為藥物應(yīng)用時的抗體蛋白中的組成比不但每批恒定，而且能達(dá)100％。保證了藥品質(zhì)量的穩(wěn)定性。除去了安全性方面的隱患。本發(fā)明系用無血清、無蛋白培養(yǎng)液為基質(zhì)，以高密度細(xì)胞生物反應(yīng)器連續(xù)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的方法予以制備和生產(chǎn)?，F(xiàn)已成功地制備了無內(nèi)源性免疫球蛋白的整分子的肝癌鼠源單克隆抗體Hepama-1、Hepama-9403、Hepama-9501等、小分子的肝癌鼠源單克隆抗體sHepama-1、sHepama-9403、sHepama-9501等。以這些單克隆抗體為載體，經(jīng)標(biāo)記放射性同位素碘-131等，制得用于治療肝癌的藥物，并獲得滿意的臨床效果，其中無內(nèi)源性抗肝癌鼠源單抗介導(dǎo)的放射性131碘用于治療晚期原發(fā)性巨塊型肝癌32例，其中13例已健康存活8年，8年生存率高達(dá)40.2％。經(jīng)動物試驗(yàn)，無內(nèi)源性抗肝癌鼠源小分子單抗介導(dǎo)的放射性131碘以高、中、低劑量分別用于治療載肝癌裸鼠的腫瘤，治療后腫瘤體積均明顯縮小，腫瘤抑制率均大于30％，顯示該藥品確有抑制腫瘤生長的作用。此種作用具有明顯的劑量依賴性。因此這一類無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單克隆抗體(整分子或小分子)是一種有前途的藥物原料。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是所采用的原料是無血清、無蛋白培養(yǎng)液，所以制得的單克隆抗體中不含任何小鼠內(nèi)源性免疫球蛋白及任何牛內(nèi)源性免疫球蛋白，也不含任何雜蛋白，且單克隆抗體的抗體蛋白中的組成比為100％；與已有技術(shù)制備單抗相比，已有技術(shù)無論是整分子還是小分子，其原料來源不外乎含雜交瘤細(xì)胞的腹水及含雜交瘤細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)液(含血清培養(yǎng)液)兩種，均具質(zhì)量不穩(wěn)定、用藥不安全的缺點(diǎn)。而本發(fā)明單抗產(chǎn)品正好避免了這兩個對藥品說來是致命的缺點(diǎn)。其技術(shù)關(guān)鍵在于采用無血清、無蛋白培養(yǎng)液為基質(zhì)，在細(xì)胞生物反應(yīng)器中經(jīng)高密度(106/mL)連續(xù)培養(yǎng)所獲得的產(chǎn)品(0.5-1mg/ml)；用這樣的組合技術(shù)，能以生產(chǎn)規(guī)模來制備無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單克隆抗體；以這些單克隆抗體為載體，經(jīng)標(biāo)記放射性同位素碘-131等，可制得用于治療肝癌的藥物制劑，并獲得滿意的臨床效果，因此這些單克隆抗體是一種有前途的原料藥。


圖1以sELISA法對雜交瘤細(xì)胞Hepama-1的DXL無血清、無蛋白的上清液、DXL無血清、無蛋白培養(yǎng)液、含20％小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液的上清液的檢測結(jié)果左抗牛IgG對雜交瘤細(xì)胞Hepama-1的DXL無血清、無蛋白的上清液的檢測結(jié)果為陰性中抗牛IgG對DXL無血清、無蛋白培養(yǎng)液的檢測結(jié)果為陰性右抗牛IgG對雜交瘤細(xì)胞的含20％小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液的上清液的檢測結(jié)果為陽性。
圖2經(jīng)72小時培養(yǎng)后，雜交瘤細(xì)胞Hepama-1在無血清、無蛋白培養(yǎng)液、含20％小牛血清1640培養(yǎng)液中的細(xì)胞計(jì)數(shù)值左雜交瘤細(xì)胞Hepama-1在DXL無血清、無蛋白培養(yǎng)液中的計(jì)數(shù)值為7.0×105個/毫升右雜交瘤細(xì)胞Hepama-1在含20％小牛血清1640培養(yǎng)液中的計(jì)數(shù)值為6.6×105個/毫升。
圖3無內(nèi)源性免疫球蛋白Hepama-1單抗經(jīng)橢偏成像生物顯微技術(shù)對肝癌細(xì)胞裂解液特異性免疫結(jié)合的三維分布灰度圖像(高度值對應(yīng)灰度值)
圖中a固體基底b無內(nèi)源性免疫球蛋白Hepama-1單抗c無內(nèi)源性免疫球蛋白Hepama-1單抗+肝癌細(xì)胞裂解液。
圖4無內(nèi)源性免疫球蛋白Hepama-1單抗經(jīng)辣根過氧化物酶組織化學(xué)染色法對人體淋巴結(jié)組織切片鏡檢的陰性顯示圖。
圖5小鼠免疫球蛋白IgG經(jīng)辣根過氧化物酶組織化學(xué)染色法對人體淋巴結(jié)組織切片鏡檢的陽性顯示圖。
本發(fā)明一類無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單克隆抗體Hepama-1、Hepama-9403、Hepama-9501(整分子及小分子)等等，制備方法類似，下面以無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單克隆抗體Hepama-1的制得為實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1制備無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單克隆抗體Hepama-1配置DXL無血清無蛋白培養(yǎng)液10升需腺嘌呤3毫克、丙氨酸70毫克、氯化鋁0.007毫克、偏釩酸銨0.007毫克、精氨酸3克、天冬酰胺300毫克、天冬氨酸150毫克、氯化鋇0.025毫克、生物素2.5毫克、氯化鈣500毫克、氯化膽堿500毫克、硫酸鉻鉀0.025毫克、檸檬酸300毫克、瓜氨酸50毫克、氯化鈷0.025毫克、硫酸銅0.05毫克、半胱氨酸500毫克、雙亞油酸卵磷脂5毫克、雙硬脂酸卵磷脂5毫克、乙醇胺50毫克、乙二胺四乙酸鹽70毫克、聚乙二醇20毫克、硫酸亞鐵25毫克、原子鐵25毫克、黃素腺嘌呤二核苷酸0.25毫克、葉酸25毫克、二氧化鍺0.005毫克、谷氨酸250毫克、谷氨酰胺2.5克、甘氨酸50毫克、葡萄糖60克、組氨酸500毫克、次黃嘌呤50毫克、異亮氨酸3克、亮氨酸3克、亞油酸0.5毫克、氯化鋰250毫克、賴氨酸2.5克、氯化鎂2.5克、氯化錳0.0025毫克、甲硫氨酸250毫克、鉬酸0.0025毫克、MOPS 50毫克、肌醇300毫克、煙酰胺50毫克、硝酸鎳0.0025毫克、鳥氨酸50毫克、草酰乙酸50毫克、泛酸25毫克、酚紅50毫克、苯丙氨酸500毫克、溴化鉀0.0025毫克、氯化鉀3克、碘化鉀0.0025毫克、脯氨酸500毫克、黃體酮0.05毫克、腐胺2.5毫克、吡哆辛2.5毫克、丙酮酸2.5克、核黃素0.25毫克、氯化銣0.00025毫克、絲氨酸500毫克、氯化銀0.00005毫克、氯化鈉70克、氟化鈉0.05毫克、硝普鈉50毫克、磷酸氫二鈉5克、亞硒酸鈉0.25毫克、精胺5毫克、氯化亞錫0.0025毫克、?；撬?50毫克、硫辛酸1.5毫克、硫胺素4毫克、蘇氨酸130毫克、胸腺嘧啶7毫克、氯化鈦0.02毫克、生育素20毫克、色氨酸50毫克、吐溫80 15毫克、酪氨酸350毫克、纈氨酸1克、維生素B12 80毫克、硫酸鋅28毫克，使之充分溶解于去離子水中，定容為10升。無菌過濾備用。
從生產(chǎn)細(xì)胞庫中取出Hepama-1細(xì)胞，通過小量擴(kuò)增后移入5升細(xì)胞生物反應(yīng)器L 1523(Bioengineering)中大量連續(xù)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞Hepama-1。按如下反應(yīng)器工藝條件，溫度37℃；轉(zhuǎn)速400RPM；pH7.0；PO20.2巴；PCO20.4巴；PN20.2巴；空氣流量2升/小時；壓力1巴，進(jìn)行高密度雜交瘤細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)。反應(yīng)器中的細(xì)胞密度高達(dá)1.5×106/ml左右?？贵w濃度高達(dá)0.7mg/ml。
再以HPLC(BECKMAN Biosys 2000)分離純化初級產(chǎn)品，以真空低壓低溫濃縮(AES2010 Automatic Environmental SpeedVac)產(chǎn)品，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢定，符合標(biāo)準(zhǔn)，最后經(jīng)過無菌過濾后獲得無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單抗的整分子單抗Hepama-1。
實(shí)施例2以實(shí)施例1制得的無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單克隆抗體Hepama-1為原料，用常規(guī)酶切法制備小分子單抗sHepama-1(Fab)先配制含0.1毫克/毫升木瓜蛋白酶的消化液(0.02摩爾乙二胺四乙酸二鈉、0.02摩爾半胱氨酸)，將現(xiàn)配的含0.1毫克/毫升木瓜蛋白酶的消化液與相同體積的無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源整分子單抗37℃作用8小時，再加碘乙酰胺至終濃度0.3摩爾，以終止酶切反應(yīng)，然后用pH8.0磷酸緩沖液4℃透析15小時，最后以HPLC分離純化，獲得無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單抗的小分子單抗sHepama-1(Fab)。
按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢定，符合標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例3以實(shí)施例1制得的無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單克隆抗體Hepama-1為載體，標(biāo)記放射性同位素碘-131，制得用于治療肝癌的藥物制劑。
一男性病人，因患晚期原發(fā)性巨塊型肝癌于1990年入院，經(jīng)CT檢查，腫塊直徑達(dá)20厘米，剖腹探察后無法手術(shù)，宣告“不治”，在自愿的前提下，經(jīng)用無內(nèi)源性肝癌鼠源單抗介導(dǎo)的放射性131碘25毫居里一次性治療，腫塊縮小至6厘米，殘留腫瘤經(jīng)病理分析全部壞死，患者迅即痊愈，健康存活至今，無復(fù)發(fā)跡象。
實(shí)施例4以實(shí)施例1制得的無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單克隆抗體Hepama-1為載體，標(biāo)記放射性同位素碘-131，制得用于治療肝癌的藥物制劑。
一男性病人，因患晚期原發(fā)性巨塊型肝癌于1990年入院，經(jīng)CT檢查，腫塊直徑達(dá)12厘米，剖腹探察后無法手術(shù)，宣告“不治”，在自愿的前提下，經(jīng)用無內(nèi)源性肝癌鼠源單抗介導(dǎo)的放射性131碘25毫居里一次性治療，健康存活至今。
實(shí)施例5以實(shí)施例2制得的無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源小分子單克隆抗體sHepama-1(Fab)為載體，標(biāo)記放射性同位素碘-131，制得用于治療肝癌的藥物制劑，來治療載肝癌裸鼠的腫瘤，治療后腫瘤體積明顯縮小，顯示該藥品確有抑制腫瘤生長的作用。每鼠注入50微居里，100微居里，500微居里的131I的小分子單抗標(biāo)記物，在30天后，均可見到明確的實(shí)驗(yàn)療效(見表2)，載瘤裸鼠的腫瘤抑制率均大于30％。表2.注射無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源小分子單克隆抗體sHepama-1(Fab)介導(dǎo)的放射性131碘后，載肝癌裸鼠的腫瘤平均體積的變化

腫瘤抑制率(％)第12天第21天第30天低劑量組29.44 44.39 46.00中劑量組 38.26 50.93 53.42高劑量組 44.63 54.12 57.50游離131I 20.23 13.41 7.38以上各劑量組的腫瘤抑制率同生理鹽水對照組及游離同位素組的相比，其P值均小于0.05。
權(quán)利要求
1.一類肝癌鼠源單克隆抗體，其特征在于它是無內(nèi)源性免疫球蛋白的單克隆抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的肝癌鼠源單克隆抗體，其特征在于所述肝癌鼠源單克隆抗體包括整分子及構(gòu)成整分子的小分子片段。
3.如權(quán)利要求1所述的肝癌鼠源單克隆抗體的制備方法，其特征在于以無血清無蛋白培養(yǎng)液為培養(yǎng)基質(zhì)，采用細(xì)胞生物反應(yīng)器高密度雜交瘤細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)法繼以分離純化制得。
4.如權(quán)利要求3所述的肝癌鼠源單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的無血清、無蛋白培養(yǎng)基質(zhì)的配方如下腺嘌呤0.1-0.5毫克/升、丙氨酸5-10毫克/升、氯化鋁0.0005-0.001毫克/升、偏釩酸銨0.0005-0.001毫克/升、精氨酸100-500毫克/升、天冬酰胺10-50毫克/升、天冬氨酸5-30毫克/升、氯化鋇0.001-0.005毫克/升、生物素0.05-0.5毫克/升、氯化鈣10-100毫克/升、氯化膽堿10-100毫克/升、硫酸鉻鉀0.0005-0.005毫克/升、檸檬酸10-50毫克/升、瓜氨酸1-10毫克/升、氯化鈷0.001-0.005毫克/升、硫酸銅0.001-0.01毫克/升、半胱氨酸10-100毫克/升、雙亞油酸卵磷脂0.1-1毫克/升、雙硬脂酸卵磷脂0.1-1毫克/升、乙醇胺1-10毫克/升、乙二胺四乙酸鹽5-10毫克/升、聚乙二醇0.5-4毫克/升、硫酸亞鐵0.5-5毫克/升、原子鐵2-5毫克/升、黃素腺嘌呤二核苷酸0.01-0.05毫克/升、葉酸1-5毫克/升、二氧化鍺0.0001-0.001毫克/升、谷氨酸10-50毫克/升、谷氨酰胺100-500毫克/升、甘氨酸1-10毫克/升、葡萄糖2000-10000毫克/升、組氨酸10-100毫克/升、次黃嘌呤1-10毫克/升、異亮氨酸100-500毫克/升、亮氨酸100-500毫克/升、亞油酸0.01-0.1毫克/升、氯化鋰5-50毫克/升、賴氨酸50-500毫克/升、氯化鎂50-500毫克/升、氯化錳0.00005-0.0005毫克/升、甲硫氨酸10-50毫克/升、鉬酸0.00005-0.0005毫克/升、MOPS1000-10000毫克/升、肌醇10-50毫克/升、煙酰胺1-10毫克/升、硝酸鎳0.0001-0.0005毫克/升、鳥氨酸1-10毫克/升、草酰乙酸1-10毫克/升、泛酸1-5毫克/升、酚紅1-10毫克/升、苯丙氨酸10-100毫克/升、溴化鉀0.00005-0.0005毫克/升、氯化鉀100-500毫克/升、碘化鉀0.00005-0.0005毫克/升、脯氨酸10-100毫克/升、黃體酮0.001-0.01毫克/升、腐胺0.1-0.5毫克/升、吡哆辛0.1-0.5毫克/升、丙酮酸100-500毫克/升、核黃素0.01-0.05毫克/升、氯化銣0.000005-0.00005毫克/升、絲氨酸10-100毫克/升、氯化銀0.000001-0.00001毫克/升、氯化鈉5000-10000毫克/升、氟化鈉0.001-0.01毫克/升、硝普鈉1-10毫克/升、磷酸氫二鈉100-1000毫克/升、亞硒酸鈉0.01-0.05毫克/升、毫克/升、精胺0.1-1毫克/升、氯化亞錫0.00005-0.0005毫克/升、?；撬?0-50毫克/升、硫辛酸0.08-0.4毫克/升、硫胺素0.1-0.8毫克/升、蘇氨酸8-18毫克/升、胸腺嘧啶0.2-1.5毫克/升、氯化鈦0.0005-0.004毫克/升、生育素0.05-4毫克/升、色氨酸1-10毫克/升、吐溫800.05-3毫克/升、酪氨酸25-45毫克/升、纈氨酸70-120毫克/升、維生素B122-15毫克/升、硫酸鋅0.6-5毫克/升。
5.如權(quán)利要求3所述的肝癌鼠源單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的細(xì)胞生物反應(yīng)器高密度雜交瘤細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)法的工藝條件是溫度30～40℃、轉(zhuǎn)速100-500RPM、pH6.5～7.5、PO20.1-2巴、PCO20.1-2巴、PN20.1-2巴、空氣流量1-5升/小時、壓力1-5巴。
6.如權(quán)利要求1或2所述的肝癌鼠源單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于所述單抗可用于作為制備治療肝癌的藥物制劑的原料藥。
全文摘要
一類無內(nèi)源性免疫球蛋白的肝癌鼠源單抗系以無血清無蛋白培養(yǎng)液為培養(yǎng)基質(zhì),采用細(xì)胞生物反應(yīng)器高密度雜交瘤細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng),分離純化制得。其細(xì)胞密度高達(dá)10
文檔編號A61K39/395GK1241573SQ9911382
公開日2000年1月19日 申請日期1999年6月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月25日
發(fā)明者謝弘, 來文, 戴信蘭, 王根風(fēng), 梁明, 張茹萍, 王放, 陳中健 申請人:中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所, 上海梅山生物技術(shù)有限責(zé)任公司