亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

整合蛋白結(jié)合肽及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:1071735閱讀:265來源:國知局
專利名稱:整合蛋白結(jié)合肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬蛋白治療領(lǐng)域,更具體地說,本發(fā)明涉及環(huán)肽及其應(yīng)用,尤其這些肽阻斷或抑制整合蛋白生物活性的應(yīng)用。
背景技術(shù)
整合蛋白為異二聚細(xì)胞表面糖蛋白,其由非共價(jià)連接的α和β亞基組成。已識別出16個(gè)α亞基,8個(gè)β亞基。發(fā)現(xiàn)了這些亞基約20多種不同組合。
整合蛋白通過調(diào)節(jié)細(xì)胞-基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用錨定細(xì)胞于周圍環(huán)境中(綜述見Hemler.M.E.免疫學(xué)年述8365-400(1990);和Hynes,R.O.細(xì)胞6911-25(1992)和本文所引用的)。整合蛋白對細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的識別是細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的基本現(xiàn)象。纖粘連蛋白是含RGD蛋白的原型。此外,哺乳動(dòng)物,鳥,蛙,和昆蟲中的大量其它基質(zhì)分子通過其RGD序列調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附。包含β1,β3,β5,或β6亞基的整合蛋白異二聚體可形成RGD-依賴性受體(Ruoslachti,E.,臨床研究雜志871-5(1991);Busk,M.等,.生物化學(xué)雜志.2677875-7881(1992);和Elices,M.J.等細(xì)胞生物學(xué)雜志.112169-181(1991))。在β1亞基中,RGD-結(jié)合位點(diǎn)被作圖于分子的氨基末端部分,有一些證據(jù)表明α亞基可能影響此相互作用(Shih,D.T.等.細(xì)胞生物學(xué)雜志。1221361-1371(1993))。綜上所述,10個(gè)整合蛋白異二聚體具有共同的β1亞基,因此還具有推測的RGD-結(jié)合位點(diǎn)。然而,多數(shù)β1整合蛋白具有其它配體結(jié)合的機(jī)制。變性纖維膠原被RGD-依賴性整合蛋白,如α5β1識別,而天然膠原與整合蛋白以非RGD-依賴性方式相互作用(Gullberg,D.等.歐洲分子生物學(xué)雜志.113865-3873(1992))。
兩個(gè)整合蛋白,α1β1和α2β1雜二聚體,為天然膠原的主要細(xì)胞受體,如同所有整合蛋白,其與配體的相互作用依賴于二價(jià)陽離子(Staatz,W.D.等,生物化學(xué)雜志.2667363-7387(1991))。整合蛋白α2β1例如在上皮細(xì)胞,血小板,肉芽組織細(xì)胞,和多種癌細(xì)胞中表達(dá)。其中α2β1整合蛋白活性(功能)是基本的生物學(xué)現(xiàn)象包括膠原誘導(dǎo)的血小板集合,細(xì)胞在膠原上遷移,膠原纖維的細(xì)胞依賴性重組。癌癥生物學(xué)中,α2β1整合蛋白與侵染性細(xì)胞表型有關(guān),它可為侵占性黑素瘤的標(biāo)記。另一方面,α2β1在乳腺癌細(xì)胞過表達(dá)恢復(fù)正常細(xì)胞表型。如其他整合蛋白,α2β1還能產(chǎn)生調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和基因表達(dá)的信號。尤其是膠原酶-1的mRNA水平似乎受α2β1整合蛋白控制。
α1和α2亞基在其結(jié)構(gòu)上與所有其它β1關(guān)聯(lián)的α亞基不同,它們含有特殊“插入”區(qū),I區(qū),該區(qū)類似例如在Willenbrand因子中發(fā)現(xiàn)的A區(qū)(Michishita,M.等,細(xì)胞72857-867(1993))。顯然,α1I和α2I區(qū)負(fù)責(zé)膠原被相應(yīng)整合蛋白的初步識別(Kamata,T等,生物化學(xué)雜志.2699659-9663(1994);Kamata,T.等.生物化學(xué)雜志26926006-26101(1994)Kern,A.等.,生物化學(xué)雜志.26922811-22816(1994)).α2β1整合蛋白的其它兩個(gè)配體,即層粘連蛋白-1和艾可病毒-1,也均與α2I-區(qū)結(jié)合。但是,艾可病毒-1看來識別不同于基質(zhì)蛋白的α2I-區(qū)上的不同位點(diǎn)(Bergelson,J.M.等.臨床研究雜志.92232-239(1993))。
膠原中α1β1和α2β1整合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)被定位于分子的三螺旋區(qū)(Eble,J.A.等,歐洲分子生物學(xué)雜志.124795-4802(1993);Gulberg,D.等113865-3873(1992))。有報(bào)道稱來自膠原α鏈的一條肽序列阻斷整合蛋白-膠原相互作用,但在許多研究中它是無效,它可能不代表膠原的實(shí)際結(jié)合位點(diǎn)(Cardarelli,P.M.等,生物化學(xué)雜志.26723159-23164(1992);Pfaff,M.等,Exp.Cell Res.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究.206167-176(1993);和Tuckwell,D.等.細(xì)胞科學(xué)雜志.1081629-1637(1995)).更可能是膠原-受體整合蛋白識別來自超過一條膠原α鏈的氨基酸殘基。在IV型膠原-α1β1整合蛋白相互作用中,表明了均來自膠原的不同α鏈的一個(gè)精氨酸和兩個(gè)天冬氨酸殘基的重要性(Eble,J.A.等.,歐洲分子生物學(xué)雜志.124795-4802(1993))。
已知的α2β1整合蛋白的基質(zhì)分子配體不包含RKK(H)序列。富含精氨酸,來自人免疫缺陷病毒Tat蛋白的線性肽包括一個(gè)RKK序列,表現(xiàn)出與αVβ5整合蛋白相互作用(Vogel,B.E.等,細(xì)胞生物學(xué)雜志121461-468(1993))。但是發(fā)現(xiàn)整合蛋白-肽相互作用在EDTA存在下穩(wěn)定,暗示了獨(dú)特的結(jié)合機(jī)制。以前還描述了在包含RKK序列基元的纖連蛋白中的肝素硫酸鹽結(jié)合序列,然而該序列顯然在整合蛋白rα2I區(qū)結(jié)合方面不起作用。(Drake等,生物化學(xué)雜志26815829-15867(1993))。
來自幾種蛇的毒液包含脫整合蛋白樣蛋白,它阻斷血小板整合蛋白功能并負(fù)責(zé)毒液的抗凝作用。這些蛋白有助于對整合蛋白的功能分子機(jī)制的理解,并還在新藥開發(fā)中具有潛在的價(jià)值。許多脫整合蛋白具有RGD序列,并且它們抑制血小板αIIbβ3和αVβ3整合蛋白的功能。在jararhagin中,來自凹蝰蛇中具竅蝮蛇屬巴西具竅蝮蛇(Bothropsjararaca)的脫整合蛋白/金屬蛋白酶,序列ECD置換了RGD(Paine,M.J.等.,生物化學(xué)雜志.26722869-22876(1992))。Jararhagin是膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的有效抑制劑,其作用是基于對α2β1整合蛋白功能的抑制(De Luca,M.等,生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊206570-576(1995))。其作用的確切機(jī)制不詳。整合蛋白α2β1也與jaracetin相互作用,其中jaracetin為一種含jararhagin的脫整合蛋白區(qū)的蛇毒蛋白,但相互作用看來比與和jararhagin的相互作用弱(De Luca,M.等,生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊206570-576(1993))。
發(fā)明概述本發(fā)明提供與人α2I區(qū)(天然和重組的)結(jié)合的環(huán)肽。而且,它們是人整合蛋白與膠原I和IV和層粘連蛋白-1相互作用的有效抑制劑。
本發(fā)明的環(huán)肽最初來自jararhagin的金屬蛋白酶區(qū)。本發(fā)明的每個(gè)新的整合蛋白結(jié)合蛋白包含一個(gè)三個(gè)氨基酸,精氨酸-賴氨酸-賴氨酸(RKK)的共線性序列。環(huán)肽中RKK序列的存在給予了整合蛋白結(jié)合活性。
本發(fā)明進(jìn)一步提供在肽序列中包含RKK序列基元的一或多個(gè)拷貝的環(huán)肽,這些拷貝足以使肽具有減少整合蛋白與膠原相互作用的能力。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含氨基酸序列X1RKKX2X3X4X5X6(SEQ ID NO.1)的環(huán)肽,其中氨基酸X1-X6可為任意氨基酸,但優(yōu)選X2為組氨酸(H)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供環(huán)肽,該環(huán)肽優(yōu)選包含氨基酸序列X1RKKX2X3X4X5(SEQ ID NO.2),其中氨基酸X1-X5為任意氨基酸,但優(yōu)選X2為組氨酸(H)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供環(huán)肽,該環(huán)肽較優(yōu)選包含氨基酸序列X1RKKX2X3X4的(SEQ ID NO.3),其中氨基酸X1-X4為任意氨基酸,但優(yōu)選X2為組氨酸。
本發(fā)明進(jìn)一步提供分別包含jararhagin的金屬蛋白酶區(qū)的氨基酸241-247(CTRKKHD;SEQ ID NO.6)和241-249(CTRKKHDNA;SEQ ID NO.7)的兩個(gè)環(huán)肽,CTRKKHDNC(SEQ ID NO.4)和CTRKKHDNAQC(SEQ ID NO.5),和這些肽的缺失一或多個(gè)氨基酸的環(huán)狀片斷,尤其是缺失選自C,T,H,D,N,A和/或Q的一或多個(gè)氨基酸。
本發(fā)明進(jìn)一步提供使用這些肽阻斷整合蛋白功能的方法,以及治療患有生理疾癥或疾病需要此阻斷活性患者的方法根據(jù)本發(fā)明的環(huán)狀整合蛋白結(jié)合肽也可用于從樣品混合物中分離包含α2的整合蛋白。
附圖簡要說明

圖1(A-D).固相分析中銪標(biāo)記的rα2I與不同底物的結(jié)合。微量滴定板孔中預(yù)敷I型膠原,IV型膠原,層粘連蛋白-1和纖連蛋白。讓rα2I接觸3小時(shí)(A)。在EDTA(B)或MgCl2以及不同濃度的巴西具竅蝮蛇毒液(C)存在下,讓rα2I與I型膠原接觸。另外也可將孔用巴西具竅蝮蛇毒液預(yù)敷,在MgCl2(D)存在下,讓rα2I接觸3小時(shí)。
圖2(A-B).固相分析中銪標(biāo)記的rα2I與粘附蛋白和jararhagin-衍生肽的結(jié)合。微量滴定板孔中預(yù)敷不同的肽,I型膠原,IV型膠原和纖連蛋白。數(shù)據(jù)代表來自顯示rα2I結(jié)合至不同底物(A)的三個(gè)平行試驗(yàn)的平均值。微量滴定板孔用BSA和I型膠原預(yù)敷,并在肽存在下(B),讓rα2I接觸3小時(shí)。
圖3在229ox肽存在下,rα2I與肽和巴西具竅蝮蛇毒液的接觸。將微量滴定板孔用肽或巴西具竅蝮蛇毒液預(yù)敷。在229ox存在或缺失時(shí)讓rα2I結(jié)合。數(shù)據(jù)代表來自三個(gè)平行試驗(yàn)的平均值。
圖4(A-C).229ox肽的特性。在環(huán)狀或線性229肽存在下(A),對rα2I與I型膠原結(jié)合的抑制的劑量應(yīng)答曲線。另外也可將微量滴定板孔用229ox肽(B)預(yù)敷。將229ox肽加入各種預(yù)敷底物的rα2I結(jié)合分析。
圖5. 229ox對rα2I與I型膠原和艾克病毒-1的結(jié)合的作用。將微量滴定板孔用I型膠原和艾克病毒-1預(yù)敷,在肽存在或缺失時(shí),讓rα2I結(jié)合。數(shù)據(jù)代表來自三個(gè)平行試驗(yàn)的平均值。
圖6.(A-B).丙氨酸取代的229ox肽對rα2I與I型膠原結(jié)合的抑制。將肽預(yù)敷于微量滴定板孔中,讓rα2I結(jié)合(A)。另外將微量滴定板孔用I型膠原預(yù)敷,在該肽存在時(shí)加入rα2I(B)。
圖7.(A-C).將α2I區(qū)肽(A)和rα2I(A,B)結(jié)合至固相中并加入生物素標(biāo)記的229ox。229ox肽與α2I區(qū)衍生肽的結(jié)合示于(A)。Mg++對229ox與固相結(jié)合的rα2I的結(jié)合的重要性示于(B)。Mg++對229ox與固相結(jié)合的I型膠原的結(jié)合的重要性示于(C)。
圖8.對重組α2I與膠原的結(jié)合的抑制。實(shí)心圓示229ox(CTRKKHDNAQC;SEQ ID No.5)所述濃度的作用。空心圓示248ox(CTRKKHDNC;SEQ ID No.4)的作用。
圖9(A-B).HOS-MNNG細(xì)胞在I型膠原的遷移。讓細(xì)胞與底物接觸。4天后將細(xì)胞染色,圖像分析器(A)確定細(xì)胞覆蓋的表面區(qū)和對孔進(jìn)行拍照(B)。
圖10.HaCaT和UT-SCC-2細(xì)胞在229ox和抗α2整合蛋白的Gi9抗體存在下的細(xì)胞粘附。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述以下所述中,廣泛使用許多醫(yī)學(xué)和蛋白領(lǐng)域所用的術(shù)語。為對說明書和權(quán)力要求書提供清晰一致的理解,包括這些術(shù)語所賦范圍,提供以下的定義。
“患者”指需要獸醫(yī)或醫(yī)學(xué)治療的,尤其是需要用本發(fā)明的組合物治療的動(dòng)物或人個(gè)體。
“治療”或“醫(yī)治”指為了可能包括預(yù)防,改善,防止或治療病癥或?qū)υ撍巹┟舾械臐撛诓“Y的目的,給藥包括本文所述的一或多種肽的有效量的組合物至需要的患者。
“給藥”指運(yùn)用任何適當(dāng)方法,對患者給藥期望的物質(zhì)。有益的給藥方法包括,但不僅限于,腸胃外的(例如,靜脈內(nèi)),肌肉內(nèi),皮下,離子滲透,口服,直腸和腸內(nèi)給藥。
“有效量”指足以達(dá)到所述期望結(jié)果的量。本發(fā)明的肽的有效量是足以減少或阻止或預(yù)防包含α2I區(qū)的整合蛋白與一或多個(gè)靶的功能性相互作用程度的量,其中靶在不存在本發(fā)明的肽時(shí)與整合蛋白相互作用。
“藥用鹽”指由藥物可接受的酸或堿形成的鹽,如,但不僅限于,酸如硫酸,鹽酸,硝酸,磷酸等,或堿如堿或堿土金屬氫氧化物,氫氧化銨,烷基氫氧化銨,等。
術(shù)語“藥用賦形劑”指包括溶劑,載體,稀釋液等,它們被用作本發(fā)明制劑的添加物以提供用于給藥這些化合物的載體或佐劑。
當(dāng)使用人整合蛋白時(shí),常提出以下討論和例證,本發(fā)明的肽和方法可用于任何對jarahagin是毒液的活性成分的蛇咬敏感的種類,因該活性是本發(fā)明的肽與此種類的靶整合蛋白結(jié)合能力的證據(jù)。因此,在這方面發(fā)明不限于以下使用人實(shí)施方案的討論和例證。
整合蛋白對膠原的識別類似于整合蛋白-纖連蛋白的結(jié)合。不僅膠原-結(jié)合αI區(qū)和RGD-結(jié)合推測的βI區(qū)具有結(jié)構(gòu)類似性,而且環(huán)狀RGD肽也能與α2β1整合蛋白結(jié)合。被認(rèn)為對整合蛋白與膠原結(jié)合非常重要的三個(gè)膠原氨基酸殘基包括兩個(gè)天冬氨酸和一個(gè)精氨酸。
發(fā)明者推測jararhagin中阻止rα2I區(qū)與膠原結(jié)合的基元一定包括天冬氨酸或精氨酸殘基,且此作用的關(guān)鍵基元在親水環(huán)中,因?yàn)樵诨|(zhì)分子或蛇毒液脫整合蛋白中的已知的整合蛋白識別位點(diǎn)處于親水環(huán)中。發(fā)明者對滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的jararhagin結(jié)構(gòu)中的以往未知序列進(jìn)行了檢索,并制備合成肽以用于使用整合蛋白rα2I區(qū)的固相結(jié)合分析中的檢測。
發(fā)現(xiàn)一種衍生自金屬蛋白酶區(qū)CTRKKHDNAQC(SEQ ID No.5)的肽與rα2I區(qū)強(qiáng)結(jié)合,該其中肽為,包含jararhagin的金屬蛋白酶區(qū)氨基酸241-249(任一末端的末端半胱氨酸被加至天然序列)。以下事實(shí)表明高結(jié)合親和性,即當(dāng)銪標(biāo)記的rα2I(重組α2I)粘附至該肽時(shí),在隨后2小時(shí)中未測得解吸作用,即使分析中加入過量10倍的未標(biāo)記rα2I區(qū)。
所測肽中,這種肽也是唯一抑制rα2I區(qū)與I型和IV型膠原和層粘連蛋白的肽。進(jìn)一步,此肽與巴西具竅蝮蛇毒液競爭結(jié)合rα2I區(qū)。因此,發(fā)明者得出結(jié)論對應(yīng)于以上氨基酸241-249的氨基酸序列的存在是為什么jararhagin與α2β1整合蛋白相互作用的原因。
對肽序列的突變分析揭示了一個(gè)新整合蛋白結(jié)合基元,RKK或RKKH(SEQ ID No.8)。組氨酸,RKKH序列中的第四氨基酸,也可能對整個(gè)功能至關(guān)重要。出乎意料地,肽序列中的天冬氨酸的突變不產(chǎn)生作用。已知的α2β1整合蛋白的基質(zhì)分子配體不包含RKK(H)序列。
以上發(fā)現(xiàn)的新rα2I區(qū)結(jié)合基元,或包含它的肽可防止基質(zhì)蛋白識別。除此解釋外,該作用被認(rèn)為是通過與I區(qū)配體結(jié)合位點(diǎn)直接相互作用或在I區(qū)構(gòu)像造成變異從而掩蓋配體識別位點(diǎn)而發(fā)生。此肽-依賴性rα2I區(qū)構(gòu)象的改變在實(shí)驗(yàn)中很明顯,說明伴隨對膠原結(jié)合的阻斷,該肽誘導(dǎo)rα2I區(qū)對艾可病毒-1的附著。這也說明占據(jù)配體識別位點(diǎn)可調(diào)節(jié)其它位點(diǎn)的親和性。
因此,本發(fā)明的每個(gè)新的整合蛋白結(jié)合蛋白包括一個(gè)三個(gè)氨基酸的共線性序列,精氨酸-賴氨酸-賴氨酸(RKK),當(dāng)肽為環(huán)狀時(shí),賦予肽整合蛋白結(jié)合活性。RKK序列基元的一個(gè),兩個(gè),三個(gè)或多個(gè)拷貝可存在于肽序列中,這些拷貝足為肽提供減少整合蛋白與膠原相互作用的能力。
第一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的肽是包含氨基酸序列X1RKKX2X3X4X5X6(SEQ ID NO.1)的環(huán)肽,其中每個(gè)X為一個(gè)氨基酸,氨基酸X1-X6為任意氨基酸(尤其A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F(xiàn),P,S,T,W,Y或V)但優(yōu)選X2為組氨酸(H)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中,本發(fā)明的肽是包含氨基酸序列X1RKKX2X3X4X5(SEQ ID NO.2)的環(huán)肽,其中氨基酸X1-X5如上為任意氨基酸,但優(yōu)選X2為組氨酸(H)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中,本發(fā)明的肽是包含氨基酸序列X1PKKX2X3X4(SEQ ID NO.3)的環(huán)肽,其中氨基酸X1-X4如上為任意氨基酸,但優(yōu)選X2為組氨酸(H)。
在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明的肽是具氨基酸序列CTRKKHDNC(SEQ ID NO.4)的環(huán)肽或具氨基酸序列CTRKKHDNAQC(SEQ ID NO.5)的環(huán)肽,并優(yōu)選兩個(gè)末端半胱氨酸殘基參與使肽成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的二硫鍵形成中。
本發(fā)明的環(huán)肽可缺失上述的一至多個(gè)氨基酸X,尤其一或多個(gè)C,T,H,D,N,A或Q。進(jìn)一步的,本發(fā)明的環(huán)肽可包含插入至上述序列和/或位于上述序列旁側(cè)的其它氨基酸,只要RKK基元保持共線性,使得這些肽保持與α2整合蛋白結(jié)合的能力。
末端半胱氨酸殘基僅需以導(dǎo)致肽環(huán)化的方式定位。優(yōu)選的,半胱氨酸被置于肽的末端,以致二硫鍵的形成導(dǎo)致適當(dāng)大小的環(huán),從而賦予肽的環(huán)狀形式以生物學(xué)活性。但是,一或兩個(gè)半胱氨酸殘基可能在肽內(nèi)部,而非末端,任何延伸超過半胱氨酸的“尾”可能不產(chǎn)生問題,只要它不導(dǎo)致喪失剩余肽的環(huán)狀形式。從此看來,只要肽的環(huán)狀形式不被阻礙,其為允許它為保持生物活性的構(gòu)象時(shí),則不同的部分,例如蛋白如白蛋白,可用作連接子,間隔區(qū),或與環(huán)狀肽的末端相接,從而使本發(fā)明的環(huán)狀肽連接于上固體載體,或其它所需部分,例如,可檢測標(biāo)記。
當(dāng)半胱氨酸位于肽的末端,肽優(yōu)選在半胱氨酸之間包括9個(gè)氨基酸。8個(gè)氨基酸不增強(qiáng)活性,并因此也可用于這方面。在末端半胱氨酸之間有7個(gè)氨基酸的環(huán)肽比有7或8個(gè)氨基酸的那些有效約20倍,因此尤其是優(yōu)選的。總的看來,在末端半胱氨酸之間包含10個(gè)或更多氨基酸的肽具有作用更像(無功能的)線性分子而非環(huán)狀分子的危險(xiǎn)。在末端半胱氨酸之間包含5或更少氨基酸的環(huán)肽如果不是不可能的,也極難制備。因此,在末端半胱氨酸之間包含7個(gè)氨基酸的環(huán)肽為最優(yōu)選的實(shí)施方案。
本發(fā)明的肽序列包括上述肽的變異體,這些變異體具有不重要差異的氨基酸取代,例,一個(gè)堿性氨基酸取代另一個(gè)(除在RKK基元中),一個(gè)疏水殘基取代另一個(gè),一個(gè)中性殘基取代另一個(gè),一個(gè)酸性殘基取代另一個(gè),一個(gè)芳香殘基取代另一個(gè)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中,肽的環(huán)狀形式由二硫鍵產(chǎn)生。但是,任何導(dǎo)致肽的環(huán)狀形式的共價(jià)鍵都被認(rèn)為有用,因橋的功能僅使肽處于適當(dāng)?shù)臉?gòu)象。
如本領(lǐng)域所知,使用適當(dāng)?shù)陌被螋然Wo(hù)基團(tuán),氨基酸殘基可為保護(hù)的或非保護(hù)形式??捎玫乃幬锟山邮艿年栯x子包括堿或堿土金屬陽離子(例,Na,K,Li,1/2Ca,1/2Ba,等)或氨基陽離子(例四烷基銨,三烷基銨,其中每個(gè)烷基集團(tuán)可為C1-C12,但優(yōu)選C1-C6支鏈或直鏈烷基基團(tuán))。也可制備藥物可接受的低級烷基酯,藥物可接受的氨化物和藥物可接受的酸加成鹽。
可使用本領(lǐng)域熟知的方法,例如在此收入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)的U.S.5,627,263,中所述的合成并環(huán)化本發(fā)明的肽。
根據(jù)本發(fā)明的環(huán)狀整合蛋白結(jié)合肽可用作整合蛋白功能,尤其人整合蛋白功能的阻斷劑(抑制劑)。整合蛋白與其天然配體的結(jié)合在本發(fā)明的肽存在時(shí)被抑制或阻斷。尤其,環(huán)狀整合蛋白結(jié)合肽可用于阻斷整合蛋白α2I區(qū)與和該區(qū)相互作用的大分子的相互作用,例如,與膠原如膠原I和膠原IV和層粘連蛋白的相互作用。
人重組α2I區(qū)的序列提供在Takada,Y.和M.E.Hemler,細(xì)胞生物學(xué)雜志.109397-407(1989)(在此收入?yún)⒖嘉墨I(xiàn))。α2I區(qū)可用普通重組宿主,例如,大腸桿菌來制備。其特性可用基于銪標(biāo)記的rα2I區(qū)的敏感固相分析和時(shí)間分辨熒光測定來表征。該分析使得能在無酶存在或無與之相連的其它大分子時(shí)直接測定rα2I區(qū)的結(jié)合。
本發(fā)明肽的α2整合蛋白結(jié)合能力可通過任何檢測該結(jié)合,尤其是檢測該結(jié)合阻斷整合蛋白與膠原I和膠原IV或?qū)诱尺B蛋白-1的相互作用的能力的分析法來確定。如下例證,運(yùn)用銪標(biāo)記的重組α2I區(qū)結(jié)合分析(實(shí)施例2)和檢測α2I區(qū)的病毒-1識別位點(diǎn)的活化的分析可用于此方面(實(shí)施例2)。
本發(fā)明的肽尤其可用于抑制或阻止體內(nèi)或體外細(xì)胞在膠原的遷移。本發(fā)明的肽阻斷細(xì)胞遷移的能力可用如實(shí)施例7所提供的細(xì)胞遷移分析來確定。因此,當(dāng)該遷移以整合蛋白-依賴性方式介導(dǎo)時(shí),本發(fā)明提供在體外和體內(nèi)在需要治療以抑制細(xì)胞遷移的患者中抑制細(xì)胞在膠原上遷移的方法。本發(fā)明因而提供治療疾病,包括齒根骨膜炎的治療方法,其中細(xì)胞遷移為部分致病機(jī)制。
本發(fā)明進(jìn)一步提供抑制惡性細(xì)胞遷移,并因此用于治療有此特征的疾病的方法,其中疾病例如為癌癥,包括骨肉瘤和黑素瘤,尤其是其中α2β1整合蛋白依賴的細(xì)胞遷移可能導(dǎo)致惡性機(jī)制的疾病。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種,抑制血小板對膠原的粘附和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的方法。本發(fā)明的肽抑制細(xì)胞粘附的能力可如實(shí)施例8提供的方法來確定。因此,本發(fā)明提供一種,治療需預(yù)防或改善治療疾病或病癥的方法,其中疾病或病癥如為心臟血管病,其特征在于需防止血小板對膠原的粘附和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集,例如中風(fēng)者或有中風(fēng)危險(xiǎn)的患者。
包含本發(fā)明的肽的藥物制備可尤其包含為用于穩(wěn)定和有效配制肽的藥物可接受載體。合適的賦形劑和它們包括其它人蛋白的制劑,例如人血清白蛋白,描述在Remington’s藥物科學(xué)(18版,A.R.Gennaro編,Mack出版,Easton,PA1990)。為了制備適用于對需要該組合物的病人給藥有效量的本發(fā)明的肽的藥物可接受的組合物,此組合物包含有效量的本發(fā)明的一或多種肽以及如所需的適量的載體賦形劑。
本發(fā)明的肽優(yōu)選被純化為基本上不含污染物。在細(xì)胞中或在體外系統(tǒng)如果基本上從合成時(shí)相關(guān)的非期望物質(zhì)中純化,而達(dá)到足以使其可用于所希望的目的的程度,則該物質(zhì)被稱為“基本上不含污染物”。
可用于本發(fā)明的方法的組合物可包含一種或多種本發(fā)明的肽。當(dāng)組合物中有不止一種肽時(shí),它可能是與另一肽相同氨基酸鏈的一部分,或在組合物中以單獨(dú)的肽存在。用于靜脈內(nèi),肌肉內(nèi)或皮下給藥的組合物優(yōu)選給藥劑量在約1pg/kg體重至1mg/kg體重范圍內(nèi),盡管可給藥更高或更低的劑量。所需劑量依賴于患者疾病的嚴(yán)重性,例如患者體重,性別,年齡,和醫(yī)療史等標(biāo)準(zhǔn)。劑量也依賴于它是否以獸醫(yī)學(xué)方式給藥至動(dòng)物或是給藥至病人。
對于腸胃外給藥的目的,包含本發(fā)明的肽的組合物優(yōu)選溶解在蒸餾水中,pH優(yōu)選調(diào)整到6-8。如果肽為凍干的形式,可加乳糖至溶液中以易于凍干過程在為這種形式時(shí)將溶液滅菌,裝入小瓶中,凍干。
腸胃外給藥的本發(fā)明組合物的有效制劑還包括無菌水和非-水溶劑,懸浮液和乳狀液。有用的非水溶劑的實(shí)例包括丙二醇,聚乙二醇,植物油,魚油和可注射有機(jī)酯。含水載體的實(shí)例包括水,水-乙醇溶液,乳狀液或懸浮液,包括鹽和緩沖的醫(yī)學(xué)腸胃外載體,包括氯化鈉溶液,林格葡萄糖溶液,葡萄糖加氯化鈉溶液,含乳糖的林格溶液,或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)賦形劑的實(shí)例包括流體營養(yǎng)補(bǔ)充物,電解液補(bǔ)充物,如基于林格葡萄糖的那些等。
可注射制劑,如油質(zhì)溶液劑,懸浮劑或乳狀劑,可根據(jù)已知技術(shù),按需要用合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑來配制。當(dāng)活性化合物為水溶性形式時(shí),如,為水溶性鹽的形式,則無菌的可注射制劑可采用無毒的胃腸外可接受的稀釋液或溶劑,例,無菌的非致熱原水或1,3-丁二醇。可使用的其它可接受的載體和溶劑為5%葡萄糖注射液,林格注射液和等滲的氯化鈉注射液(如在USP/NF中所述)。當(dāng)活性化合物以非水溶性形式存在,使用無菌的適當(dāng)?shù)挠蜖顟腋∫?,該油狀懸浮液包含合適的親脂性溶劑或載體,如脂肪油,例如芝麻油,或合成脂肪油脂,例如油酸乙酯或甘油三酯。另外,也可采用水性注射懸浮液,其包含增加粘性的物質(zhì),例如羧甲基纖維素鈉,山梨醇,和/或葡聚糖,并任選還可包含穩(wěn)定劑。
為了離子電滲傳遞本發(fā)明的肽,肽優(yōu)選pH為約4.0或更低,或約7.0或更高。離子等滲的方法廣為人知,例如描述在被本文引作參考的在U.S.5,637,084和U.S.4,950,229中。
用于口服(但全身性的)的藥物制劑可通過將活性化合物與固體賦形劑混合而獲得,如需要或必需,在加入合適的輔劑后任選研磨得到粒狀混合物并加工混合物或顆粒以制成糖衣錠核心的片劑。治療齒根骨膜炎的藥物制劑可以保留在口腔中的組合物形式給藥,優(yōu)選將制劑直接放入牙周腔,最優(yōu)選為持續(xù)釋放形式。也可將制劑刷在牙齒和/或牙齦上以在所需部位釋放肽。這些教導(dǎo)提供在被本文引作參考的U.S.5,002,769,U.S.5,023,082,U.S.5,160,737,U.S.5,330,746,U.S.5,425,953,U.S.5,438,076和U.S.5,639,795。制劑也可在膜上提供。
合適的賦形劑尤其為填充物如糖,例乳糖或蔗糖,甘露醇或山梨糖醇,纖維素制劑和/或磷酸鈣,例三磷酸鈣或磷酸氫鈣,以及粘合劑,如淀粉,糊,使用如玉米淀粉,小麥淀粉,米淀粉,或土豆淀粉,明膠,黃芪膠,甲基纖維素,羥基丙基甲基纖維素,羧甲基鈉纖維素,和/或聚乙烯吡咯烷酮,和/或,如需要,分散劑,如上所述的淀粉,還有羧甲基淀粉,交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮,瓊脂或藻酸或其鹽,如藻酸鈉。輔劑總的為流動(dòng)調(diào)節(jié)劑和潤滑劑,例如二氧化硅,滑石粉,硬脂酸或其鹽,如硬脂酸鎂,硬脂酸鈣,如需要合適的外殼,此殼可抗胃液,以及為了此目的,尤其是濃縮糖溶液,糖溶液可任選包含阿拉伯樹膠,滑石粉,聚乙烯吡咯烷酮,聚乙二醇和/或二氧化鈦,紫膠漆溶液和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。為了制備抗胃液的外殼,使用適宜的纖維素制劑溶液,如乙酰纖維素鄰苯二甲酸鹽或羥基丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸鹽。例如為鑒定或?yàn)榱吮碚骰钚曰衔飫┝康牟煌M合,可加染料或顏料至片劑或糖衣丸外衣中。
口服給藥的固體劑型包括膠囊劑,片劑,丸劑,片劑,錠劑干粉劑和顆粒劑。在這些固體劑型中,可將活性化合物與至少一種惰性稀釋劑混合,如蔗糖,乳糖或淀粉。這些劑型在正常情況下還可包含藥物輔助物質(zhì),如,硬脂酸潤滑劑。固體口服制劑也可用腸衣或其它調(diào)節(jié)活性組份釋放的外殼制備。
用于口服給藥的液體劑型包括包含本領(lǐng)域普遍應(yīng)用的惰性無毒稀釋劑,如水和酒精的藥物可接受的乳劑,溶液劑,懸浮液劑,糖漿和馳劑。這些組合物也可包含輔劑,如濕潤劑,乳化劑,懸浮劑,增甜劑,增味劑和香料劑。
本發(fā)明的組合物也可通過泵,或以持久釋放的形式給藥。本發(fā)明的組合物也可以通過適當(dāng)插入的導(dǎo)管高濃度傳送到特定器官,或通過以被設(shè)計(jì)靶定特定器官的嵌合分子(或復(fù)合物)的一部分的形式來提供這些分子。在這點(diǎn)上,上面的肽可在較長肽的末端形成環(huán)狀的“環(huán)”,這些肽具有擁有期待活性的第二區(qū)。這些融合蛋白可被設(shè)計(jì)來提供一段幫助殺傷細(xì)胞的區(qū),此細(xì)胞含有與本發(fā)明的環(huán)肽結(jié)合的膜結(jié)合的整合蛋白。
當(dāng)指定延長時(shí)間的重復(fù)注射以使患者享有最大限度的舒適時(shí),持續(xù)釋放形式的給藥對患者更為方便,可通過使用聚合物以復(fù)合成吸附本發(fā)明的肽來制備控制釋放制劑。通過選擇適當(dāng)?shù)拇蠓肿?例如聚酯,多聚氨基酸,聚乙烯吡咯烷酮,乙烯乙烯基乙酸鹽,甲基纖維素,魚精蛋白鋅羧甲基纖維素和魚精蛋白硫酸鹽)及摻入方法以控制釋放來進(jìn)行受控的送遞。通過控制釋放制劑的另一種可能的控制作用期的方法是摻入期待的肽到聚合物,如聚酯,多聚氨基酸,水凝膠,聚(乳酸)或乙烯乙烯基乙酸鹽共聚物的顆粒中。另一方面,代替將肽摻入這些聚合物顆粒中,可將肽包裹到微粒中,其中該微粒通過,例如通過凝聚技術(shù)或界面聚合制備,例如分別為羥甲基纖維素或凝膠微囊素和聚(異丁烯酸甲酯)微膠囊,或包裹在膠質(zhì)的藥物傳遞系統(tǒng)中,例如在脂質(zhì)體,白蛋白微球體,微滴乳狀液,毫微顆粒,和毫微膠囊或在大分子乳濁液中。
本發(fā)明的肽的生物學(xué)半衰期可通過增加所需環(huán)境中環(huán)狀形式的保留或穩(wěn)定性而延長。尤其是提高環(huán)狀形式的穩(wěn)定性的試劑可望延長肽的生物學(xué)半衰期。在這點(diǎn)上,在肽結(jié)構(gòu)中運(yùn)用一或多個(gè)D-氨基酸(尤其是取代原位點(diǎn)的相同L-氨基酸),或使用一種或多種氨基酸類似物,如可在肽結(jié)構(gòu)中插入青霉胺(3-巰基纈氨酸),為樣D-氨基酸或氨基酸類似物干擾被給藥該組合物的動(dòng)物或患者中的或所需的體外組合物中的環(huán)狀結(jié)構(gòu)代謝分解。
還設(shè)想了運(yùn)用D-氨基酸或氨基酸類似物增加本發(fā)明的肽與靶的結(jié)合,尤其與含α2I區(qū)的整合蛋白的結(jié)合。
用于本發(fā)明組合物和方法的肽可以如下劑型使用,如片劑,膠囊劑,粉末包裝劑,或口服給藥的液體溶液劑,如果物質(zhì)的生物學(xué)活性不被消化過程破壞,且化合物的特性容許穿過腸內(nèi)組織吸收。
本發(fā)明的藥學(xué)組合物可以本身已知的例如常規(guī)的混合,顆粒化,制造糖衣丸,溶解,凍干或類似過程生產(chǎn)。
本發(fā)明的肽還可用作提取與之結(jié)合的配體的親和試劑,尤其是從混合物中提取含α2I區(qū)的整合蛋白。
現(xiàn)已充分描述了本發(fā)明,參考以說明方式提供的實(shí)例將更容易理解本發(fā)明,且除非特別說明本發(fā)明不限于實(shí)施例。
實(shí)施例實(shí)施例1人重組整合蛋白α2I區(qū)的產(chǎn)生編碼的α2I區(qū)的DNA通過PCR,使用人整合蛋白α2 cDNA為模板來制備。(整合蛋白α2 cDNA由M.Hemler博士贈(zèng)送,DanaFarber,波士頓)。正向引物是5’-CACAGGGATCCCCTGATTTTCAGCTC-3’(SEQ IDNo.9),反向引物是5’-GTGGCTGAATTCAACAGTACCTTCAATG-3’(SEQ IDNo.10)。設(shè)計(jì)引物以在產(chǎn)物中引入兩個(gè)限制性位點(diǎn)5’端的BamHI-位點(diǎn)和3’端的EcoRI-位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物和pGEX2T(Pharmacia)用BamHI和EcoRI消化,連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DHα5F’細(xì)胞接著測序。具α2I區(qū)插入物的質(zhì)粒(pJKα2I),轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL2I以制備重組蛋白rα2I。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-rα2I融合蛋白的制備和純化如下進(jìn)行通常將400mlLB(羧芐青霉素50μg/ml)用40ml BL2I/pJKα2I的過夜培養(yǎng)物接種,培養(yǎng)物37℃生長1小時(shí)。加入誘導(dǎo)物IPTG(終濃度0.1mM)4小時(shí)。
人重組整合蛋白α2I如下從大腸桿菌細(xì)胞中純化。離心收獲細(xì)胞,沉淀重懸在磷酸緩沖液中(PBS,pH7.4)。懸浮液超聲,離心,收獲上清。沉淀在PBS中重懸,超聲,并離心兩次,收集上清。加入谷胱甘肽Sepharose(Pharmacia),得到的溶解產(chǎn)物室溫下孵育30分鐘,輕柔攪動(dòng)。溶解產(chǎn)物離心,移去上清部分,與融合蛋白結(jié)合的谷胱甘肽Sepharose轉(zhuǎn)移至合適的柱上。用10體積PBS(140mM NaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.3)洗滌,谷胱甘肽洗脫緩沖液(Pharmacia;10mM降低的谷胱甘肽的50mM Tris-HCl溶液,pH8.0)洗脫融合蛋白室溫下,用凝血酶蛋白酶(Pharmacia;10單位)裂解融合蛋白至少2小時(shí),PBS透析去除谷胱甘肽。裂解混合物第二次通過谷胱甘肽的50mM Tris-HCl中柱以去除谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。
從流過液中收集rα2I。必須用5mM二硫蘇糖醇(DTT)處理重組蛋白以允許適當(dāng)?shù)恼郫B(5mM DTT的PBS溶液),因?yàn)橥ㄟ^天然PAGE分析時(shí),不經(jīng)處理可見額外的帶。重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝焦電泳)為至少90%的純度,天然PAGE僅見一條帶。
制備的重組α2I區(qū)長223個(gè)氨基酸,在對應(yīng)于整合蛋白序列124-339(PDGQ-IEGTV)(SEQ ID No.11和SEQ ID No.12)的氨基末端(GS)整合蛋白氨基酸中具有2個(gè)非整合蛋白氨基酸,在羧基末端具6個(gè)非整合蛋白氨基酸(EFIVTD;SEQ ID No.13)。
實(shí)施例2銪標(biāo)記的rα2I的結(jié)合分析巴西具竅蝮蛇凹蝰蛇毒液阻止重組整合蛋白α2I區(qū)與I型膠原的結(jié)合開發(fā)了基于使用銪標(biāo)記的rα2I的敏感的固相rα2I配體結(jié)合分析。銪標(biāo)記rα2I如下進(jìn)行純化rα2I中加入1/20體積1M NaHCO3(pH8.5)以提高pH用于用異硫氰酸酯標(biāo)記。銪標(biāo)記的試劑(Wallac)以過量100倍的摩爾數(shù)加入,4℃孵育過夜。未結(jié)合的標(biāo)記物通過葡聚糖凝膠G50/瓊脂糖凝膠6B(Pharmacia)柱凝膠過濾去除,收集含標(biāo)記蛋白的部分。
4℃下,通過將其各孔表面暴露于0.1ml PBS中12小時(shí)來覆蓋96孔免疫板(Maxisorp,Nunc),其中PBS中包含5μg/cm2平板表面的I型膠原。(牛皮,Cellon),IV型膠原(Sigma),層粘連蛋白-1(從Engelbreth-Holm-Swarm鼠腫瘤基底膜純化,CollaborativeResearch),纖連蛋白(人血漿纖連蛋白,Boehringer Mannheim)或3.3μg/ml艾可病毒-1或艾可病毒-7。另外,根據(jù)制造商的說明,將肽和巴西具竅蝮蛇毒液(Sigma)以各種濃度在96孔胺結(jié)合平板(Costar)中。
所有孔的殘余蛋白吸收位點(diǎn)用含0.1%熱滅活的牛血清白蛋白的PBS溶液在37℃封閉1小時(shí)。艾可病毒-1(Farouk菌)和艾可病毒-7(Wallace)從ATCC獲得。純化的病毒在含0.5mM MgCl2的PBS稀釋,-70℃凍存直至使用。向被覆蓋的孔中加入在PBS中濃度為500ng/ml銪標(biāo)記的rα2I,2mM MgCl2,1mg/ml BSA,37℃孵育3小時(shí)。將孔用PBS,2mM MgCl2洗三次,將0.1ml Delfia增強(qiáng)溶液(Wallac)加入每孔,熒光計(jì)(Model 1232 Delfia,Wallac)測定銪信號。
當(dāng)內(nèi)源加入肽時(shí),凍干的肽直接溶解至銪標(biāo)記的rα2I的PBS溶液中,隨后加入2mM MgCl2,1mg/ml BSA并接著加入各孔中。當(dāng)使用EDTA替代MgCl2時(shí),銪標(biāo)記的rα2I稀釋在PBS,2mM EDTA中,并以此緩沖液進(jìn)行隨后的沖洗。發(fā)現(xiàn)結(jié)合分析十分敏感,使得有可能在實(shí)驗(yàn)中減少rα2I區(qū)的用量。進(jìn)一步的,銪的小體積說明此測量比用較大的標(biāo)記分子更可靠。第三,發(fā)現(xiàn)此處所述的微量滴定孔分析可用于篩選大量的推測的整合蛋白rα2I區(qū)阻斷分子。
rα2I結(jié)合I型膠原,IV型膠原和層粘連蛋白-1。但是,它并不顯著地與纖連蛋白或白蛋白結(jié)合(圖1A)。rα2I以Mg++依賴方式結(jié)合I型膠原,添加2mM EDTA可完全解除結(jié)合(圖1B)。這與α2β1僅在二價(jià)陽離子存在下與膠原相互作用的事實(shí)相符合。rα2I區(qū)與艾可病毒-1的結(jié)合比其與基質(zhì)分子的結(jié)合弱得多。
以往研究顯示,巴西具竅蝮蛇毒液抑制血小板α2β1整合蛋白與膠原的相互作用(De Luca,M.等,生物化學(xué)生物物理研究通訊.206570-576(1995))。但是,此抑制反應(yīng)是否由于對α2I區(qū)功能的阻抑仍然不詳。而且,參與相互作用的抗原決定簇仍然未知。
巴西具竅蝮蛇毒液對rα2I區(qū)與I型膠原結(jié)合的作用通過上述的固相配體結(jié)合分析研究。讓銪標(biāo)記的rα2I區(qū)在2mM Mg++存在時(shí)與膠原I底物接觸,確定結(jié)合的rα2I的量。毒液的作用在1μg/ml-1000μg/ml濃度范圍內(nèi)檢測。毒液有效并以濃度依賴方式抑制rα2I區(qū)-膠原相互作用(圖1C)。為確定所見的抑制現(xiàn)象是否是由于rα2I與蛇毒液直接作用,將微量滴定孔用毒液蛋白覆蓋并檢測rα2I與此底物的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)rα2I以濃度依賴性方式直接與毒液結(jié)合(圖1D)。根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn),jarahagin明顯為巴西具竅蝮蛇毒液中抑制α2β1整合蛋白與膠原的結(jié)合的蛋白(De Luca,M.等生物化學(xué)生物物理研究通訊.206570-576(1995)),因此最可能是與rα2I區(qū)結(jié)合的毒液組分。
實(shí)施例3運(yùn)用生物素標(biāo)記的229ox的肽和結(jié)合分析短的環(huán)狀jarahagin衍生肽模擬具巴西具竅蝮蛇毒液對整合蛋白rα2I區(qū)-膠原相互作用的作用jarahagin中α2I區(qū)結(jié)合位點(diǎn)的的鑒定通過使用對應(yīng)于蛋白區(qū)的一系列短環(huán)肽進(jìn)行。檢測區(qū)域根據(jù)以下選擇i)基質(zhì)蛋白和蛇毒液脫整合蛋白中整合蛋白結(jié)合基元被發(fā)現(xiàn)位于環(huán)狀結(jié)構(gòu)中。ii)已知整合蛋白結(jié)合基元包括天冬氨酸殘基。iii)已發(fā)表的整合蛋白-膠原相互作用模型在天冬氨酸殘基之外還強(qiáng)調(diào)精氨酸殘基的作用。
Jarahagin-衍生肽根據(jù)jarahagin氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。使用來自遺傳電腦創(chuàng)建組(GCG)軟件包(Madison,WI)的肽結(jié)構(gòu)程序預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。根據(jù)Emini方法(Emini,E.A.等.,病毒學(xué)雜志.55836-839(1985))的表面可能性和根據(jù)Kyte-Doolittle方法(Kyte.J.等.,分子生物學(xué)雜志.157105-132(1982))的親水性被予以考慮。
在自動(dòng)肽合成儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)431A)中,用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)化學(xué)合成該肽。用于丙氨酸取代系列的肽從Research Genetics(Huntsville,AL)公司購買。合成后肽被氧化形成二硫鍵。肽以1mg/ml濃度溶解在0.1M碳酸銨緩沖液中,4℃孵育16-24小時(shí)。反向高效液相色譜檢測氧化,并將氧化肽凍干。
所有肽在PBS中以10mg/ml完全溶解。因使用濃度最高為1mg/ml,避免了由于不溶性肽的非特異性作用。不同肽的等電點(diǎn)(PI)也使用來自遺傳電腦創(chuàng)建組(GCG)軟件包(Madison,WI)的等電程序從一級序列確定。肽225ox(表1)被發(fā)現(xiàn)具有與229ox(表1)相似的等電點(diǎn),因此在一些實(shí)驗(yàn)中被選作對照肽。
229ox的生物素標(biāo)記如下進(jìn)行凍干的229ox肽溶解在PBS中,加入1/5體積的0.1M NaHCO3,0.5M NaCl(pH8.0)以提高用于生物素標(biāo)記的pH。硫代-NHS-生物素(Calbiochem)按1∶2(w/w)229ox生物素加入,室溫下孵育2小時(shí)。加入1/10體積0.5M Tris-HCl(pH8.0)結(jié)束生物素標(biāo)記反應(yīng)。
對于使用生物素標(biāo)記的229ox肽進(jìn)行的結(jié)合分析,根據(jù)制造商的說明在96孔胺結(jié)合平板(Costar)中覆蓋不同濃度rα2I區(qū)或rα2I區(qū)衍生肽。37℃下,所有孔內(nèi)的殘余蛋白吸收位點(diǎn)用含0.1%熱滅活的牛血清白蛋白的PBS溶液封閉1小時(shí)。向覆蓋的孔中加入100μM生物素標(biāo)記的229ox的PBS溶液,2mM MgCl2,1mg/ml BSA,37℃孵育3小時(shí)。將各孔用PBS洗3次,室溫下,加入2mM MgCl2和濃度為500μg/ml的銪標(biāo)記鏈霉抗生物素蛋白(Wallac)的PBS溶液,2mM MgCl2,1mg/ml BSA30分鐘。再洗孔3次。每孔中加入0.1ml Delfia增強(qiáng)溶液(Wallac),熒光計(jì)測銪信號(Model 1232 Delfia,Wallac)。當(dāng)用EDTA替代MgCl2時(shí),將銪標(biāo)記rα2I稀釋在PBS,2mM EDTA中,隨后以此緩沖液沖洗。
合成對應(yīng)于選擇的序列的肽,得到的肽總結(jié)于表I。
為研究是否任何該種肽都能與α2I區(qū)直接相互作用,加jarahagin肽以及環(huán)狀RGD肽,I型膠原,IV型膠原和纖連蛋白被加至微量滴定孔中,并加入rα2I-Eu。結(jié)果顯示一種jararhagin肽,即229ox,有效地與rα2I區(qū)結(jié)合而其它試驗(yàn)肽未顯示效果(圖2A)。
該肽隨后被檢測在濃度為500μM時(shí)其影響rα2I與I型膠原結(jié)合的能力。又只有肽,229ox具有顯著作用它幾乎完全抑制rα2I區(qū)與膠原的相互作用(圖2B)。
表1研究中使用的合成肽的序列。顯示基于jararhagin(Paine,M.J>I.等,生物化學(xué)雜志.26722869-22876(1992))和α2I區(qū)(Takada,Y.和Hemler.M.E.,細(xì)胞生物學(xué)雜志.109397-407(1989))的級序列合成的肽的名稱和位置。Jararhagin 肽 氨基酸序列 殘基號192ox;SEQ ID No.14CWSNGDKITC*212-219195ox;SEQ ID No.15CEQQRYDPYKC*151-159197ox;SEQ ID No.16CKLPDSEAHAC*103-111223ox;SEQ ID No.17CHYSPDGREIC*46-54225ox;SEQ ID No.18CPADVFHKNC*441-449229ox;SEq ID No.5 CTRKKHDNAQC*241-249231ox;SEQ ID No.19CYSNDDEHKGC*537-545I區(qū)肽 氨基酸序列 殘基號P1;SEQ ID No.20 VCDESNSIYC*149-157P2;SEQ ID No.21 VCDESNSIYPWDAVKNC*149-164P3;SEQ ID No.22IYPWDAVKNFLEKFVQG 155-172P4;SEQ ID No.23AVKNFLEKFVQGLDIG160-176P5;SEQ ID No.24LDIGPTKTQVGLIQYA173-188P6;SEQ ID No.25QYANNPRVVFNLNTYKTKEE186-205P7;SEQ ID No.26LNTYKTKEEMIVAT 197-210P8;SEQ ID No.27ATSQTSQYGGDLTNT 209-223P9;SEQ ID No.28RKYAYSAASGGRRSAT231-246P10;SEQ ID No.29 TDGESHDGSMLKAVIDQ 253-269P11;SEQ ID No.30 LDTKNLIKEIKAIASIPTER291-310P12;SEQ ID No.31 SDEAALLEKAGTLGEQ316-331其它肽 氨基酸序列 參考文獻(xiàn)RGD GACRGDCLGA*;SEQ IDKoivunen,E.et al.,J.Biol.
No.32 Chem.26820205-20210(1993)RGE GACRGECLGA*;SEQ IDKoivunen,E.et al.,J.Biol.
No.33 Chem.26820205-20210(1993)*環(huán)肽為顯示229ox肽的結(jié)合特性與具巴西具竅蝮蛇毒液的相互性,檢測229ox肽與蛇毒液競爭rα2I結(jié)合位點(diǎn)的能力。結(jié)果顯示229ox與具巴西具竅蝮蛇毒液都與rα2I結(jié)合,并且229ox rα2I說明229ox代表jararhagin中實(shí)際的整合蛋白結(jié)合位點(diǎn)。因?yàn)橐种撇煌耆?約50%),所以也可能巴西具竅蝮蛇毒液還包含α2I區(qū)的其它結(jié)合位點(diǎn)。
在許多文獻(xiàn)中,已表明整合蛋白配體模仿合成肽的環(huán)狀結(jié)構(gòu)是高親和性結(jié)合的關(guān)鍵。為檢測這一點(diǎn),如前述在固相結(jié)合分析中使用氧化和線性的p229肽。環(huán)狀229ox表現(xiàn)其抑制rα2I與I型膠原的粘附的能力,而此肽的線性形式作用甚微(圖4A)。rα2I與固相結(jié)合的229ox的結(jié)合被發(fā)現(xiàn)為濃度依賴性的,且在濃度為75μg/ml時(shí)觀察到最顯著的結(jié)合(圖4B)。除I型膠原外,rα2I區(qū)還和IV型膠原,以及纖連蛋白結(jié)合。229ox肽抑制rα2I與這些配體的結(jié)合,而等長同構(gòu)象,具有類似等電點(diǎn)值的對照肽225ox沒有抑制作用(圖4C)。這表明α2I區(qū)通過相同機(jī)理與所有這些配體結(jié)合,且229ox通過直接與配體識別位點(diǎn)相互作用或改變I區(qū)的三維結(jié)構(gòu)使之鈍化來抑制結(jié)合。
實(shí)施例4jararhagin-衍生肽活化整合蛋白rα2I區(qū)的艾可病毒-1識別位點(diǎn)除介導(dǎo)細(xì)胞對膠原和纖連蛋白-1的粘附外整合蛋白α2β1還具有病毒受體的功能,介導(dǎo)人病原體,艾可病毒-1的細(xì)胞表面附著和感染。發(fā)現(xiàn)基質(zhì)蛋白和艾可病毒-1與整合蛋白以不同方式相互作用,艾可病毒-1的結(jié)合位點(diǎn)也定位在α2亞基的I區(qū)。如上所述,rα2I區(qū)顯示弱的與包被的艾可病毒-1的結(jié)合,但令人驚奇地,添加229ox肽結(jié)合增強(qiáng)約10倍,而對照肽225ox無作用(圖5)。此結(jié)果說明,229ox肽與α2I區(qū)的結(jié)合誘導(dǎo)蛋白的結(jié)構(gòu)變化,從而提高rα2I與艾可病毒-1的親和性。
這說明在I區(qū)存在一個(gè)可能的活性調(diào)節(jié)位點(diǎn),其中RKK的結(jié)合可變構(gòu)地抑制與膠原的結(jié)合。RKK-誘導(dǎo)的rα2I區(qū)構(gòu)象的變化在我們的實(shí)驗(yàn)中明顯,其中RKK肽不僅阻斷rα2I區(qū)與膠原的粘附,還顯著增加rα2I區(qū)對艾可病毒-1的附著。除證實(shí)以往的論點(diǎn)外,艾可病毒-1,與膠原識別α2I區(qū)的不同位點(diǎn),數(shù)據(jù)說明存在一個(gè)通過占有其它結(jié)合位點(diǎn)(RKK結(jié)合位點(diǎn))的重要的配體識別位點(diǎn)(艾可病毒-1結(jié)合位點(diǎn))的調(diào)節(jié)機(jī)制。但是,已知的有關(guān)α2I區(qū)結(jié)構(gòu)-功能相互關(guān)系的信息不足以作結(jié)論RKK是否直接與膠原識別位點(diǎn)結(jié)合或是否它是α2I區(qū)-膠原相互作用的變構(gòu)抑制劑。在兩個(gè)種情況下,包含RKK的肽是用于揭示整合蛋白I區(qū)配體識別功能的研究的十分有價(jià)值的工具。
實(shí)施例5三個(gè)氨基酸的序列,RKK,是與整合蛋白rα2I區(qū)結(jié)合的關(guān)鍵以往發(fā)表的有關(guān)在不同蛋白中整合蛋白識別位點(diǎn)的信息強(qiáng)調(diào)兩個(gè)氨基酸殘基,即天冬氨酸和精氨酸的重要性。為揭示229ox肽中關(guān)鍵的氨基酸殘基,檢測一系列新肽,其中p229中的氨基酸逐一被丙氨酸殘基取代。肽與固相結(jié)合,檢測它們與rα2I結(jié)合的能力。有趣的是,發(fā)現(xiàn)三個(gè)氨基酸,精氨酸-賴氨酸-賴氨酸(RKK)為關(guān)鍵,并且鄰近的組氨酸也有一些作用。與此一致的,rα2I與I型膠原的結(jié)合被含丙氨酸取代的RKK序列不良抑制,而天冬氨酸或精氨酸殘基的取代則不損害該功能(圖6A)。
為辨別α2I區(qū)中229ox肽的可能結(jié)合位點(diǎn),合成對應(yīng)于α2I區(qū)親水區(qū)的一系列肽,并檢測他們與生物素標(biāo)記的229ox的結(jié)合能力。α2I區(qū)肽和rα2I與固相結(jié)合,加入生物素標(biāo)記的229ox。229ox明顯顯示與rα2I和肽P9結(jié)合,而在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中不與其它蛋白結(jié)合(圖7A)。生物素標(biāo)記的229ox和固相結(jié)合的rα2I的相互作用依賴于二價(jià)陽離子(圖7B),銪標(biāo)記的rα2I與固相結(jié)合的I型膠原和229ox肽的結(jié)合也是如此(圖7C)。
實(shí)施例6RKK肽的臨界長度為確定RKK肽的臨界長度,制備如下一系列包括RKK序列和額外氨基酸的肽。檢測CTRKKHDNAQC(229ox;SEQ ID No.5),CTRKKHDNAC(SEQID No.34)和CTRKKHDNC(248ox;SEQ ID No.4)。最短的肽在濃度為10μM時(shí)顯示對rα2I與膠原結(jié)合最強(qiáng)的抑制。它比較長的肽229ox有效10倍以上(圖8)。
實(shí)施例7細(xì)胞遷移分析遷移分析模仿細(xì)胞在膠原基質(zhì)上的運(yùn)動(dòng)。此實(shí)施例證明本發(fā)明肽阻止這些細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),并因此可用于治療特征在于這類細(xì)胞遷移的疾病的治療方法中。
為顯示229ox/RKK肽和225ox在細(xì)胞-膠原相互作用中的作用,讓化學(xué)轉(zhuǎn)化的HOS-MNNG細(xì)胞與I型膠原接觸,隨后轉(zhuǎn)移到膠原上。以前表明過α1β1整合蛋白在此過程中的重要性(Vihinen,P.等.,細(xì)胞生長分化7439-447(1996))。
如前述進(jìn)行細(xì)胞遷移分析(Vihinen,P.等.,細(xì)胞生長分化7439-447(1996))。首先,人HOS-MNNG骨肉瘤細(xì)胞(ATCC)懸浮在無血清的Optimem 1培養(yǎng)基(生命技術(shù)公司)中,并將20,000-30,000細(xì)胞/孔轉(zhuǎn)移到直徑為2.80mm的金屬圓柱中的24孔細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)板(Costar)。將細(xì)胞培養(yǎng)孔中覆蓋5μg/cm2I型膠原。細(xì)胞與膠原37℃接觸16小時(shí)。移去圓柱,用Optimem(生命技術(shù)公司)洗去未粘附細(xì)胞,讓粘附細(xì)胞在肽存在下在Optimem中遷移4天。每天更換含肽的新鮮Optimem。4天后,被細(xì)胞覆蓋的表面區(qū)域用微機(jī)影像設(shè)備模型M4(影像研究公司)測量。
本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖9顯示。229ox或225ox肽以500μM濃度加入到細(xì)胞中,每天加入新鮮肽。HOS-MNNG細(xì)胞遷移到I型膠原的能力不受225ox對照肽的影響,但229ox明顯抑制(p<0.001,Student’s t-檢驗(yàn))遷移(圖9)。
對骨肉瘤細(xì)胞在膠原上遷移的抑制說明 i)惡性細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),從而癌細(xì)胞侵染可被229ox抑制,和ii)當(dāng)遷移是α1β1整合蛋白-膠原相互作用的結(jié)果或部分結(jié)果時(shí),任何細(xì)胞類型的遷移也可被抑制。
實(shí)施例8RKK肽對細(xì)胞粘附的抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞和從口的鱗狀細(xì)胞的骨肉瘤建立的細(xì)胞系UT-SCC-2與I型膠原在肽229ox或抗α2整合蛋白的功能性抗體,Gi9(商業(yè)用抗-α2整合蛋白抗體,Immunotech/Coulter,Westrbrook,Maine,美國)存在下的細(xì)胞粘附。細(xì)胞用放線菌酮10μg/ml在無血清培養(yǎng)基中處理1小時(shí)。而后分離細(xì)胞,并在含0.1%甘氨酸的DMEM中預(yù)敷I型膠原的微量滴定板上粘附1小時(shí)。洗去未粘附細(xì)胞,粘附細(xì)胞用結(jié)晶紫染色,通過測量光吸收來估測粘附細(xì)胞的數(shù)目。
總結(jié)于圖10的結(jié)果表明依照本發(fā)明的肽,例如肽229ox(p229ox)抑制細(xì)胞遷移,并因此對治療或預(yù)防涉及細(xì)胞遷移的疾病有益,例如齒根骨膜炎,因?yàn)樯掀ぜ?xì)胞結(jié)合α1β1整合蛋白,并用此結(jié)合在膠原上遷移。
實(shí)施例9RKK肽在治療齒根骨膜炎和齒齦炎中的運(yùn)用齒根骨膜炎是一種特征在于發(fā)炎并失去牙支撐性結(jié)締組織的疾病。疾病由致病口腔細(xì)菌引起,該細(xì)菌活化組織細(xì)胞以產(chǎn)生和釋放降解組織成分的水解酶。疾病過程的首要特征是將牙齦與牙齒表面連接的上皮細(xì)胞(連接上皮細(xì)胞和囊上皮細(xì)胞)增殖和遷移的增加。
對齒根骨膜炎和齒齦炎的傳統(tǒng)治療著眼于通過機(jī)械刮牙或抗生素治療將致病菌從牙周組織除去。進(jìn)一步的,常用外科矯正牙周組織結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的肽提供的細(xì)胞遷移抑制,例如p229ox,可單獨(dú)使用或作為其它治療的輔助劑來防止或治療牙周疾病,包括齒根骨膜炎和齒齦炎。尤其是,包括有效量的一或多種本發(fā)明的含RKK序列的環(huán)肽的組合物可被局部給藥至需治療牙周疾病,包括齒根骨膜炎和齒齦炎的患者。在這點(diǎn)上有益的組合物可用任何常規(guī)技術(shù)進(jìn)行配制以用于局部施用。本發(fā)明的肽可被配制在載體中,包括聚合物載體如,例如基于乙基纖維素,聚硅氧烷橡膠,和尤其是可降解聚合物和共聚物,如聚(乳酸),聚(乙醇酸),聚(乳酸)-(乙醇酸)共聚物,聚酰胺和聚酯,明膠,膠原,白蛋白和纖維蛋白原的那些,交聯(lián)被期望給予期待的RKK活性或釋放特性??谇挥玫膫鬟f系統(tǒng)在,例如在此被引作參考的U.S.5,002,769,U.S.5,023,082,U.S.5,160,737,U.S.5,330,746,U.S.5,425,953,U.S.5,438,076和U.S.5,39,795,中描述。肽在口腔中以植入物形式,或以在適當(dāng)位置凝固在口腔中的液體組合物的一部分,或以在所期待的位點(diǎn)提供有效水平的包含RKK的肽的牙膏或凝膠的形式被提供在口腔所需部位。本發(fā)明的肽的量因需要而不同以便提供,在口腔和傳遞系統(tǒng)的環(huán)境中提供需要的抑制作用的有效量,但取決于治療病癥的嚴(yán)重性,一般在凝固以前或在固體組合物中可以液體組合物的約為0.001%-95%的量存在。
膜也可用作將本發(fā)明肽提供至所需部位的載體。
依照本發(fā)明的包含RKK的肽可用于治療和/或預(yù)防特征在于上皮細(xì)胞遷移的疾病,尤其是用于治療優(yōu)選局部施用的醫(yī)學(xué)疾病。
現(xiàn)已詳細(xì)描述了本發(fā)明,顯然對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說可進(jìn)行不影響其內(nèi)容或?qū)嵸|(zhì)的微小修改。
序列表(1)一般信息(i)申請人Heino,JyrkiIvaska,JohannaKāpylā,Jarmo(ii)發(fā)明題目整合蛋白結(jié)合肽及其應(yīng)用(iii)序列號(iv)聯(lián)系地址(A)地址Sterne,Kessler,Goldstein & Fox P.L.L.C.
(B)街1100 New York Ave.,N.W.
(C)城市Washington(D)州D.C.
(E)國家USA(F)編碼20005-3934(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型Floppy disk(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件(vi)優(yōu)先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/893,526 USA(B)申請日(99)-7-11(C)分類(viii)代理人/代理機(jī)構(gòu)信息(A)名字Cimbala,Michele,A.
(B)注冊號33,851(C)參考/摘要號1102.0240000(ix)通訊信息(A)電話202/371-2600(B)傳真202/371-2540(C)電報(bào)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO1Xaa Arg Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Xaa Arg Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa1 5(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO3Xaa Arg Lys Lys Xaa Xaa Xaa1 5(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO4Cys Thr Arg Lys Lys His Asp Asn Cys1 5(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO5Cys Thr Arg Lys Lys His Asp Asn Ala Gln Cys1 5 10(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征
(A)長度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO6Cys Thr Arg Lys Lys His Asp1 5(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO7Cys Thr Arg Lys Lys His Asp Asn Ala1 5(2) SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO8Arg Lys Lys His1(2)SEQ ID NC9的信息(i)序列特征(A)長度26個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸學(xué)線狀(ii)分子類型DNA(xi)序列說明SEQ ID NO9CACAGGGATC CCCTGATTTT CAGCTC(2)SEQ ID NO10的信息
(i)序列特征(A)長度28個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸學(xué)線狀(ii)分子類型DNA(xi)序列說明SEQ ID NO10GTGGCTGAAT TCAACAGTAC CTTCAATG 28(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)線狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO11Pro Asp Phe Gln1(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度5個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)線狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO12Ile Glu Gly Thr Val1 5(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)線狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO13Glu Phe Ile Val Thr Asp1(2)SEQ ID NO14的信息
(i)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO14Cys Trp SerAsn Gly Asp Lys Ile Thr Cys1 5 10(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO15Cys Glu Gln Gln Arg Tyr Asp Pro Tyr Lys Cys1 5 10(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO16Cys Lys Leu Pro Asp Ser Glu Ala His Ala Cys1 5 10(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO17Cys His Tyr Ser Pro Asp Gly Arg Glu Ile Cys1 5 10(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO18Cys Pro Ala Asp Val Phe His Lys Asn Cys1 5 10(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO19Cys Tyr Ser Asn Asp Asp Glu His Lys Gly Cys1 5 10(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO20Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser Ile Tyr Cys1 5 10(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度17個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO21Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser Ile Tyr Pro Trp Asp Ala Val Lys Asn Cys
1 5 1015(2)SEQ ID No22的信息(i)序列特征(A)長度17個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)線狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID No22Ile Tyr Pro Trp Asp Ala Val Lys Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)線狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO23Ala Val Lys Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln Gly Leu Asp Ile Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)線狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID No24Leu Asp Ile Gly Pro Thr Lys Thr Gln Val Gly Lys Ile Gln Tyr Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長度20個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)線狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)
(xi)序列說明SEQ ID NO25Gln Tyr Ala Asn Asn Pro Arg Val Val Phe Asn Leu Asn Thr Tyr Lys Thr1 5 10 15Lys Glu Glu20(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)線狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO26Leu Asn Thr Tyr Lys Thr Lys Glu Glu Met Ile Val Ala Thr1 5 10(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)線狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO27Ala Thr Ser Gln Thr Ser Gln Tyr Gly Gly Asp Lys Thr Asn Thr1 5 10 15(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)長度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)線狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO28Arg Lys Tyr Ala Tyr Ser Ala Ala Ser Gly Gly Arg Arg Ser Ala Thr1 5 10 15(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)長度17個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓樸學(xué)線狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO29Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Gly Ser Met Leu Lys Ala Val Ile Asp Gln1 5 10 15(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)長度20個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)線狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO30Leu Asp Thr Lys Asn Leu Ile Lys Glu Ile Lys Ala Ile Ala Ser Ile Pro1 5 10 15Thr Glu Arg(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)長度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)線狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO31Ser Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Lys Ala Gly Thr Leu Gly Glu Gln1 5 10 15(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)線狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO32Gly Ala Cys Arg Gly Asp Cys Leu Gly Ala1 5 10(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO33Gly Ala Cys Arg Gly Glu Cys Leu Gly Ala1 5 10(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸學(xué)環(huán)狀(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO34Cys Thr Arg Lys Lys His Asp Gln Ala Cys1 權(quán)利要求
1.一種環(huán)狀整合蛋白結(jié)合肽,它包括氨基酸序列RKK。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽,包括氨基酸序列RKKH(SEQ ID NO.8)。
3.一種環(huán)肽,包括氨基酸序列X1RKKHX2Xn其中X為任意氨基酸,n=1-4。
4.一種環(huán)肽整合蛋白結(jié)合肽,它包括氨基酸序列CTRKKHDNC(SEQID NO.4)。
5.一種環(huán)肽整合蛋白結(jié)合肽,它包括氨基酸序列CTRKKHDNAQC(SEQ ID NO.5)。
6.一種藥物組合物,它包括根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的整合蛋白結(jié)合肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物組合物,其中組合物適合于局部給藥。
8.一種抑制包含α2I區(qū)的整合蛋白與識別所述α2I區(qū)的分子結(jié)合的方法,所述方法包括將所述整合蛋白暴露于根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的所述整合蛋白結(jié)合肽中。
9.一種抑制病人中整合蛋白依賴性細(xì)胞遷移的方法,所述方法包括對所述病人提供有效量的權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的所述整合蛋白結(jié)合肽。
10.權(quán)利要求8的方法,其中所述細(xì)胞遷移與癌癥、心血管病或所述患者的齒根骨膜炎有關(guān)。
11.一種在需此治療的患者中抑制膠原上細(xì)胞遷移的方法,所述方法包括對所述病人給藥有效量的權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的肽。
12.一種抑制患者血小板對膠原粘附或膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的方法,所述方法包括對所述病人提供有效量的權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述整合蛋白結(jié)合肽。
13.權(quán)利要求13的方法,其中所述粘附或聚集與所述病人的心血管疾病有關(guān)。
14.一種鑒定整合蛋白結(jié)合試劑的結(jié)合分析法,所述方法包括i)將待分析的整合蛋白結(jié)合試劑進(jìn)行生物素標(biāo)記;ii)在適宜于結(jié)合的條件下,將所述生物素標(biāo)記的試劑與固定化的重組α2I區(qū)或區(qū)衍生肽反應(yīng);iii)沖洗攜帶結(jié)合試劑的固相支持物;iv)加入標(biāo)記的生物素結(jié)合試劑,和v)檢測任何結(jié)合的整合蛋白結(jié)合試劑。
15.一種鑒定整合蛋白結(jié)合試劑的結(jié)合分析法,所述方法包括i)銪標(biāo)記的α2I區(qū)ii)在適宜于結(jié)合的條件下,將待分析的整合蛋白結(jié)合試劑與銪標(biāo)記的α2I區(qū)混合;并iii)檢測任何結(jié)合的整合蛋白結(jié)合試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了包括3個(gè)共線性氨基酸,精氨酸—賴氨酸—賴氨酸(RKK)的環(huán)肽用于與整合蛋白α2Ⅰ域結(jié)合,該肽是整合蛋白α21區(qū)與膠原Ⅰ和Ⅳ和層粘連蛋白-1相互作用的有效抑制劑。本發(fā)明還提供使用這些肽阻斷整合蛋白功能并抑制細(xì)胞遷移的方法。
文檔編號A61K38/12GK1262688SQ98806979
公開日2000年8月9日 申請日期1998年7月9日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月11日
發(fā)明者J·海諾, J·伊瓦斯卡, J·凱派萊 申請人:拜奧泰治療有限公司
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1