專利名稱：治療皮膚色素沉著的方法
1、發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及引起皮膚色素沉著和/或?qū)е缕つw脫色素的方法和組合物。更具體地說，本發(fā)明涉及影響黑素生成并能用作脫色素試劑或皮膚增黑劑的化合物。
2、發(fā)明背景許多年來，皮膚著色一直為人所關(guān)心。特別地，除去色素過度沉著的能力是那些希望有統(tǒng)一膚色的人們所關(guān)心的一個問題，其中的色素過度沉著，例如通常發(fā)現(xiàn)在老年斑、雀斑或老化的皮膚中。而在世界上的某些地方，通常希望皮膚增白。色素沉著不足和色素過度沉著這兩種病癥都希望得到治療。類似地，對許多人來說，在不導(dǎo)致光損害的前提下，日光照射產(chǎn)生棕褐色外觀的能力是非常重要的。
已經(jīng)提出許多方法用于達(dá)到脫色素和增深皮膚顏色的目的。例如，曲酸、氫醌、視黃醛衍生物和其它化合物已經(jīng)用于脫色素。二羥丙酮等化合物由于能在不受目光照射的情況下使皮膚變成“棕褐色”已經(jīng)得到應(yīng)用。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在這些以前的解決方法中，有許多是不能接受的。在這些以前的組合物所應(yīng)用的皮膚區(qū)域之間經(jīng)常有一條明顯的界線。因此，為了達(dá)到預(yù)期的結(jié)果，必須精確應(yīng)用所有的這些化合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在這些化合物中有許多十分刺激皮膚，因此，是不宜應(yīng)用的。
對黑素生成的化學(xué)和酶基礎(chǔ)的理解已經(jīng)有許多文件證明。黑素細(xì)胞從胚胎神經(jīng)嵴遷移到皮膚產(chǎn)生分泌粒，產(chǎn)生黑素的黑素粒。在黑素粒中發(fā)生黑素生成，所生成的黑素再通過黑素細(xì)胞樹突分布到角化細(xì)胞中。酪氨酸酶是黑素生成中的關(guān)鍵酶，它引發(fā)一系列反應(yīng)使酪氨酸轉(zhuǎn)變成生物多聚體黑素。已知有兩種酪氨酸酶相關(guān)的蛋白質(zhì)(TRP’s):TRP-1和TRP-2。這些蛋白質(zhì)與酪氨酸酶享有約40％的同源性，在黑素生成中它們具有催化活性和調(diào)節(jié)作用。黑素細(xì)胞中，TRP-1是最豐富的糖蛋白。
盡管黑素生成的化學(xué)或酶基礎(chǔ)已經(jīng)有許多文件證明，但它在細(xì)胞水平的調(diào)節(jié)只是部分地被理解。酪氨酸酶和TRP’s與結(jié)合溶菌體的膜蛋白(LAMP)基因族具有共同的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性質(zhì)，因此，它們靶向溶菌體膜可能導(dǎo)致它們的活化。在黑素生成的調(diào)節(jié)中，可能包括發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)尾部的這些蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化反應(yīng)。蛋白激酶C(PKC)族的β異構(gòu)體顯示通過活化酪氨酸酶來調(diào)節(jié)人黑素生成。酪氨酸酶、TRP-1和TRP-2的基因表達(dá)是協(xié)調(diào)一致的。這三種酶都在人體表皮中表達(dá)。在與角化細(xì)胞共同培養(yǎng)的黑素細(xì)胞中，這些轉(zhuǎn)錄體表達(dá)的比例分別是45∶45∶10。在單獨(dú)培養(yǎng)的黑素細(xì)胞中，只存在TRP-1轉(zhuǎn)錄體，這表明來源于角化細(xì)胞的信號包括在這些基因的協(xié)調(diào)表達(dá)中。角化細(xì)胞—黑素細(xì)胞相互作用的調(diào)整和黑素體轉(zhuǎn)變成角化細(xì)胞的機(jī)理至今尚不清楚。
蛋白酶激活受體-2(PAR-2)是一個七跨膜域G-蛋白偶合受體，其在序列上與凝血酶受體(TR，亦稱為PAR-1和PAR-3)有關(guān)但有區(qū)別。這兩個受體都是通過在細(xì)胞外區(qū)域的精氨酸—絲氨酸裂解被蛋白水解而活化。新產(chǎn)生的N-末端再作為束縛的配體活化這些受體。兩個受體均通過胰蛋白酶活化，但只有TRs通過凝血酶活化。只有PAR-2通過肥大細(xì)胞類胰蛋白酶活化。兩個受體均可通過與它們新N-末端相對應(yīng)的肽類來活化，而與受體裂解無關(guān)。SLIGRL，小鼠PAR-2活性肽，與活化人類受體是等效的。當(dāng)TR的功能被充分得到文件證明時，尚沒有完全認(rèn)識PAR-2的生物學(xué)性質(zhì)。最近記載了活化PAR-2在抑制角化細(xì)胞生長和分化中的作用(Derian等，“一個新系蛋白酶活化受體對人角化細(xì)胞生長和分化的分化調(diào)節(jié)作用”(“Differential Regulation of Human Keratinocyte Growth andDifferentiation by a Novel Family of Protease-activate Receptors”)，細(xì)胞生長與分化(Cell Growth & Differentiation)，第8卷，第743-749頁，1997年7月)。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，我們發(fā)現(xiàn)一種影響哺乳動物皮膚色素沉著變化的方法，包括把影響PAR-2路徑的化合物在哺乳動物的皮膚上局涂敷。本發(fā)明的組合物包括一個或多個化合物，這些化合物作為胰蛋白酶、類胰蛋白酶、絲氨酸蛋白酶或作為PAR-2激動劑，用來增強(qiáng)皮膚色素沉著。或者，它們含有一個或多個化合物，這些化合物作為絲氨酸蛋白酶抑制劑、胰蛋白酶抑制劑、凝血酶抑制劑、類胰蛋白酶每抑制劑或作為PAR-2路徑抑制劑或作為PAR-2拮抗劑，用來降低皮膚色素沉著，或“脫色素”。
這里所用的“哺乳動物”是指“包括哺乳類的高等脊椎動物”的任何成員，正如Webster’s醫(yī)學(xué)辦公詞典(Webster’s Medical Desk Dictionary)407(1986)所定義的，包括但不限于人。這里所用的“受體”應(yīng)該包括細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的受體，應(yīng)該是指那些能夠接受和傳導(dǎo)信號的分子。術(shù)語PAR-2是指蛋白酶活化受體-2或有關(guān)的蛋白酶活化受體。蛋白酶活化受體-2(后面稱“PAR-2”)是一種絲氨酸-蛋白酶活化受體，它可在許多組織包括角化細(xì)胞和纖維細(xì)胞中表達(dá)。凝血酶受體(也稱PAR-1，后面稱“TR”)是絲氨酸-蛋白酶活化受體，在許多組織包括角化細(xì)胞中表達(dá)。尚不完全了解皮膚中PAR-2和TR的生物學(xué)作用。然而，我們發(fā)現(xiàn)角化細(xì)胞和黑素細(xì)胞的相互作用通過PAR-2路徑影響黑素的生成。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)凝血酶抑制劑、和/或類胰蛋白酶抑制劑、和/或胰蛋白酶抑制劑和PAR□□拮抗劑可用作脫色素試劑而且不刺激皮膚。PAR-2激動劑和絲氨酸蛋白酶如胰蛋白酶和類胰蛋白酶可用作增黑劑。并且，作為增白劑和增黑劑的標(biāo)靶，PAR-2是有用的。
附圖的簡要說明
圖1A表示根據(jù)本發(fā)明的方法，用已知的色素沉著試劑和脫色素試劑對含有黑素細(xì)胞的表皮等同物進(jìn)行處理，該表皮等同物的相對色素沉著的增加或減少圖。
圖1B表示應(yīng)用本發(fā)明的方法和組合物對含有黑素細(xì)胞的表皮等同物進(jìn)行處理，該表皮等同物的相對色素沉著的增加或減少圖。
圖2表示用PAR-2激動劑和化合物I處理的含有黑素細(xì)胞的表皮等同物時得到的一組表皮等同物圖象。
圖3表示應(yīng)用本發(fā)明的方法和組合物對含有黑素細(xì)胞的表皮等同物進(jìn)行處理，該表皮等同物的相對色素沉著的增加或減少圖。
圖4A表示當(dāng)用本發(fā)明的組合物處理時，相對于含有黑素細(xì)胞的表皮等同物中的色素沉著的劑量/反應(yīng)圖。
圖43表示用紫外光照射含有黑素細(xì)胞的表皮等同物后，再用本發(fā)明的組合物進(jìn)行處理得到的反應(yīng)圖。
圖5A是凝膠的照片，顯示皮膚中TR和PAR-2、黑素瘤細(xì)胞和含有黑素細(xì)胞的表皮等同物的表達(dá)。
圖5B是凝膠的照片，顯示原始的人黑素細(xì)胞對TR和PAR-2的表達(dá)。
圖6A和圖6B是凝膠的照片，顯示用不同濃度的化合物I和SLIGRL處理后的不同基因表達(dá)。
圖7是本發(fā)明的不同組合物對豚鼠乳頭色素沉著的亮度的作用示意圖。
圖8是Yucatan豬皮膚的照片，為了使皮膚脫色素，用本發(fā)明的組合物對Yucatan豬皮膚進(jìn)行了處理。
圖9表示用本發(fā)明的組合物和方法對Yucatan豬皮膚處理過程中的皮膚亮度示意圖。
圖10A、10B、10C和10D分別是根據(jù)本發(fā)明的方法，用含有濃度為0、10μM、50μM和250μM的組合物處理Yucatan豬皮膚，F(xiàn)&M著色組織學(xué)部分的照片。
圖11A、11B和11C是用本發(fā)明組合物處理含有黑素細(xì)胞的表皮等同物得到的電子顯微視圖的照片。
圖11E、11F和11H是用本發(fā)明組合物處理Yucatan豬皮膚得到的電子顯微視圖的照片。
圖11D和11G是Yucatan豬皮膚未處理部位的電子顯微視圖照片。
圖12A、12B、12C、12D和12E是Yucatan豬皮膚的組織學(xué)F&M著色部分的照片，其中12A表示未處理的皮膚；12B表示用本發(fā)明的組合物處理8星期后的皮膚；12C表示停止處理1星期后的皮膚；12D表示停止處理兩星期后的皮膚；12E表示停止處理4星期后的皮膚。
圖13是用本發(fā)明的組合物處理Yucatan豬皮膚后，從該皮膚中取出的F&M著色組織學(xué)部分的照片。
圖14包括用本發(fā)明組合物處理人皮膚時，處理前和處理后的紫外和可見光數(shù)字照片。
發(fā)明詳述我們發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶、類胰蛋白酥和PAR-2激動劑可用來增加哺乳動物皮膚的色素沉著，胰蛋白酶抑制劑、和/或類胰蛋白酶抑制劑、和/或和凝血酶抑制劑和PAR-2拮抗劑可用來降低皮膚的色素沉著。按照我們的觀點(diǎn)，在此引入作為參考的US5,523,308號專利中記載了一些化合物，它們作為凝血酶和/或胰蛋白酶和/或類胰蛋白酶抑制劑，在本發(fā)明中的方法是有用的。其中一部分這些化合物或它們的藥用鹽同樣記載在Costanzo等，“探測S1′亞位點(diǎn)的強(qiáng)效凝血酶抑制劑”(“Potent Thrombin Inhibitors That Probe the S1′Subsite:以雜環(huán)活化羰基為基礎(chǔ)的三肽過渡態(tài)類似物”，藥物化學(xué)雜志(J.Med.Chem)1996，第39卷，第3039-3043頁。其具有下面的結(jié)構(gòu)式
其中A選自C1-8烷基、羧基C1-4烷基、C1-4烷氧羰基C1-4烷基、苯基C1-4烷基、取代苯基C1-4烷基(其中；苯上取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、甲?；1-4烷氧基羰基、C1-2烷羰基、苯基C1-4烷氧基羰基、C3-7環(huán)烷基羰基、苯羰基、取代苯羰基(其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、C1-4烷基磺?；1-4烷氧基磺?；?、全氟C1-4烷基磺酰基、苯基磺?；⑷〈交酋；?其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、10-樟腦磺酰基、苯基C1-4烷基磺?；⑷〈交鵆1-4烷基磺?；1-4烷基亞磺?；⑷鶦1-4烷基亞磺?；⒈交鶃喕酋；?、取代苯基亞磺?；?其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、苯基C1-4烷基亞磺酰基、取代苯基C1-4烷基亞磺?；?、1-萘基磺酰基、2-萘基磺?；蛉〈粱酋；?其中取代在萘環(huán)上的基團(tuán)獨(dú)立的選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、1-萘基亞磺?；?-萘基亞磺?；蛉〈妮粱鶃喕酋；?其中取代在萘環(huán)上的基團(tuán)獨(dú)立的選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)；羧基末端結(jié)合到如式Ⅰ所示N原子上的D或L型氨基酸，這些氨基酸選自丙氨酸、天門冬酰胺、2-氮雜環(huán)丁烷羧酸、甘氨酸、N-C1-8烷基甘氨酸、脯氨酸、1-氨基-1-環(huán)C3-8烷基羧酸、四氫噻唑-4-羧酸、5,5-二甲基四氫噻唑-4-羧酸、噁唑烷-4-羧酸、2-哌啶酸、纈氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、正亮氨酸、亮氨酸、叔亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-噻吩丙氨酸、3-噻吩丙氨酸、[1,2,3,4]-四氫異喹啉-1-羧酸和[1,2,3,4]-四氫異喹啉-2-羧酸；其中與所述氨基酸的氨基末端連接的基團(tuán)選自C1-4烷基、四唑-5-基-C1-2烷基、羧基C1-4烷基、C1-4烷氧基羰基C1-4烷基、苯基C1-4烷基、取代苯基C1-4烷基(其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、1,1-二苯基C1-4烷基、3-苯基-2-羥丙?；?,2-二苯基-1-羥乙基羰基、[1,2,3,4]-四氫異喹啉-1-羰基、[1,2,3,4]-四氫異喹啉-3-羰基、1-甲氨基-1-環(huán)己烷羰基、1-羥基-1-環(huán)己烷羰基、1-羥基-1-苯基乙?；?-環(huán)己烷基-1-羥基乙酰基、3-苯基-2-羥基丙?；?,3-二苯基-2-羥基丙?；?-環(huán)己烷基-2-羥基丙?；?、甲酰基、C1-4烷氧基羰基、C1-12烷羰基、全氟C1-4烷基、C1-4烷基羰基、苯基C1-4烷基羰基、取代苯C1-4烷羰基(其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、1,1-二苯C1-4烷基羰基、取代1,1-二苯C1-4烷基羰基(其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、全氟C1-4烷基磺?；?、C1-4烷基磺?；?、C1-4烷氧基磺?；?、苯基磺酰基、取代苯基磺?；?其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C-1烷基、全氟C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、10-樟腦磺?；?、苯基C1-4烷基磺?；⑷〈交鵆1-4烷基磺?；⑷鶦1-4烷基亞磺?；?、C1-4烷基亞磺酰基、苯基亞磺?；?、取代苯基亞磺?；?其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、1-萘基磺?；?、2-萘基磺?；蛉〈粱酋；?其中萘上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、1-萘基亞磺?；?、2-萘基亞磺酰基或取代的萘基亞磺?；?其中萘上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)；或者由兩個氨基酸組成的多肽，其中第一個氨基酸是D或L氨基酸，其羧基末端與式Ⅰ所示的氮結(jié)合，這些氨基酸選自甘氨酸、N-C1-8烷基甘氨酸、丙氨酸、2-氮雜環(huán)丁烷羧酸、脯氨酸、四氫噻唑-4-羧酸、5,5-二甲基四氫噻唑-4-羧酸、噁唑烷-4-羧酸、1-氨基-1-環(huán)C3-8烷基羧酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、3-(C1-4烷氧基)脯氨酸、4-(C1-4烷氧基)脯氨酸、3,4-脫氫脯氨酸，2,2-二甲基-4-四氫噻唑羧酸、2,2-二甲基-4-噁唑烷羧酸、2-哌啶酸、纈氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、叔亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-噻吩丙氨酸、3-噻吩丙氨酸、[1,2,3,4]-四氫異喹啉-2-羧酸、天冬氨酸-4-C1-4烷基酯、谷氨酸-5-C1-4烷基酯。第二個D或L氨基酸結(jié)合到上述第一個氨基酸的氨基末端，這些氨基酸選自苯丙氨酸、4-苯甲酰基基苯丙氨酸、4-苯丙氨酸、4-(羧基C1-2烷基)苯丙氨酸、取代苯丙氨酸(其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-聯(lián)苯基丙氨酸、高苯丙氨酸(homophenylalanine)、八氫吲哚-2-羧酸、2-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-噻唑基丙氨酸、2-噻吩基丙氨酸、3-(3-苯并噻吩基)丙氨酸、3-噻吩基丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天門冬酰胺、3-三C1-4烷基甲硅烷基丙氨酸、環(huán)己烷基甘氨酸、二苯基甘氨酸、苯基甘氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸砜、2.2-二環(huán)己烷基丙氨酸、2-(1-萘基丙氨酸)、2-(2-萘基丙氨酸)、苯基取代的苯丙氨酸(其中的取代基選自C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、天冬氨酸、天冬氨酸-4-C1-4烷基酯、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、天冬氨酸、天冬氨酸-4-C1-4烷基酯谷氨酸、谷氨酸-5-C1-4烷基酯、環(huán)C3-8烷基丙氨酸、取代的環(huán)C3-8烷基丙氨酸(其中環(huán)上的取代基為羧基、C1-4烷基酯、環(huán)C3-8烷基丙氨酸、取代的環(huán)C3-8烷基丙氨酸(其中環(huán)上的取代基為羧基、C1-4烷基羧基、C1-4烷氧基羰基或氨基羰基)、2,2-二苯基丙氨酸和所有氨基酸的所有α-C1-5烷基的衍生物，其中，所述的第二個氨基酸的氨基末端沒有取代或單取代，單取代時的取代基選自甲?；1-12烷基、四唑-5-基C1-2烷基、羧基C1-8烷基、羧烷氧基C1-4烷基、苯基C1-4烷基、取代的苯基C1-4烷基(其中苯上的取代基團(tuán)獨(dú)立的選自一個或多個C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、1,1-二苯基C1-4烷基、C1-6烷氧基羰基、苯基C1-6烷氧基羰基、C1-2烷基羰基、全氟C1-4烷基C0-4烷基羰基、苯基C1-4烷基羰基、取代苯基C1-4烷基羰基(其中苯上的取代基團(tuán)獨(dú)立的選自一個或多個C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、1,1-二苯基C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基羰基)、10-樟腦磺?；?、苯基C1-4烷基磺?；?、取代苯基C1-4烷基磺?；?、C1-4烷基亞磺酰基、全氟C1-4烷基亞磺酰基、苯基亞磺酰基、取代苯基亞磺?；?其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、苯基C1-4烷基亞磺?；?、取代苯基C1-4烷基亞磺?；?、1-萘基磺酰基、2-萘基磺酰基或取代萘基磺?；?其中取代在萘環(huán)上的基團(tuán)選自C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基氨基C1-4烷氨基C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、1-萘基亞磺?；?、2-萘基亞磺?；蛉〈妮粱鶃喕酋；?其中取代在萘環(huán)上的基團(tuán)選自C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)；R1選自氫或烷基、R2選自氨基C2-8烷基、胍基C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基C2-5烷基、苯基、取代苯基(其中取代基獨(dú)立地選自一或多個氨基、脒基、胍基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基或硝基)、芐基、苯基取代的芐基(其中取代基團(tuán)獨(dú)立地選自一或多個氨基、脒基、胍基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-04烷基、C1-3烷氧基或硝基)、羥基C2-5烷基、C1-5烷氨基C2-5烷基、C1-5二烷氨基C2-5烷基、4-氨基環(huán)己烷基C0-2烷基和C1-5烷基；P為0或1；B為
其中，n為0-3，R3為H或C1-5烷基，B的羰基部分與E相連；E為雜環(huán)，選自噁唑啉-2-基、噁唑-2-基、噻唑-2-基、噻唑-5-基、噻唑-4-基、噻唑啉-2-基、咪唑-2-基、4-氧代-2-喹喔啉-2-基、2-吡啶基、3-吡啶基、苯并[b]噻吩-2-基、三唑-4-基、三唑-6-基、吡唑-2-基、4,5,6,7-四氫苯并噻唑-2-基、萘并[2,1-d]噻唑-2-基、萘并[1-2-d]噻唑-2-基、喹喔啉-2-基、異喹啉-1-基、異喹啉-3-基、苯并[b]呋喃-2-基、吡嗪-2-基、喹唑啉-2-基、異噻唑-5-基、異噻唑-3-基、嘌呤-8-基、和取代的雜環(huán)，其中的取代基選自C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、氨基、硝基、酰胺基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、羧基、C1-4烷氧基羰基、羥基或苯基C1-4烷氨基羰基。
更具體地說，按我們的觀點(diǎn)，上式含有d-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸骨架的一些化合物應(yīng)該能有效地抑制PAR-2路徑從而引起脫色素。一個特別優(yōu)選的化合物，其作為凝血酶和胰蛋白酶抑制劑，能有效地是使哺乳動物皮膚脫色素，該化合物是(S)-N-甲基-D-苯丙氨酰-N-[4-[(氨基亞氨基甲基)氨基]-1-(2-苯并噻唑基羰基)丁基]-L-脯氨酰胺((S)-N-Methyl-D-phenylalanyl-N-[4-[(aminoimionmethyl)amino]-1-(2-benzothiazolylcarbonyl)butyl]-L-prolinamide)(化學(xué)文摘(CA)命名)(以下稱“化合物Ⅰ”)。我們認(rèn)為在US5,523,308中公開的與化合物Ⅰ類似或功能類似的其他化合物，可能在本發(fā)明的組合物和方法中是具有活性作用的。其它的抑制胰蛋白酶的化合物如絲氨酸蛋白酶抑制劑和特別是大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)也在本發(fā)明的方法中是有用的。大豆(soybean)、大棉豆和黑豆提取物，以及由這些豆類制得的其它天然產(chǎn)品例如包括但不限于豆奶、豆糊和醬等，也通過此機(jī)理減少色素沉著。
絲氨酸蛋白酶抑制劑的另外來源還可從下列科屬植物中得到茄科(如馬鈴薯、西紅柿和粘果(tomatilla)等)；禾本科(如稻谷、蕎麥、高梁、小麥、大麥和燕麥等)；葫蘆科(如黃瓜、南瓜屬植物、葫蘆和絲瓜屬植物等)；以及優(yōu)選的豆科(如大豆、豌豆、兵豆和花生等)。
當(dāng)不愿被下列理論所束縛時，我們的理論是能影響皮膚色素沉著的化合物的作用機(jī)理是通過直接或間接與角化細(xì)胞PAR-2或與其活性蛋白酶相互作用，因而直接或間接影響黑素的生成。也許，在增加色素沉著的情況下，本發(fā)明中的化合物誘導(dǎo)皮膚黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)黑素體的信號或者角化細(xì)胞接受黑素體的信號；在減少黑素沉著的情況下，本發(fā)明的化合物減低皮呋中的這些信號。
對于在本發(fā)明的組合物和方法中有活性的化合物，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式，局部施用。如果這些局部活性的藥品或化妝品的轉(zhuǎn)運(yùn)參數(shù)需要，對于本發(fā)明的局部活性組合物，可優(yōu)選再含有藥物或化妝品可接受的載體，這些載體能夠作為轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)使活性物質(zhì)局部穿透皮膚。
當(dāng)本發(fā)明的一些組合物特別是蛋白質(zhì)如胰蛋白酶和STI局部給藥時，一種可接受的載體包括脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體更優(yōu)選非離子脂質(zhì)體并包括a)甘油二月桂酸酯(優(yōu)選的含量約為5％-70％重量比)；b)具有膽甾醇中的甾體骨架的化合物(優(yōu)選的含量約為5％-45％重量比)；和c)一種或多種具有約12-18個碳原子的脂肪酸醚(總共優(yōu)選的含量約為5％-70％重量比)。其中脂質(zhì)體化合物成分的優(yōu)選比例約為37.5∶12.5∶33.3∶16.7。最優(yōu)選的脂質(zhì)體組成物質(zhì)是甘油二月桂酸酯/膽甾醇/聚氧乙烯基-10-硬脂醚/聚氧乙烯基-9-月桂醚(GDL脂質(zhì)體)。以組合物的總量為基礎(chǔ)，優(yōu)選含有的脂質(zhì)體含量約為10mg/mL至100mg/ml，更優(yōu)選的含量約為20mg/ml-50mg/ml。最優(yōu)選的比例約為37.5∶12.5∶333∶16.7。合適脂質(zhì)體優(yōu)選根據(jù)實(shí)施例1設(shè)定的方案制備得到，通過本領(lǐng)域的其它常用方法得到的脂質(zhì)體也可接受。上面所述的組合物可制備如下在合適容器中合并所需要的成分，在周圍環(huán)境條件下，以本領(lǐng)域熟知的、任何通常的高剪切混合方式混合上述物質(zhì)，得到非離子脂質(zhì)體。例如這些脂質(zhì)體的公開在Niemiec等，“非離子脂質(zhì)體組合物對毛囊皮脂腺單位中肽類藥物局部給藥的影響應(yīng)用Hamster耳模型的體內(nèi)試驗(yàn)研究”，12藥物研究，1184-88(1995)“Influence of Nonionic Liposomal CompositionOn Topical Delievery of Peptide Drugs Into Pilosebacious Units:An In Vivo Study Usingthe Hamster Ear Model”12 Pharm.Res.1184-88(1995)(“Niemiec”)，其全部內(nèi)容在此引入作為參考。我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的組合物中脂質(zhì)體的存在，可以增強(qiáng)本發(fā)明的一些組合物脫色素的能力。
其它優(yōu)選的制劑包括例如豆奶或其它直接來源于豆類或其它合適植物的液體制劑。例如這些制劑可包括大量的豆奶、維持豆奶物理穩(wěn)定性的乳化劑和選擇性存在的絡(luò)合劑、防腐劑、潤膚劑、濕潤劑和/或增稠劑或膠粘劑。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的水包油乳劑、油包水乳劑、基于溶劑的制劑和水性膠均可用作載體用于本發(fā)明組合物的使用。
用于制劑的活性化合物來源通常取決化合物的特殊形式。對于小的有機(jī)分子和肽類片斷可以化學(xué)合成，并以適合藥/化妝品應(yīng)用的純凈形式提供。天然提取物產(chǎn)品可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)純化。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員還可應(yīng)用重組的化合物。
在可選擇的實(shí)施例中，局部活性的藥用組合物或化妝品可任意選擇地與其它成分結(jié)合，這些成分如增濕劑、化妝品輔料、抗氧化劑、漂白劑、酪氨酸酶抑制劑和其它已知的脫色素試劑、表面活性劑、發(fā)泡劑、調(diào)理劑、濕潤劑、香味劑、增粘劑、緩沖劑、防腐劑和防曬劑等。本發(fā)明的組合物還可包括有效量的視黃醛衍生物(即可與任一視網(wǎng)膜受體結(jié)合的化合物)。包括例如維A酸、維生素A1、維A酸和/或維生素A1的酯等。
局部活性的藥物或化妝品應(yīng)該有效量地施用從而使哺乳動物皮膚的色素沉著產(chǎn)生變化。這里所述的“有效量”應(yīng)該是指能足以覆蓋需要產(chǎn)生色素沉著變化的皮膚表面區(qū)域的量。優(yōu)選地，所述組合物自由地用于皮膚表面，因此，基于皮膚表面的面積，當(dāng)在制劑中需要色素沉著產(chǎn)生變化時，局部活性試劑存在的量約為2-200μl/cm2。當(dāng)應(yīng)用凝血酶或胰蛋白酶抑制劑時如化合物Ⅰ或其類似物，無論是合成物質(zhì)還是天然來源的物質(zhì)，這些活性物質(zhì)與組合物的重量/體積比應(yīng)該約為0.0001％-15％。更優(yōu)選地，這些物質(zhì)在組合物中的含量約為0.0005％-5％。最優(yōu)選地，它們在組合物中的含量約為0.001-1％。當(dāng)然，對于前述組份，這些是建議的范圍。在本發(fā)明方法中，對于具有較高治療指數(shù)的PAR-2路徑激動劑/拮抗劑和/或抑制劑，它們不需要非常高的濃度和劑量就可在本發(fā)明方法中有效，設(shè)置低范圍的目的是能夠提高效率。這樣的化合物可以是合成的或天然來源的。
在本發(fā)明的組合物中，還可應(yīng)用直接來源于植物的液體衍生物或天然提取物，應(yīng)用的濃度(重量/體積)約為1-99％。天然提取物和天然衍生物蛋白酶抑制劑如STI的比例有不同的優(yōu)選范圍約為組合物的約O.01％-20％和更優(yōu)選的約1％-10％。當(dāng)然，對于本發(fā)明的活性試劑混合物，它們可組合和合并使用在同一制劑中，或應(yīng)用在不同制劑的系列應(yīng)用中。
我們意外的發(fā)現(xiàn)當(dāng)局部活性試劑例如PAR-2激動劑和/或抑制劑和胰蛋白酶和/或凝血酶和/或類胰蛋白酶和/或它們的抑制劑，當(dāng)局部涂敷于動物皮膚時，色素沉著產(chǎn)生顯著的變化。優(yōu)選地，脫色素試劑(還有本發(fā)明中其它影響色素沉著的試劑)以一個相對高的濃度和劑量用于哺乳動物皮膚(對于具有高治療指數(shù)的化合物如化合物Ⅰ以及相關(guān)的物質(zhì)，其含量約為0.005％-1％；液體衍生物和植物提取物約為20％-99％；天然提取物和天然產(chǎn)生的蛋白酶抑制劑如STI或它們的混合物約為1％-20％)，每天1-2次維持一段時間直至皮膚顯示色素沉著的變化，這段時間可能約為4-10周或更長。然后，一旦色素沉著發(fā)生變化，則可應(yīng)用低濃度或劑量的活性物質(zhì)(對于具有高治療指數(shù)的化合物如化合物Ⅰ以及相關(guān)的化合物，其含量約為0.00001％-0.005％；液體衍生物和植物提取物約為10％-90％；天然提取物和天然產(chǎn)生的蛋白酶抑制劑如STI或它們的混合物約為0.01％-5％)，并降低用藥頻率，如約每天約一次直至約每星期兩次。本發(fā)明中，活性物質(zhì)的作用是可逆的，因此，為了維持上述作用，必須持續(xù)用藥或服藥。在此只是說明性地公開本發(fā)明，如果缺少在此沒有特別公開的任何成分、組份或步驟，本發(fā)明也可能合適地實(shí)施。
下面幾個實(shí)施例可進(jìn)一步說明本發(fā)明的特性以及實(shí)施本發(fā)明的方式，但本發(fā)明的組合物和方法并不局限于這些實(shí)施例。實(shí)施列1影響色素沉著的蛋白酶抑制劑為了研究PAR-2路徑對于色素沉著可能的作用，應(yīng)用體外的表皮等同物系統(tǒng)。所用的表皮等同物系統(tǒng)含有黑素細(xì)胞。在進(jìn)行該項研究中，一個有用的表皮等同物系統(tǒng)是購自MatTek公司的黑素皮膚系統(tǒng)(MelanoDerm system)。該系統(tǒng)含有正常的人黑素細(xì)胞，還有正常的來源于人體的表皮角化細(xì)胞，該細(xì)胞培養(yǎng)成高度分化的多層人表皮模型。在下列實(shí)施例中，用試驗(yàn)的化合物處理等同物三天，在開始處理后的第四天收集樣品。收集的等同物用DOPA(酪氨酸酶酶解物)和H&E(一種標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)著色方法)著色，或用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的另一種著色方法Fontana-Mason(F&M)著色。F&M著色是一種銀著色技術(shù)，能干凈地、清楚地標(biāo)記具有高活性地還原硝酸銀性質(zhì)的黑素。
應(yīng)用含黑素細(xì)胞的多層人表皮等同物系統(tǒng)作為研究蛋白酶抑制劑影響黑素生成的體外模型系統(tǒng)。所用的表皮等同物為黑素皮膚，購自Ashland的MatTek,MA。已知這些等同物受紫外光B(“UVB”)照射時，色素沉著增加；這些等同物與增白劑如苯甲醛和氫醌接觸時，色素沉著減少。使這些黑素皮膚表皮等同物與苯甲醛(來自St.Louis,MO的Sigma)和氫醌(來自Sigma)相接觸以及曝露在UVB射線下。UV射線照射時，在照射室中進(jìn)行，應(yīng)用UVB FS光源，除去蓋板(plate cover)，在照射室的下部放置磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，來自Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)。用UVX輻射計(UVP Inc.,San Gabriel CA)測量UVB的強(qiáng)度。用0.1-0.12J/cm2的強(qiáng)度處理等同物，應(yīng)用直至0.3J/cm2的強(qiáng)度處理等同物時，沒有發(fā)現(xiàn)會影響活力。
在紫外光照射/接觸試驗(yàn)化合物的第四天，固定等同物，分成若干部分并著色，或者不分份作為一個整體著色。黑素皮膚等同物用福爾馬林固定后置于石蠟塊中，應(yīng)用下列標(biāo)準(zhǔn)方法對黑素皮膚等同物各部分著色(1)H&E,(2)DOPA+H&E和(3)Fontana-Mason(“F&M”)，應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)?；蛘邔φ麄€黑素皮膚等同物著色。捕獲它們的圖象進(jìn)行圖象分析。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時至少每個實(shí)驗(yàn)三個等同物，每個等同物至少分成三部分。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。DOPA是酪氨酸酶酶解物。F&M識別還原硝酸銀的分子，主要識別黑素。應(yīng)用Optomax Inc,Hollis,NH的Optomax圖象分析系統(tǒng)對F&M著色部分進(jìn)行圖象分析。或者在Gateway 2000 P5-100電腦(Media Cybemetics,Silver Springs,MD)上應(yīng)用Empire圖象數(shù)據(jù)庫1.1捕獲圖象。應(yīng)用4.0版Image Pro Plus進(jìn)行圖象分析。測定的參數(shù)如下(1)個體黑素細(xì)胞的著色程度，和(2)對于Optomax系統(tǒng)，每個區(qū)域著色的黑素細(xì)胞數(shù)目，或者(1)黑素細(xì)胞中銀沉積的表面積，和(2)對于Image Pro系統(tǒng)，著色黑素細(xì)胞的數(shù)目。應(yīng)用Optomax系統(tǒng)時，在60個黑素細(xì)胞中，測量了個體黑素細(xì)胞中銀沉積的表面積，每次處理時，用三份相同的等同物，各個等同物分成多個部分。在這些部分中，計算出每個區(qū)域黑素細(xì)胞的數(shù)目。單個黑素細(xì)胞銀沉積的平均表面積乘上每個區(qū)域色素沉著的黑素細(xì)胞數(shù)目，得到的積定義為“色素沉著因子”(pigmentation factor)。指定一個值為未處理對照，相對于它們的對照值，把處理組的值正?；幚?。應(yīng)用Image Pro系統(tǒng)時，對于整個等同物，測定硝酸銀沉積的表面積和黑素細(xì)胞的數(shù)目。指定一個值為未處理對照，相對于它們的對照值，把處理組的值正常化處理。
圖1A表示如上所述，當(dāng)與苯甲醛(50M)和氫醌(50M)接觸以及受UVB照射(0.12J/cm2)時，通過整個等同物/Image Pro系統(tǒng)計算和測量的相對色素沉著的增加或減少圖。
人體表皮等同物還與蛋白酶抑制劑的混合物接觸，所述的蛋白酶抑制劑如下面的表A所述。蛋白酶抑制劑來源于Indianapolis,IN的Boehringer Mannheim。應(yīng)用來自Boehringer Mannheim的Complete蛋白酶抑制劑雞尾酒片劑，其含有胰凝乳蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶、胰腺提取物和胰蛋白酶的抑制劑。大豆胰蛋白酶抑制劑(“STI”)來自Sigma，將其溶于50mg/ml脂質(zhì)體載體或1×PBS中。本體外實(shí)施例所用的其它蛋白酶抑制劑溶于1×PBS中，應(yīng)用上述Niemic等所述的方法制備GDL脂質(zhì)體，但作了下列改變非離子脂質(zhì)體制劑中，二月桂酸甘油酯(Emulsynt GDL ISP Van Dyk)/膽甾醇(Croda)/聚氧乙烯基-10-硬脂醚(Brij76,ICI)/聚氧乙烯基-9-月桂醚的比例是37.5∶12.5∶33.3∶16.7。制備脂質(zhì)體時，用pH為7.4的0.05M Hepes緩沖液(Gaithersburg,MD的Gibco-BRL)作為水相。對于這些蛋白酶抑制劑的混合物和絲氨酸蛋白酶抑制劑的不同組合物，測試它們影響黑素生成的能力。正如圖1B所示，一些絲氨酸蛋白酶抑制劑，特別是STI(大豆胰蛋白酶抑制劑)能非常有效地抑制黑素的生成。
表A<
實(shí)施例2蛋白酶活化受體參與色素沉著實(shí)施例1證實(shí)了STI能減少色素沉著。STI抑制胰蛋白酶。因?yàn)橐阎鹊鞍酌改芑罨疶R和PAR-2，我們測試了TR和PAR-2參與色素沉著的可能性。將黑素皮膚人上皮等同物每天用下面表B中陳列的TR和PAR-2激動劑以及拮抗劑處理，處理3天。在第四天，將樣本收集、固定，進(jìn)行DOPA、H&E或F&M著色。組織學(xué)檢查和整個等同物測定顯示了處理后色素沉著的變化。圖2描述了本實(shí)施例的結(jié)果。如圖所示，PAR-2肽激動劑SLIGRL減少了色素在單個黑素細(xì)胞中的沉著。用是凝血酶和胰蛋白酶抑制劑處理的化合物Ⅰ導(dǎo)致色素沉著減少。
圖3顯示了本實(shí)施例中的試驗(yàn)結(jié)果，表示用TR和PAR-2試劑處理的黑素皮膚等同物中的色素沉著水平。作為一種PAR-2激動劑，SLIGRL能極大地增加色素沉著，這表明PAR-2可能參與色素沉著。水蛭素是一種凝血酶特異抑制劑，TFLLRNPNDK是一種TR選擇性激動劑，它們對色素沉著都沒有任何影響。然而，作為一種特異性較差的TR抑制劑，SFLLRN表現(xiàn)出減輕或減少色素沉著的傾向。這表明TR參與色素沉著的可能性較小。
表B
實(shí)施例3蛋白酶活化受體信號傳導(dǎo)與黑色素生成之間的劑量-反應(yīng)關(guān)系用與實(shí)施例2相同的方法，將黑素皮膚等同物用SLIGRL，這種PAR-2肽活化劑，以不斷增加的濃度0、10和50μM處理。在第四天進(jìn)行F&M著色。如附圖4A所示，SLIGRL，這種PAR-2肽活化劑，其濃度的增加導(dǎo)致色素沉著增加。作為PAR-2肽活化劑，胰蛋白酶具有相同的效果。用化合物Ⅰ，這種凝血酶和胰蛋白酶的抑制劑，以從0.1pM到1μM不斷增加的濃度進(jìn)行處理，結(jié)果導(dǎo)致色素沉著降低(見附圖4A)。相對于未處理對照組，用UVB照射進(jìn)行預(yù)處理增加了黑色素的生成?；衔铫褚材軠p少UVB誘導(dǎo)的色素沉著(見附圖4B)。本實(shí)施例證實(shí)了色素沉著的增加和減少與PAR-2信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)之間的劑量-反應(yīng)關(guān)系。本實(shí)施例還證實(shí)了化合物Ⅰ能抑制色素沉著和阻止UV誘導(dǎo)的色素沉著。實(shí)施例4:PAR-2在角化細(xì)胞、但不在黑素細(xì)胞中表達(dá)以前已經(jīng)證實(shí)了PAR-2和TR能在角化細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中表達(dá)。本實(shí)施例證實(shí)了PAR-2在角化細(xì)胞、但不在黑素細(xì)胞中表達(dá)。此外，還證實(shí)了TR在角化細(xì)胞和黑素細(xì)胞中都能表達(dá)。為了證實(shí)上述結(jié)論，將黑素皮膚人上皮等同物、人初生黑素細(xì)胞組織(新生兒和成人，從Clonetics of San Diego,CA得到)和得自ATCC of Rockville,MD的Cloudman S91小鼠黑素瘤細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長，使用“RNA Stat-60”試劑提取總的RNAs,“RNA Stat-60”試劑可從“Tel-Test B”公司中獲得，如Chomczymski在“通過胍翁酸硫氰酸鹽-苯酚-氯仿提取法來分離RNA的單步法”162生化年報(Anal.Biochem),156-69(1987)中描述的。然后將足夠量的不含RNase的DNase加入到從每份樣本中提取的RNA中，這樣通過使用Promega公司出版(1995年5月)的使用說明“不含RNase的DNase”中提供的操作步驟，每一各自產(chǎn)物能得到200ng DNA酶化的RNA，不含RNase的DNase可以商品名“RQ1不含RNase的DNase”從Promega公司中購得。依據(jù)Gibco-BRL(現(xiàn)為現(xiàn)代生命技術(shù))出版(1992年4月)的使用說明“Superscript逆轉(zhuǎn)錄酶Ⅱ”中提供的操作步驟，使用無規(guī)則六聚物，例如可從生命技術(shù)公司購得的無規(guī)則引物將得到的200ng DNA酶化的RNA逆轉(zhuǎn)錄(“RT”)。
將得到的RT產(chǎn)物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)擴(kuò)增，反應(yīng)使用約0.5單位(每100μl反應(yīng)物)耐熱的DNA聚合酶和約0.1μmol/反應(yīng)物的TR和PAR-2特異引物或甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(G3PDH)引物，DNA聚合酶可以商品名“Taq聚合酶”從Perkin-Elmer-Cetus公司購得，TR和PAR-2特異引物描述在表C和Marthinusset al.,1995中，此文獻(xiàn)在此引入以作參考，G3PDH引物可從Clontech實(shí)驗(yàn)室，PaloAlto公司，CA中獲得，實(shí)驗(yàn)依據(jù)Marthinuss et al.,1995提供的操作步驟或Clontech實(shí)驗(yàn)室的引物所附的使用說明。
為了比較一定基因在角化細(xì)胞和黑素細(xì)胞中的表達(dá)水平，依據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法，用2％瓊脂糖/溴化乙錠凝膠測定PCR產(chǎn)物。當(dāng)需要更好的可見性時，依據(jù)眾所周知的技術(shù)，用乙醇將得到的PCR產(chǎn)物沉淀。當(dāng)使用G3PDH引物時，只用了10％PCR反應(yīng)產(chǎn)物。用得自表皮等同物并且沒有逆轉(zhuǎn)錄的RNA樣本作為每一PCR擴(kuò)增的陰性對照。在凝膠相關(guān)路徑中沒有譜帶表示樣本中沒有基因組DNA污染物。當(dāng)陽性對照物不能商購獲得時，用逆轉(zhuǎn)錄的人皮膚RNA樣本作為陽性對照。RT-PCR產(chǎn)物在凝膠上的遷移與陽性對照組完全相同，并且與報導(dǎo)的擴(kuò)增物尺寸完全一樣。
通過測定G3PDH的mRNA水平來比較每一RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物各自的相對質(zhì)量，G3PDH是每一反應(yīng)產(chǎn)物都有的一種“看家”基因。如附圖5和6所示，在所以進(jìn)行測定的時間點(diǎn)，G3PDH基因的表達(dá)相似，這使得能夠比較感興趣基因的基因表達(dá)水平。
附圖5A表明，正如所預(yù)期的那樣，TR和PAR-2在所有的皮膚和黑素皮膚等同物(“MD”)中都表達(dá)。然而，S91黑瘤細(xì)胞(“S91”)不表達(dá)PAR-2或TR。為了進(jìn)行進(jìn)一步研究，我們測定了新生兒初生黑素細(xì)胞(“mel-NB”)和成人黑素細(xì)胞(“mel-A”)能否表達(dá)TR和PAR-2。如附圖5B所示，人初生黑素細(xì)胞表達(dá)TR但不表達(dá)PAR-2。因此，我們提出在黑素皮膚等同物中，PAR-2激動劑和拮抗劑能與角化細(xì)胞但不能與黑素細(xì)胞互相作用，TR激動劑和拮抗劑既能與角化細(xì)胞又能與黑素細(xì)胞相互作用。因此角化細(xì)胞—黑素細(xì)胞相互作用是指，在此作用期間角化細(xì)胞—PAR-2信號轉(zhuǎn)化成色素沉著終點(diǎn)。
表C中說明了所使用的DNA引物，PCR擴(kuò)增反應(yīng)所需MgCl2的量，以及PCR周期的長度。
表C:RT-PCR測定中使用的DNA引物
實(shí)施例5化合物Ⅰ脫色素作用需要角化細(xì)胞-黑素細(xì)胞接觸實(shí)施例4的結(jié)果表明，單獨(dú)的黑素細(xì)胞可能不能對PAR-2拮抗劑的脫色素作用有反應(yīng)。實(shí)際上，化合物Ⅰ不能影響由對苯二酚和苯甲醛減少的人初生黑素細(xì)胞或霍亂毒素誘導(dǎo)的S91細(xì)胞的色素沉著水平。既然PAR-2不能在黑素細(xì)胞中表達(dá)，我們測定了化合物Ⅰ脫色素作用需要角化細(xì)胞—黑素細(xì)胞相互作用的可能性。比較初生黑素細(xì)胞組織與固定在表皮等同物(表皮，缺乏黑素細(xì)胞)上的同一組織，固定后能產(chǎn)生角化細(xì)胞與黑素細(xì)胞沒有任何接觸的共培養(yǎng)物。也比較這些組織與黑素皮膚等同物，其中黑素細(xì)胞存在于等同物的基底層中。將組織用如表D所示的化合物Ⅰ、PAR-2激動劑SLIGRL、TR激動劑TFLLRNPNDK處理3天，在第四天用DOPA著色。在表D中，角化細(xì)胞用“K”表示，黑素細(xì)胞用“M”表示，沒有角化細(xì)胞—黑素細(xì)胞接觸用“非K-M接觸”表示。如表D所示，在用這些試劑處理的初生黑素細(xì)胞和共培養(yǎng)物中，沒有觀察到影響色素沉著的作用。在黑素皮膚等同物中，化合物Ⅰ減少了色素沉著，SLIGRL誘導(dǎo)色素沉著，而TFLLRNPNDK沒有任何影響。這些結(jié)果表明PAR-2對色素沉著的影響需要角化細(xì)胞—黑素細(xì)胞接觸。
表D處理 黑素細(xì)胞共培養(yǎng)物黑素皮膚(非K) (非K-M接觸) (K-M接觸)
實(shí)施例6化合物Ⅰ影響黑素細(xì)胞基因表達(dá)將黑素皮膚等同物用凝血酶和胰蛋白酶抑制劑即化合物Ⅰ或PAR-2激動劑SLIGRL以不斷增加的濃度進(jìn)行處理。用實(shí)施例4中的方法，通過RT-PCR來測定從未處理和用化合物Ⅰ處理的等同物中提取的RNAs。設(shè)計如表C中列舉的基因特異性引物，使用如實(shí)施例4中的人G3PDH的Clontech引物。用來測定其表達(dá)水平的黑素生成基因是酪氨酸酶、TRP-1和TRP-2。
如附圖6A所示，在用化合物Ⅰ處理的樣本中觀察到，TRP-1 mRNA表現(xiàn)出劑量-依賴性減少，TRP-2mRNA表現(xiàn)出劑量-依賴性增加，然而，酪氨酸酶的表達(dá)沒有受影響。這些變化與此抑制劑的劑量—依賴性增白作用有關(guān)。兩種模式的基因表達(dá)都導(dǎo)致變白效應(yīng)。TRP-2酶將氨基二氧環(huán)己二烯丙酸轉(zhuǎn)化為5,6-二羥基吲哚羧酸(DHICA)，而不是5,6-二羥基吲哚(DHI)。此過程產(chǎn)生褐色的、分散地很好的真黑素，完全不同與不溶性黑色的真黑素，并且使皮膚產(chǎn)生較淺的色調(diào)。TRP-1穩(wěn)定了黑素生成復(fù)合物，使色素能夠產(chǎn)生。TRP-1水平的降低導(dǎo)致酪氨酸酶的活性下降和色素沉著的減少。缺乏這種蛋白導(dǎo)致白化病。然而，增加SLIGRLR的濃度不能影響黑素生成基因的表達(dá)(附圖6B)TRP-1和TRP-2是黑素細(xì)胞特異性的?；衔铫褚种埔鹊鞍酌负湍?。水蛭素是一種特異性凝血酶抑制劑，其對色素沉著沒有影響，參見實(shí)施例2。因此，我們決定測定胰蛋白酶和凝血酶是否在皮膚中表達(dá)。如表C所述，設(shè)計一種檢測腦和胃胰蛋白酶的探針，用其檢測兩種mRNAs在整個皮膚mRNA樣本和黑素皮膚等同物中的表達(dá)，整個皮膚mRNA樣本是從Invitrogen of Carlsbad,CA中得到的。用相同的表達(dá)檢測方法檢測凝血酶的表達(dá)。胰蛋白酶和凝血酶都沒有在正常的黑素細(xì)胞中表達(dá)(附圖5A,B)。這些數(shù)據(jù)表明，如果胰蛋白酶活化PAR-2，其可能僅由角化細(xì)胞產(chǎn)生。如附圖6A所示，用化合物Ⅰ處理導(dǎo)致胰蛋白酶的表達(dá)增加。SLIGRL雖然不能影響黑素生成基因表達(dá)(附圖6B)，但也增加等同物中胰蛋白酶的表達(dá)。我們推斷，雖然在皮膚里胰蛋白酶可能是一種天然的PAR-2活化劑并且可能影響色素沉著，但是其mRNA水平與色素沉著無關(guān)。這表明在表皮中，另一種還未經(jīng)確認(rèn)的、能被化合物Ⅰ和STI以及類似物抑制的絲氨酸蛋白酶，是一種天然的PAR-2活化劑。能誘導(dǎo)或抑制這種蛋白酶的化合物可分別用作增黑劑和增白劑。實(shí)施例7凝血酶和胰蛋白酶抑制劑和PAR-2激動劑在體內(nèi)影響色素沉著將兩只天竺鼠用溶在70∶30乙醇∶丙二醇載體中的化合物Ⅰ以1和10μM的濃度處理其色素沉著的一只乳頭，每天處理兩次，每周處理5天，處理7周。將每只天竺鼠的另一個乳頭僅用載體處理以作為對照。處理7周后，色度測量顯示各自的的劑量-依賴性增白效果分別是+9.6L*和約18L*單位。同時沒有觀察到刺激作用的可見信號。
將每組有三只的四組天竺鼠各自用化合物Ⅰ、SFLLRN、FSLLRN和SLIGRL以10μM的濃度處理，每天處理兩次，每周處理5天，處理8周。處理6周后，色度測量顯示化合物Ⅰ具有增白作用，PAR-2激動劑SLIGRL具有變黑作用。本實(shí)施例的結(jié)果在附圖7中描述。實(shí)施例8凝血酶和胰蛋白酶抑制劑和和PAR-2激動劑在體內(nèi)影響色素沉著將一頭Yucatan小豬用化合物Ⅰ、SFLLRN、FSLLRN和SLIGRL以10μM的濃度處理，每一種化合物在豬的兩個位點(diǎn)上施用，每天處理兩次，每周處理5天，處理8周。處理8周后進(jìn)行色度測量。用化合物Ⅰ處理導(dǎo)致明顯的增白效果。PAR-2激動劑SLIGRL導(dǎo)致如色度測量所示的變黑效果。SFLLRN和FSLLRN沒有顯著作用。
將兩頭Yucatan豬用化合物Ⅰ以不斷增加的濃度處理七周半或10周，每天處理兩次，每周處理5天?；钚曰衔镆运姆N濃度使用，即0、10、50和250μM。每一濃度的化合物在豬背相反兩側(cè)的兩個位點(diǎn)上進(jìn)行處理。色度測量在處理前開始，以后每兩周測量一次。在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诙ㄆ谂恼?。?50、50和10μM活性化合物處理的位點(diǎn)分別在處理的第4、5和6周觀察到了明顯的增白效果。到第8周，兩組最高劑量處理的位點(diǎn)的增白效果相似。這些結(jié)果在附圖8中顯示。附圖9顯示了在處理期間其中一頭豬的色度記錄(L*，測定增白)。觀察到了時間和濃度依賴性的飽和作用。本實(shí)施例證實(shí)了在與人皮膚色素沉著最相似的動物模型系統(tǒng)中，化合物Ⅰ明顯的脫色素作用。
在這些實(shí)驗(yàn)的后期，用活組織來進(jìn)行組織學(xué)和電鏡學(xué)(EM)分析。將組織樣本用H&E和F&M著色。H&E著色表明在皮膚結(jié)構(gòu)中沒有刺激、炎癥反應(yīng)或變化，這證實(shí)了長期使用化合物Ⅰ的安全性。F&M著色表明在處理過的樣本中，基底層和整個表皮的色素沉著都減少了。這些結(jié)果在附圖10中顯示。未處理和用載體處理的樣本(附圖10A)色度相同，都是最暗的。10μM處理(附圖10B)樣本表現(xiàn)出色素沉著減少，50和250μM處理樣本(分別是附圖10C、10D)的顏色是最淺的。
本實(shí)施例的結(jié)果表明，化合物Ⅰ以較高濃度短期間使用，或以較低濃度長時間使用，可以獲得最大的增白效果。因此，為了達(dá)到所需的皮膚增白效果，至少有兩種不同的用藥方案可以采用。實(shí)施例9超微結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了化合物Ⅰ在體內(nèi)和體外對皮膚的作用對用化合物Ⅰ處理的黑素皮膚等同物和豬皮膚位點(diǎn)進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)分析。使用電鏡測定用化合物Ⅰ處理的黑素皮膚等同物的暗色體的形成和分布。相對于未處理的對照組，處理過的樣本含有更多的暗色體，但是含有更少的成熟的暗色體，即能顯著誘導(dǎo)黑色素生成的暗色體(附圖11A,11B)。在處理過的角化細(xì)胞中，含有暗色體的樹突能容易地識別(附圖1lC)，但是在對照組的角化細(xì)胞中則很難發(fā)現(xiàn)。這表明在處理過的樣本中，有異常的暗色體形成，并且減緩或減少暗色體向角化細(xì)胞的遷移。
使用電鏡分析從用化合物Ⅰ如實(shí)施例8所述處理8周的Yucatan豬中得到的皮膚樣本。與對照組相比，處理位點(diǎn)的角化細(xì)胞中的暗色體較小并且色素沉著更少(附圖11D、11E和11F)。此外，在處理過的皮膚中暗色體的分布也是反常的。與未處理對照組中暗色體的隨機(jī)分布相比，在處理過的皮膚中，暗色體主要是在表皮-真皮邊緣處檢測到的(附圖11G,11H)。雖然不能排除其它機(jī)理，但是我們認(rèn)為用化合物Ⅰ處理過的角化細(xì)胞不能從存在的樹突中積極地攝取或吸收暗色體。實(shí)施例10化合物Ⅰ在體內(nèi)對脫色素的影響是可逆的將Yucatan豬用化合物Ⅰ以250□M的濃度處理8周，每天處理兩次，每周處理5天，在8個位點(diǎn)上處理。在處理的末期，所有的位點(diǎn)都表現(xiàn)出明顯的脫色素效果，見附圖12B。在接下來的4周內(nèi)(從實(shí)驗(yàn)的第9周開始)，監(jiān)視處理位點(diǎn)的顏色，每周進(jìn)行兩個處理位點(diǎn)的活組織檢查。未處理位點(diǎn)也進(jìn)行活組織檢查。在處理后的第一周和第二周可以看到脫色素效果，到第四周觀察到了完全的逆轉(zhuǎn)。皮膚F&M著色皮膚切片的組織學(xué)測定證實(shí)了能明顯觀察到的色素再沉著(如附圖12所示)。象在處理后第一周那么早時，色素再沉著就已經(jīng)被組織學(xué)測定所證實(shí)。對于角質(zhì)層的色素沉著，目測法與組織學(xué)證實(shí)是相關(guān)聯(lián)的。本實(shí)施例證實(shí)了化合物Ⅰ對色素沉著機(jī)構(gòu)不引起持久的損壞，并且在體內(nèi)其作用是可逆的。附圖12A表明未用化合物Ⅰ處理的位點(diǎn)的兩個F&M著色的組織學(xué)切片。圖12B表明用化合物Ⅰ處理8周的位點(diǎn)的兩個F&M著色的組織學(xué)切片。圖12C表明用化合物Ⅰ處理8周、停止處理后1周的位點(diǎn)的切片。圖12D表明用化合物Ⅰ處理8周、停止處理后2周的位點(diǎn)的切片。圖12E表明用化合物Ⅰ處理8周、停止處理后4周的位點(diǎn)的切片。如附圖12E所示，處理后4周，在切片中色素又完全再沉著了。實(shí)施例11制備含有STI的天然產(chǎn)物實(shí)施例1證實(shí)了在任何增白制劑中含有大豆胰蛋白酶抑制劑對于其脫色素活性是可取的?；诜治鰷y試，已經(jīng)證明大豆奶和大豆糊中富含有大豆胰蛋白酶抑制劑。
為了制備大豆糊，先將大豆在去離子水或純化水中浸泡幾小時。大豆完全水化后將其磨碎，如果需要的話，再加入少量的水使糊光滑。為了制備大豆奶，除了加入更多的水以外，其它步驟同上。(磨碎步驟是為了提取大豆奶)。收集大豆奶后，將大豆奶過濾以除去大豆皮殘渣。
制備的大豆奶、大豆糊和大豆醬能用作含有STI的天然產(chǎn)物，并且能用來增白皮膚的顏色。實(shí)施例12用能影響PAR-2路徑的天然產(chǎn)物進(jìn)行處理誘導(dǎo)脫色素作用將兩頭Yucatan豬用不同的大豆和大棉豆產(chǎn)物處理8周和10周，每天處理兩次，每周處理5天。這些天然產(chǎn)物包括大豆糊、大豆蛋白的酸水解產(chǎn)物、大豆醬、天然和煮沸過的大豆奶和可商購獲得的大豆提取物(ActiphyteTMof Active Organics,Dallas Texas)、以及純化的STI、及從大豆和大棉豆(limabean)中得到的不同的胰蛋白酶抑制劑制劑。在處理的第7周，除了用煮沸過的大豆奶和大豆蛋白的酸水解產(chǎn)物處理的位點(diǎn)，其它所有的位點(diǎn)都比周圍皮膚明顯變白。從處理位點(diǎn)取得的活組織F&M著色后的組織學(xué)分析證實(shí)了大豆和大棉豆產(chǎn)物的脫色素作用。附圖13是此組織學(xué)數(shù)據(jù)的一個實(shí)例。煮沸過的大豆奶和大豆蛋白的酸水解產(chǎn)物缺乏脫色素活性的原因被解釋為，大豆蛋白在其中分別被變性和降解。我們推理，在大豆和大棉豆產(chǎn)物中的活性脫色素劑分別是大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)和大棉豆胰蛋白酶抑制劑。(實(shí)施例1表明了STI在體外的脫色素作用)。本實(shí)施例證實(shí)了具有胰蛋白酶抑制劑活性的天然提取物可用作能影響PAR-2路徑的增白劑。實(shí)施例13脂質(zhì)體制劑中的STI能使人老年斑的顏色變淺一個在其手背上有三個老年斑的人以如下方式治療8周，每天治療兩次最靠近手臂的老年斑用含有20mg/ml的脂質(zhì)體的安慰劑處治療。中間的老年斑不治療。第三個老年斑用包含在脂質(zhì)體(20mg/ml)中的1％的STI治療。
GDL脂質(zhì)體用Niemiec,et al.，在上面提供的方法制備，只是下面這些步驟有變化非離子性脂質(zhì)體制劑，含有甘油二月桂酸酯(Emulsynt GDL,ISP Van Dyk)/膽固醇(Croda)/聚氧化乙烯-10-硬脂醚(Brij76,ICI)/聚氧化乙烯-9-月桂醚，其比例是37.5∶12.5∶33.3∶16.7。Hepes緩沖液，0.05M,PH7.4(Gibco-BRL ofGaithersburg,MD)用作制備脂質(zhì)體的水相。在治療的第0、4和8周拍攝紫外和可見光數(shù)字照片。L*(亮度)值是從使用Adobe Photoshop的影像中計算出的。
如附圖14所示，治療8周后，用STI治療的老年斑變亮。圖14是四張照片的組合。左邊一半是8周治療前(上面)和治療后(下面)，手的可見光照片。在此定向，上面的老年斑是用安慰劑治療的，中間的老年斑是未治療的，下面的老年斑是用STI治療的。右邊一半是同一只手在同一時間的紫外光照片。紫外光能使皮膚較深處的色素被觀察到，這證明STI的增白效果不是皮膚表面的。附圖14清楚地顯示了STI制劑能使下面的老年斑變亮。經(jīng)計算，STI治療位點(diǎn)增加了15個L*單位，這進(jìn)一步證實(shí)了這種治療能使老年斑變白。實(shí)施例14含有大豆奶的脫色素制劑在生成大豆奶的過程中，發(fā)現(xiàn)具有很好的潤膚作用的大豆奶適于用在皮膚保養(yǎng)劑中。因?yàn)樵谌魏嗡腿閯┲兴际侵饕煞?，因此在許多其它皮膚保養(yǎng)劑中，我們假定大豆奶可以作為這些制劑中去離子水的替代物。然而，我們預(yù)計由于大豆奶中油和水的不融和性，這種類型的制劑將是物理不穩(wěn)定的。令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)用大豆奶代替水是物理穩(wěn)定的。使用大豆奶的制劑應(yīng)當(dāng)含有約1％-99％的大豆奶，更優(yōu)選含有約80％-95％的大豆奶。這種以及類似的制劑優(yōu)選含有約0％-5％(更優(yōu)選約0.1％-2％)的粘性助劑、約20％的一種或多種潤膚劑和/或約0.1％-10％(更優(yōu)選約3％-5％)的乳化劑，并且可選擇地含有約0％-5％(更優(yōu)選約1％-2％)的擴(kuò)展劑、防腐劑、螯合劑或濕潤劑。防腐劑應(yīng)當(dāng)以有效量存在以保持奶的完整性和維持組合物的活性。應(yīng)加入足夠量的增稠劑以使身體能分擔(dān)制劑而又不使其過于粘以致于阻礙了其覆蓋性，例如以約0-10％、更優(yōu)選約3％-5％的量加入。防曬劑、抗氧化劑、維生素和其它脫色素劑以及其它皮膚局部保養(yǎng)組分也可以加入到本發(fā)明的組合物中。
以大豆奶代替水的一個特別優(yōu)選脫色素制劑的實(shí)例展現(xiàn)在下面表E中。
表E
STI、大豆糊和其它含有胰蛋白酶抑制劑的天然提取物可以加入到這種制劑中以增加絲氨酸蛋白酶抑制劑的濃度。制劑中所用的活性成份的水平可以是0.01％-15％。其它脫色素劑，包括PAR-2抑制劑、酪氨酸酶抑制劑、對苯二酚、大豆產(chǎn)物、抗壞血酸及其衍生物、以及其它皮膚保養(yǎng)劑也可以加入到這種制劑中。實(shí)施例15水包油脫色素乳劑表F是水包油脫色素乳劑的兩個實(shí)例。在表F的第4欄描述了一種含有STI的制劑，其中STI能用任何天然得到的絲氨酸蛋白酶抑制劑，或任何含有絲氨酸蛋白酶抑制劑的天然提取物或成份替代。表F的第5欄是含有化合物Ⅰ的相似制劑。在此組合物中，化合物Ⅰ可以用相似的化合物、絲氨酸蛋白酶抑制劑或具有高治療指標(biāo)的PAR-2抑制劑替代，無論活性成份是通過合成得到的還是天然得到的。在這些制劑中，組分的推薦的含量范圍也陳列在表F中。這些制劑中的去離子水可以用大豆奶替代。
表F
為了制備此制劑，將各脂質(zhì)相組分合并并且在85℃混合，然后冷卻至60℃。在一個單獨(dú)的容器中，將卡波姆緩慢地加入到水或大豆奶中?；旌?0分鐘后，加入其余的水相組分并且將化合物加熱到60℃。合并兩相，混合10分鐘，冷卻至室溫。當(dāng)然，在本實(shí)施例和下面的實(shí)施例以及本發(fā)明的方法和組合物的其它實(shí)施方案中，在同一制劑中可以加入一種或多種脫色素劑。實(shí)施例16脫色素組合物(水包油乳劑)水包油脫色素乳劑的另外兩個實(shí)例展現(xiàn)在表G中。在表G的第3欄描述了一種含有STI的制劑，其中STI能用任何天然得到的絲氨酸蛋白酶抑制劑，或任何含有絲氨酸蛋白酶抑制劑的天然提取物或成分替代。表G的第4欄是含有化合物Ⅰ的相似制劑。在此組合物中，化合物Ⅰ可以用相似的化合物、絲氨酸蛋白酶抑制劑或具有高治療指標(biāo)的任何PAR-2抑制劑替代，無論活性成份是通過合成得到的還是天然得到的。在這些制劑中，組分的推薦的含量范圍也陳列在表G中。這些制劑中的去離子水可以用大豆奶替代。
表G
為了制備此制劑，將羥乙基纖維素緩慢地加入水或大豆奶中，并且攪拌直到完全溶解。在一個單獨(dú)的容器中，加入丙烯酸酯/丙烯酸C10-30烷基酯交聯(lián)聚合物并且攪拌直到完全溶解。將兩個容器中的組份合并并且混合20分鐘。然后加入維生素E醋酸酯并且混合，再加入異十六烷和泛醇(98％)。混合5分鐘后，將STI或天然提取物或化合物Ⅰ與丙二醇一起加入，攪拌5分鐘。然后加入甘油并且將制劑攪拌20分鐘。最后，用氫氧化鈉將pH值調(diào)到，對STI是8(6-8.5)，或?qū)衔铫袷?(5.5-8.5)。實(shí)施例17脫色素組合物(油包水乳劑)
表H中是油包水脫色素乳劑的一個實(shí)例。在表H的第4欄描述了一種含有STI的制劑，其中STI能用任何天然得到的絲氨酸蛋白酶抑制劑，或任何含有絲氨酸蛋白酶抑制劑的天然提取物或成分替代。表H的第5欄是含有化合物Ⅰ的相似制劑。在此組合物中，化合物Ⅰ可以用相似的化合物、絲氨酸蛋白酶抑制劑或具有高治療指標(biāo)的PAR-2抑制劑替代，無論活性成份是通過合成得到的還是天然得到的。在這些制劑中，組分的推薦的含量范圍也。
為了制備此制劑，將羥乙基纖維素緩慢地加入水或大豆奶中，并且攪拌直到完全溶解。在一個單獨(dú)的容器中，加入丙烯酸酯/丙烯酸C10-30烷基酯交聯(lián)聚合物并且攪拌直到完全溶解。將兩個容器中的組份合并并且混合20分鐘。然后加入維生素E醋酸酯并且混合，再加入異十六烷和泛醇(98％)?；旌?分鐘后，將STI或天然提取物或化合物Ⅰ與丙二醇一起加入，攪拌5分鐘。然后加入甘油并且將制劑攪拌20分鐘。最后，用氫氧化鈉將pH值調(diào)到，對STI是8(6-8.5)，或?qū)衔铫袷?(5.5-8.5)。實(shí)施例17脫色素組合物(油包水乳劑)表H中是油包水脫色素乳劑的一個實(shí)例。在表H的第4欄描述了一種含有STI的制劑，其中STI能用任何天然得到的絲氨酸蛋白酶抑制劑，或任何含有絲氨酸蛋白酶抑制劑的天然提取物或成分替代。表H的第5欄是含有化合物Ⅰ的相似制劑。在此組合物中，化合物Ⅰ可以用相似的化合物、絲氨酸蛋白酶抑制劑或具有高治療指標(biāo)的PAR-2抑制劑替代，無論活性成份是通過合成得到的還是天然得到的。在這些制劑中，組分的推薦的含量范圍也陳列在表H中。這些制劑中的去離子水可以用大豆奶替代。
表H<
為了制備止制劑，將硬脂醇和礦物油在70℃熔化。加入其它的油相組份并且加入到75℃。然后，加入已經(jīng)先溶于水或大豆奶體相并且加熱到70℃的水相組份，將混合物攪拌直到其凝固。實(shí)施例18脫色素組合物(水凝膠)表J中是脫色素水凝膠制劑的兩個實(shí)例。在表J的第3欄描述了一種含有STI的制劑，其中STI能用任何天然得到的絲氨酸蛋白酶抑制劑，或任何含有絲氨酸蛋白酶抑制劑的天然提取物或成分替代。表J的第4欄是含有化合物Ⅰ的相似制劑。在此組合物中，化合物Ⅰ可以用相似的化合物、絲氨酸蛋白酶抑制劑或具有高治療指標(biāo)的任何PAR-2抑制劑替代，無論活性成份是通過合成得到的還是天然得到的。在這些制劑中，組分的推薦的含量范圍也陳列在表J中。這些制劑中的去離子水可以用大豆奶替代。
表J
列表K中。這些制劑中的去離子水可以用大豆奶替代。
表K
為了制備此制劑，將化合物Ⅰ溶于水。把乙醇和丙二醇混合并且與含有化合物Ⅰ的水溶液合并。
Ⅰ.簡言之，我們已經(jīng)證實(shí)，活化角化細(xì)胞受體PAR-2會導(dǎo)致色素沉著增加。優(yōu)選地，通過使用胰蛋白酶或SLIGRL或SLIGKVD或其它SLIGRL或SLIGKVD衍生物，可以達(dá)到完成這種活化。我們還證實(shí)，通過使用絲氨酸蛋白酶抑制劑或PAR-2拮抗劑以及暗色體遷移阻滯劑，可以達(dá)到增白效果。其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的能抑制暗色體向角化質(zhì)細(xì)胞遷移的化合物也能用作脫色素劑。
化合物Ⅰ是一種胰蛋白酶和凝血酶抑制劑，例如能抑制暗色體向角質(zhì)化細(xì)胞遷移。STI通過相同機(jī)理起作用。未被釋放的暗色體在黑素細(xì)胞中的積聚能誘導(dǎo)負(fù)反饋機(jī)理，減緩了新的暗色體的形成。作為黑素細(xì)胞中主要的糖蛋白，TRP-1的產(chǎn)生被下調(diào)，導(dǎo)致酪氨酸酶不穩(wěn)定。這導(dǎo)致黑色素生成減少，并且導(dǎo)致顏色轉(zhuǎn)化成淺棕色，例如TRP-1∶TRP-2的比例下降。用化合物Ⅰ處理后，或用STI處理后，暗色體在黑素細(xì)胞中的積聚已經(jīng)減少了，并且改變了黑色素的含量，這也增加了化合物Ⅰ或STI的增白效果。
權(quán)利要求
1.一種影響哺乳動物皮膚色素沉著變化的方法，包括把影響PAR-2路徑的化合物以色素沉著變化的有效量施用于哺乳動物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的化合物抑制PAR-2路徑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的化合物是PAR-2的拮抗劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的化合物結(jié)合或者阻滯但并不活化PAR-2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的化合物選自結(jié)合或者阻滯但并不活化PAR-2的基于SLIGRL的拮抗劑；結(jié)合或者阻滯但并不活化PAR-2的基于SLIGKVD的拮抗劑；和它們的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的化合物為蛋白酶抑制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的化合物為絲氨酸蛋白酶抑制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的化合物為凝血酶和/或類胰類蛋白酶和/或胰蛋白酶抑制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的化合物選自式Ⅰ或其可藥用鹽
其中A選自C1-8烷基、羧基C1-4烷基、C1-4烷氧羰基C1-4烷基、苯基C1-4烷基、取代苯基C1-4烷基(其中；苯上取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、甲酰基、C1-4烷氧基羰基、C1-2烷羰基、苯基C1-4烷氧基羰基、C3-7環(huán)烷基羰基、苯羰基、取代苯羰基(其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、C1-4烷基磺?；?、C1-4烷氧基磺?；?、全氟C1-4烷基磺酰基、苯基磺?；?、取代苯基磺?；?其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、10-樟腦磺?；⒈交鵆1-4烷基磺?；?、取代苯基C1-4烷基磺?；1-4烷基亞磺?；⑷鶦1-4烷基亞磺?；?、苯基亞磺?；?、取代苯基亞磺?；?其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、苯基C1-4烷基亞磺?；⑷〈交鵆1-4烷基亞磺?；?、1-萘基磺?；?-萘基磺?；蛉〈粱酋；?其中取代在萘環(huán)上的基團(tuán)獨(dú)立的選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、1-萘基亞磺?；?-萘基亞磺?；蛉〈妮粱鶃喕酋；?其中取代在萘環(huán)上的基團(tuán)獨(dú)立的選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)；羧基末端結(jié)合到如式Ⅰ所示N原子上的D或L型氨基酸，這些氨基酸選自丙氨酸、天門冬酰胺、2-氮雜環(huán)丁烷羧酸、甘氨酸、N-C1-8烷基甘氨酸、脯氨酸、1-氨基-1-環(huán)C3-8烷基羧酸、四氫噻唑-4-羧酸、5,5-二甲基四氫噻唑-4-羧酸、噁唑烷-4-羧酸、2-哌啶酸、纈氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、正亮氨酸、亮氨酸、叔亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-噻吩丙氨酸、3-噻吩丙氨酸、[1,2,3,4]-四氫異喹啉-1-羧酸和[1,2,3,4]-四氫異喹啉-2-羧酸；其中與所述氨基酸的氨基末端連接的基團(tuán)選自C1-4烷基、四唑-5-基-C1-2烷基、羧基C1-4烷基、C1-4烷氧基羰基C1-4烷基、苯基C1-4烷基、取代苯基C1-4烷基(其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、1,1-二苯基C1-4烷基、3-苯基-2-羥丙酰基、2,2-二苯基-1-羥乙基羰基、[1,2,3,4]-四氫異喹啉-1-羰基、[1,2,3,4]-四氫異喹啉-3-羰基、1-甲氨基-1-環(huán)己烷羰基、1-羥基-1-環(huán)己烷羰基、1-羥基-1-苯基乙?；?-環(huán)己烷基-1-羥基乙?；?-苯基-2-羥基丙?；?、3,3-二苯基-2-羥基丙?；?、3-環(huán)己烷基-2-羥基丙酰基、甲?；?、C1-4烷氧基羰基、C1-12烷羰基、全氟C1-4烷基、C1-4烷基羰基、苯基C1-4烷基羰基、取代苯C1-4烷羰基(其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、1,1-二苯C1-4烷基羰基、取代1,1-二苯C1-4烷基羰基(其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、全氟C1-4烷基磺?；?、C1-4烷基磺?；?、C1-4烷氧基磺酰基、苯基磺酰基、取代苯基磺?；?其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C-1烷基、全氟C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、10-樟腦磺?；⒈交鵆1-4烷基磺?；?、取代苯基C1-4烷基磺?；?、全氟C1-4烷基亞磺?；1-4烷基亞磺?；?、苯基亞磺酰基、取代苯基亞磺?；?其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、1-萘基磺酰基、2-萘基磺酰基或取代萘基磺?；?其中萘上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、1-萘基亞磺?；?-萘基亞磺?；腿〈妮粱鶃喕酋；?其中萘上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)；或者由兩個氨基酸組成的多肽，其中第一個氨基酸是D或L氨基酸，其羧基末端與式Ⅰ所示的氮結(jié)合，這些氨基酸選自甘氨酸、N-C1-8烷基甘氨酸、丙氨酸、2-氮雜環(huán)丁烷羧酸、脯氨酸、四氫噻唑-4-羧酸、5,5-二甲基四氫噻唑-4-羧酸、噁唑烷-4-羧酸、1-氨基-1-環(huán)C3-8烷基羧酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、3-(C1-4烷氧基)脯氨酸、4-(C1-4烷氧基)脯氨酸、3,4-脫氫脯氨酸，2,2-二甲基-4-四氫噻唑羧酸、2,2-二甲基-4-噁唑烷羧酸、2-哌啶酸、纈氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、叔亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-噻吩丙氨酸、3-噻吩丙氨酸、[1,2,3,4]-四氫異喹啉-2-羧酸、天冬氨酸-4-C1-4烷基酯和谷氨酸-5-C1-4烷基酯；第二個D或L氨基酸結(jié)合到上述第一個氨基酸的氨基末端，這些氨基酸選自苯丙氨酸、4-苯甲?；奖彼?、4-羧基苯丙氨酸、4-(羧基C1-2烷基)苯丙氨酸、取代苯丙氨酸(其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-聯(lián)苯基丙氨酸、高苯丙氨酸(homophenylalanine)、八氫吲哚-2-羧酸、2-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-噻唑基丙氨酸、2-噻吩基丙氨酸、3-(3-苯并噻吩基)丙氨酸、3-噻吩基丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天門冬酰胺、3-三C1-4烷基甲硅烷基丙氨酸、環(huán)己烷基甘氨酸、二苯基甘氨酸、苯基甘氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸砜、2.2-二環(huán)己烷基丙氨酸、2-(1-萘丙氨酸)、2-(2-萘基丙氨酸)、苯基取代的苯丙氨酸(其中的取代基選自C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、天冬氨酸、天冬氨酸-4-C1-4烷基酯、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷氨基、羧基或C1-4烷氧羰基)、天冬氨酸、天冬氨酸-4-C1-4烷基酯谷氨酸、谷氨酸-5-C1-4烷基酯、環(huán)C3-8烷基丙氨酸、取代的環(huán)C3-8烷基丙氨酸(其中環(huán)上的取代基為羧基、C1-4烷基酯、環(huán)C3-8烷基丙氨酸、取代的環(huán)C3-8烷基丙氨酸(其中環(huán)上的取代基為羧基、C1-4烷基羧基、C1-4烷氧基羰基或氨基羰基)、2,2-二苯基丙氨酸和所有氨基酸的所有α-C1-5烷基的衍生物，其中，所述的第二個氨基酸的氨基末端沒有取代或單取代，單取代時的取代基選自甲?；?、C1-12烷基、四唑-5-基C1-2烷基、羧基C1-8烷基、羧烷氧基C1-4烷基、苯基C1-4烷基、取代的苯基C1-4烷基(其中苯上的取代基團(tuán)獨(dú)立的選自一個或多個C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、1,1-二苯基C1-4烷基、C1-6烷氧基羰基、苯基C1-6烷氧基羰基、C1-2烷基羰基、全氟C1-4烷基C0-4烷基羰基、苯基C1-4烷基羰基、取代苯基C1-4烷基羰基(其中苯上的取代基團(tuán)獨(dú)立的選自一個或多個C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、1,1-二苯基C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基羰基)、10-樟腦磺酰基、苯基C1-4烷基磺?；?、取代苯基C1-4烷基磺?；?、C1-4烷基亞磺?；?、全氟C1-4烷基亞磺酰基、苯基亞磺酰基、取代苯基亞磺酰基(其中苯上的取代基獨(dú)立地選自一個或多個，C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、苯基C1-4烷基亞磺?；⑷〈交鵆1-4烷基亞磺?；?-萘基磺?；?、2-萘基磺酰基或取代萘基磺?；?其中取代在萘環(huán)上的基團(tuán)選自C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)、1-萘基亞磺?；?、2-萘基亞磺?；腿〈妮粱鶃喕酋；?其中取代在萘環(huán)上的基團(tuán)選自C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷氨基、C1-4二烷基氨基、羧基或C1-4烷氧基羰基)；R1選自氫和烷基、R2選自氨基C2-8烷基、胍基C2-5烷基、C1-4烷基胍基C2-5烷基、二C1-4烷基胍基C2-5烷基、脒基C2-5烷基、C1-4烷基脒基C2-5烷基、二C1-4烷基脒基C2-5烷基、C1-3烷氧基C2-5烷基、苯基、取代苯基(其中苯上取代基獨(dú)立地選自一或多個氨基、脒基、胍基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-4烷基、C1-3烷氧基或硝基)、芐基、苯基取代的芐基(其中取代基團(tuán)獨(dú)立地選自一或多個氨基、脒基、胍基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、鹵素、全氟C1-4烷基、C1-04烷基、C1-3烷氧基或硝基)、羥基C2-5烷基、C1-5烷氨基C2 -5烷基、C1-5二烷氨基C2-5烷基、4-氨基環(huán)己烷基C0-2烷基和C1-5烷基；P為0或1；B為
其中，n為0-3,R3為H或C1-5烷基，B的羰基部分與E相連；E為雜環(huán)，選自噁唑啉-2-基、噁唑-2-基、噻唑-2-基、噻唑-5-基、噻唑-4-基、噻唑啉-2-基、咪唑-2-基、4-氧代-2-喹喔啉-2-基、2-吡啶基、3-吡啶基、苯并[b]噻吩-2-基、三唑-4-基、三唑-6-基、吡唑-2-基、4,5,6,7-四氫苯并噻唑-2-基、萘并[2,1-d]噻唑-2-基、萘并[1-2-d]噻唑-2-基、喹喔啉-2-基、異喹啉-1-基、異喹啉-3-基、苯并[b]呋喃-2-基、吡嗪-2-基、喹唑啉-2-基、異噻唑-5-基、異噻唑-3-基、嘌呤-8-基、和取代的雜環(huán)，其中的取代基選自C1-4烷基、全氟C1-4烷基、C1-4烷氧基、羥基、鹵素、酰胺基、硝基、氨基、C1-4烷基氨基、C1-4二烷基氨基、羧基、C1-4烷氧基羰基、羥基或苯基C1-4烷氨基羰基。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的化合物含有d-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的化合物是(S)-N-甲基-D-苯丙氨?；?N-[4-[(氨基亞氨甲基)氨基]-1-(2-苯并噻唑基羰基)丁基]-L-脯氨酰胺。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的化合物是影響PAR-2路徑的天然產(chǎn)品。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的化合物是衍生自一或多種豆科、茄科、禾本科和葫蘆科的植物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的化合物衍生自豆類。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的化合物選自未變性的大豆提取物、大棉豆提取物、黑豆提取物或它們的混合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的化合物選自未變性的大豆提取物、大棉豆提取物、黑豆提取物中的組分和它們的混合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的化合物選自大豆奶、大棉豆奶、黑豆奶、大豆提取物、大棉豆提取物、黑豆提取物、大豆糊、大棉豆糊和黑豆糊和它們的混合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的化合物是黑素體轉(zhuǎn)移抑制劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的化合物活化PAR-2路徑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的化合物是結(jié)合并活化PAR-2路徑的PAR-2激動劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的化合物選自結(jié)合并活化PAR-2路徑的SLIGRL、SLIGKVD以及SLIGRL和SLIGKVD的衍生物，和它們的混合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的化合物是活化PAR-2路徑的蛋白酶。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的化合物是活化PAR-2路徑的絲氨酸蛋白酶。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的化合物選自活化PAR-2路徑的胰蛋白酶、類胰蛋白酶、凝血酶和皮膚中天然存在的蛋白酶。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的化合物是黑素體轉(zhuǎn)移的增強(qiáng)物質(zhì)。
26.一種影響哺乳動物皮膚色素沉著變化的組合物，包括影響PAR-2路徑的、色素沉著變化有效量的化合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述的化合物是PAR-2路徑抑制劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述的化合物是PAR-2拮抗劑。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，其中所述的化合物結(jié)合或阻滯但并不活化PAR-2。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述的化合物選自基于SLIGRL的結(jié)合或阻滯但并不活化PAR-2的拮抗劑、基于SLIGKVD的結(jié)合或阻滯但并不活化PAR-2的拮抗劑和它們的混合物。
31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述的化合物是蛋白酶抑制劑。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述的化合物是絲氨酸蛋白酶抑制劑。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述的化合物是凝血酶和/或胰蛋白酶和/或類胰蛋白酶抑制劑或者皮膚中天然產(chǎn)生的活化PAR-2的絲氨酸蛋白酶抑制劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的組合物，其中所述的化合物含有d-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸骨架。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的組合物，其中所述的化合物選自(S)-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[4-[(氨基亞氨甲基)氨基]-1-(2-苯并噻唑基羰基)丁基]-L-脯氨酰胺。
36.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述的化合物是影響PAR-2路徑的天然來源產(chǎn)品。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述的化合物是衍生自一或多種豆科、茄科、禾本科和葫蘆科的植物。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述的化合物衍生自豆類。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述的化合物衍生自大豆、大棉豆和/或黑豆。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述的化合物選自未變性的大豆提取物、大棉豆提取物、黑豆提取物或它們的混合物。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的組合物，其中所述的化合物選自大豆奶、大棉豆奶、黑豆奶、大豆提取物、大棉豆提取物、黑豆提取物、大豆糊、大棉豆糊和黑豆糊和它們的混合物。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的組合物，其中所述的化合物選自大豆奶、大豆提取物、大豆糊、大棉豆奶、大棉豆提取物、大棉豆糊、黑豆奶、黑豆提取物、黑豆糊及其混合物。
43.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述的化合物是黑素體轉(zhuǎn)移抑制劑。
44.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述的化合物活化PAR-2路徑。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述的化合物是結(jié)合并活化PAR-2路徑的PAR-2激動劑。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的組合物，其中所述的化合物選自結(jié)合并活化PAR-2路徑的SLIGRL、SLIGKVD以及SLIGRL和SLIGKVD的衍生物，和它們的混合物。
47.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述的化合物是活化PAR-2路徑的蛋白酶。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的組合物，其中所述的化合物是活化PAR-2路徑的絲氨酸蛋白酶。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的組合物，其中所述的化合物選自活化PAR-2路徑的胰蛋白酶、類胰蛋白酶、凝血酶和皮膚中天然產(chǎn)生的蛋白酶。
50.根據(jù)權(quán)利要求26述的組合物，其中所述的化合物是黑素體轉(zhuǎn)移的增強(qiáng)物質(zhì)。
51.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中影響PAR-2路徑的化合物占所述組合物的重量/體積比含量約為0.0001％-15％。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的組合物，其中所述的化合物占所述組合物的含量約為0.001％-5％。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的組合物，其中所述的化合物占所述組合物的含量約為0.005％-1％。
54.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其所含豆奶的重量含量約為1％-99％。
55.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其所含大豆胰蛋白酶抑制劑、大棉豆胰蛋白酶抑制劑或黑豆胰蛋白酶抑制劑的重量含量約為0.01％-20％。
56.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的組合物每天施用兩次，至少施用八星期。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中的組合物以相對高的劑量施用至少約4-10星期，然后以相對低的劑量持續(xù)施用以維持皮膚的光亮作用。
58.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的組合物口服使用。
59.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的組合物非腸道使用。
60.根據(jù)權(quán)利要求26所述的化妝品組合物，包括所述影響色素沉著的化合物和化妝品可接受的載體。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的組合物，其中的組合物還含有其它的脫色素試劑。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的組合物，其中的組合物還含有酪氨酸酶抑制劑。
63.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中的組合物還含有脂質(zhì)體。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的組合物，其中的組合物含有甘油二月桂酸酯、膽甾醇、聚氧乙烯基-10-硬脂醚和聚氧乙烯基-9-月桂醚。
65.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中的組合物還含有抗氧化劑。
66.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中的組合物還含有防曬劑。
67.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物，其中的組合物含有約1-99％的豆奶、約0.1-20％的乳化劑和有效量的防腐劑。
68.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中的組合物還含有的化合物選自抗氧化劑、防曬劑、增濕劑、漂白劑、脫色素試劑、表面活性劑、發(fā)泡劑、調(diào)節(jié)劑、濕潤劑、香味劑、增粘劑、緩沖劑、防腐劑和它們的混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及引起皮膚色素沉著改變的方法和組合物。更具體地說,本發(fā)明涉及通過利用PAR－2路徑能影響黑色素生成并且能用作脫色素劑或使皮膚增黑劑的化合物。
文檔編號A61K8/96GK1234735SQ98801022
公開日1999年11月10日 申請日期1998年7月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月28日
發(fā)明者S·S·沙皮諾, S·尼梅斯, J·昆, M·塞伯格 申請人:莊臣消費(fèi)者有限公司