專利名稱：藥用級(jí)銀杏的制作方法
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1．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的來水涉及植物藥材以及將所述藥材轉(zhuǎn)化成醫(yī)學(xué)有用且藥學(xué)可接受形式的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及組成指紋和活性指紋在將白果(銀杏)加工成適于臨床治療和／或改善疾病、紊亂和／或病情的具備藥用級(jí)組合物水平的植物藥過程中的應(yīng)用。
2．發(fā)明背景藥物生產(chǎn)是在對各生產(chǎn)批次的組成和生物活性的控制下進(jìn)行的。這種標(biāo)準(zhǔn)化和控制在對患者的可預(yù)期性治療和一致性治療中提供了可重現(xiàn)的材料。由植物藥材制備的植物藥給生產(chǎn)者提出了特殊的問題，即期望實(shí)現(xiàn)藥物需要的有控制、可重現(xiàn)、和標(biāo)準(zhǔn)化。由于植物藥含有多種成分，并且由于原料的生長、收獲和加工條件所致的組成和含量的巨大差異，導(dǎo)致上述問題成為首要問題。
植物曾是并還將是大量藥物化合物的來源。幾個(gè)世紀(jì)以來，各種形式的植物來源材料被用于治療無數(shù)種不同疾病。植物藥材的形式通常是來源于一種或多種植物或植物部分的粉末，或者來源于整體植物或選擇的植物部分的提取物。這些粉末或提取物大多數(shù)是生物活性和非生物活性成分的復(fù)雜混合物。
雖然植物粉末和提取物已經(jīng)廣泛地在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用，但仍然存在很多與這類藥物應(yīng)用有關(guān)的問題。例如，植物藥材的復(fù)雜化學(xué)性質(zhì)使其難于以任何形式的控制和預(yù)期方式應(yīng)用。由收獲方式不同的植物得到的不同批次的藥材其化學(xué)組成的潛在差異導(dǎo)致該藥材不適于臨床應(yīng)用。
在積極的方面，植物藥材中典型存在的生物活性成分的復(fù)雜組合提供了協(xié)同或增加生物活性范圍的可能。然而，由于這些復(fù)合藥材的未知特征，其藥效的潛在改進(jìn)還不能預(yù)測。
上述與植物藥固有的化學(xué)復(fù)雜性有關(guān)的問題導(dǎo)致，在從大量具有藥用價(jià)值的植物材料中分離提取生物活性成分方面需付出巨大的努力。該研究領(lǐng)域隨著化學(xué)分離和分析技術(shù)的改進(jìn)得以迅速發(fā)展。分離純化后，各種活性成分可以應(yīng)用于臨床，確定具體成分的藥效。從植物藥材中分離和純化個(gè)體成分是這類藥物發(fā)展過程的基礎(chǔ)。純化后，通常將可能的活性成分與藥物可接受載體混合，然后進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)動(dòng)物研究以及最終的對人的臨床實(shí)驗(yàn)。證明臨床有效性后，這類藥物被認(rèn)為是藥用級(jí)的，因?yàn)樗鼈兒袉我坏幕蛑炼嗌贁?shù)幾個(gè)含量已知、特征明確的成分。
藥用級(jí)藥物的優(yōu)點(diǎn)在于可以在治療方案中精確地跟蹤各個(gè)成分的作用。而且，可以準(zhǔn)確控制藥物劑量，提供相對可預(yù)測的藥物作用。所述相對純的藥用級(jí)藥物的缺點(diǎn)在于由于將藥物從天然環(huán)境中分離出來，降低了天然形成植物材料提供的復(fù)合潛能和協(xié)同生物活性。分離產(chǎn)物的研究也可以稱為通過分解敏感的生物／植物復(fù)合體制備的人工制品。一些行業(yè)專家認(rèn)為由這種協(xié)同活性提供的潛在優(yōu)勢，其價(jià)值超過了與特征不明確或臨床應(yīng)用不能控制的復(fù)合植物材料應(yīng)用有關(guān)的臨床風(fēng)險(xiǎn)。
雖然從植物材料中分離和純化單一成分成為藥物研究和發(fā)展的普遍方式，研究復(fù)合植物提取物，鑒定其藥物質(zhì)量仍然得到關(guān)注。一些復(fù)合植物藥材和提取物存在有效但相對不可預(yù)測的藥學(xué)特性。由于用未曾建立批次穩(wěn)定性和組成上差異較大的特征不明的藥材治療患者可能引起的固有風(fēng)險(xiǎn)，使這些藥材中的大多數(shù)不能應(yīng)用于臨床。因此，需要提供標(biāo)準(zhǔn)化上述復(fù)合植物材料的方法，以使它們可以更有效地用于臨床研究和治療患者。
2．1銀杏銀杏(白果)還被稱為銀杏樹，是其科(銀杏科)、目和裸子植物綱(ginkgoatae)僅存的一員。銀杏從中國的后冰期已存活了大約2億年。該單種落葉樹生長高度為35-40米。它具有覆蓋其與眾不同的的樹干和枝葉結(jié)構(gòu)的灰色樹皮。銀杏，僅從其種植可知，是世界范圍內(nèi)常見的耐污染觀賞植物。其種名“biloba(白果、二裂片)”來源于其二裂片、扇型的葉片。
銀杏樹的樹葉，如500年前中國植物藥所記載，已用于改善腦功能和治療支氣管炎及其它疾病(Foster，1991，銀杏，植物藥材系列304，美國植物藥材協(xié)會(huì)，Austin，Texas)。在韓國、法國、美國生長有商業(yè)規(guī)模的銀杏葉。對一種標(biāo)準(zhǔn)為含有大約24％類黃酮和6％萜烯內(nèi)酯(大約5050的雙萜銀杏苦內(nèi)酯和倍半萜烯白果內(nèi)酯)的濃縮、半純化的干葉提取物(EGb 761)，進(jìn)行了大量研究(DeFeudis，1991，銀杏提取物(EGb 761)藥理活性和臨床應(yīng)用，Elsevier，巴黎，法國)。其獨(dú)特的“籠狀”六環(huán)核結(jié)構(gòu)的銀杏苦內(nèi)酯以及它們的內(nèi)酯環(huán)和叔丁基，從化學(xué)和生物學(xué)觀點(diǎn)，引起了極大的興趣。
在歐洲銷售最好的植物藥中，德國Commision E已經(jīng)批準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)干燥提取物用于大腦機(jī)能不全病癥，外周動(dòng)脈阻塞性疾病，和眩暈與耳鳴。這些應(yīng)用和銀杏作為血小板激活因子特異性拮抗劑、抗真菌藥、抗氧化劑、和血管舒張藥(DeFeudis，1991，Id．)的體外作用相一致。傳統(tǒng)上，銀杏還被用于作為抗周期的抗生素、止血?jiǎng)?、利尿劑和滋補(bǔ)劑。
3．發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于測定銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏的方法。該方法包括PharmaPrintingTM的過程。本發(fā)明進(jìn)一步提供了應(yīng)用本文公開的任何一個(gè)方法測定的藥用級(jí)銀杏。本發(fā)明具體的實(shí)施方案包括，但不限于下面總結(jié)實(shí)施方案。
本發(fā)明提供了用于測定銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏的方法，該方法包括以下步驟將具有生物活性的銀杏材料(該銀杏材料包括若干成分)的有代表性部分分成若干標(biāo)記組分，其中至少一種標(biāo)記組分含有至少一種活性成分；測定至少一種標(biāo)記組分的生物活性，以提供有代表性部分的生物活性指紋；將有代表性部分的生物活性指紋與已建立的藥用級(jí)銀杏的生物活性指紋標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。
在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種標(biāo)記組分含有至少一種活性成分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括另外的步驟測定至少一種標(biāo)記組分中活性成分的量，以提供有代表性部分的定量組成指紋；將有代表性部分的定量組成指紋與已建立的藥用級(jí)銀杏的定量組成指紋標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法另外的步驟測定銀杏材料有代表性部分的總體生物活性；將有代表性部分的總體生物活性與總體生物活性標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。在另一個(gè)實(shí)施方案中，銀杏材料為醇提取物。在第5個(gè)實(shí)施方案中，銀杏材料為水或有機(jī)提取物。在第6個(gè)實(shí)施方案中，銀杏材料為超臨界二氧化碳提取物。在第7個(gè)實(shí)施方案中，銀杏材料為油。在第8個(gè)實(shí)施方案中，銀杏材料為粉末植物藥材。在第9個(gè)實(shí)施方案中，銀杏材料為均一材料。在第10個(gè)實(shí)施方案中，銀杏材料為植物藥材的混合物。在第11個(gè)實(shí)施方案中，至少一種活性成分為內(nèi)酯。在第12個(gè)實(shí)施方案中，內(nèi)酯為銀杏苦內(nèi)酯。在第13個(gè)實(shí)施方案中，銀杏苦內(nèi)酯為銀杏苦內(nèi)酯A。在第14個(gè)實(shí)施方案中，銀杏苦內(nèi)酯為銀杏苦內(nèi)酯B。在第15個(gè)實(shí)施方案中，銀杏苦內(nèi)酯為銀杏苦內(nèi)酯C。在第16個(gè)實(shí)施方案中，內(nèi)酯為白果內(nèi)酯。在第17個(gè)實(shí)施方案中，生物活性為用于治療或改善心血管疾病的指標(biāo)。在第18個(gè)實(shí)施方案中，生物活性為用于治療或改善心理疾病的指標(biāo)。
本發(fā)明還提供了用于測定銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏的方法，該方法包括以下步驟提供銀杏材料，該銀杏材料含有具有生物活性的多種成分，其中至少一種成分具有標(biāo)準(zhǔn)生物活性譜；將銀杏材料有代表性部分分成若干標(biāo)記組分，其中至少一種標(biāo)記組分含有至少一種活性成分；測定至少一種標(biāo)記組分中至少一種活性成分的量；基于至少一種活性成分的存在量以及標(biāo)準(zhǔn)生物活性譜計(jì)算至少一種標(biāo)記組分的生物活性，以提供有代表性部分的計(jì)算生物活性指紋；將有代表性部分的計(jì)算生物活性指紋與已建立的藥用級(jí)銀杏的生物活性指紋標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括另外的步驟測定銀杏材料有代表性部分的總體生物活性；將有代表性部分的總體生物活性與總體生物活性標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。在另一個(gè)實(shí)施方案中，銀杏材料為水或有機(jī)提取物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，銀杏材料為粉末植物藥材。在另一個(gè)實(shí)施方案中，銀杏材料為均一材料。在第5個(gè)實(shí)施方案中，銀杏材料為植物藥材的混合物。在第6個(gè)實(shí)施方案中，至少一種活性成分為內(nèi)酯。在第7個(gè)實(shí)施方案中，至少一種活性成分為銀杏苦內(nèi)酯。在第8個(gè)實(shí)施方案中，至少一種活性成分為白果內(nèi)酯。在第9個(gè)實(shí)施方案中，生物活性為用于治療或改善心血管疾病的指標(biāo)。在第10個(gè)實(shí)施方案中，生物活性為用于治療或改善心理疾病的指標(biāo)。在第11個(gè)實(shí)施方案中，至少一種標(biāo)記組分含有一組相關(guān)成分。
本發(fā)明還提供了用于測定銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏的方法，該方法包括提供具有生物活性的銀杏材料，該銀杏材料含有多種成分，將銀杏材料有代表性部分分成若干標(biāo)記組分，其中至少一種標(biāo)記組分含有至少一種活性成分；測定至少一種標(biāo)記組分的生物活性，以提供有代表性部分的生物活性指紋；將有代表性部分的生物活性指紋與已建立的藥用級(jí)銀杏的生物活性指紋標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種活性成分為內(nèi)酯。
本發(fā)明提供了用于測定銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏的方法，該方法包括測定銀杏材料有代表性部分的總體生物活性，應(yīng)用的生物檢測選自GABAA檢測，GABA苯并二氮卓中心檢測，白細(xì)胞三烯C4合成酶檢測，5-脂肪氧合酶檢測，單胺氧化酶A檢測；將有代表性部分的總體生物活性與總體生物活性標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。
本發(fā)明還提供了用于測定銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏的方法，包括將銀杏材料有代表性部分分成若干標(biāo)記組分，該銀杏材料含有多種成分，其中至少一種標(biāo)記組分含有至少一種活性成分；測定至少一種標(biāo)記組分中生物活性的量，以提供有代表性部分的定量組成指紋；將有代表性部分的定量組成指紋與已建立的藥用級(jí)銀杏的定量組成指紋標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。
本發(fā)明還提供了用于測定銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏的方法，該方法包括測定銀杏材料有代表性部分的總體生物活性；將有代表性部分的總體生物活性與總體生物活性標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。
本發(fā)明提供了應(yīng)用本文公開的任何一種方法測定的藥用級(jí)銀杏。本發(fā)明進(jìn)一步提供了應(yīng)用本文公開的任何一種方法測定的藥用級(jí)銀杏，其中至少一種標(biāo)記組分含有一組相關(guān)成分。本發(fā)明更進(jìn)一步提供了應(yīng)用本文公開的任何一種方法測定的藥用級(jí)銀杏，其中至少一種標(biāo)記組分含有至少兩種活性成分。
本發(fā)明提供了應(yīng)用本文公開的任何一種方法測定的藥用級(jí)銀杏，其中所述的多種成分含有至少一種選自下組的成分，包括穗花杉雙黃酮、漆樹酸、白果內(nèi)酯、γ-氨基丁酸、銀杏苦內(nèi)酯A、銀杏苦內(nèi)酯B、銀杏苦內(nèi)酯C、谷氨酸、谷氨酰胺、檜黃素、異鼠李黃素、4’，5，7-三羥黃酮醇、脯氨酸、和櫟精。本發(fā)明進(jìn)一步提供了應(yīng)用本文公開的任何一種方法測定的藥用級(jí)銀杏，其中至少一種標(biāo)記組分含有至少一種選自下組的活性成分，包括穗花杉雙黃酮、漆樹酸、白果內(nèi)酯、γ-氨基丁酸、銀杏苦內(nèi)酯A、銀杏苦內(nèi)酯B、銀杏苦內(nèi)酯C、谷氨酸、谷氨酰胺、檜黃素、異鼠李黃素、4’，5，7-三羥黃酮醇、脯氨酸、和櫟精。
本發(fā)明還提供了用于制備藥用級(jí)植物藥(例如，銀杏)的方法。本方法是PharmaPintingTM的過程。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括以下步驟提供含有多種具有給定生物活性成分的銀杏植物藥材；從該植物藥材中取出有代表性的部分；將該部分分成若干標(biāo)記組分，其中每個(gè)標(biāo)記組分含有至少一種活性成分；測定每個(gè)標(biāo)記組分中給定生物活性的等級(jí)，以提供該部分的生物活性指紋；將該部分的生物活性指紋與已建立的藥用級(jí)銀杏的生物活性指紋標(biāo)準(zhǔn)相比較，以提供生物活性指紋比值，根據(jù)生物活性指紋比值得以確定該植物藥材是否為藥用級(jí)銀杏。
本發(fā)明還提供了包括以下步驟的方法提供具有給定生物活性的銀杏植物藥材，所述的植物藥材含有多種成分；將植物藥材中有代表性部分分成若干標(biāo)記組分，其中至少一種標(biāo)記組分含有至少一種活性成分；測定每種標(biāo)記組分中給定生物活性的等級(jí)，以提供有代表性部分的生物活性指紋；將有代表性部分的生物活性指紋與已建立的藥用級(jí)銀杏的生物活性指紋標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該植物藥材是否為藥用級(jí)銀杏。
在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或更多的標(biāo)記組分含有一種活性成分。
該方法還可以包括另外的步驟測定每個(gè)標(biāo)記組分中活性成分的量；以提供該部分的定量組成指紋；將定量組成和生物活性指紋與定量組成和生物活性指紋標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該植物藥材是否為藥用級(jí)銀杏。該方法還可以包括另外的步驟測定植物藥材該部分的總體生物活性；將該部分的總體生物活性與已建立的藥用級(jí)銀杏標(biāo)準(zhǔn)的總體生物活性相比較。
本發(fā)明還提供了用于制備藥用級(jí)銀杏的方法，該方法包括以下步驟提供含有多種具有給定生物活性成分的銀杏植物藥材，其中每個(gè)活性成分具有標(biāo)準(zhǔn)生物活性譜；從該植物藥材中取出有代表性的部分；將該部分分成若干標(biāo)記組分，其中每個(gè)標(biāo)記組分含有至少一種活性成分；測定每個(gè)標(biāo)記組分中每個(gè)活性成分的存在量；基于每個(gè)活性成分的存在量以及標(biāo)準(zhǔn)生物活性譜計(jì)算每個(gè)標(biāo)記組分的生物活性，以提供該部分的計(jì)算生物活性指紋；將該部分的計(jì)算生物活性指紋與已建立的藥用級(jí)銀杏的生物活性指紋標(biāo)準(zhǔn)相比較，以提供生物活性指紋比值，根據(jù)生物活性指紋比值確定該植物藥材是否為藥用級(jí)銀杏。
本發(fā)明的方法可用于從具有給定或所需生物活性的適當(dāng)植物藥材，制備藥用級(jí)植物藥材，例如，銀杏。植物藥材優(yōu)選由植物材料提取到的提取物，例如水提物或有機(jī)提取物，如醇提物，或超臨界二氧化碳提取物，或可以進(jìn)行進(jìn)一步加工的有機(jī)溶劑提取物?；蛘撸参锼幉氖侵参锊牧戏勰?、種子油、香精油、或水蒸汽蒸餾產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物藥材是單一物理狀態(tài)的均勻材料，例如油或溶液。植物藥材可以是單獨(dú)地來源于目的植物的純化材料。
在本發(fā)明中，活性成分可以包括但不限于一種或多種下列化學(xué)種類多聚乙酰、生物堿、白果內(nèi)酯、碳水化合物、類胡羅卜素、肉桂酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸酯、類黃酮、銀杏苦內(nèi)酯、糖甙、異戊二烯類、內(nèi)酯、脂類、大環(huán)抗生素、核酸、青霉素、多肽、酚類、聚乙炔、多聚乙酰、多酚、多糖、蛋白質(zhì)、前列腺素、甾類和萜類。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備藥用級(jí)銀杏的方法，其中一種或更多標(biāo)記組分含有至少兩種活性成分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備藥用級(jí)銀杏的方法，其中至少一種標(biāo)記組分含有至少一種選自下組的成分，包括穗花杉雙黃酮、漆樹酸、白果內(nèi)酯、γ-氨基丁酸、銀杏苦內(nèi)酯A、銀杏苦內(nèi)酯B、銀杏苦內(nèi)酯C、谷氨酸、谷氨酰胺、檜黃素、異鼠李黃素、4’，5，7-三羥黃酮醇、脯氨酸、和櫟精。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備藥用級(jí)銀杏的方法，其中至少一種活性成分選自穗花杉雙黃酮、漆樹酸、白果內(nèi)酯、γ-氨基丁酸、銀杏苦內(nèi)酯A、銀杏苦內(nèi)酯B、銀杏苦內(nèi)酯C、谷氨酸、谷氨酰胺、檜黃素、異鼠李黃素、4’，5，7-三羥黃酮醇、脯氨酸、和櫟精。
銀杏的生物活性／臨床適應(yīng)癥與人或其它動(dòng)物的疾病、功能失調(diào)或病癥有關(guān)。因此該方法可用于制備用于治療和／或改善和／或預(yù)防人和／或獸類疾病、功能紊亂或病癥的藥用級(jí)銀杏。適應(yīng)癥的例子包括但不限于中樞和外周血管疾病的治療，包括腦血管疾病和靜脈疾病。銀杏給藥的主要適應(yīng)癥是增加血流，特別是腦血流。銀杏還具有減少視網(wǎng)膜水腫，視網(wǎng)膜中細(xì)胞損傷，增加FontaineII期外周動(dòng)脈閉塞疾病的無疼痛行走距離(間歇的跛行)的適應(yīng)癥。適應(yīng)癥還有源于血管和退化的眩暈和耳鳴。
在這些方法中，所述部分可以分成生物活性成分和非生物活性成分。而且，標(biāo)記組分可以含有一組相關(guān)成分。
本發(fā)明還提供了制備藥用級(jí)植物藥材(例如，銀杏)的PharmaPrint_的方法。并且本發(fā)明提供了通過本文描述的方法制備的藥用級(jí)植物藥材，例如銀杏。
本發(fā)明還提供了如上所描述的用于制備藥用級(jí)銀杏的方法，其中活性成分選自類黃酮、銀杏苦內(nèi)酯、配醣、內(nèi)酯、脂類、和類萜烯。本發(fā)明進(jìn)一步提供了如上所描述的用于制備藥用級(jí)銀杏的方法，其中活性成分為黃酮糖甙的類黃酮。本發(fā)明還提供了如上所描述的用于制備藥用級(jí)銀杏的方法，其中活性成分為萜烯內(nèi)酯的類萜烯。另外，本發(fā)明提供了如上所描述的用于制備藥用級(jí)銀杏的方法，其中活性成分為白果內(nèi)酯。
在一個(gè)替換實(shí)施方案中，銀杏可以與一種或更多選自下述的植物藥材組合V．a(chǎn)gnus-castus、蘆薈、紫云英、越桔、黑總狀升麻(black cohosh)牛蒡、甘菊、栗子、coriolus versicolor、茅草、crampbark、蒲公英根、dong quai、echinacea、土木香、月見草、小米草、false unicorm root、小白菊、大蒜、姜、人參(亞洲或西伯利亞變種)、goldenseal、gota kola、葡萄子提取物、綠茶、guggulipid、山楂、蛇麻子、常春藤、kava、甘草、水飛雉、槲寄生(美洲、亞洲和歐洲變種)、益母草、燕麥、osha、粉色西番蓮、南瓜、pygeum、紅三葉草、迷迭香、撒爾沙植物、sawpalmetto、黃芩、St．John＇s wort、小蕁麻、纈草、wild indigo、wils yam、和yerba mansa。本發(fā)明的制備藥物的方法包括PharmaPrintingTM銀杏加一種或更多上面所列植物的方法，以及含銀杏和一種或多種上面所列植物的藥用級(jí)藥物。在該實(shí)施方案的一個(gè)方式中，銀杏可以與gota kola和／或黃芩組合。以舉例說明的方式而不是限制的方式，藥用級(jí)銀杏可以與藥用級(jí)植物藥材組合，例如echinacea、纈草和／或black cohosh。參見1997年10月23日申請的，發(fā)明名稱為“藥用級(jí)echinacea”，美國申請?zhí)枮?8／956603(代理人檔案號(hào)為9117-015)的美國專利申請(其全文作為參考插入本文)；還參見1997年10月23日申請的，發(fā)明名稱為“藥用級(jí)纈草”，美國申請?zhí)枮?8／956615(代理人檔案號(hào)9117-016)的美國專利申請(其全文作為參考插入本文)；還參見1997年10月23日申請的，發(fā)明名稱為“藥用級(jí)black cohosh”，美國申請?zhí)枮?8／956611(代理人檔案號(hào)為9117-018)的美國專利申請(其全文作為參考插入本文)。
3．1定義術(shù)語“藥用級(jí)”，在本說明書中應(yīng)用的含義是，植物藥中的某些給定生物活性成分和／或非生物活性成分必需在明確規(guī)定的絕對和／或相對濃度范圍內(nèi)，和／或這些成分經(jīng)疾病、失調(diào)或病癥特異性生物活性檢測測定必須表現(xiàn)一定活性水平。所述疾病、失調(diào)或病癥可以是人或動(dòng)物患有的。
就象本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，術(shù)語“藥用級(jí)”不意味著暗示該植物藥只適用于受控制的產(chǎn)品，例如處方列出的藥，即“處方藥”，或柜臺(tái)提供的藥，即“非處方藥”。該術(shù)語同樣適用于處方列出的藥物、非處方藥、或者作為飲食添加的成分，即“食品添加劑”。
本文提到的“成分”指分開的化合物(即化學(xué)物質(zhì))，其天然存在于植物藥中，或者加入植物藥，從而制備具有規(guī)定生物活性范圍和／或組成范圍的成分的藥用級(jí)植物藥。
本文提到的“活性成分”指一種或多種成分，其在疾病特異性生物檢測中得到的各個(gè)成分活性總和，它占該植物藥材觀察到的生物活性的實(shí)質(zhì)性部分。優(yōu)選活性成分的活性總和占觀察到的生物活性的大部分或超過50％。
本文提到的“組分”一般指具有規(guī)定參數(shù)例如溶解度、分子量范圍、極性范圍、吸附系數(shù)、結(jié)合特性、化學(xué)反應(yīng)性、或選擇性溶解度的一組成分或一類結(jié)構(gòu)類似的成分。組分更經(jīng)常為選擇性溶劑溶解技術(shù)和分離技術(shù)(即液-液萃取)的產(chǎn)物，包括pH依賴性分離、色譜分離技術(shù)即閃光色譜、制備型高效液相色譜(HPLC)、制備型氣相色譜、分配色譜、制備型薄層色譜、親合色譜、尺寸排阻色譜、液-液色譜例如逆流色譜或向心色譜或離心色譜。
通過參考對本發(fā)明的詳細(xì)描述和具體實(shí)施方案的例子以及附圖可以更充分地理解本發(fā)明。
4．附圖簡述

圖1是按照本發(fā)明用于建立標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)和／或生物活性指紋的程序的示意圖，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋用于在制備藥用級(jí)藥物過程中，將隨后處理的植物藥材與之相比較。
圖2是按照本發(fā)明用于將植物藥材加工成為藥用級(jí)藥物的程序的示意圖。
圖3是分離不同類生物活性組分的程序的示意圖。
圖4顯示了六種商業(yè)可購買的銀杏產(chǎn)品的化學(xué)分析，顯示了每個(gè)產(chǎn)品中萜烯內(nèi)酯和黃酮糖甙的相對濃度。
5．發(fā)明詳述5．1 PharmaPrintingTM法本發(fā)明提供了制備可以被分類為藥用級(jí)植物藥的方法。該方法被命名為PharmaPrintingTM。用本發(fā)明方法生產(chǎn)的藥用級(jí)植物藥尤其適合應(yīng)用于臨床研究，更重要是用于治療患者。該方法確保特定方案中應(yīng)用的藥物質(zhì)量穩(wěn)定，始終適于用作人和獸類預(yù)防或治療劑。
本發(fā)明提供了密切控制植物提取物和其它植物藥材(例如銀杏植物藥材)的質(zhì)量、劑量和臨床效果的可能。本發(fā)明的一方面涉及為各種植物藥材建立化學(xué)和／或生物活性指紋標(biāo)準(zhǔn)。一旦該標(biāo)準(zhǔn)建立后，其被用于藥物生產(chǎn)程序，以確保植物材料符合藥用級(jí)要求。本發(fā)明進(jìn)一步提供了為多種植物藥材建立的具體定量指紋和生物指紋。這些指紋用于確定是否具體植物藥材符合特定治療方案中藥物活性要求和藥物組成要求的水平。該確定對于保證用植物藥材進(jìn)行的臨床研究和患者治療是基于一致的和可證明的提取組合物參數(shù)是重要的。
本發(fā)明可用于提供充分表征，批次間組成一致的植物藥材，以便可以精確地確定它們的給藥劑量，并有效地應(yīng)用于臨床。本文所述的方法提供了臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重現(xiàn)的保證。
首先，得到目的植物藥材的樣品。一些植物藥材可以原料的形式或以加工過的提取物的形式通過商業(yè)途徑獲得。通常它們是植物提取物或其它的意欲被用作藥物的組合物。加工后的藥材可以包括表現(xiàn)給定生物活性的多種活性成分和不直接表現(xiàn)相關(guān)生物活性的多種非活性成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，從植物藥材中取出一部分，將其用于質(zhì)量保證程序或標(biāo)準(zhǔn)化程序。優(yōu)選該部分為均勻植物藥材的代表性部分。該程序涉及將植物藥材部分分成若干標(biāo)記組分，其中每種標(biāo)記組分包括至少一種活性成分或者有時(shí)含有一種非活性成分。確定各標(biāo)記組分中的活性成分或非活性成分的量，以便提供該部分的定量指紋。同時(shí)確定各標(biāo)記組分的生物活性的程度，以提供該部分的生物活性指紋。然后將該部分的化學(xué)和／或生物活性指紋與已建立的藥用級(jí)藥物相應(yīng)指紋相比較。如果該植物的指紋與標(biāo)準(zhǔn)指紋相當(dāng)，那么該植物被鑒定為藥用級(jí)植物藥。如果不能，那么可以改良該植物藥材以便使其與標(biāo)準(zhǔn)指紋相當(dāng)，或者不使用該植物藥材。
5．1．1形成PharmaPrint_的方法當(dāng)一些藥材的推定活性成分已知，則其PharmaPrint_方法的形成始于文獻(xiàn)綜述。這涉及綜述化學(xué)文獻(xiàn)、生物學(xué)文獻(xiàn)、已出版的藥材的生物檢測方法和臨床數(shù)據(jù)。尤其有用的信息資源是由Norman Farnswroth博士為伊利諾斯州大學(xué)(Chicago)藥學(xué)合作研究負(fù)責(zé)程序管理的NAPRALERT計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫；Leung和Foster，食品、藥品和化妝品中應(yīng)用的常見天然成分大全(Encyclopedia of Common Natural IngredientsUsed in Food，Drug and Cosmetics)，第二次編輯，John Wiley&SonsNew York，NY，1996；草藥和植物藥(Herbal Drugs andPhytopharmaceuticals)，N．G．Bisset編，CRC出版社Boca Raton，F(xiàn)L，1994；Duke，生物活性植物藥及其活性手冊(Handbook of Biologically ActivePhytochemicals and Their Activities)，CRC出版社Boca Raton，F(xiàn)L，1992；Tyler和Foster＂草藥和植物藥產(chǎn)品(Herbs and Phytomedicinal Products)＂，非處方藥手冊(Handbook of Nonprescription Drugs)，Berardi等編，UnitedBook Press，Inc．Washington，DC，1996。對于一種特定適應(yīng)癥，必須研究文獻(xiàn)確定推定的活性成分確實(shí)與那種疾病狀況有關(guān)。另外，如果公開了推定活性成分和適應(yīng)癥的任何生物檢測法，生物檢測必須與適應(yīng)癥和推定活性成分一致。適當(dāng)?shù)纳餀z測應(yīng)與臨床相關(guān)端點(diǎn)結(jié)合。生物檢測應(yīng)在一段較寬的濃度范圍內(nèi)定量。通常，制作IC50曲線(半數(shù)抑制濃度)、EC50(半數(shù)有效濃度)、或者適當(dāng)?shù)腒i或Kd(酶離解常數(shù)和其抑制物的離解常數(shù))曲線。然后對植物藥材的推定活性成分和色譜組分進(jìn)行徹底的化學(xué)和生物學(xué)分析。分析結(jié)果，以確定樣品中各化學(xué)成分的生物活性定量分析。然后，將樣品的生物活性作為一個(gè)整體與單獨(dú)成分的生物活性比較。在這一點(diǎn)上，個(gè)體化學(xué)成分可以與臨床相關(guān)端點(diǎn)相關(guān)。同樣的方法可以應(yīng)用于測定刺激或抑制效果的生物檢測。
基于個(gè)體成分的活性和已知的總活性，如果混合這些成分，它們應(yīng)當(dāng)占生物活性的基本部分。通常，混合活性至少占總活性的25％。
優(yōu)選個(gè)體活性成分的活性總和占觀察生物活性的大多數(shù)或超過50％。更優(yōu)選，分離的個(gè)體成分代表超過70％的活性。更優(yōu)選分離的個(gè)體成分代表超過80％的生物活性。
另一個(gè)考慮是盡可能選擇較少的活性成分作為PharmaPrint_的部分。較少的活性成分對于在原料的接受和加工方面的實(shí)際考慮是重要的。本發(fā)明建立了有關(guān)化學(xué)成分和生物活性之間的相關(guān)性。一旦滿意的相關(guān)性建立后，就可以不必對每個(gè)樣品的生物指紋進(jìn)行操作。目的植物藥材各樣品的適當(dāng)成分和／或標(biāo)記組分的化學(xué)分析足以代表大多數(shù)生物活性，然后確定某種給定植物藥材樣品為藥用級(jí)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可以涉及下列程序之一。一個(gè)程序(如圖1所示)涉及為一種特定的藥用級(jí)植物藥建立組成和生物活性指紋標(biāo)準(zhǔn)。指紋標(biāo)準(zhǔn)建立后，可以如圖2所示將植物藥材實(shí)際加工成藥用級(jí)藥物。
為特定植物藥材建立化學(xué)和／或生物活性指紋的開始步驟涉及將提取物或粉末分成一組或多組(如圖1步驟1所示)?；谶@些組作為指紋標(biāo)記(可以含有或不含有活性成分)的潛力分離并鑒定這些組，所述指紋是為加工的植物藥材而建立。經(jīng)選擇和鑒定作為潛在標(biāo)記的推定成分或推定成分組根據(jù)被加工的植物藥材和藥物用途變化較大。每種植物藥材至少應(yīng)當(dāng)選擇兩種推定標(biāo)記。潛在標(biāo)記的數(shù)目可以超過五個(gè)，對于復(fù)雜的植物藥材提取物或粉末可以多達(dá)15-20或者更多。潛在標(biāo)記的鑒定和選擇大部分基于它們的潛在生物活性或?qū)μ囟ㄋ幬飸?yīng)用的生物活性的貢獻(xiàn)。對于不同的適應(yīng)癥，可以用不同的提取方法對同樣的植物藥材制備提取物，以便優(yōu)化特定的生物活性組成。自身無明顯生物活性的標(biāo)記可以被分離，可以被包括作為指紋中應(yīng)用的標(biāo)記。當(dāng)這些標(biāo)記的存在能夠指示提供觀察到的植物藥整體生物活性的基本部分的其它活性成分的存在時(shí)，這些“代理”標(biāo)記可以作為理想的內(nèi)標(biāo)。它們還有助于確定藥物的正確植物學(xué)名稱(即chemotoxonomy)。
將植物藥材分成各種推定標(biāo)記組的最初分離步驟可以通過簡單的萃取和分配到復(fù)雜的親和色譜技術(shù)等常規(guī)分離技術(shù)實(shí)現(xiàn)，包括凝膠過濾色譜、發(fā)光硅膠色譜和反相色譜。一旦鑒定到特定植物藥材的推定標(biāo)記后，則如圖1步驟2所述測定各標(biāo)記的生物活性。用于測定植物藥材生物活性的特定生物檢測法基于植物藥材的預(yù)期用途進(jìn)行選擇。優(yōu)選生物檢測將能夠反映推定標(biāo)記的關(guān)于用植物藥材治療的疾病或適應(yīng)癥的生物活性。
步驟2中得到的生物檢測結(jié)果被用于鑒定具有所需生物活性的成分(步驟3)和較少活性或基本上無活性的成分(步驟4)。然后定量分析步驟3和4中鑒定的各組，確定各組中存在的各鑒定組分的量。然后如圖1步驟5所述用生物檢測和定量組成分析的結(jié)果制作植物藥材的生物檢測指紋和／或化學(xué)指紋。確定生物活性和／或化學(xué)組成的可接受范圍，作為建立植物藥材指紋的一部分。此步操作主要基于建立各標(biāo)記的生物活性和定量的可接受范圍，這能夠提供加工材料所需的整體藥理活性。
另外，可以評(píng)價(jià)活性和非活性標(biāo)記的各種組合，以確定由活性和非活性成分組合導(dǎo)致的所需生物活性的潛在增加。
步驟5建立的生物檢測和定量指紋可以準(zhǔn)確鑒定植物藥材，這可以用于建立臨床應(yīng)用所需的劑量療法和治療方案。利用任何新藥研究中通常應(yīng)用的常規(guī)臨床方法建立劑量療程和治療方案。用于確定劑量和治療方案的加工材料必須與步驟5建立的指紋的要求匹配或相符。該方法能夠確保劑量和治療方案有效并可重復(fù)，因?yàn)橛糜谘芯縿┝亢头桨傅募庸げ牧隙季哂型瑯拥谋景l(fā)明的指紋。
通過如圖1所示的一般程序確定的生物檢測和定量指紋作為制備藥用級(jí)植物藥的部分生產(chǎn)程序。該指紋被作為定性確認(rèn)或標(biāo)準(zhǔn)化程序的一部分，以確保特定植物藥材含有適當(dāng)?shù)幕衔?，可以被正確加工，以提供與已經(jīng)被標(biāo)準(zhǔn)化并按照如圖1所示的程序測試的材料發(fā)揮相同臨床作用的植物藥。
制備本發(fā)明的藥用級(jí)植物藥的實(shí)例程序如圖2所示。首先通過萃取、粉末化或其它生產(chǎn)方法加工目的植物藥材21，以制備加工的植物材料22。然后分析加工材料22的樣品，確定其是否與圖1標(biāo)準(zhǔn)化程序中建立的指紋要求相匹配。該定性確認(rèn)或標(biāo)準(zhǔn)化程序如圖2步驟23所示。如果加工材料符合前面建立的特定材料的指紋要求，則其如步驟24所示可以被認(rèn)為是藥用級(jí)的。如果該材料接近但不十分符合標(biāo)準(zhǔn)指紋，則按照需要對其改進(jìn)，以符合指紋標(biāo)準(zhǔn)(步驟25)。使加工材料符合指紋標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)可以通過很多方法進(jìn)行。進(jìn)一步加工植物藥材的方法可以包括對植物藥材的進(jìn)一步萃取、選擇性萃取、選擇性加工、批次重組(例如，將高劑量和低劑量的批次混合，以制備藥用級(jí)藥材)或者按照需要添加各種化合物。如果植物藥材基本上落在生物活性標(biāo)記和定量標(biāo)記的指紋范圍之外，則拋棄該批次(步驟26)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于確定特定植物藥材是否屬于藥用級(jí)的定性確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)化步驟23包括取得均勻樣品，優(yōu)選均一樣品，或者待測植物藥材的一部分。樣品應(yīng)當(dāng)包括活性成分，其為藥材提供觀察生物活性并產(chǎn)生前面確定的標(biāo)準(zhǔn)品的生物活性和／或化學(xué)指紋。樣品還將包括一種或多種非活性成分。非活性成分是那些不具有直接可測量的生物活性的成分。非活性成分包括下列種類活性非常低以至于不能占活性的基本部分的成分；其存在表明其它活性成分的存在，可以作為其它成分的代理標(biāo)記的成分；在相關(guān)檢測中不表現(xiàn)化學(xué)或生物學(xué)活性的非活性成分。優(yōu)選樣品僅是待測植物藥材的一小部分。因此，取得代表藥材全部批次的均勻樣品優(yōu)選均一樣品是重要的。
圖3顯示了一個(gè)更詳細(xì)的方案，表明存在于植物藥材水提取物中的不同成分的最初分離步驟。隨后采用萃取和沉淀分離水或有機(jī)相中的活性成分。圖3的方案尤其很好地適用于從植物藥材例如槲寄生中分離水溶性活性成分類型。
圖3顯示了一個(gè)分離植物主要化學(xué)成分類型的實(shí)例性通用方法。主要應(yīng)當(dāng)使用新鮮植物(包括葉、根、花、漿果和莖)，雖然也可以使用干藥材。如果需要可以使用植物的特殊部分，例如葉、花、莖或根。
在該方法中，可以在液氮溫度下冷凍植物的特殊部分或整體植物。這有助于粉碎，并保證活性成分的完整性和效力。
用蒸餾水反復(fù)提取磨碎的粉末。如果需要，用熱水、乙醇、其它有機(jī)溶劑、水醇溶液、稀釋乙酸或它們的任意組合進(jìn)行提取。選擇的實(shí)際溫度優(yōu)選接近或?yàn)樗姆序v溫度。優(yōu)選首先確定提取物的總生物活性?；旌系奶崛∥镉糜谶M(jìn)行特定生物檢測，例如，如果藥物被用作抗菌藥，則在有蓋培養(yǎng)皿中進(jìn)行抑制細(xì)菌生長的試驗(yàn)?；蛘?，如果藥物預(yù)期用作抗癌藥，則優(yōu)選進(jìn)行抑制癌細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)的試驗(yàn)。從這些數(shù)據(jù)計(jì)算每毫升提取物中含有的生物活性單位(生物活性單位被定義為在試驗(yàn)系統(tǒng)中該提取物抑制50％的細(xì)菌或癌細(xì)胞生長的稀釋倍數(shù))。可以用于計(jì)算刺激效果例如免疫激活等的類似生物活性單位。
為了建立本發(fā)明的藥物指紋(PharmaPrint_)，按照圖3所示的程序提取植物，將其分為主要成分(例如皂甙、萜類、脂類、生物堿、核酸、蛋白質(zhì)和碳水化合物)。各成分的分離組分按照需要測試生物活性。這可以指活性(例如槲寄生群的蛋白質(zhì)和生物堿組分)。進(jìn)一步用親和色譜、高效液相色譜、氣相色譜或其它色譜將活性成分組分成個(gè)體成分。以重量和特定生物活性單位為基礎(chǔ)量化提供主要生物活性的成分。這些成分能夠?yàn)樽畛醯牟菟幪崛∥锾峁┙⑺幬镆蟮闹讣y。每毫升藥用級(jí)提取物的生物活性單位為臨床研究提供了建立準(zhǔn)確劑量的方式。
一旦樣品分離成個(gè)體標(biāo)記組分，其中至少一種標(biāo)記組分含有至少一種活性成分，對每個(gè)組分進(jìn)行分析，以測定其活性成分的量，并提供樣品的定量指紋。每個(gè)成分的定量可以通過應(yīng)用任何已知的定量分析方法獲得。示范性的定量方法包括重量分析、光譜分析或應(yīng)用定量檢測器，如使用氣相色譜或高效液相色譜和其它分離系統(tǒng)。其它適合的定量方法包括通過酶、放射性、比色、元素分析分光光度法、熒光或磷光和抗體檢測(如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)或放射性免疫測定(RIA))進(jìn)行分析。
在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)組分定量分析的結(jié)果用于制備樣品的定量指紋。指紋由成分在每個(gè)標(biāo)記組分中的量和該成分的身份組成。然后將該定量指紋和已建立的已知標(biāo)準(zhǔn)指紋相比較(圖1)，以確定該材料是否為藥用級(jí)。如果樣品的定量指紋落在藥用級(jí)指紋要求的定量范圍內(nèi)，該材料可以被鑒定為達(dá)到藥用級(jí)。
作為進(jìn)一步的質(zhì)量保證分析，對個(gè)體標(biāo)記組分可以進(jìn)行生物學(xué)檢測。用于不同組分檢測的生物學(xué)檢測和用于標(biāo)準(zhǔn)指紋的相同，也依賴于該材料特定的臨床應(yīng)用傾向。
從該材料獲得的生物活性和已建立的標(biāo)準(zhǔn)生物活性進(jìn)行比較，以確定該材料是否為藥用級(jí)。如果樣品的生物活性指紋落在藥用級(jí)指紋要求的生物活性范圍內(nèi)，該材料可以被鑒定和證明為達(dá)到藥用級(jí)。
5．1．2．可選的形成PharmaPrint_的方法當(dāng)推定的植物藥材活性成分未知時(shí)，其形成PharmaPrint_的方法也始于文獻(xiàn)綜述。這涉及綜述該植物藥材，或相關(guān)植物藥材，或由相關(guān)活性的植物藥材可獲得的任何化學(xué)文獻(xiàn)、生物學(xué)文獻(xiàn)、已出版的生物檢測方法和臨床數(shù)據(jù)。根據(jù)疾病狀況，選擇一系列相關(guān)的生物檢測法。應(yīng)用生物檢測法分析樣品或提取物的總體活性。然后將該顯示活性的生物檢測法用于推定的活性成分未知的植物藥材的組分分析。這種分離是根據(jù)通常的方法進(jìn)行的，例如，通過介電常數(shù)、生物親合性、極性、大小、溶解度或吸附粉末分離。然后分析組分，以確定哪一個(gè)組分有活性。假定發(fā)現(xiàn)活性，再分餾每個(gè)活性組分，以分離單個(gè)的推定的活性成分，即，化學(xué)成分單一的化合物。根據(jù)已知的單體化學(xué)化合物和它們定量的生物活性，可以繪出定量效能曲線，并可以測定出每個(gè)單體化學(xué)化合物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。如果推定活性成分是激動(dòng)劑，可能需要其它的參數(shù)(結(jié)合、活化、應(yīng)答)。在通常情況下，生物檢測由以下組成對成分、組分或整個(gè)提取物的刺激或抑制作用的進(jìn)行適當(dāng)檢測，然后對這些影響進(jìn)行適當(dāng)定量評(píng)價(jià)。對于最可能的(或典型的)檢測(其中標(biāo)準(zhǔn)(或放射標(biāo)記的)激動(dòng)劑或拮抗劑產(chǎn)生可以測定的作用)，可以對該材料的抑制和／或刺激進(jìn)行評(píng)價(jià)，并典型地通過IC50、EC50等或其它適當(dāng)?shù)膮?shù)(Ki、Kd、Km等)進(jìn)行表示。然后將單個(gè)推定活性成分的活性相加，和未分餾的植物藥材樣品進(jìn)行比較。如果這些成分是主要活性成分，那么它就具有植物藥材(其中活性成分未知)“活性成分”的一個(gè)最初指紋。
5．1．3．形成PharmaPrint_方法的其它改變?nèi)绻跈z測過程中出現(xiàn)復(fù)雜情況，從上述假定活性成分未知的植物藥材PharmaPrint_概括的普通方法具有幾種改變。一種改變發(fā)生在個(gè)體成分的活性總和不占植物藥材生物活性的主要部分的情況。在這一點(diǎn)，有幾種減少個(gè)體成分活性的可能原因，第一，活性成分的分解或降解，或，第二，協(xié)同作用。另一種可能的情況，從任何組分都沒有發(fā)現(xiàn)明顯的或大量減少的活性，但是植物藥材或提取物在生物檢測中顯示出活性。和標(biāo)準(zhǔn)相比，非特異性基質(zhì)作用也可能減少總體提取物的活性。
如果活性成分在分析過程中分解，測定相對簡單。僅是組分再結(jié)合時(shí)，再結(jié)合組分的活性和原材料的活性進(jìn)行比較。如果活性損失較大，那么問題可能在于分解。為了確定哪一個(gè)活性成分分解，將植物藥材原藥的色譜分析和再結(jié)合組分進(jìn)行對比。峰消失或峰面積減小表明該成分可能分解。為了克服許多方法存在的分解，典型地，可以使用溫和的提取／分餾方法，如液-液色譜(反相流動(dòng)色譜)或超臨界二氧化碳提取或色譜。
對于個(gè)體組分的活性不占植物藥材生物活性總和的主要部分的另一個(gè)解釋，是一個(gè)或更多活性成分之間或和非活性成分之間的協(xié)同作用。為了確定協(xié)同作用的發(fā)生，需要對成對的(pair-wise)再結(jié)合組分進(jìn)行分析。如果結(jié)合成分比個(gè)體組分顯示更高的活性，組分中兩個(gè)或更多的個(gè)體成分可以產(chǎn)生協(xié)同。例如，一個(gè)藥材可能含有3個(gè)組分，每一個(gè)單獨(dú)具有10％的活性(即，它們未結(jié)合的生物活性總和為30％)，但是結(jié)合后具有100％的活性。在這種情況下，組分間協(xié)同作用。通過重復(fù)對組分成對(pair-wise)再結(jié)合或觀察更大的組分，任何協(xié)同活性都會(huì)發(fā)現(xiàn)。一旦兩個(gè)組分表現(xiàn)出協(xié)同，像上面那樣進(jìn)行再分餾，研究成對的個(gè)體組分或成對的分離成分，以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生協(xié)同的個(gè)體成分。也可以研究個(gè)體成分或組分三種方式的比較。
為什么當(dāng)植物藥材顯示出活性，而組分在生物檢測中無活性 這里，解釋包括分解、協(xié)同、或許多活性成分而沒有個(gè)體組分顯示活性。第一步是分餾每一個(gè)最初的組分，看生物檢測中是否有活性成分。如果沒有，組分應(yīng)該再結(jié)合，分析確定是否有活性的分解發(fā)生。如果發(fā)生分解，應(yīng)該按照上面所述進(jìn)行適當(dāng)?shù)臏y定。如果沒有分解，應(yīng)該嘗試可選的分餾方法。最終，足夠大量或適當(dāng)大小或選擇的組分顯示出活性。如果懷疑協(xié)同，按照上面描述的協(xié)同部分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
5．2．加工和提取植物藥材材料的方法植物藥材(例如銀杏)可以加工形成整個(gè)植物或植物的選擇部位的水或有機(jī)提取物。整個(gè)植物或部分的植物藥材還可以加工形成粉末。許多感興趣的植物藥材商業(yè)可以購買到粉末、水提取物、有機(jī)提取物或油。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選植物材料提取物，因?yàn)樗鼈円子谌芙庠谝后w藥物載體中。但是，粉末植物材料非常適合許多以固體劑型(例如片劑或膠囊)給藥的應(yīng)用。這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。并且，許多植物材料和／或提取物可以商業(yè)購買。作為植物藥材的加工和提取實(shí)例，下文提供了實(shí)施例。另外對提供的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)的描述。
對于有代表性的根部，可以切片、冷凍或研磨成粉末。如果是粉末狀的，用適當(dāng)?shù)娜軇┱駬u，過濾(Tanabe等，1991，Shoyakugaku Zassi，45(4)316-320)。或者，可以采用以下方法使根均質(zhì)化，丙酮提取過濾；可以對植物藥材進(jìn)行蒸汽蒸餾，以獲得必要的油，餾出液溶解于丙酮-水或適當(dāng)?shù)娜芤海换蛘咔衅母o冷凍和／或冷凍干燥，得到的粉末用丙酮-水提取(Tanabe等，1991，Shoyakugaku Zassi，45(4)321-326)。另一個(gè)加工植物藥材的方法是用100℃水溶液提取(Yamahara等，1985，J．Ethnopharmacology 13217-225)。從上述方法提取的最初溶液，可以用適當(dāng)?shù)娜軇?yīng)用液／液提取進(jìn)一步提取。植物藥材可以分別使用極性或非極性溶劑進(jìn)行兩步提取。然后蒸發(fā)溶劑，合并組分(Nagabhusan等，1987，Cancer Let．36221-233)。植物藥材還可以加工成可以蒸煮的糊狀物或粉末(Zhang等，1994，食品科學(xué)雜志(J．Of FoodScience)59(6)1338-1343)。
提取干燥的植物藥材可以使用許多溶劑，例如丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、己烷、異丙醇、甲醇、其它的醇、和超臨界二氧化碳(Sipro等，1990，國際食品科學(xué)和技術(shù)雜志(Int．J．Of FoodScience and Technology)，25566-575，和其中的參考文獻(xiàn))。
對于其它的植物藥材如saw palmetto，醫(yī)藥產(chǎn)品為種子油或漿果。再一個(gè)有代表性的制備中，制備采用己烷或超臨界二氧化碳提取。許多saw palmetto制劑可以商業(yè)購買，例如PermixonTM或TalsoTM。對于臨界二氧化碳提取植物藥材的一個(gè)實(shí)例，參見Indena，歐洲專利No．0 250953 B1?；蛘撸梢詫⒅参锼幉哪胨?，在索氏萃取器中用適當(dāng)?shù)娜軇?90％)提取(Elghamry等，1969，Experientia 25(8)828-829)。還可以用乙醇提取植物藥材(Weisser等，1996，前列腺(The Prostate)，28300-306)。
可以用多種方法制備干燥材料，包括冷凍干燥、微波干燥、液氮冷卻和研磨成粉末70℃真空干燥10小時(shí)；或陰涼處空氣干燥，或熱空氣干燥(List和Schmidt，Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis，Springer-Verlag紐約，1933，1973-1979；Araya等，1981，比較病理學(xué)雜志(Journal of comparative Pathology，135-141)。浸劑、稀釋的水溶液提取物、還已知浸劑，可以用60-100℃水制備(Nosel和Schilcher，1990)。還可以使用煎劑。當(dāng)粒子大小小于0．25mm時(shí)，提取更有效率(List和Schmidt，植物藥學(xué)技術(shù)，CRC PressBoca Raton，F(xiàn)L，1989)。
對于制備植物藥材的油提取物，有許多指導(dǎo)原則。植物藥材可以在油中45℃下消化(浸漬)10天，同時(shí)還推薦70℃下12-24小時(shí)(Hobbs，1989，HerbalGram 18／1924-33；Smith等，實(shí)驗(yàn)室中藥藥學(xué)定量確認(rèn)Williams，OR，1996)。在St．John’s Wort中，例如，據(jù)報(bào)道提取中將制品暴露于太陽光下，導(dǎo)致黃酮類含量提高40％(以四羥黃酮計(jì)算)(Maisenbacher和Kovar，1992)。另外，據(jù)報(bào)道對于St．John’s Wort，油制品中的金絲桃素(hypericin)增加20％，其中材料經(jīng)乙醇進(jìn)一步提取，和油混合(Georgiev等，1983，Nauchni Tr．-Vissh Inst．Plovid．30175-183)。
或者，可以制備植物藥材的乙醇-水制品(Dyukova，1985，F(xiàn)armitsiya3471-72；Georgiev等，1983，Nauchni Tr．-Vissh Inst．Plovid．32257-263；Wagner和Bladt，1994，Kowalewski等，1981，Herba Pol．27295-302)。按照Hagers Handbuch植物藥材的酊劑，如St．John’s Wort，可以通過應(yīng)用藥物或冷凍乙醇浸泡植物藥材，過濾，在深色瓶中保存(List和Horhammer，1993)。
一些植物藥材，如St．John’s Wort，對溫度和光都敏感。對于該類植物藥材，應(yīng)該干燥和制冷劑一起包裝，或冷藏運(yùn)輸，并閉光和空氣保存。在St．John’s Wort中，當(dāng)在60℃-140℃保存6周以上，粉末提取物、片劑和糖漿制劑中的金絲桃素(hypericin)含量明顯減少。干燥提取物在20℃下保存，至少1年保持穩(wěn)定(Adamski等，1971，F(xiàn)arm．Pol．27237-241；Benigni等，Hypericum．Plante MedicinaliChimica，F(xiàn)armacologia e Terapia，MilanoInverni & della beffa；1971)。St．John’sWort的其它成分，發(fā)現(xiàn)油制劑中的hyperforin和adhyperforin非常不穩(wěn)定，特別是暴露于光線下，和14日降解的一樣多(meisenbacher等，1992，Planta Med．，351-354)。乙醇提取的制劑穩(wěn)定性(在空氣中)提高至6個(gè)月。同樣地，檢測到四個(gè)呫噸酮和幾種黃酮類化合物(包括四羥黃酮和I3’，Ⅱ 8-biapigenlin)，認(rèn)為它們可能是外用制劑的活性成分(Bystrov等，1975，四面體通訊(Tetrahedron Letters)322791-2794)。
5．2．1．植物材料和粉末植物材料的液體提取物有代表性地，銀杏以干燥提取物的植物藥材形式被提供。
通常的液體提取物劑型為“浸劑”。浸劑的制備可以通過浸漬或煎煮加工。浸劑通常是從干燥或新鮮的植物藥材中提起水溶性成分有效的方式。
另一個(gè)通常的液體植物藥材提取物為酊劑。有代表性地，植物藥材酊劑為從新鮮或干燥的植物藥材的醇或水醇提取物。它通常通過滲透或浸漬加工制備。
植物藥材濃的酊劑，和酊劑母液中，100ml酊劑可以代表10g植物藥材(干燥重量)。通常的植物藥材，100ml酊劑可以代表20g植物藥材。在這些制劑中，干燥植物藥材和溶劑的比例分別為1∶10和1∶5。這些濃度已經(jīng)被美國國家藥典官方認(rèn)可，通常制備1∶4和其它濃度的酊劑。
和植物藥材粗提取物相比，酊劑的微生物量減少，保存期更長。這主要是由于提取液中含有20％或更大濃度的醇。有時(shí)液體提取物由甘油和水作為溶劑進(jìn)行制備。該甘油溶液通常需要含有至少50％的甘油，以抑制微生物的污染。甘油溶液還可以通過酊劑蒸干乙醇，“后加入”甘油進(jìn)行制備。
另一種類型的液體提取物為“流體提取液”。流體提取液為植物藥材的液體制劑，其藥物性質(zhì)為1ml提取液代表1g干燥植物藥材。官方的解釋是按照官方的標(biāo)準(zhǔn)(其中使用的溶劑已確定)浸透加工進(jìn)行制備。
通常通過溶劑蒸發(fā)的濃縮液體提取物，可以形成油狀、半固體或固體的提取物。
干燥的液體提取物在除去溶劑前，通過液體提取物、油或半固體在適當(dāng)?shù)妮d體上吸附進(jìn)行制備?；蛘?，干燥的粉末狀提取物可以按如下制備從液體提取物中除去溶劑，得到粉末狀的固體提取物。
5．3組分的分離一旦制備出樣品提取物和／或可選地商業(yè)購買提取物，就需要進(jìn)行組分分析。如果已經(jīng)建立指紋，樣品或等分試樣分成許多相同的具有標(biāo)準(zhǔn)指紋的標(biāo)記組分。每一個(gè)標(biāo)記組分包括一個(gè)或更多的活性或非活性成分。分別根據(jù)每一個(gè)待測植物藥材，建立標(biāo)記組分。對于一些藥材，只需要很少幾個(gè)標(biāo)記組分。對于其它更復(fù)雜的藥材，可能有許多標(biāo)記組分。例如，槲寄生Viscum album L．蛋白質(zhì)提取物，優(yōu)選的蛋白質(zhì)標(biāo)記組分為根據(jù)組分與糖結(jié)合的親和性分離的組分。但是，根據(jù)植物藥材中成分的類型，可以建立鑒定和將材料分成標(biāo)定組分的不同參數(shù)。將樣品分離成標(biāo)記組分可根據(jù)常規(guī)技術(shù)中的任何一種來進(jìn)行，例如液相色譜和抽提方法。應(yīng)該使用與用于建立標(biāo)準(zhǔn)指紋相同的程序。因?yàn)樾枰獪y定許多組分的生物活性，因此優(yōu)選應(yīng)用非破壞性的分離技術(shù)。液柱色譜是一種有用的分離技術(shù)，它使用了根據(jù)具體所使用的化合物的特定親和能力的親和色譜(例如，碳水化合物和靶向酶)。
分餾后，除去溶劑，材料溶解于適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中，用于生物檢測。適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)的例子包括DEMO、乙醇、不同的洗滌劑、水和適當(dāng)?shù)木彌_液。溶劑的選擇依賴于待測成分的化學(xué)性質(zhì)和與測定系統(tǒng)的相容性。
5．4適當(dāng)?shù)纳餀z測方法的建立示范性的生物檢測可以包括任何細(xì)胞增殖檢測，如L 1210細(xì)胞抑制的測定，和特定疾病相關(guān)的免疫活性或關(guān)鍵酶的抑制。可用于生物檢測的其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的實(shí)例包括HDLM-3Hodgkin’s淋巴瘤和RajiBurkitt’s淋巴瘤，肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系，攜帶特定細(xì)胞受體或酶的人／動(dòng)物細(xì)胞系的初級(jí)或已建立的培養(yǎng)物。
生物檢測的結(jié)果用于制備藥材的生物活性指紋。指紋可以像兩個(gè)選擇標(biāo)定組分的檢測一樣簡單。相反，指紋可以包括對許多不同組分進(jìn)行的大量不同的生物檢測?？梢詫Σ煌臉?biāo)定組分進(jìn)行相同的檢測。也可以對相同的標(biāo)定組分進(jìn)行不同的檢測。生物檢測的結(jié)合依賴于特定的植物藥材和它可能的臨床應(yīng)用的復(fù)雜性。生物檢測要和標(biāo)準(zhǔn)藥材建立生物活性指紋的方法相同。
5．4．1．酶和基于受體的檢測本發(fā)明實(shí)際應(yīng)用中優(yōu)選酶和基于受體的檢測。檢測的選擇或是根據(jù)臨床疾病可接受的酶檢測，或是從特定臨床疾病相關(guān)的檢測中選擇。選擇適當(dāng)、有效的生物檢測非常重要。理想地，生物檢測應(yīng)該是穩(wěn)定的，即經(jīng)時(shí)具有重現(xiàn)性，并在一個(gè)較寬的濃度范圍內(nèi)顯示出定量的劑量反應(yīng)。對于活性成分未知的植物藥材，選擇相關(guān)的生物檢測。根據(jù)可能的活性機(jī)理，以人的治療應(yīng)用作為指導(dǎo)，選擇本領(lǐng)域已知的檢測?；钚詸C(jī)理應(yīng)該和臨床相關(guān)應(yīng)用相一致。根據(jù)酶活性、受體結(jié)合活性、細(xì)胞培養(yǎng)物活性、抗組織活性和整個(gè)動(dòng)物體內(nèi)活性，存在大量的臨床相關(guān)檢測。
這部分涉及酶和受體結(jié)合檢測。有許多關(guān)于酶和受體結(jié)合檢測的書，例如，酶學(xué)方法，科學(xué)出版社，或Boyers，酶。天然生物活性制品，檢測、分離和結(jié)構(gòu)確定，S．M．Colegate和R．J．Molyneux，CRC Press(1993)。也討論了特定的生物。細(xì)胞免疫學(xué)方法，R．Rafael Fernadez-Botran和V．Vetvicka，CRC Press(1995)中描述了免疫細(xì)胞活化檢測和細(xì)胞因子受體檢測?！昂Y選微生物代謝物中新藥理論和實(shí)際的考慮”描述了發(fā)現(xiàn)藥學(xué)相關(guān)生物檢測的其它方法(Yarbrough)等，(1993)，抗生素雜志(J．Antibiotics)，46(4)536-544)。還有許多商業(yè)合同研究供應(yīng)商，包括Panlabs，Paracelsian和NovaScreen。
例如，對于用于治療神經(jīng)學(xué)疾病的植物藥材，生物檢測的集合可以包括腎上腺素受體、膽堿能受體、多巴胺受體、GABA受體、谷氨酸受體、單胺氧化酶、氧化氮合成酶、阿片受體或5-羥色胺受體。對于心血管疾病，檢測的集合可以包括腺苷A1激動(dòng)；腎上腺素能α1、α2、β1激動(dòng)和拮抗；血管緊縮素Ⅰ抑制；血小板凝集；鈣通道阻滯；回腸收縮反應(yīng)；心律失常；心肌收縮；血壓；心律；變時(shí)性；收縮性；缺氧；低密度；KCN缺氧；門靜脈鉀去極化；門靜脈自發(fā)激活；血栓烷血小板凝集。對于代謝疾病，可以使用下列生物檢測膽固醇，血清HDL，全血清；血清HDL／膽固醇比率，HDL／LDL比率；葡萄糖，血清葡萄糖含量；或腎功能，尿鉀排泄、尿鹽排泄和尿溶劑變化。對于過敏／炎癥疾病，可以使用下列生物檢測變態(tài)Arthurs反應(yīng)，被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)；緩激肽B2；氣管收縮；組胺H1拮抗；炎癥，角叉菜膠對巨噬細(xì)胞移動(dòng)的影響；白細(xì)胞三烯D4拮抗；神經(jīng)激肽NK1拮抗；或血小板激活因子，血小板凝集或重要的炎癥介質(zhì)的生物合成的誘導(dǎo)(例如，白細(xì)胞介素IL-1，IL-6，腫瘤壞死因子或花生四烯酸)。對于胃腸道疾病，可以使用下列生物檢測縮膽囊素CCKA拮抗；外周膽堿能抑制；胃酸，五肽促胃酸激素；胃潰瘍，乙醇；回腸電刺激調(diào)節(jié)；回腸電刺激痙攣或5-羥色胺5-HT3抑制。對于抗菌、抗真菌、或抗滴蟲疾病，可以使用下列白色念珠菌；大腸桿菌；肺炎克氏桿菌；蛙分支桿菌；普通變形桿菌；綠膿桿菌；耐性金黃色葡萄球菌；胎兒毛滴蟲；或須發(fā)癬菌。對于其它的疾病，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇相關(guān)的生物檢測。
基于酶或受體的檢測具體實(shí)例包括下列乙酰膽堿酯酶；3-羥基丁醛還原酶；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)；腎上腺素α、β、大鼠雄激素受體；CNS受體；1或2環(huán)加氧酶(Cox1，Cox2)；DNA修復(fù)酶；多巴胺受體；雌激素受體內(nèi)分泌生物檢測；纖維蛋白原酶；GABA A或GABAB；β-葡萄糖苷酸酶；脂肪氧化酶，例如5-脂肪氧化酶；單胺氧化酶(MAO-A，MAO-B)；磷脂酶A2，血小板激活因子(PAF)；鉀通道檢測；前列環(huán)素細(xì)胞周期蛋白；前列腺素合成酶；5-羥色胺檢測，例如，5-HT活性或其它5-羥色胺受體亞型；5-羥色胺再攝取活性；類固醇／甲狀腺總科受體；血栓烷合成活性?？梢詮拇罅康馁Y源中獲得具體的酶檢測，包括PanlabsTMINC(Bothell，WA)和NovaScreenTM(Baltimmore，MD)。另外的檢測包括ATP酶抑制，苯并芘羥化酶抑制，HMG-CoA還原酶抑制，磷酸二酯酶抑制，蛋白酶抑制，蛋白質(zhì)生物合成抑制，酪氨酸羥化酶和激酶抑制，睪酮-5α-還原酶和細(xì)胞因子受體檢測。
5．4．2．細(xì)胞培養(yǎng)物及其它檢測除了酶和受體檢測，還有其它生物檢測。這些檢測優(yōu)選在細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行，但也可以在整個(gè)生物體中進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)檢測包括培養(yǎng)的肝細(xì)胞和肝細(xì)胞瘤活性(對膽固醇水平、LDL膽固醇受體水平、HDL／LDL膽固醇比率的影響)；對抗L 1210、HeLa或MCF-7細(xì)胞抗癌活性；PC12人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞調(diào)控受體水平；初級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)物促黃體生成激素(LH)、促卵泡激素(FSH)或促乳激素的活性調(diào)控；肥大細(xì)胞Ca2+流入量；對吞噬作用、淋巴細(xì)胞活性或TNF釋放的細(xì)胞培養(yǎng)物檢測；血小板凝集活性或?qū)笻DLM-3 Hodgkin's淋巴瘤和RajiBurkitt’s淋巴瘤活性，抗有絲分裂活性，受感染細(xì)胞抗病毒活性，抗菌活性(細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物)和抗真菌活性?？梢允褂玫慕M織或整個(gè)動(dòng)物檢測還包括抗炎小鼠耳皮炎，大鼠腳爪膨脹；肌肉收縮檢測；被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)；血管舒張檢測；或全動(dòng)物碳粒清除試驗(yàn)。這些檢測可以從許多來源獲得，包括PanlabsTMInc．(Bothell，WA)。
5．4．3．抗癌活性藥物的抗癌作用可以通過大量的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行研究；它們包括小鼠白血球過多、L 1210、P388、L1578Y等。也可以使用人的腫瘤細(xì)胞系，像KB和HeLa。在一個(gè)有代表性的檢測中，腫瘤細(xì)胞在適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)(像含有10％胎牛血清的RPMI-1640)中生長。根據(jù)細(xì)胞系的細(xì)胞周期時(shí)間，用不同濃度的測試材料處理對數(shù)性生長的細(xì)胞14-72小時(shí)。在培育期結(jié)束時(shí)，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器評(píng)價(jià)處理組和未處理組的細(xì)胞生長。通過錐蟲蘭排除實(shí)驗(yàn)和通過線粒體脫氫酶造成的四唑染料減少，測定細(xì)胞的生活力。藥物抑制培養(yǎng)物中細(xì)胞生長的能力可以表明其可能的抗癌作用。這些作用可以通過動(dòng)物耐受腫瘤(其為人疾病模型)來證實(shí)(Khwaja，T．A．等，1986，腫瘤學(xué)(Oncology)，43(增補(bǔ)1)42-50)。
藥物抗癌作用的最經(jīng)濟(jì)的評(píng)價(jià)方法，是研究它對含有10％胎牛血清的最小必需介質(zhì)(MEM)中腫瘤細(xì)胞生長的影響。接觸藥物的細(xì)胞(兩組)在潮濕的CO2培養(yǎng)箱中在37℃下培養(yǎng)2-4天(依賴于腫瘤細(xì)胞的數(shù)量加倍時(shí)間)。培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，統(tǒng)計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞生長抑制程度，和在同樣條件下未處理的對照組細(xì)胞生長進(jìn)行比較。不同的實(shí)驗(yàn)室根據(jù)個(gè)體的需要使用不同類型的細(xì)胞系。美國國家癌癥研究所(NCI)推薦使用KB細(xì)胞(人鼻咽癌)用于抗癌藥物的體內(nèi)評(píng)價(jià)。細(xì)胞生長抑制由藥物處理和未處理對照組評(píng)價(jià)的蛋白質(zhì)含量(Lowry’s方法)所決定。NCI還推薦使用小鼠白血病P388懸浮培養(yǎng)物用于評(píng)價(jià)植物提取物和相關(guān)天然產(chǎn)物的抗癌潛力。
在微量滴定平板中培養(yǎng)的小鼠白血病L1210細(xì)胞，常規(guī)用于抗癌活性的體內(nèi)檢測。白血病L1210的細(xì)胞數(shù)量加倍時(shí)間為10-11小時(shí)，和藥物接觸48小時(shí)(3-4代的對數(shù)生長)，用于評(píng)價(jià)其抗腫瘤活性。對于生長抑制研究，所有的儲(chǔ)備液和稀釋液用無菌的0．9％NaCl溶液制備。在微量滴定平板(0．18 ml／孔)中，對于每個(gè)抑制劑濃度以2-5×104細(xì)胞／ml的濃度接種細(xì)胞培養(yǎng)物兩份。在每種情況下，加入0．02ml的抑制劑以獲得1∶10的稀釋液。加蓋的微量滴定平板在空氣中含有5％CO2的潮濕的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。在培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，將每孔等分量的培養(yǎng)物加入到測量體積的等滲鹽水中，用電子細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。通過錐蟲蘭排除測定細(xì)胞的生活力。通過繪制細(xì)胞生長抑制百分率(和鹽處理的對照組細(xì)胞濃度相比)對對數(shù)藥物濃度的曲線，計(jì)算結(jié)果，表示為引起50％細(xì)胞生長抑制的的濃度(IC50)(從圖中可測出)。
也可以評(píng)價(jià)出藥物對腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒效應(yīng)。然而，這些實(shí)驗(yàn)需要較長的時(shí)間，而且花費(fèi)更昂貴。在該研究中，洗滌藥物處理的細(xì)胞，使其不含藥物，然后在軟瓊質(zhì)或適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基鋪板，通過存活細(xì)胞增殖和形成微集落能力評(píng)價(jià)細(xì)胞的生活力。某種藥物濃度得到的細(xì)胞集落數(shù)量和未處理的對照組得到的相比較，以評(píng)價(jià)細(xì)胞殺傷和細(xì)胞毒活性。在槲寄生提取物研究中，我們使用EMT-6細(xì)胞松散的貼壁培養(yǎng)物(小鼠乳腺癌)。該細(xì)胞在含有10％的透析的胎牛血清和抗生素的Eagle’s MEM(F14)中生長。旋轉(zhuǎn)細(xì)胞懸浮液，懸浮于添加10％的透析胎牛血清的Spinner’s培養(yǎng)基中的小球(70個(gè)細(xì)胞／ml)，在塑料培養(yǎng)皿中鋪板，培養(yǎng)2小時(shí)，使細(xì)胞附著。這時(shí)細(xì)胞和不同濃度的提取物接觸2-24小時(shí)。然后，除去培養(yǎng)基，用不含藥物的培養(yǎng)基代替，在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)5-7天。集落用亞甲蘭(0．33％，在0．01％KOH中)染色，用自動(dòng)集落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。EMT-6細(xì)胞的鋪板效率為46％。(Khwaja等，1986，腫瘤學(xué)(Oncology)，43(增補(bǔ)1)42-50)。
5．4．4．抗病毒活性不同藥物的抗病毒活性可以通過人細(xì)胞系(像HeLa或H9淋巴瘤細(xì)胞)的細(xì)胞培養(yǎng)物確定。將該細(xì)胞用病毒感染，病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖。病毒產(chǎn)生細(xì)胞溶解作用或致細(xì)胞病變效應(yīng)的能力取作終點(diǎn)。例如，H9細(xì)胞的HIV感染導(dǎo)致多核細(xì)胞的產(chǎn)生。該致細(xì)胞病變效應(yīng)如果通過某一濃度的藥物降低或提高，表示了其作為抗HIV藥的潛力。結(jié)果可以通過細(xì)胞培養(yǎng)物中病毒酶的評(píng)價(jià)驗(yàn)證，例如，通過研究病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)量。病毒酶的表達(dá)降低支持了藥物治療的抗病毒作用(Khwaja T．A．美國專利第5，565，200號(hào)；J．Levy等，1984，科學(xué)，225∶840)。
5．5．分析化學(xué)成分的分析方法有許多方法用于分離和分析單個(gè)的化學(xué)成分，包括氣相色譜(GC)，質(zhì)譜(MS)，GC-MS，高效液相色譜(HPLC)，HPLC-MS，薄層色譜(TLC)，高效TLC(HPTLC)凝膠色譜和反相色譜(RPC)。這些色譜方法基可以應(yīng)用分析級(jí)的，也可以應(yīng)用制備級(jí)的。為了確定未知成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，有代表性地應(yīng)用核磁共振(NMR)和質(zhì)譜組分分析。
色譜類型的確定依賴于最有可能具有生物活性的化學(xué)成分。例如，其生物活性是由于脂肪酸，就將該脂肪酸酯化，用GC分析它的酯。對于具有醇基團(tuán)的有機(jī)化合物，將其修飾，制備酯、甲硅烷基或其它極性更小的官能團(tuán)。該衍生物適合于GC分析(Steinke等，1993，Planta Med．59155-160；Breu等，1992，Arzneim．-Forsch／Drug Res．42(1)547-551)。如果活性最可能是由于類黃酮，可以選擇HPLC法。反相HPLC(RP-HPLC)已用于許多植物藥材(具體為山楂、粉色西番蓮、甘菊、銀杏)的類黃酮分析(Pietta等，1989，色譜學(xué)(Chromatographia)，27(9／10)509-512)。通過TLC(Vanhaelen和Vanhealen-Fastre，1983，色譜雜志，281263-271)以及MS分析對大蒜的植物成分進(jìn)行定量檢測。CRC色譜手冊關(guān)于“液體分析”，K．D．Mukherjee，“甾體的分析和特征鑒定”，H．Lamparczyk，J．Sherma，和“肽和蛋白質(zhì)的高效液相色譜”，C．TMant和R．S．Hodges，是可獲得的現(xiàn)有文獻(xiàn)，其描述了柱和溶劑系統(tǒng)。
5．6．組分的分析在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，指紋不是根據(jù)已知生物活性的個(gè)別化學(xué)成分，還可以應(yīng)用限定的組分或化合物的種類建立PharmaPrint_。一些植物藥材的化學(xué)成分形成許多密切相關(guān)成分的復(fù)雜混合物，以至于，從實(shí)際的觀點(diǎn)考慮，需要根據(jù)組分或化合物的種類，而不是根據(jù)單個(gè)的化合物，建立PharmaPrint_。該類型的成分的實(shí)例為外源凝集素(糖結(jié)合蛋白質(zhì))或醣蛋白以及水飛薊中的水飛薊素。有許多組分分析的實(shí)例(凝膠過濾原理和方法，Pharmacia Biotech，Rahms i Lund瑞典，Ulsumi等，1987，生物化學(xué)雜志(J．Biochem．)，1011199-1208)。
5．7．應(yīng)用PHARMAPRINTEDTM材料的方法在植物藥材建立指紋后，分析單個(gè)樣品，以確定其是否落在可接受的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。一旦樣品得到證實(shí)，它適合用于有關(guān)人和動(dòng)物的許多疾病。該材料可用于臨床實(shí)驗(yàn)，以提供穩(wěn)定質(zhì)量的材料和用于實(shí)驗(yàn)的ose制劑的準(zhǔn)確劑量。PharmaPrintedTM材料還可用于動(dòng)物的毒理分析，其中質(zhì)量穩(wěn)定的材料可用于定量毒理分析。在許多情況下，它可以作為材料分析或生物應(yīng)用的參考。
PharmaPrintedTM植物材料可用于植物藥相關(guān)的任何疾病。參見例如，Leung和Foster，1996，和中藥和植物藥學(xué)，1994。更具體的病狀或治療適應(yīng)癥包括AIDS、適應(yīng)原(adaptogen)、輕度至中度抑郁、抗關(guān)節(jié)炎、抗癌、止瀉、抗蠕蟲、抗炎、通過GI止惡心、抗風(fēng)濕、解痙、抗?jié)?、絞痛、抗菌、抗誘變、抗氧化、抗病毒、動(dòng)脈硬化、關(guān)節(jié)炎、哮喘、血壓、前列腺良性增生(BPH)、支氣管哮喘、支氣管炎、鎮(zhèn)靜、咳嗽、大腦循環(huán)紊亂、膽固醇降低、肝硬化、皮膚病抗炎、糖尿病、利尿、劇瀉、痛經(jīng)、消化不良、肺氣腫、環(huán)境緊張、祛痰、自由基清除劑、GI損傷、痔瘡、肝炎、肝保護(hù)、高血壓、高血脂、血催乳素過多、免疫調(diào)節(jié)活性、纖維蛋白溶解增加、對抗細(xì)菌感染、炎癥、失眠、哺乳、肝保護(hù)、長壽、月經(jīng)循環(huán)調(diào)節(jié)、偏頭痛、肌肉痛、骨關(guān)節(jié)炎、疼痛、外周血管疾病、血小板凝集、PMS、促進(jìn)月經(jīng)、前列腺疾病、甘油三酯減少、減輕月經(jīng)痛、呼吸道感染(RTI)、視網(wǎng)膜病、鼻竇炎、風(fēng)濕、鎮(zhèn)靜、催眠藥、咽喉痛、刺激頭發(fā)生長、表面?zhèn)谟稀⒍Q、局部濕疹(皮炎)、泌尿道感染(UTI)、靜脈曲張、靜脈不足或傷口愈合。
其它的適應(yīng)癥包括止血、抗菌、抗寄生蟲、退熱、強(qiáng)心、祛風(fēng)、利膽、鎮(zhèn)痛、發(fā)汗、催吐、通經(jīng)、潤膚、退燒、催奶、肝的、催眠、通便、鎮(zhèn)定、祛痰、發(fā)紅、興奮、滋補(bǔ)、醫(yī)治創(chuàng)傷、潰瘍stores、溢膿、牙齦炎、胃炎、潰瘍、膽結(jié)石、間歇性跛行、感冒、流行性感冒、喉炎、頭痛、帶狀皰疹、膀胱炎、腎結(jié)石、特異反應(yīng)性陰道炎、子宮纖維瘤、骨質(zhì)疏松、痛風(fēng)。
據(jù)報(bào)道銀杏可有效治療外周血管疾病，包括腦血管疾病和靜脈疾病，阿爾茨海默疾病，和作為抗氧化劑治療。給藥銀杏的主要適應(yīng)癥是增加血流，特別是腦血流。在德國已證明銀杏提取物可有效治療腦循環(huán)紊亂導(dǎo)致的功能性容量減少和失眠(Yyler，1994，植物藥選擇，Haworth Press，NY)。銀杏還具有減少視網(wǎng)膜水腫，視網(wǎng)膜中細(xì)胞損傷，增加FontaineⅡ期外周動(dòng)脈閉塞疾病的無疼痛行走距離(間歇的跛行)的適應(yīng)癥。適應(yīng)癥還有源于血管和退化的眩暈和耳鳴。
5．8．銀杏PHARMAPRINT_下面的生物和化學(xué)PHARMAPRINT_值是對植物藥材銀杏的舉例說明。
5．8．1．生物PHARMAPRINT_應(yīng)用本文描述的方法得到的示范性的生物PHARMAPRINT_值如表1-3所示。參見下文6．4部分對于表1-3中每個(gè)數(shù)值的每個(gè)生物檢測的詳細(xì)討論和解釋。
每個(gè)生物檢測的值表示為在10-4M濃度下的抑制百分比范圍，除非另有說明。對于提取物和組分的計(jì)算基于平均分子量為200的假定。
表1生物PHARMAPRINT_
表2PAF檢測PHARMAPRINT_
例如，應(yīng)用表1中的數(shù)據(jù)，PharmPrint_可以基于在5-脂肪氧合酶檢測中提取物的生物活性和選自下組的一個(gè)或更多的檢測GABAA檢測，白細(xì)胞三烯C4合酶檢測，單胺氧化酶A檢測，煙堿受體檢測，5-羥色胺攝取檢測，環(huán)加氧酶-1檢測，和／或組分18，23和／或28在PAF受體中的檢測。
在一個(gè)供選擇的實(shí)施方案中，PharmPrint_的形成基于生物活性等于或大于生物活性范圍的最小值，如表1和2中所示。作為該實(shí)施方案的說明性實(shí)例，基于在5-脂肪氧合酶檢測中(60±20)總提取物的生物活性的PharmPrint_值，在10-4M濃度至少40％抑制。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物PharmPrint_可以基于生物檢測中的生物活性，如表3所示。表3生物藥物指紋銀杏的藥物指紋范圍
5．8．2．化學(xué)PHARMAPRINT_應(yīng)用本文描述的方法，銀杏的化學(xué)PHARMAPRINT_可以限定為下面表4和5所列。在一個(gè)實(shí)施方案中，銀杏的化學(xué)PHARMAPRINT_如表4所列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，銀杏的化學(xué)PHARMAPRINT_如表5所列。參見下文6．5部分中選擇化學(xué)化合物的詳細(xì)討論和解釋。表4化學(xué)PHARMAPRINT_
表5化學(xué)藥物指紋銀杏的藥物指紋范圍
其中ppm表示報(bào)道量的單位是百萬分之幾，而不是％(W／W)。
5．8．3．換算率應(yīng)用植物藥材(例如銀杏)的干燥粉末提取物得到的PharmPrint_值，可以換算成與植物藥材原材料干重有關(guān)的值，應(yīng)用的比例在下表6中進(jìn)行說明。因此，將基于干燥粉末提取物的PharmPrint_值換算成與干燥植物材料有關(guān)的值，在表6中，通過適當(dāng)?shù)囊蜃觿澐帧?br> 表6換算率
下面的實(shí)施例只是為了舉例說明，絕不是為了限制本發(fā)明的范圍。
6．實(shí)施例銀杏PHARMAPRINTING_下面的實(shí)施例舉例說明銀杏生物PharmPrint_和化學(xué)PharmPrint_的形成。
6．1．商業(yè)供應(yīng)商／產(chǎn)品名銀杏制品是可獲得的最常見的植物藥材產(chǎn)品。Egb 761為IPSEN研究實(shí)驗(yàn)室(法國，巴黎)的市售提取物，商品名為TeboninTM，TanakanTM，和RokanTM，在歐洲已廣泛用于臨床實(shí)驗(yàn)。IPSEN的另一個(gè)銀杏提取物，LI 1370，商品名為Kaveri。銀杏干燥提取物可以從Indena s．a(chǎn)．(意大利，米蘭)獲得，其標(biāo)準(zhǔn)為含有24％總銀杏黃酮糖甙，6％銀杏苦內(nèi)酯和白果內(nèi)酯。提取物還可以從以下公司獲得Natural Factors NutritionalProducts，Ltd．(Bumaby，british Columbia，Canada)，Murdock MadausSchwabe(Springville，Utah)，和Zuelling Botanicals，Inc．(德國)的部門Botanicals International購買，Herbal Choice-Botalia，ThompsonNutritional，Hudson，NaturaLife，Botalia Gold，Nature’s Resource，HerbPharm，PhytoPharmica，Nature’s Way，TeboninTM(Schwabe，Germany)，RokanTM(Intersan，Germany)，和PhytoPharmica。
6．2．臨床應(yīng)用銀杏以液體或固體劑型口服給藥，據(jù)報(bào)道它對外周血管疾病的治療有效，包括腦血管疾病和靜脈疾病。副作用包括偶見腸道不適，頭痛，和過敏性皮膚反應(yīng)。已知銀杏和其它藥物沒有相互作用。銀杏禁用于已知對銀杏制劑高度過敏的患者。另外，應(yīng)確定想要進(jìn)行治療的病癥是否表明根本的疾病過程需要可選擇的治療。最近已有對銀杏臨床應(yīng)用的綜述(Cleijen和Knipchild，1992，Lancet，3401136-1139)。
6．2．1．主要適應(yīng)癥銀杏給藥的主要適應(yīng)癥是增加血流，特別是腦血流。在德國已證明銀杏提取物可有效治療腦循環(huán)紊亂導(dǎo)致的功能性容量減少和失眠(Tyler，1994，植物藥選擇，Haworth Press，NY)。對于記憶力缺失，注意力不能集中，感情抑郁，和頭痛，推薦每日2或3個(gè)劑量，每個(gè)劑量120-240mg天然干燥提取物(German Commission E Monograph，銀杏葉提取物，1994年7月)。
6．2．1．第二適應(yīng)癥銀杏還具有減少視網(wǎng)膜水腫，視網(wǎng)膜中細(xì)胞損傷，增加FontaineⅡ期外周動(dòng)脈閉塞疾病的無疼痛行走距離(間歇的跛行)的適應(yīng)癥。適應(yīng)癥還有源于血管和退化的眩暈和耳鳴。對于間歇的跛行，眩暈和耳鳴，推薦每日2或3個(gè)劑量，每個(gè)劑量120-240mg天然干燥提取物。銀杏成分和使用已在專利文獻(xiàn)中進(jìn)行報(bào)道(美國專利No．5，246，216，Bombardelli等，報(bào)道了作為抗感染藥使用，特別是對卡氏肺囊蟲，美國專利No．5，202，313，Bombardelli等，報(bào)道了白果內(nèi)酯衍生物)。
6．3．組分分析銀杏成分的組分分析按照標(biāo)準(zhǔn)色譜技術(shù)進(jìn)行。可參考大量的已公開的方法(例如，Kreuter等，1993，Planta Med．，59A633；Piettta等，1992，J．Pharm & Biomed．Anal．，101077-1079；Huh和Staba，1992，色譜雜志(J．Chromatog．)600364-369；Pietta等，1990，色譜學(xué)(Chromatographia)29251-253；Lobstein-Guth等，1983，色譜雜志(J．Chromatog．)267431-438；Kameyama和Urakami，1979，J．Am．OilChem．Soc．5549-551)。
在對文獻(xiàn)進(jìn)行綜合檢索后選定銀杏的化學(xué)標(biāo)記物。檢索結(jié)果表明多種生物活性成分可以用作標(biāo)記物，包括萜烯內(nèi)酯和黃酮糖甙。
6．3．1．組分作為例子，但不僅限于此，應(yīng)用HPLC對銀杏組分進(jìn)行檢測。
將20克銀杏提取物粉末用40ml去離子水溶解。加入幾滴MeOH，以獲得澄清溶液。裝填入LiChroprep RP-18(40-60μm)的柱中(2．5×92cm，柱體積450ml)。預(yù)先裝填柱子，用去離子水平衡。按順序分批用水，水／甲醇混合液，最后用乙酸乙酯過柱。如表7所示的總共收集到28個(gè)組分。然后將組分蒸發(fā)，得到殘?jiān)闹亓俊Ｃ總€(gè)組分的收集殘?jiān)亓吭诒?中列出。組分體積都是225mL，除了組分20和24位450mL，組分21和28為900mL，組分27為675mL。
表7制備HPLC柱收集組分
對柱組分通過HPLC分析銀杏萜烯內(nèi)酯和黃酮糖甙。在樣品組分2、3、10、13-24、和28中檢測到萜烯內(nèi)酯。HPLC條件包括在30℃下使用PhenomenexIB-SIL C-18柱(250×4．6mm)；RI檢測器；MeOH∶H2O∶DMSO(29∶69∶2)的恒溶劑。通過將組分2-28在甲醇鹽酸中回流分析檢測到黃酮糖甙。HPLC條件包括使用PhenomenexIB-SIL C-18柱(250×4．6mm)；設(shè)定在370nm的UV／VIS檢測器；MeOH0．5％磷酸(58∶42)的恒溶劑。
6．4．生物活性檢測銀杏的組織水平作用包括膜穩(wěn)定；氧和葡萄糖利用提高；血小板激活因子(PAF)抑制；脂類過氧化物酶；Na+K+ATP酶的激活；微循環(huán)和組織灌注提高；內(nèi)皮衍生的松弛因子釋放的刺激(Cott，精神藥理學(xué)公報(bào)雜志(J．Psychopharmacology Bulletin)31745-751，1995)。大量報(bào)告還表明人和動(dòng)物的認(rèn)知功能提高，說明銀杏獨(dú)有的急性給藥改變EEG。
銀杏提取物和銀杏組分的生物活性可以應(yīng)用多種檢測進(jìn)行分析，下面描述了其中的幾種。
每個(gè)生物檢測的值表示為在10-4M濃度下的抑制百分比范圍，除非另有說明。抑制百分比大于或等于20％，認(rèn)為具有明顯生物活性。對于提取物和組分的計(jì)算基于平均分子量為200的假定。
6．4．1．對血小板作用近年來更加確定血小板在動(dòng)脈粥樣硬化形成中起到的作用。內(nèi)皮損傷導(dǎo)致內(nèi)皮下膠原暴露于循環(huán)的血細(xì)胞下，這樣導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和血小板在損傷部位發(fā)生堆積。在該過程中，血小板分泌多種化學(xué)物質(zhì)，包括血管活性物質(zhì)和血小板衍生的生長因子(PDGF)。該細(xì)胞增殖和平滑肌細(xì)胞遷移的結(jié)果導(dǎo)致了動(dòng)脈粥樣硬化損傷的增長。
一些研究人員已證明銀杏提取物及其成分可抑制血小板凝集，他們的檢測可能是有啟發(fā)性的(Know和Lee，1995，Yakhak hoeji，39337-345)。
血小板激活因子(PAF)的活性在哮喘、休克、局部缺血、過敏性反應(yīng)、移植排斥、腎病、CNS疾病和許多炎癥的病理學(xué)中非常重要。證明銀杏苦內(nèi)酯是天然的PAF拮抗劑，是銀杏提取物的重要成分。
6．4．1．1．血小板凝集檢測簡而言之，從新西蘭種的白化病大鼠(重2．5-3．0kg，雄性或雌性)得到的靜脈血，和十分之一體積的檸檬酸三鈉(0．13M)混合，然后在室溫、220X g下離心10分鐘。得到的上清液為富含血小板的血漿(PRP)。通過200μM花生四烯酸鈉在37℃下保溫，進(jìn)行非可逆聚集。通過光學(xué)凝集器(optical aggregometer)測定凝集。測試材料在30μM的濃度下和PRP保溫5分鐘。測定對血小板凝集的作用，報(bào)道為百分比抑制。文獻(xiàn)參考的標(biāo)準(zhǔn)如下所列。檢測基于Bertele等(1983，科學(xué)(Science)220517-519)。
化合物IC50(μM)阿司匹林(乙酰水楊酸) 12BM13，505(Daltroban)3．2BW-755C 1．2CGS12970 120*吲哚美辛0．28NDGA 35苯異妥英 2．6保泰松 28*表示使用的標(biāo)準(zhǔn)參照藥物；BW-755C=3-氨基-1-[3-(三氟甲基)苯基]-2-二氫吡唑；CGS 12970=3-甲基-2-(3-吡啶)-1H-吲哚-1-辛酸；NDGA=去甲二氫愈創(chuàng)木酸。
除了使用200μM花生四烯酸鈉誘導(dǎo)血小板凝集，還使用5nM血小板激活因子acether(PAF-acether)(Nunez D．等，1986，歐洲藥理學(xué)雜志(Eur．J．Pharmacol)123197-205)。文獻(xiàn)參考的標(biāo)準(zhǔn)如下所列。
化合物IC50(μM)Nectandrin A(BN-52021)3．3CGS-12970 26CV-3988 1040
Kadsurenone(L-651108)1．7L-652731 0．83L-659989 0．33RP-48740 17SRI-63441 1．7WEB-2086 0．11CGS-12970=3-甲基-2-(3-吡啶)-1H-吲哚-1-辛酸；CV-3988=3-(4-羥基-7-甲氧基-10-氧-3，5，9-trixa-11-氮雜-4-磷雜二十九烷-1-基)-噻唑啉；L-652731=2R，5R-二(3，4，5-三甲氧基苯)。
還可以使用文獻(xiàn)中描述的其它檢測。Kieswetter等(1991，Int’l J．Clin．Pharm．，Ther．，& Toxicol．29151-155)描述了評(píng)價(jià)血小板凝集的其它技術(shù)。血管擴(kuò)張抑制作用的臨床指示是靜脈不足的另一種檢測。它是通過研究冠狀動(dòng)脈片斷對乙酰膽堿的收縮反應(yīng)得出的(Bettini等，1991，F(xiàn)itoterapia 62(1)15-28)。
6．4．1．2．血小板凝集因子檢測該檢測測定了銀杏提取物和組分對[3H]-血小板激活因子(PAF)和PAF受體結(jié)合的作用。從雄性或雌性新西蘭種的白化病大鼠(重2．5-3．0kg，)得到的血小板，在改性Tris-HCl pH 7．5緩沖液中應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。50μg的膜試樣和0．4nM的[3H]-PAF在25℃下保溫60分鐘。在1μM PAF存在下，評(píng)價(jià)非特異性結(jié)合。在玻璃過濾器上收集標(biāo)記的膜，洗滌三次，以除去未結(jié)合標(biāo)記。用液體閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)過濾器，以測定[3H]-PAF特異性結(jié)合的量?；衔镒畛鹾Y選濃度在10μM。文獻(xiàn)化合物如下所列；商業(yè)可購買的銀杏苦內(nèi)酯A、B和C和白果內(nèi)酯作為提取物和組分化合物的對照(見下)。
化合物 IC50(nM) Ki(nM) nHPAF 9 5．8 1．0WEB-2086*110 71 0．8
*WEB-2086=3-(4-[2氯苯]-9-甲基-6H-噻吩并[3，2-f][1，2，4]-三唑-[3，3-a][1，4]-二氮雜-2-基)1-(4-嗎啉基)-1-丙酮銀杏苦內(nèi)酯是PAF-acether結(jié)合的競爭性抑制劑(Braquet，P．，前列腺素、血栓烷和白細(xì)胞三烯研究進(jìn)展，16179-198，1986)。
化合物 IC50銀杏苦內(nèi)酯A9．4×10-7M銀杏苦內(nèi)酯B2．5×10-7M銀杏苦內(nèi)酯C1．7×10-7M6．4．2．GABAA結(jié)合的生物檢測銀杏結(jié)合物和組分的GABAA結(jié)合活性檢測可以應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行(Enna等，1977，大腦研究(Brain Research)，124185-190；Falch等，1986，神經(jīng)化學(xué)雜志(J．Neurochem．)47(3)898-903)。該檢測的參照文獻(xiàn)化合物包括安定和蠅蕈醇(Sigma化學(xué)公司)。
通過實(shí)施例，但不限于此，進(jìn)行GABAA拮抗位點(diǎn)結(jié)合檢測，簡要描述如下。
使用從牛小腦膜來源的受體，最終濃度為5．0nM的[3H]-GABA(70-90 Ci／mmol)放射性配體，和GABA，反應(yīng)在50mM的TRIS-HCl(pH 7．4)中、0-4℃下進(jìn)行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾，中止反應(yīng)。測定過濾器上捕集的放射性，和對照值比較，以確定測試化合物和 GABAA受體任何互相作用。
參照化合物Ki(nM)蠅蕈醇4．4異去甲檳榔次堿9．5GABA 23．1TRIP 25．1檢測特性KD(結(jié)合親和性) 370nM
Bmax(受體數(shù)量)0．7pmol／mg蛋白質(zhì)還可以進(jìn)行中心GABAA苯并二氮卓受體檢測，例如，如下所示。為了測定[3H]氟硝安定(New England Nuclear，產(chǎn)品目錄no．NET 567)和中心GABAA苯并二氮卓受體(GABAA，BDZ，中心)的結(jié)合，從大鼠大腦皮層制備了部分純化受體制品。最終放射性配體濃度為0．4 nM。使用每檢測點(diǎn)100μg的部分純化受體。使用3μM冷的安定(Sigma，產(chǎn)品目錄no．D0899)測定非特異性結(jié)合。該物質(zhì)、受體和配體在50mM的TRIS-HCl(pH 7．7)、1μM胃酶抑素、1μg／ml亮肽素和10μ／ml胰島素抑制劑中、4℃下進(jìn)行60分鐘。通過應(yīng)用Packard GF／B裝置迅速過濾，中止反應(yīng)。應(yīng)用Packard Topcount裝置通過液體閃爍計(jì)數(shù)測定特異性活性的量(Speth，R．C．等，1979，生命科學(xué)(Life Sci．)，24351)。
化合物 受體參數(shù)氟硝安定Kd=2．1nM安定IC50=13 nM6．4．3緩激肽生物檢測為了研究該物質(zhì)對緩激肽與其受體(BK2)結(jié)合的抑制，從豚鼠回腸膜制備了部分純化受體制品。檢測中使用的放射性配體為最終濃度0．2nM的[3H]緩激肽。用1μM緩激肽TFA鹽的內(nèi)含物測定非特異性結(jié)合。檢測反應(yīng)在具有1mM 1，10-菲咯啉、0．1mM桿菌肽和0．1％BSA的25mM TES(pH 6．8)緩沖液中進(jìn)行。反應(yīng)在25℃下進(jìn)行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速過濾樣品，中止反應(yīng)。通過液體閃爍計(jì)數(shù)測定特異性活性的量(Manning，D．J．，J．Pharmacol．Exp．Therap．43504-512，1986)。
6．4．4免疫活性生物檢測6．4．4．1脂肪氧合酶生物檢測研究該物質(zhì)潛在抗炎特性的檢測可以包括酶5-脂肪氧合酶(5-LO)檢測。5-LO催化花生四烯酸和5-羥基二十碳四烯酸(5-HETE)的氧化代謝，起始反應(yīng)導(dǎo)致炎癥原白細(xì)胞三烯形成。粗品酶可以從大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞(RB-1)制備。該物質(zhì)和粗品酶制品在25℃下保溫5分鐘。然后通過加入[14C]-花生四烯酸開始反應(yīng)。8分鐘后，通過加入檸檬酸中止反應(yīng)。通過放射免疫檢測法(RIA)測定放射標(biāo)記的5-HETE量(Shimuzu，T．等，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．，81689-693)。
還可以進(jìn)行下列檢測，以測定該物質(zhì)對5-LO的抑制活性。5-LO酶從分化型HL60細(xì)胞部分純化制得。測試物質(zhì)和酶在室溫下預(yù)保溫5分鐘，然后通過加入0．4μM花生四烯酸開始反應(yīng)。在室溫下保溫8分鐘后，通過加入檸檬酸中止反應(yīng)。按照生產(chǎn)廠家說明書應(yīng)用放射免疫檢測法測定產(chǎn)生的5-HETE量(Coffey等，1992，生物化學(xué)雜志，267，570)。
6．4．4．2二聚類黃酮生物檢測二聚類黃酮(Biflavone)抑制體內(nèi)某些炎癥過程(R．Della loggia等，Planta Med59S588，1993)。對提取物進(jìn)行體內(nèi)測試，以測定抗炎活性。富含二聚類黃酮的組分顯示劑量依賴性作用(見下表)。除了該反應(yīng)，作者還報(bào)道了當(dāng)劑量為200μg／耳部時(shí)，耳部炎癥細(xì)胞減少62％。
組分的抗炎活性物質(zhì) 劑量μg動(dòng)物數(shù) 浮腫(mg)m±ES浮腫抑制對照 … 48 7．5±0．2 …二聚類黃酮組分 50 13 6．4±0．4*15％100 13 4．7±0．3*37％200 48 2．0±0．2*73％吲哚美辛 70 14 3．0±0．3*60％*分析方差為p＜0．05
局部應(yīng)用10mg／ml巴豆油，以誘導(dǎo)小鼠耳部炎癥。測試化合物的給藥或作為局部應(yīng)用直接用于耳部，或通過強(qiáng)飼法口服給藥。測試化合物給藥30分鐘后，耳部給藥巴豆油(8％，在20μl丙酮中)。明顯反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)為巴豆油給藥后2小時(shí)耳部腫脹減少≥50％。文獻(xiàn)測試化合物如下所列。
化合物 ED50(mg／耳)對乙酰氨基酚＞30阿司匹林＞10BM-13177＞10地塞米松3氫化可的松 10布洛芬 10吲哚美辛10LY-171883 ＞10NDGA＞10Phenidone 36．4．4．3環(huán)加氧酶-1生物檢測花生四烯酸通過酶環(huán)加氧酶-1或-2代謝為前列腺素。前列腺素的激素作用包括降低血壓；刺激平滑肌收縮；炎癥的調(diào)節(jié)；血液凝固和免疫反應(yīng)。
環(huán)加氧酶-1(從公羊精囊制備)，每檢測管125單位，和1mM GSH，1mM對苯二酚，1．25mM血紅蛋白和測試化合物在25℃下預(yù)保溫1分鐘。然后通過加入花生四烯酸(100mM)開始反應(yīng)。在37℃下保溫20分鐘后，通過加入三氯醋酸(TCA)中止反應(yīng)。之后離心分離，加入硫代巴比土酸(thiobarbiturate)，通過在530 nm處吸收值，測定環(huán)加氧酶活性(Evans等，1987，Biochem．Pharamac．362035-2037；Boopathy和balasubramanian，1988，生物化學(xué)雜志239371-377)。
下列參照化合物用于抑制環(huán)加氧酶-1化合物 ED50(μM)阿司匹林240吲哚美辛1．7在初始濃度3×10-4下篩選化合物和組分。如果在3×10-4下觀察到大于50％抑制，繪出全劑量反應(yīng)曲線。
6．4．4．4白細(xì)胞三烯C4合成酶生物檢測另一個(gè)炎癥過程中涉及的酶是白細(xì)胞三烯C4合成酶(LTC4)，從大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞(RB-1)制備部分純化的酶制品。LTC4的甲基酯和粗品酶制品在白蛋白和絲氨酸硼酸鹽存在下、15℃保溫25分鐘。通過加入冰-冷甲醇中止反應(yīng)。應(yīng)用RIA讀數(shù)方法，LTC4的形成被認(rèn)為是酶活性的指標(biāo)(Bach等，生物化學(xué)藥理學(xué)(Biochem．Pharmacol)，342695-2704，1985)。
6．4．4．5白細(xì)胞介素-6生物檢測該物質(zhì)對白細(xì)胞介素-6(IL-6)與其受體結(jié)合的抑制活性，應(yīng)用從U266人骨髓瘤細(xì)胞制備的部分純化制品，進(jìn)行測定。必要的檢測涉及使用最終濃度為80pM的[125I]IL-6。反應(yīng)在22℃下進(jìn)行24小時(shí)。在40nM IL-6存在下，測定非特異性結(jié)合(Lida，J．等，J．Exp．Med．，166967-981，1987)。
6．4．4．5白細(xì)胞三烯B4生物檢測相反，該物質(zhì)對白細(xì)胞三烯B4受體的抑制特性，應(yīng)用從豚鼠脾膜制備的部分純化的受體進(jìn)行測定。放射性配體使用最終濃度為0．5nM的[3H]-白細(xì)胞三烯B4。加入500nM白細(xì)胞三烯B4，測定非特異性結(jié)合。檢測反應(yīng)在含有NaCl、MgCl2、EDTA和桿菌素的磷酸鹽緩沖液(pH 7．4)中、0℃下進(jìn)行2小時(shí)。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應(yīng)混合物，中止反應(yīng)。通過液體閃爍計(jì)數(shù)測定結(jié)合放射性活性(Cardiner，P．J．等，歐洲藥理學(xué)雜志(Eur．J．Pharmac．)182291-299，1990)。
6．4．5．蛋白激酶C生物檢測在應(yīng)用從小鼠大腦膜制備的酶的結(jié)合檢測中，檢測了蛋白激酶C。放射性配體使用最終濃度為4nM的[3H]-佛波酯二丁酸鹽(PDBu)。為了測定非特異性結(jié)合，反應(yīng)中使用1μM PDBu。檢測反應(yīng)在含有1％BSA和0．5nM CaCl2的50nM Tris-HCl(pH 7．4)中進(jìn)行。反應(yīng)在37℃下進(jìn)行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速過濾樣品，中止反應(yīng)。通過液體閃爍計(jì)數(shù)測定特異性活性的量(Dunphy，W．G．等，癌癥研究(Cancer Res．)403635-3641，1980)。
6．4．6．酪氨酸激酶生物檢測兩種檢測集中于該物質(zhì)對兩種酪氨酸激酶的抑制特性。第一種檢測的酪氨酸激酶為外皮生長因子酪氨酸激酶(EGF TK)?；旧显摍z測涉及將編碼人EGF受體(EGF TK)的細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)cDNA，在Sf9昆蟲細(xì)胞的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。通過使用固定合成多肽作為酶作用物，激酶檢測測定了69 kD激酶區(qū)的活性。隨后反應(yīng)10分鐘，通過和單克隆抗-磷酸酪氨酸抗體保溫，測定磷酸化酪氨酸殘?jiān)?。通過和維生素H-相關(guān)的抗小鼠IgG，隨后和鏈酶抗生物素(streptavadin)相關(guān)的β-牛乳糖酶保溫，定量結(jié)合抗-磷酸酪氨酸抗體。測定了熒光素-二-β-半乳糖苷轉(zhuǎn)化為熒光素引起的熒光。通過加入苯乙基-β-硫代半乳糖苷(β-半乳糖苷酶的可逆性競爭抑制劑)，中止和熒光素-二-β-半乳糖苷的反應(yīng)(Geissler等，1990，生物化學(xué)雜志(J．Biol．Chem．)，26522255-22261)。
第一種檢測的激酶為從牛胸腺部分純化的p59fyn酪氨酸激酶(FYNTK)。使用固定合成多肽作為酶作用物的熒光終點(diǎn)ELISA，用作酶作用物。該物質(zhì)和／或載體與酶預(yù)保溫15分鐘。隨后在100μM ATP存在下激酶反應(yīng)10分鐘，檢測磷酸化酪氨酸殘?jiān)?，作為用于EGF TK的描述(Appleby等，1992，細(xì)胞(Cell)70751-763)。
6．4．7．谷氨酸受體生物檢測對于谷氨酸受體活性，進(jìn)行了三種檢測。在第一種檢測中，研究了谷氨酸受體位點(diǎn)的拮抗(NMDA)。銀杏提取物和組分對谷氨酸NMDA拮抗位點(diǎn)的結(jié)合檢測，可以應(yīng)用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行(例如，Lehmann等，1988，J．Pharmac．Exp．Ther．24665-75；Murphy等，1987，J．Pharmac．Exp．Ther．240778-784)。這里，受體為從大鼠前腦制備的部分純化材料。放射性配體為最終配體濃度2nM的[3H]-CGP 39653。應(yīng)用1mMNMDA測定了非特異性結(jié)合。檢測反應(yīng)在50mM Tris-醋酸(pH 7．4)、0-4℃下進(jìn)行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應(yīng)混合物，中止反應(yīng)(Lehmann，J．等，J．Pharmac．Exp．Ther．，24665-75，1988)。
在谷氨酸受體的第二種檢測中，應(yīng)用最終濃度5nM的[3H]-AMPA進(jìn)行反應(yīng)。應(yīng)用100μM AMPA測定了非特異性結(jié)合。檢測反應(yīng)在10mMK2HPO4／100mM KSCN(pH 7．5)、0-4℃下進(jìn)行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應(yīng)混合物，中止反應(yīng)(Nurphy等，1987，神經(jīng)化學(xué)研究(Neurochem．Res．)12775-781)。
在谷氨酸受體的第三種檢測中，應(yīng)用從大鼠皮層膜制備的部分純化受體，使用最終濃度為10nM的放射性配體[3H]-氨基乙酸。在1mM氨基乙酸存在下測定非特異性結(jié)合。檢測反應(yīng)在50mM HEPES(pH7．1)、4℃下進(jìn)行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應(yīng)混合物，中止反應(yīng)(Snell等，歐洲藥理學(xué)雜志(Eur．J．Pharmacol．)53370-375，1987)。
6．4．8．蠅蕈堿M1結(jié)合生物檢測銀杏提取物、組分和化合物對蠅蕈堿M1結(jié)合檢測，應(yīng)用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行(例如，Watson等，1983，生命科學(xué)(Life Sciences)323001-3011；Luthin和Wolfe，1984，Molec．Pharmac．26164-169)。
通過實(shí)施例，但不是限制，按照下面簡要描述進(jìn)行蠅蕈堿M1結(jié)合檢測。
應(yīng)用從牛紋狀體膜制備的部分純化受體，最終濃度為1．0nM的放射性配體[3H]-硝化甘油(70-87 Ci／mmol)和阿托品，在25mM HEPES(pH 7．4)、25℃下反應(yīng)60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾，中止反應(yīng)。測定過濾器上捕集到的放射性活性，和對照值相比較，以確定測試化合物和蠅蕈堿結(jié)合位點(diǎn)的任何相互作用。
參照化合物 Ki(nM)阿托品 0．4哌侖西平4．5替?zhèn)愓燮?4．5檢測特性KD(結(jié)合親和性)2．2 nMBmax(受體數(shù)量) 1．4pmol／mg蛋白質(zhì)6．4．9．鈉通道生物檢測為了測定該物質(zhì)對鈉通道，位點(diǎn)2(鈉通道)的活性，從大鼠前腦制備粗品受體制品，使用的放射性配體[3H]-蟾毒素最終濃度為2nM。在100nM烏頭堿存在的條件下測定非特異性結(jié)合。檢測反應(yīng)在含有130mM膽堿氯化物的50mM HEPES(pH 7．4)中、37℃下進(jìn)行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾，中止反應(yīng)，通過閃爍計(jì)數(shù)測定特異性活性(Creveling，C．R．分子藥理學(xué)(Mol．Pharmacology)23350-358，1983)。
6．4．10．單胺氧化酶生物檢測應(yīng)用小鼠肝線粒體膜作為部分純化的酶源，測定了MAOA酶活性(MAOA)的抑制。酶作用物為[14C]-5-羥色胺，應(yīng)用1μM的Ro 41-1049，對非特異性活性進(jìn)行了測定。反應(yīng)包括酶作用物向[14C]-5-羥基吲哚乙醛+NH4+的轉(zhuǎn)化。簡要地，酶和該物質(zhì)、亞型特異性阻滯劑司來吉蘭(300nM)在37℃、100mM KPO4(pH 7．2)下預(yù)保溫60分鐘。加入酶作用物，再保溫10分鐘。通過加入0．5ml的2M檸檬酸中止反應(yīng)。放射性產(chǎn)物用甲苯／乙酸乙酯氟提取，應(yīng)用閃爍分光光度測定法和對照樣品進(jìn)行比較(Otsuka，S．和Kobayashi，Y．，1964，生物化學(xué)藥理學(xué)(Biochem．Pharmacol．)13995-1006)。
為了檢測該物質(zhì)對MAOB抑制的生物活性，還使用大鼠肝線粒體膜作為部分純化的酶源，測定了MAOB酶活性(MAOB)。酶作用物為[14C]-苯乙胺。在1μM的Ro 166491存在的條件下，對非特異性酶活性進(jìn)行了測定。簡要地，酶和亞型選擇性阻滯劑氯吉靈(300nM)在37℃、100mM KPO4(pH 7．2)下預(yù)保溫60分鐘。然后加入酶作用物，再保溫7分鐘。通過加入0．5ml的2 M檸檬酸中止反應(yīng)。然后像檢測MAOA酶一樣檢測放射活性(Otsuka，S．和Kobayashi，Y．，1964，生物化學(xué)藥理學(xué)(Biochem．Pharmacol．)13995-1006)。
6．4．11．5-羥色胺受體結(jié)合生物檢測還評(píng)價(jià)了5-羥色胺受體結(jié)合的抑制。粗品受體制品從大鼠皮層膜制備。使用的放射性配體[3H]-麥角酰二乙胺最終濃度為5nM。檢測反應(yīng)在含有4mM CaCl2、0．1mM巴吉林和0．1％抗壞血酸的50mM Tris-鹽酸(pH 7．4)中、37℃下進(jìn)行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾，中止反應(yīng)，通過液體閃爍計(jì)數(shù)測定特異性活性(Peroutka，S．J．和Snyder，S．H．分子藥理學(xué)(Mol．Pharmacology)16687-699，1979)。
6．4．12．促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子結(jié)合生物檢測銀杏提取物和組分與促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)結(jié)合檢測，可以應(yīng)用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行(De Souza，1987，神經(jīng)科學(xué)(Neuroscience)788-100；De Souza，1985，神經(jīng)科學(xué)(Neuroscience)53189-3203)。
通過實(shí)施例，但不是限制，按照下面簡要描述進(jìn)行CRF結(jié)合檢測。
使用來源于大鼠皮層膜的受體，最終配體濃度為0．1nM的放射性配體[125I]-Tyr-OCRF(2200 Ci／mmol)，和Tyr0-OCRF(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子，Tyr0-綿羊)，在含有10mM MgCl2、2mM EGTA和0．3％BSA和0．12 TIU／ml抑肽酶的50mM HEPES中、25℃下進(jìn)行反應(yīng)120分鐘。通過檢測管在Sorvall離心機(jī)中4℃下離心15分鐘，中止反應(yīng)。重復(fù)洗滌后，收集得到的小球，置于管中，應(yīng)用γ光譜測定法評(píng)價(jià)組織小球中捕集到的放射性活性。
參照化合物 Ki(nM)OCRF2．3Tyr0-OCRF 4．1α-螺旋狀OCRF(9-41) 41．1檢測特性KD(結(jié)合親和性)4．5 nMBmax(受體數(shù)量)243 pmol／mg蛋白質(zhì)6．4．13．組胺H2受體生物檢測為了測定該物質(zhì)對組胺H2(H2)受體的抑制活性，從豚鼠紋狀體膜制備粗品受體制品。使用的放射性配體[3H]-tiotdine最終濃度為4nM，在10nM西米替丁存在的條件下測定非特異性結(jié)合。檢測反應(yīng)在50mM NaKPO4緩沖液(pH 7．4)中25℃下進(jìn)行20分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應(yīng)混合物，中止反應(yīng)(Martinez-Mur，1990，大腦研究(Brain Res．)，526322-327)。
6．4．14．煙堿受體生物檢測應(yīng)用從大鼠皮層膜部分純化的受體，對神經(jīng)元煙堿受體進(jìn)行檢測。使用的放射性配體為最終濃度為5nM的[3H]N-甲基氨基甲酰膽堿碘化物。在1μM煙堿硫酸鹽存在下測定非特異性結(jié)合。檢測反應(yīng)在含有120mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、和3μM阿托品硫酸鹽的50mM Tris-鹽酸(pH 7．4)中、4℃下進(jìn)行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應(yīng)混合物，中止反應(yīng)(Boska和Quirion，1987，歐洲藥理學(xué)雜志(Eur．J．Pharmacology)139323-333)。
6．4．15．阿片受體生物檢測為了測定該物質(zhì)對阿片受體的抑制活性，受體從大鼠前腦部分純化。使用的配體為1nM的[3H]-納洛酮，但在1μM納洛酮存在下測定非特異性結(jié)合。檢測在50mM Tris-鹽酸(pH 7．4)、25℃下進(jìn)行90分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應(yīng)混合物，中止反應(yīng)(Pert，C．和Snyde，S．H．，1974，分子藥理學(xué)(Mol．Pharmacology)19868-879)。
6．4．1 6．多巴胺攝取生物檢測為了測定該物質(zhì)對多巴胺受體(dp)的抑制活性，進(jìn)行了下列檢測。應(yīng)用[3H]-螺環(huán)哌啶苯作為配體(最終濃度為0．3nM)，從牛紋狀體膜制備部分純化的受體。為了測定非特異性結(jié)合，用1μM的冷螺環(huán)哌啶苯進(jìn)行測定。反應(yīng)在含有120mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2和1mM MgCl2的50mM Tris-鹽酸(pH 7．7)、37℃下進(jìn)行60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應(yīng)混合物，中止反應(yīng)(Leysen等，1978，生物化學(xué)藥理學(xué)(Biochem．Pharmacol．)27307-316)。
6．4．17．血管緊縮素Ⅱ生物檢測表明該物質(zhì)活性的其它生物檢測有血管緊張素Ⅱ，2型，中心(AT2)。從牛小腦膜制備部分純化的受體。作為放射性配體的[125I]-tyr4-血管緊張素Ⅱ的最終濃度為0．1nM。在50nM人血管緊張素Ⅱ存在的條件下，對非特異性結(jié)合進(jìn)行了測定。檢測反應(yīng)在含有NaCl、EDTA和BSA的磷酸鹽緩沖液(pH 7．4)中進(jìn)行，在37℃下反應(yīng)60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上快速真空過濾反應(yīng)混合物，中止反應(yīng)，通過γ計(jì)數(shù)測定特異性活性(Bennett和Synder，1976，生物化學(xué)雜志(J．Bio．Chem．)2517423-7430)。
6．4．18．過氧化物歧化酶的抑制的生物檢測在體內(nèi)已觀察到銀杏提取物對抗幾種自由基的抗氧化特性。應(yīng)用不含萜烴的類黃酮組分或不含類黃酮的萜烴組分，對該作用的機(jī)理進(jìn)行研究。
在最近N．Haramaki等的文章中(1996，抗氧化劑健康疾病(Antioxidant Health Disease)3487-510)，討論了EGb 761(24％的類黃酮和6％的類萜烯)抗氧化特性。該提取物抑制黃嘌呤氧化酶活性，以劑量依賴型，并具有最大抑制(70％-80％)。因?yàn)辄S嘌呤氧化酶是重要的過氧化物源，對該酶的抑制可以歸結(jié)于EGb 761的抗氧化特性。
為了檢測化合物的活性，從Sigma化學(xué)公司購買酶過氧化物歧化酶和黃嘌呤氧化酶。反應(yīng)在含有0．3mM黃嘌呤、0．6mM EDTA、1％牛血清白蛋白、150μM氮蘭四唑、0．06U黃嘌呤氧化酶、400mM Na2CO3(pH 10．2)和定量的SOD或測試化合物的混合物中進(jìn)行。通過加入黃嘌呤氧化酶開始酶反應(yīng)，在25℃下進(jìn)行20分鐘。通過550nm處吸收的讀數(shù)，測定甲_的生成。然后計(jì)算該反應(yīng)的SOD或測試化合物的百分比抑制。測試化合物的最初篩選在10μM的濃度下(Sun，Y等，臨床化學(xué)(Clin．Chem．)34497-500，1988)。SOD的IC50為2．1nM。提取物及其組分的參照化合物為銀杏苦內(nèi)酯A、B和C和白果內(nèi)酯(Sigma化學(xué)公司)。
6．4．19．抗癌檢測有許多標(biāo)準(zhǔn)的生物檢測可以評(píng)價(jià)銀杏的抗癌活性。這些檢測可以涉及使用整個(gè)動(dòng)物或癌細(xì)胞系。Itokawa等(1987，化學(xué)藥學(xué)公報(bào)(Chem．Pharm．Bull．)353016-3020)描述了銀杏細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的漆樹酸、白果酚和腰果酚的抗腫瘤作用。
優(yōu)選的生物檢測將涉及標(biāo)準(zhǔn)增殖檢測，應(yīng)用癌細(xì)胞系(例如，MCF-7[乳腺癌]、HeLa[宮頸癌]、SCC-25[鱗狀細(xì)胞癌]、NCI-H446[肺癌]、HL-60[急性早幼粒細(xì)胞白血病]、Hep G2[肝細(xì)胞瘤]、COLO 320 DM[結(jié)腸癌系])和該物質(zhì)或溶劑對照培養(yǎng)最多10天。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，測定細(xì)胞數(shù)或菌落形成。該化合物的細(xì)胞數(shù)和對照進(jìn)行比較，以測定該物質(zhì)的IC50。
6．4．20．生物活性檢測結(jié)果通過實(shí)驗(yàn)，檢測了銀杏的幾種生物活性。結(jié)果如下表8所示。
表8生物檢測數(shù)據(jù)
+表示數(shù)量不能準(zhǔn)確測定的正結(jié)果。
6．4．20．1．PAF檢測例如，但不是限制，PAF活性是在暴露于銀杏提取物和組分后進(jìn)行的。對兩種提取物、27種組分和4種參照標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行了生物檢測，以測定PAF和其受體的拮抗的程度(表9)。提取物(GB300和GB301)為商業(yè)購買的干燥銀杏提取物。組分2-28如上6．3．1．部分所描述的那樣獲得。純的銀杏苦內(nèi)酯和白果內(nèi)酯可從商業(yè)或美國主要藥學(xué)院校獲得。實(shí)施例PAF實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如下表9所示。
表13實(shí)施例PAF生物檢測結(jié)果
表明沒有生物活性的提取物由于許多不同情況可能得到具有生物活性的組分。第一，分餾當(dāng)除去非活性成分后，生物活性的濃度增加。第二，組分可以除去干擾物質(zhì)，其可以是通過和配體絡(luò)合阻滯活性位點(diǎn)活性結(jié)合，或直接和活性位點(diǎn)競爭性附著。第三，化學(xué)組成可能在分餾中改變。例如，在大蒜中，蒜氨酸可以轉(zhuǎn)化為蒜素。另外，提取物或油的溶解度可能妨礙獲得足夠高濃度的提取物。
6．4．20．2．其它檢測進(jìn)一步通過實(shí)施例，不是限制，對指示生物檢測的活性進(jìn)行測定，如下表10所示。
表10
6．5．化學(xué)檢測應(yīng)用GC-MS和HPLC對銀杏進(jìn)行化學(xué)檢測。主要成分為黃酮醇和黃酮(主要為櫟精和4’，5，7-三羥黃酮醇)、糖甙、白果內(nèi)酯(倍半萜烯)、異銀杏黃素、銀杏苦內(nèi)酯A、B、C、M & J(雙萜內(nèi)酯衍生物)、6-羥基犬尿喹啉酸、莽草酸、原兒茶酸、香草酸、對羥基苯甲酸、前花色素(proanthrocyanidins)、阿福豆苷、生物類黃酮、sciopitysin、銀杏黃素、白果黃素和銀杏酚酸。
為了評(píng)價(jià)銀杏中幾種生物活性化合物的濃度，按上面描述檢測了六種商業(yè)獲得的產(chǎn)品。測試的結(jié)果如下表11和圖＃4所示。表11銀杏產(chǎn)品比較
通過實(shí)例，應(yīng)用商業(yè)獲得的銀杏提取物和上面描述的方法，測定了銀杏幾種生物活性成分的濃度。這些成分的水平如下表12所示。
本文中描述和要求的本發(fā)明不只限于本文公開的具體實(shí)施方案的范圍，因?yàn)檫@些實(shí)施方案只是想作為本發(fā)明幾個(gè)方面的舉例說明。任何等同的實(shí)施方案應(yīng)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，除了本文展示和描述的修改之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以從上文描述明顯地得出許多修改。這些修改也應(yīng)落在后面的權(quán)利要求范圍內(nèi)。在本申請中，在括號(hào)中引用了許多出版物和專利。它們的內(nèi)容在這里引用作為本申請的參考。
權(quán)利要求
1．一種用于測定銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏的方法，該方法包括以下步驟將含有多種成分的具有生物活性的銀杏材料的有代表性部分分成多個(gè)標(biāo)記組分，其中至少一種標(biāo)記組分中含有至少一種活性成分；測定至少一種標(biāo)記組分的生物活性，以提供有代表性部分的生物活性指紋；和將有代表性部分的生物活性指紋和已建立的藥用級(jí)銀杏的生物活性指紋標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。
2．權(quán)利要求1的方法，其中至少一種標(biāo)記組分含有至少一種活性成分。
3．權(quán)利要求1的方法，還包括以下步驟測定至少一種標(biāo)記組分中活性成分的量，以提供有代表性部分的定量組成指紋；和將有代表性部分的定量組成指紋和已建立的藥用級(jí)銀杏的定量組成指紋標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。
4．權(quán)利要求1的方法，還包括以下步驟測定銀杏材料中有代表性部分的總體生物活性；和將有代表性部分的總體生物活性和總體生物活性標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。
5．權(quán)利要求1的方法，其中銀杏材料為醇提取物。
6．權(quán)利要求1的方法，其中銀杏材料為水或有機(jī)提取物。
7．權(quán)利要求1的方法，其中銀杏材料為超臨界二氧化碳提取物。
8．權(quán)利要求1的方法，其中銀杏材料為油。
9．權(quán)利要求1的方法，其中銀杏材料為粉末狀植物藥材。
10．權(quán)利要求1的方法，其中銀杏材料為均一的材料。
11．權(quán)利要求1的方法，其中銀杏材料為植物藥材的混合物。
12．權(quán)利要求1的方法，其中至少一種活性成分為內(nèi)酯。
13．權(quán)利要求12的方法，其中內(nèi)酯為銀杏苦內(nèi)酯。
14．權(quán)利要求13的方法，其中銀杏苦內(nèi)酯為銀杏苦內(nèi)酯A。
15．權(quán)利要求13的方法，其中銀杏苦內(nèi)酯為銀杏苦內(nèi)酯B。
16．權(quán)利要求13的方法，其中銀杏苦內(nèi)酯為銀杏苦內(nèi)酯C。
17．權(quán)利要求12的方法，其中內(nèi)酯為白果內(nèi)酯。
18．權(quán)利要求1的方法，其中生物活性是用于治療或改善心血管疾病的使用指標(biāo)。
19．權(quán)利要求1的方法，其中生物活性是用于治療或改善精神疾病的使用指標(biāo)。
20．一種用于測定銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏的方法，該方法包括以下步驟提供含有多種具有生物活性的成分的銀杏材料，其中至少一種成分具有標(biāo)準(zhǔn)化的生物活性譜；將銀杏材料中有代表性的部分分成多個(gè)標(biāo)記組分，其中至少一種標(biāo)記組分中含有至少一種活性成分；測定至少一種標(biāo)記組分中至少一種活性成分的量；根據(jù)存在的至少一種活性成分的量和標(biāo)準(zhǔn)化的生物活性譜，計(jì)算至少一種標(biāo)記組分的生物活性，以提供有代表性部分的計(jì)算生物活性指紋；和將有代表性部分的計(jì)算生物活性指紋和已建立的藥用級(jí)銀杏的生物活性指紋標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。
21．權(quán)利要求20的方法，其中該方法還包括其它步驟測定銀杏材料中有代表性部分的總體生物活性；和將有代表性部分的總體生物活性和總體生物活性標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。
22．權(quán)利要求20的方法，其中銀杏材料為水或有機(jī)提取物。
23．權(quán)利要求20的方法，其中銀杏材料為粉末狀植物藥材。
24．權(quán)利要求20的方法，其中銀杏材料為均一的材料。
25．權(quán)利要求20的方法，其中銀杏材料為植物藥材的混合物。
26．權(quán)利要求20的方法，其中至少一種活性成分為內(nèi)酯。
27．權(quán)利要求20的方法，其中至少一種活性成分為銀杏苦內(nèi)酯。
28．權(quán)利要求20的方法，其中至少一種活性成分為白果內(nèi)酯。
29．權(quán)利要求20的方法，其中生物活性是用于治療或改善心血管疾病的使用指標(biāo)。
30．權(quán)利要求20的方法，其中生物活性是用于治療或改善精神疾病的使用指標(biāo)。
31．權(quán)利要求1、4、20或21的方法，其中至少一種標(biāo)記組分含有一組相關(guān)成分。
32．一種用于用于測定銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏的方法，該方法包括提供具有生物活性的銀杏材料，其中銀杏材料含有多種成分；將銀杏材料中有代表性部分分成多個(gè)標(biāo)記組分，其中至少一種標(biāo)記組分中含有至少一種活性成分；測定至少一種標(biāo)記組分的生物活性，以提供有代表性部分的生物活性指紋；和將有代表性部分的生物活性指紋和已建立的藥用級(jí)銀杏的生物活性指紋標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。
33．權(quán)利要求32的方法，其中至少一種活性成分為內(nèi)酯。
34．一種用于用于測定銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏的方法，該方法包括應(yīng)用選自GABAA檢測，GABA苯并二氮卓中心檢測，白細(xì)胞三烯C4合成酶檢測，5-脂肪氧合酶檢測和單胺氧化酶A檢測的生物檢測測定銀杏材料有代表性部分的總體生物活性；和將有代表性部分的總體生物活性和總體生物活性標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。
35．一種用于測定銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏的方法，該方法包括將含有多種成分的銀杏材料中有代表性部分分成多個(gè)標(biāo)記組分，其中至少一種標(biāo)記組分中含有至少一種活性成分；測定至少一種標(biāo)記組分中活性成分的量，以提供有代表性部分的定量組成指紋；和將有代表性部分的定量組成指紋和和已建立的藥用級(jí)銀杏的定量組成指紋標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。
36．一種用于用于測定銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏的方法，該方法包括測定銀杏材料有代表性部分的總體生物活性；和將有代表性部分的總體生物活性和總體生物活性指紋標(biāo)準(zhǔn)相比較，以確定該銀杏材料是否為藥用級(jí)銀杏。
37．一種按照權(quán)利要求1、20、32、34、35或36的方法確定的藥用級(jí)銀杏。
38．一種按照權(quán)利要求1的方法確定的藥用級(jí)銀杏，其中至少一種標(biāo)記組分含有一組相關(guān)成分。
39．按照權(quán)利要求1的方法確定的藥用級(jí)銀杏，其中至少一種標(biāo)記組分含有至少兩種活性成分。
40．權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中所說的多種成分含有至少一種選自下組的成分包括穗花杉雙黃酮、漆樹酸、白果內(nèi)酯、γ-氨基丁酸、銀杏苦內(nèi)酯A、銀杏苦內(nèi)酯B、銀杏苦內(nèi)酯C、谷氨酸、谷氨酰胺、檜黃素、異鼠李黃素、4’，5，7-三羥黃酮醇、脯氨酸、和櫟精。
41．權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中至少一種標(biāo)記組分含有至少一種選自下組的活性成分包括穗花杉雙黃酮、漆樹酸、白果內(nèi)酯、γ-氨基丁酸、銀杏苦內(nèi)酯A、銀杏苦內(nèi)酯B、銀杏苦內(nèi)酯C、谷氨酸、谷氨酰胺、檜黃素、異鼠李黃素、4’，5，7-三羥黃酮醇、脯氨酸、和櫟精。
全文摘要
本發(fā)明一般性涉及銀杏材料和用于制備該材料(醫(yī)學(xué)有用,并且具有藥學(xué)可接受的劑型)的方法。更具體地,本發(fā)明涉及組合物和在將銀杏材料制備成藥物的加工過程中的活性指紋的應(yīng)用,其中限定為藥用級(jí)組合物,其適合于臨床或獸醫(yī)應(yīng)用,以治療和/或改善疾病、病癥或癥狀。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1290349SQ98812473
公開日2001年4月4日 申請日期1998年10月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月23日
發(fā)明者塔斯尼姆·A·赫瓦賈, 埃利奧特·P·弗西德曼 申請人:法瑪普林特公司, 南加州大學(xué)