專利名稱：牛泌乳相關(guān)的親免疫性蛋白(cd14),編碼基因以及在b細(xì)胞激活中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)，生物化學(xué)以及細(xì)胞與分子生物學(xué)的領(lǐng)域，涉及稱為L(zhǎng)AIT蛋白能激活B細(xì)胞的蛋白質(zhì)或者那些轉(zhuǎn)錄時(shí)修飾的和/或轉(zhuǎn)錄后修飾的蛋白質(zhì)。本發(fā)明也涉及該蛋白在藥用制劑中的應(yīng)用，和包含LAIT蛋白或其功能衍生物的藥用組合物。本發(fā)明也涉及編碼牛LAIT蛋白或其功能衍生物的核酸分子以及純化激活B細(xì)胞的天然和重組形式的上述蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
骨髓來源的“B”淋巴細(xì)胞，通常稱為B細(xì)胞，是在淋巴結(jié)、血液，以及免疫系統(tǒng)的次級(jí)淋巴器官中存在的一種白血球。B細(xì)胞是抗體分泌細(xì)胞，漿細(xì)胞的前體細(xì)胞，它們對(duì)體液免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)是主要的。
在成年人中大部分體液免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)包括許多在胸腺來源的T淋巴細(xì)胞，通常稱為T細(xì)胞，抗原遞呈細(xì)胞(APC)，和B細(xì)胞之間的細(xì)胞相互作用〔《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)147:1159,1978；PNAS77:1612,1982；PNAS79:1989,1989；《免疫學(xué)綜述》(Immunol,Rev.)95:914,1987〕。
正如目前的理解，T細(xì)胞依賴的B細(xì)胞激活包括T細(xì)胞一旦識(shí)別抗原后的激活，該抗原與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)所編碼的蛋白質(zhì)相結(jié)合由APC遞呈，這些蛋白質(zhì)表達(dá)于APC的細(xì)胞表面。該抗原特異的和MHC限制的T細(xì)胞APC相互作用導(dǎo)致兩種細(xì)胞的相互激活，以及T細(xì)胞生理功能的改變，如它的輔助功能變得明顯。
輔助T細(xì)胞可以激活抗原特異的B細(xì)胞。T細(xì)胞-B細(xì)胞相互作用的抗原特異性因B細(xì)胞最終能夠作為APC發(fā)揮功能而被保持。這樣，盡管靜態(tài)的B細(xì)胞不是有效的APC(PNAS 79:1989,1982)，但是它們通過膜結(jié)合的免疫球蛋白與抗原特異性地相互作用，該特異性反應(yīng)了其子細(xì)胞將分泌的免疫球蛋白的特異性(《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)140:904,1974)。
免疫球蛋白介導(dǎo)的特異性B細(xì)胞的抗原內(nèi)化-包括另一類APC，濾泡樹突狀細(xì)胞，的遞呈-導(dǎo)致B細(xì)胞起始抗原加工過程，上調(diào)MHCⅡ類分子和B7的表達(dá)，以及與MHC相結(jié)合的抗原衍生肽的遞呈(《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)178:2055,1993)。通過該途徑激活的B細(xì)胞是激活的輔助T細(xì)胞的靶細(xì)胞。
T細(xì)胞的輔助功能包括T細(xì)胞-B細(xì)胞相互作用，以及T細(xì)胞來源的可溶性介質(zhì)，稱為細(xì)胞因子，與B細(xì)胞膜上被表達(dá)的其同源配體之間的相互作用所傳遞的信號(hào)。T細(xì)胞-B細(xì)胞相互作用也是MHC限制的，類似于T細(xì)胞-APC相互作用(《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)12:627,1982；《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)12:634,1982)。然而，那些介導(dǎo)這兩種淋巴細(xì)胞系之間MHC限制的相互作用的分子，尤其是T細(xì)胞抗原受體(TcR)，和B細(xì)胞表達(dá)的MHC/抗原復(fù)合物的特異性相互作用并不表明B細(xì)胞增殖和分化的誘導(dǎo)(《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)18:375,1988)。
主要的分子相互作用，由T細(xì)胞-B細(xì)胞之間相互作用的需求來反映，是通過B細(xì)胞漿膜上表達(dá)的CD40，和其同源配體，gp39(或CD40L)它表達(dá)于T細(xì)胞的漿膜上，來介導(dǎo)的(PNAS89:6550,1992；《自然》(Nature)357:80,1982)。與該模型一致的觀察是隨著T細(xì)胞-APC的相互作用，后者在細(xì)胞膜上的表達(dá)增加，T細(xì)胞-B細(xì)胞的相互作用亦然(PNAS 89:6550,1992)。再者，膜免疫球蛋白介導(dǎo)的B細(xì)胞與抗原的相互作用導(dǎo)致CD40在膜上的表達(dá)增加(Sem.inImmunol 6:303,1994)。CD40與CD40L之間的相互作用表明了B細(xì)胞增殖，B細(xì)胞分化成免疫球蛋白分泌細(xì)胞，以及免疫球蛋白獨(dú)特型轉(zhuǎn)換的誘導(dǎo)(《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)198:1567,1993)。
與該模型相一致的觀察是可溶性CD40L，或CD40特異的單克隆抗體(mAb)可以誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖并分化成免疫球蛋白分泌細(xì)胞(Sem.in Immunol)6:267,1994；PNAS 83:4494,1986；《免疫學(xué)雜志》J.Immunol.140:1425,1988)。
除了必需T細(xì)胞-B細(xì)胞相互作用之外，許多T細(xì)胞來源的細(xì)胞因子，IL-2,IL-4和IL-5對(duì)B細(xì)胞增殖和分化也是重要的。B細(xì)胞對(duì)這些細(xì)胞因子的敏感性很大程度上受到以前與T細(xì)胞相互作用的限制。這樣，隨著與T細(xì)胞的相互作用，B細(xì)胞增加了細(xì)胞因子特異性膜受體的表達(dá)(PNAS 80:6628,1983；《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)145:2025,1990；《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)146:1118,1991)。已經(jīng)證實(shí)IL-2和IL-5能促進(jìn)激活B細(xì)胞的增殖(PNAS 77:1612,1980；《免疫學(xué)綜述》(Immunol.Rev.)52:115,1980)。再者，IL-4和抗免疫球蛋白已經(jīng)證實(shí)能夠協(xié)同促進(jìn)B細(xì)胞的增殖(《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)155:914,1982)。
在該事件中值的注意的例外是靜止B細(xì)胞對(duì)IL-4和IL-5的反應(yīng)。IL-4誘導(dǎo)MHCⅡ類蛋白的從頭轉(zhuǎn)錄和翻譯(《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)155:914,1982；PNAS 81:6149,1984；《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)160:679,1984)，而IL-5能夠在缺乏細(xì)胞增殖的情況下促進(jìn)靜止B細(xì)胞分化成免疫球蛋白高分泌細(xì)胞(《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)22:2323,1992)。
在任一事件中，來自T細(xì)胞和B細(xì)胞膜分子之間分子相互作用的信號(hào)，以及來自T細(xì)胞來源的細(xì)胞因子與它們?cè)贐細(xì)胞上的同源配體相互作用的信號(hào)均是復(fù)雜信號(hào)系統(tǒng)的組成部分。每一信號(hào)都驅(qū)使B細(xì)胞進(jìn)展到激活的另一時(shí)相，使它對(duì)隨后的進(jìn)展信號(hào)敏感。這些信號(hào)相互補(bǔ)充，而不是單獨(dú)具有驅(qū)動(dòng)B細(xì)胞增殖和分化全過程的能力(《免疫學(xué)綜述》(Immunol.Rev.)95:177,1987)。
1988年，發(fā)現(xiàn)了羊初乳中的獨(dú)特活性(《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)140:1366,1988)。采用蛋白質(zhì)純化的經(jīng)典技術(shù)已經(jīng)部分純化了脯氨酸富集的蛋白質(zhì)(PRP)。已經(jīng)證明該蛋白質(zhì)能夠促進(jìn)靜止B細(xì)胞誘導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞周期，并且促進(jìn)它們分化成免疫球蛋白高分泌細(xì)胞。很明顯，這是介導(dǎo)這些功能的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)的第一例報(bào)告。
隨后制備羊PRP特異的單克隆抗體。當(dāng)PRP制劑通過已用抗體準(zhǔn)備的親和柱時(shí)，所有的PRP被層析柱截獲，這通過對(duì)洗脫液和流出液的Western雜交分析評(píng)估。然而，所有的B細(xì)胞刺激活性均見于流出液中。這樣，已發(fā)表的羊初乳中存在的B細(xì)胞系生物活性的特征不能歸因于PRP(未發(fā)表的資料)。
發(fā)明概要本發(fā)明描述一種新牛蛋白質(zhì)以及編碼該蛋白質(zhì)的分離核苷酸序列，該蛋白質(zhì)能夠激活哺乳動(dòng)物來源的B細(xì)胞。基本純化的LAIT蛋白或其轉(zhuǎn)錄時(shí)和/或轉(zhuǎn)錄后修飾的蛋白質(zhì)形式可通過生化純化來制備，或通過重組的方法在基本上不含其它與之天然相關(guān)的蛋白質(zhì)的原核或真核宿主中進(jìn)行制備。再者，本發(fā)明也包括從牛初乳乳清中純化LAIT蛋白或翻譯時(shí)和/或翻譯后修飾形式的本發(fā)明LAIT蛋白的方法，其包括(ⅰ)對(duì)所述的樣品中所包含的蛋白質(zhì)進(jìn)行鹽析(ⅱ)利用經(jīng)典的蛋白質(zhì)分離技術(shù)從已在(ⅰ)步中鹽析的蛋白質(zhì)中富集和最終純化LAIT蛋白。
在每種情況下所述的蛋白包含所需要的生物活性。
本發(fā)明也涉及包含編碼LAIT蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸分子。該核酸分子可以是cDNA或基因組DNA。
所分離的牛蛋白與人CD14和小鼠CD14具有同源性，因而也稱之為牛CD14。本發(fā)明包括激活B細(xì)胞的方法，尤其是通過施用CD14，該蛋白質(zhì)的重組形式，或其功能性衍生物在需要該激活的哺乳動(dòng)物中激活B細(xì)胞的方法。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是病人。
根據(jù)一方面，本發(fā)明包括將CD14加入到嬰兒飲食配方中。本發(fā)明包括將CD14施用于嬰兒，給嬰兒喂該飲食配方是施用的優(yōu)選方式。
在另一方面中，本發(fā)明包括將CD14摻入使之成為接種的成分。本發(fā)明包括將CD14和抗原施用于需要免疫的病人，施用的優(yōu)選方式包括施用含CD14和抗原的單一制劑。
在另一方面中，本發(fā)明包括CD14施用于患T細(xì)胞免疫缺陷的病人。在優(yōu)選方面中，本發(fā)明包括將CD14施用于患gp39低表達(dá)或病人T細(xì)胞表面完全缺乏的特定T細(xì)胞功能障礙的病人。
在另一方面中，本發(fā)明包括將抗CD14抗體施用于患功能障礙的病人，其中由于血清CD14高于正常水平因而病人的B細(xì)胞是高度活化。在優(yōu)選的方面中，本發(fā)明包括將抗CD14抗體施用于患類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患者，其中由于B細(xì)胞被血清CD14的激活而分泌類風(fēng)濕因子。
本發(fā)明包括制備分泌所需特異性mAb的雜交瘤的方法，即將B細(xì)胞與亞最適量有絲分裂濃度的CD14和用以產(chǎn)生抗體的抗原一起培養(yǎng)。以該方法激活的B細(xì)胞群富含激活的抗原特異的B細(xì)胞，然后將它們用于制備分泌所需特異性mAb的雜交瘤。
本發(fā)明包括CD14在制備用于需要B細(xì)胞激活的哺乳動(dòng)物中激活B細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
天然或重組CD14均可用于本發(fā)明。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“CD14”包括小鼠，牛或人CD14。術(shù)語(yǔ)定義根據(jù)本發(fā)明“功能性衍生物”至少保留一部分CD14的功能，例如與特異性抗體結(jié)合或與具有允許其利用的所述受體的細(xì)胞上的同源受體結(jié)合。本文所用的術(shù)語(yǔ)“功能性衍生物”包括“片斷”或“CD14”的“變體”，這些術(shù)語(yǔ)定義如下。
CD14的“片斷”指任何亞類的多肽，即，更短的肽。術(shù)語(yǔ)“片斷”用于指明來源于具有天然存在的蛋白序列，在C末端、N末端，和其序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失的CD14的多肽。這些片斷應(yīng)該保留完整CD14多肽或轉(zhuǎn)錄時(shí)和/或轉(zhuǎn)錄后修飾形式的CD14特異性的一種或多種生物活性或功能。
CD14的“變體”是指具有相似于天然CD14或其片斷的一級(jí)序列的多肽，這樣其天然活性至少部分地保留。變體肽可以通過合成法或在編碼所述多肽的cDNA中產(chǎn)生突變的方法來加以制備，該多肽保留所述多肽的生物活性，在多肽中包括缺失、插入或保守氨基酸的替代。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是能夠被所述蛋白質(zhì)不保守區(qū)中的獨(dú)特表位結(jié)合的免疫球蛋白，因而使抗體能夠區(qū)別一種蛋白質(zhì)與另一種蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“表位”意思是指任何分子中能夠被抗體結(jié)合的部位。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括多克隆抗體，單克隆抗體(mAbs)或嵌合抗體。
多克隆抗體是來自抗原免疫的動(dòng)物血清的異質(zhì)抗體分子群。
單克隆抗體是能夠結(jié)合抗原上一個(gè)獨(dú)特表位的均一抗體群。MAbs可通過本領(lǐng)域中的技術(shù)人員熟知的方法獲得。這些抗體可以是任何一類免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD，以及它們的任一亞類。術(shù)語(yǔ)“抗體”也包括完整的分子以及它們的片斷，例如，F(xiàn)ab和F(ab′)2，它們能夠結(jié)合抗原。Fab和F(ab′)2缺乏完整抗體的Fc段，更迅速地從血液循環(huán)中清除，并且比完整抗體有更少的非特異性組織結(jié)合(Wahl等，J.Nucl.Med.24:316-325,1983)。
嵌合抗體是這樣一種分子，其不同的部分來自不同的動(dòng)物種類，例如具有來自小鼠mAb的可變區(qū)和來自人免疫球蛋白的恒定區(qū)的嵌合抗體。
“抗原”是能被抗體結(jié)合的一種分子或分子的一部分，它另外能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生能與該抗原的表位相結(jié)合的抗體?？乖梢跃哂幸粋€(gè)或不止一個(gè)表位。當(dāng)抗體對(duì)多肽，片斷，或其變體被述為“特異的”，或者被述為能與多肽，片斷或其變體結(jié)合的時(shí)候，意思是抗原以高度選擇性的方式與其相應(yīng)抗體反應(yīng)而不與被其它抗原激發(fā)的大量其它抗體反應(yīng)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1C表示天然牛LAIT(nBo-LAIT)蛋白的純化。圖1A表示已裝載了50mg 62％(v/v)(NH4)2SO4沉淀物的陰離子柱〔FPLC-Mono-Q,Pharmacia〕的洗脫圖。結(jié)合的蛋白質(zhì)用10mMBis-tris丙烷中50-400mM的梯度NaCl洗脫，同時(shí)pH梯度7.5-9.5。表1A表示具有高峰活性的樣品，樣品#57，的生物活性，正如以前所述分離出高懸浮密度的小鼠脾B細(xì)胞(《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol131:581,1983)，并在0.2ml無血清培養(yǎng)基中以5×104個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)于96孔平底組織培養(yǎng)板中(Costar)。在含，或不含0.25μg/ml LPS的情況下加入每一樣品至終濃度10％(v/v)。在40小時(shí)時(shí)，培養(yǎng)物中加入1μCi的3H-TdR,6小時(shí)后收集到濾紙盤上，并用閃爍計(jì)數(shù)儀評(píng)估胸苷攝取情況。數(shù)字代表cpm×10-3。圖1B表示已裝載了20mg樣品#57(圖1A)的分子篩柱〔FPLC-Superdex 75,Pharmacia〕的層析圖。柱子在含0.45M NaCl pH8.0的20mM tris-HCl中平衡。表1B表示高峰樣品，樣品#38，的生物活性，如圖1A所述進(jìn)行評(píng)估。圖1C表示已裝載了1mg樣品#38(圖1B)的羥基磷灰石柱〔FPLC-羥基磷灰石，Pharmacia〕的洗脫圖。結(jié)合的蛋白質(zhì)用含1mM NaClpH6.8 1-500mM K2HPO4的梯度緩沖液洗脫。表1C表示高峰樣品，樣品#25，的生物活性，如圖1A所述進(jìn)行評(píng)估。圖中的插入表示從樣品#25中取出的大約5μg蛋白質(zhì)的銀染SDS-PAGE膠。左泳道樣品#25；右泳道MW標(biāo)志物，從頂端開始分別是97、66、45、31、21和14kD。
圖2表示人CD14(SEQ ID NO:5)的已知序列和nBo-LAIT的序列片斷。Bo-LAIT片斷來自親和純化的初乳nBo-LAIT(見圖3)。與人CD14殘基235-264和344-355相應(yīng)的片斷分別是主要和次要肽，每一片斷大約18kD，用CnBr裂解產(chǎn)生，并通過反相HPLC(C8柱，Pharmacia)分離。與人CD14殘基53-67相應(yīng)的片斷是CnBr裂解所產(chǎn)生的24kD片斷的部分序列，并通過SDS-PAGE分離而且電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。與人CD14殘基19-36和151-165相對(duì)應(yīng)的片斷是用胰蛋白酶裂解產(chǎn)生的，并通過反相HPLC分離(C8柱，Pharmacia)。對(duì)每一片斷將牛序列與人CD14預(yù)計(jì)序列重疊的長(zhǎng)度標(biāo)以下劃線。短線表示相同氨基酸，而不同于人序列的那些被標(biāo)出。
圖3表示從牛和人中親和純化的初乳L(zhǎng)AIT蛋白的SDS-PAGE和銀染。泳道1MW標(biāo)志物，如圖1C中所示；泳道2牛初乳乳清中的62.5％(v/v)(NH4)2SO4沉淀物；泳道3從#842-Sepharose親和柱中pH2.5的洗脫液；泳道4從CD14特異性mAb63D3(PNAS77:6764,1980)-Sepharose親和柱，已裝載了泳道5中代表的物質(zhì)，中pH2.5的洗脫液；泳道5Sephacryl S 100HR分離的人初乳乳清。泳道1-5中每一泳道均含5μg蛋白質(zhì)。5×104高懸浮密度的小鼠脾B細(xì)胞在指定的刺激物存在下培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基中至40小時(shí)，加入1μCi的3H-TdR,6小時(shí)后收集到濾紙盤上，通過液體閃爍計(jì)數(shù)儀來評(píng)估胸苷攝入，所獲得的結(jié)果示于表2，數(shù)字代表cpm×10-3。生物測(cè)定的詳細(xì)情況如圖1A所述。對(duì)照cpm×10-3無刺激物，0.3；50μg/mlLPS,75.0；0.25μg/ml LPS〔LPS↓〕,0.8；和1μg/ml mlgM特異的mAbb-7-6(《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)14:753,1984),0.7。
圖4A和4B表示熱不穩(wěn)定性和抗體介導(dǎo)的nBo-LAIT活性的抑制。圖4A表示在95℃已加熱10分鐘的指定濃度的親和純化的nBo-LAIT存在下，按圖1A所述而培養(yǎng)的5×104高懸浮密度的小鼠脾B細(xì)胞的胸苷攝入情況(●)，和未被加熱的nBo-LAIT存在下的胸苷攝入情況(○)。在40小時(shí)培養(yǎng)物中加入3H-TdR,6小時(shí)后收集，然后液體閃爍計(jì)數(shù)儀評(píng)估胸苷攝入。插入表示含指定濃度LPS的培養(yǎng)物的反應(yīng)，LPS已按照對(duì)nBo-LAIT的處理被加熱(或未加熱)。圖4B表示在0.25μg/ml親和純化的nBo-LAIT或50μg/ml LPS存在下，按圖4A所述而建立的培養(yǎng)物的胸苷攝入。這些刺激物每一種均在指定濃度的多克隆兔IgG抗-Bo-LAIT,#842，或正常兔IgG存在下進(jìn)行培養(yǎng)。#842 IgG對(duì)nBo-LAIT和LPS介導(dǎo)的刺激的胸苷攝入的抑制百分?jǐn)?shù)示于括號(hào)中。正常兔IgG介導(dǎo)的對(duì)nBo-LAIT和LPS刺激的抑制水平分別為9～20％，和12～31％。#842 IgG在0.4和50μg/ml單獨(dú)直接誘導(dǎo)的CPM分別為454±53～764±69，對(duì)正常兔IgG來說，在0.4和50μg/ml分別為297±34的420±31。未刺激的對(duì)照對(duì)兩組實(shí)驗(yàn)均為195±29。
圖5A表示含牛CD14基因的7.1kb EcoRl-Xhol片斷的限制性圖譜。限制性位點(diǎn)的簡(jiǎn)稱是X,Xhol；P,Pstl；O,Ncol；B,BamHⅠ；N,Notl；D,BssHⅠ；T,BstEll；M,Smal；S,Sacll；C,Hpal；R,EcoRⅤ；A,Sphl；G,BglⅡ；H,HindⅢ；E,EcoRⅠ。圖5B是牛CD14位點(diǎn)的圖表。陰影區(qū)表示基因的編碼區(qū)，空白區(qū)是內(nèi)含子序列。ATG起始密碼子上游的短線區(qū)是5′非翻譯區(qū)，而TAA終止密碼子下游的短線區(qū)是3′非翻譯區(qū)。圖5C是表示所采用的測(cè)序策略的圖表。箭頭表示測(cè)序的方向。片斷數(shù)在右側(cè)指明(詳見正文)。
圖6表示牛(SEQ ID NO:1)，人(SEQ ID NO:2)和小鼠(SEQ ID NO:3)CD14編碼區(qū)的核酸序列的比較圖。第一個(gè)堿基的位置對(duì)應(yīng)于ATG密碼子的第一個(gè)核苷酸，最后一個(gè)核苷酸對(duì)應(yīng)于TAA終止密碼子的第三個(gè)核苷酸。采用DNA STAR-Megalign軟件，利用具有重要?dú)埢淼腃lustal法進(jìn)行序列對(duì)比。在該對(duì)比中使用的人cDNA序列(登記號(hào)PO8571)和小鼠cDNA序列(登記號(hào)PO8571)均來自瑞士-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。
圖7表示牛(SEQ ID NO:4)，人(SEQ ID NO:5)和小鼠(SEQ ID NO:6)CD14蛋白質(zhì)氨基酸序列的比較圖。氨基酸序列是從示于圖6的相應(yīng)cDNA序列中推導(dǎo)出來的。與PAM250殘基重要性表相結(jié)合，采用J.Hein所述的方法(《酶學(xué)方法》(Methods inEnzymology)183:626,1990)將DNA Star-Megalign軟件用于進(jìn)行該序列對(duì)比。
圖8表示用于擴(kuò)增牛CD14 cDNA編碼區(qū)的引物。圖8A表示用于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的正向(SEQ ID NO:7)和反向(SEQ IDNO:8)引物。圖8B表示用于哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的正向(SEQ IDNO:9)和反向(SEQ ID NO:10)引物。
圖9表示天然和重組牛CD14的免疫印跡。采用Western雜交分析來評(píng)估和比較nBo-LAIT蛋白與重組CD14蛋白的大小。250ngCD14蛋白在12.5％ SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳并在180mA電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore)上30分鐘。膜在溶于TBST(20mM TrisHCl,pH7.5,150mM NaCl,0.025％ Tween20)的5％脫脂奶粉中封閉1小時(shí)，隨后在補(bǔ)充了5％脫脂奶粉的TBST中與濃度為2.5μg/ml的兔抗Bo-LAIT#842共育1小時(shí)。在TBST中將雜交的斑點(diǎn)沖洗3次，每次10分鐘。用偶聯(lián)了辣根過氧化物酶(BioRad)的羊抗兔IgG來檢測(cè)兔抗體。然后該膜用TBST沖洗3次(10分鐘/次)。利用ECL試劑盒(Amersbam)使蛋白質(zhì)顯現(xiàn)。泳道1:MW標(biāo)志物；泳道2:nBo-LAIT-842-Sepharose親和純化的nBo-LAIT蛋白；泳道3:rBo-Sf9-12CA5親和純化的，Sf9昆蟲細(xì)胞來源的重組牛CD14；泳道4:rBo-C127-842-Sepharose親和純化的，C127小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞系來源的重組牛CD14。
圖10比較nBo-LAIT和LPS的增殖促進(jìn)活性。按圖1A所述制備，培養(yǎng)和收集高懸浮密度的靜止小鼠脾B細(xì)胞。在培養(yǎng)開始時(shí)加入指定濃度的親和純化的nBo-LAIT，(按圖1所述親和純化的)或LPS，其來源于S.typhosa(Difco)。
圖11比較nBo-LAIT和LPS的分化促進(jìn)活性。按圖1A所述制備和培養(yǎng)高懸浮密度，靜止的，小鼠脾B細(xì)胞。用10μg/ml LPS〔S.typhosa(Difco)〕，或500ng/ml親和純化的nBo-LAIT開始復(fù)孔培養(yǎng)，并在指定時(shí)間收集。利用商業(yè)上可獲得的ELISA試劑盒定量測(cè)定上清中存在的IgM來評(píng)估累積的IgM產(chǎn)量。
圖12比較nBo-和rBo-LAIT蛋白與LPS的生長(zhǎng)促進(jìn)活性。按圖1A所述制備，培養(yǎng)，并收集高懸浮密度的，靜止的，小鼠脾B細(xì)胞。在培養(yǎng)開始時(shí)加入指定濃度的nBo-LAIT〔按圖1A所述純化的〕，在昆蟲細(xì)胞或哺乳細(xì)胞中產(chǎn)生的rBo-LAIT，和LPS〔S.typhosa(Difco)〕。來自昆蟲細(xì)胞的重組Bo-LAIT是從已轉(zhuǎn)染了Bo-LAITcDNA的Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)上清中親和純化的。表達(dá)載體包括編碼來自流感血凝集素(HA tag)的非肽的3′27聚體。親和純化是通過將Sf9上清通過mAb12CA5偶聯(lián)的Sepharose來進(jìn)行的(《細(xì)胞》(Cell)57:787,1984)，其中該抗體能識(shí)別HA標(biāo)志。來自哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，C127，的重組Bo-LAIT的親和純化如同對(duì)nBo-LAIT進(jìn)行的一樣，采用已偶聯(lián)了IgG的Sepharose，該IgG是從來自兔842的多克隆抗血清中分離的。
圖13表示nBo-LAIT對(duì)純化的原代B和T細(xì)胞群的增殖促進(jìn)活性的比較分析。按圖1A所述制備高懸浮密度的、靜止的、小鼠脾B細(xì)胞。原代T細(xì)胞是從脾B細(xì)胞分離的相同動(dòng)物的淋巴結(jié)中分離的。具體地說，根據(jù)制造商的說明，以及按照以前的描述(《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)24:967,1994)將淋巴結(jié)懸液通過抗Ig柱(Biotex labora)。通過免疫熒光染色和FACS分析來評(píng)估T細(xì)胞群是＞95％CO3+，以及＜0.5％mIg+。左側(cè)表示含1.5×105純化的T或B細(xì)胞的培養(yǎng)物對(duì)指定濃度親和純化的nBo-LAIT的增殖反應(yīng)。右側(cè)表示相同數(shù)量的B或T細(xì)胞對(duì)50μg/ml的LPS〔S.typhosa(Difo)〕或1μg/ml的伴刀豆球蛋白A(Sigma)的增殖反應(yīng)。采用無血清的培養(yǎng)條件，并且所有的刺激物在培養(yǎng)開始時(shí)加入。在40小時(shí)，培養(yǎng)物中加入1μCi的3H-TdR,6小時(shí)后收集到濾紙盤上，并用閃爍計(jì)數(shù)儀來評(píng)估胸苷攝入。標(biāo)明的數(shù)字代表復(fù)孔培養(yǎng)的平均cpm。
圖14表示nBo-LAIT介導(dǎo)的小鼠B細(xì)胞增殖的胎牛血清的非依賴性。按圖1A所述制備，培養(yǎng)，并收集高懸浮密度的，靜止的，小鼠脾B細(xì)胞。無血清培養(yǎng)基補(bǔ)充指定濃度的熱滅活的(56℃1小時(shí))胎牛血清(Gibco BRL)以及不加刺激物(■)，0.5μg/ml親和純化的nBo-LAIT(○)，或50μg/ml LPS(S.typhosa(Difco))(●)。在40小時(shí)，培養(yǎng)物中加入1μCi3H-TdR,6小時(shí)后收集到濾紙盤上，并用閃爍計(jì)數(shù)儀評(píng)估胸苷攝入。標(biāo)明的數(shù)字代表復(fù)孔培養(yǎng)的平均cpm。
圖15表示包含于以下細(xì)胞中的CD14的Northern雜交分析(1)未分離的脾細(xì)胞，(2)按圖1A所述制備的高懸浮密度的，靜止的，小鼠脾B細(xì)胞，以及(3)來自后者高懸浮密度靜止群的FACS分類的mlg+細(xì)胞。為了進(jìn)行FACS分類，高懸浮密度的細(xì)胞與FITC偶聯(lián)的mAb187.1-對(duì)小鼠IgK特異的(Hybridoma 1:5,1981)-共育。三種細(xì)胞群每一種中的mlg+細(xì)胞的比例被指明。根據(jù)制造商的說明用Trizol法(Gibco BRL Life Tochnologies)從三種細(xì)胞群的每種107個(gè)細(xì)胞中分離總RNA并且溶于1.2％的甲醛凝膠中。用真空雜交系統(tǒng)(Pharmacia)將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜(GenenScreen)上。按照膜制造商的推薦進(jìn)行交聯(lián)，預(yù)雜交和雜交。小鼠CD14特異的探針來自通過PCR獲得的基因組小鼠CD14片斷，PCR采用正向引物5′- CTA GAA TTCTCT CCC GCC CCA CCA GAG CCC TGC G-3′(SEQ ID NO:11)，和反向引物5′-CTA GAA TTC TTA AAC AAA GAG GCG ATCTCC TAG G-3′(SEQ ID NO:12)。擴(kuò)增的片斷通過瓊脂糖凝膠電泳分離，酶切并純化。L32cDNA探針(Nucl.Acid.Res.16:10751,1988)，對(duì)大核糖體亞單位蛋白組成性表達(dá)的mRNA是特異的，被用于標(biāo)化RNA負(fù)荷(loading)。該探針(每種100ng)用寡核苷酸標(biāo)記試劑盒(Pharmacia)標(biāo)記至特異性活性0.2-1×109cpm/μgDNA。然后膜在65℃于0.2×SSC,1％SDS中沖洗2小時(shí)并對(duì)X光膠片(Kodak,Biomax MS)曝光1-5天。
圖16表示已按圖15所述為mlg+細(xì)胞而進(jìn)一步純化的，或未純化的，高懸浮密度，靜止的，小鼠脾B細(xì)胞對(duì)50μg/ml LPS〔S.typhosa(Difco)〕和0.5μg/ml親和純化的nBo-LAIT的反應(yīng)。建立培養(yǎng)，加入氚標(biāo)記的胸苷，收集，并按對(duì)圖1A所述來評(píng)估胸苷攝入。標(biāo)明的數(shù)字代表復(fù)孔培養(yǎng)的平均cpm。
圖17表示重組Bo-LAIT介導(dǎo)的B細(xì)胞激活對(duì)CD40的非依賴性。高懸浮密度的，靜止的，小鼠脾B細(xì)胞分離于常規(guī)C57BL/6小鼠?；蛘咄ㄟ^CD40位點(diǎn)的靶向破壞而制備的CD40缺陷動(dòng)物(《免疫學(xué)》(Immunity)1:167,1994)。細(xì)胞(1.5×105)在10μg/ml LPS，或指定濃度的來源于昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的rBo-LAIT存在下進(jìn)行培養(yǎng)。如圖1A所述加入胸苷并收集培養(yǎng)物。標(biāo)明的數(shù)字代表復(fù)孔培養(yǎng)的平均cpm。
圖18比較來源于人(nHu)，牛(nBo)和小鼠(nMo)的天然CD14的銀染(左側(cè))和免疫雜交(右側(cè))分析。按以前所述，nHu從腎病病人的尿中分離(《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur,J.Immunol.)24:1779,1994)。按圖3所述nBo從牛初乳中親和純化。nMo從小鼠雜交瘤OKT3(PNAS USA77:4914,1980)的上清中分離，利用CD14特異性mAb3C10固化的Sepharose4B通過親和層析進(jìn)行(《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)15:126,1983)。為了進(jìn)行銀染，1μg的每種樣品在200V于10％SDS-PAGE上分離45分鐘。按照制造商的說明蛋白質(zhì)通過銀染(Biorad)使之顯色。為了進(jìn)行免疫雜交，250ng樣品在180mA通過10％SDS-PAGE分離45分鐘，在180mA電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore)上30分鐘。膜在溶于TBST(20mM TrisHCl,pH7.5,150mM NaCl,0.025％吐溫20)的5％脫脂奶粉中封閉1小時(shí)，隨后在補(bǔ)充了5％脫脂奶粉的TBST中與濃度為10μg/ml的mAb3C10(《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)15:126,1983)共育1小時(shí)。雜交斑點(diǎn)在TBST中沖洗3次，每次10分鐘。用偶聯(lián)了辣根過氧化物酶(BioRad)的羊抗小鼠IgG來檢測(cè)小鼠抗體。然后膜用TBST沖洗3次(10分鐘/次)。用ECL試劑盒(Amersham)使蛋白質(zhì)顯色。
圖19比較分析刺激小鼠B細(xì)胞增殖的來源于人(nHu)，牛(nBo)和小鼠(nMo)的天然CD14。這三種蛋白按圖18中所述來純化。評(píng)估按圖1A中所述而分離的高懸浮密度的，靜止的，小鼠脾B細(xì)胞對(duì)指定濃度的這三種蛋白的反應(yīng)。在40小時(shí)時(shí)培養(yǎng)物中加入1μCi3H-Tad并在6小時(shí)時(shí)收集。標(biāo)明的數(shù)字代表刺激指數(shù)，該數(shù)是用不含刺激物的復(fù)孔培養(yǎng)的平均cpm除已用指定濃度的nHu、nBo，和nMo刺激的復(fù)孔培養(yǎng)的平均cpm而得到的。
圖20A和B分別表示nBo-LAIT對(duì)從臍血和扁桃體中分離的人B細(xì)胞的增殖促進(jìn)活性。圖20A表示通過陽(yáng)性選擇而分離的臍血B細(xì)胞的胸苷攝入。臍血淋巴細(xì)胞懸液用熒光標(biāo)記的B細(xì)胞標(biāo)記物CD72特異的mAb來加以染色。然后在熒光激活的細(xì)胞分類器(FACStar Plus,Becton Dickenson)上分離CD72陽(yáng)性的臍血淋巴細(xì)胞至純度＞98％。不存在刺激物或2μg/ml nBo-LAIT存在下，按圖1A所述來培養(yǎng)B細(xì)胞(1.5×105)。無另外的刺激物，或2μg/ml nBo-LAIT存在下，B細(xì)胞也培養(yǎng)于已用兩種mAbs預(yù)包被9小時(shí)的培養(yǎng)孔中，兩種mAbs一種是人Igκ特異的〔LO-HK3，(《大鼠雜交瘤和大鼠單克隆抗體》“Rat Hybridomas and Rat Monodonal Antibodies”ed,H.Bazin,CRC出版社，Boca Raton,FL，美國(guó))〕，另一個(gè)是人Igλ特異的〔LO-HL2，(《大鼠雜交瘤和大鼠單克隆抗體》“RatHybridomas and Rat Monodonal Antibodies”ed,H.Bazin,CRC出版社，Boca Raton,FL，美國(guó))〕，每一種使用1.5μg/ml的包被濃度。在60小時(shí)時(shí)培養(yǎng)物加入1μCi3H-TdR,12小時(shí)后收集到濾紙盤上，用閃爍計(jì)數(shù)儀評(píng)估胸苷攝入。圖20B表示采用陰性選擇而制備的B細(xì)胞所獲得的結(jié)果。具體地說，白細(xì)胞懸液用生物素化的CD3ε特異的mAb(Becton Dickenson)標(biāo)記，隨后用含“微珠”的用鐵偶聯(lián)的親和素(Beton Dicknson)處理。標(biāo)記的細(xì)胞群通過MACS(Becton Dickenson)，并收集流出液。通過細(xì)胞系特異性mAbs的免疫熒光染色所進(jìn)行的評(píng)估，該細(xì)胞群含＜1％T細(xì)胞，和＞97％B細(xì)胞。如圖1A所述來培養(yǎng)B細(xì)胞(1.5×105)。正如對(duì)臍血B細(xì)胞的處理一樣，扁桃體B細(xì)胞在存在和缺乏培養(yǎng)板結(jié)合的人Igκ和λ特異性mAbs的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，但在該情況下，培養(yǎng)孔用濃度為0.5μg/ml的每種mAbs進(jìn)行預(yù)包被。培養(yǎng)物加入胸苷，收集并按對(duì)圖20A所述的那樣評(píng)估胸苷攝入。
圖21表示分娩后乳房奶中CD14隨著時(shí)間的濃度。乳房奶在分娩后指定的時(shí)間從兩位供者(A.D.和S.B.)中收集。制備澄清的乳清，并按制造商的說明用CD14特異的ELISA試劑盒(1BL,Hamburg)來評(píng)估所含CD14的濃度。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述從下所述的實(shí)驗(yàn)說明從初乳乳清中純化天然的牛LATI蛋白(nBo-LAIT)，本文也稱為牛CD14。純化的nBo-LAIT的氨基酸序列分析已列出，而且與人CD14的同源性已證實(shí)。純化人CD14的方法已列出。從雜交瘤上清中純化小鼠CD14的方法已列出。
對(duì)親和純化的初乳Bo-LAIT，人初乳CD14，來源于尿的人CD14，和來源于雜交瘤上清的小鼠CD14描述了體外的B細(xì)胞刺激試驗(yàn)。來自小鼠的高懸浮密度靜止的脾B細(xì)胞在對(duì)來自這三種的LAIT蛋白的反應(yīng)中能進(jìn)入并進(jìn)展完成細(xì)胞周期，而對(duì)來自牛的LAIT蛋白的反應(yīng)中則分化成免疫球蛋白的高分泌細(xì)胞。這些激活事件發(fā)生在成分明確的無血清培養(yǎng)基中，而且也證明培養(yǎng)基中胎牛血清的存在不影響LAIT蛋白介導(dǎo)的B細(xì)胞激活。實(shí)驗(yàn)證實(shí)nBo-LAIT特異地激活小鼠B細(xì)胞，而不激活小鼠T細(xì)胞，而且LAIT蛋白激活不能檢測(cè)到CD14 mRNA的B細(xì)胞群，這些實(shí)驗(yàn)被描述。也描述了證實(shí)牛CD14誘導(dǎo)不表達(dá)CD40的B細(xì)胞的生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)。
本文描述了編碼牛CD14的基因組DNA和cDNA的分離，克隆和測(cè)序。與文獻(xiàn)中已知的小鼠和人CD14s的序列比較表明Bo-LAIT和這些以前已知的CD14s的序列相關(guān)性。與重組牛CD14相關(guān)的B細(xì)胞的增殖和分化也被描述。
描述了重組牛CD14在昆蟲和哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的表達(dá)方法。具體地說，桿狀病毒表達(dá)載體被用于幫助重組蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)。天然Bo-LAIT(nBo-LAIT)和來源于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的重組Bo-LAIT(rBo-LAIT)對(duì)B細(xì)胞增殖和分化特性的比較表明后者是功能性的，并且具有nBo-LAIT特異活性的大約50％。
將小鼠乳腺癌細(xì)胞系，C127，用作編碼來自牛的CD14的cDNA的受者。cDNA被克隆進(jìn)牛乳頭瘤病毒表達(dá)載體中。建立穩(wěn)定的C127轉(zhuǎn)染體，并通過親和層析從匯合的C127上清中分離出重組CD14蛋白。昆蟲細(xì)胞和C127來源的重組LAIT蛋白的Western雜交分析表明在兩個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生了不同的轉(zhuǎn)錄時(shí)和/或轉(zhuǎn)錄后的修飾體。哺乳動(dòng)物來源的重組牛CD14的特異活性與昆蟲細(xì)胞來源的重組蛋白相同。
對(duì)昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞來源的天然Bo-LAIT和重組牛CD14所支持的B細(xì)胞增殖促進(jìn)活性進(jìn)行了比較。再者，描述了天然Bo-LAIT活性對(duì)人B細(xì)胞的增殖促進(jìn)活性，其中B細(xì)胞是從扁桃體，或從臍血中分離的。結(jié)果證實(shí)從新生兒或成年人中分離的人B細(xì)胞是對(duì)Bo-LAIT介導(dǎo)的增殖敏感的，正如小鼠B細(xì)胞一樣。
已經(jīng)證明人初乳，以及分娩后78天的乳房奶中存在的CD14的濃度是健康供者血清中觀察到的濃度的3～20倍。方法牛LAIT蛋白的純化從剛分娩的牛的第一次乳房泌乳中獲得5升以上的初乳。
(ⅰ)首先將4420g初乳離心30分鐘以除去細(xì)胞和細(xì)胞殘片來制備澄清的初乳乳清。該離心的上清再在250,000g離心2小時(shí)。棄去漂浮的脂質(zhì)和沉淀的酪蛋白，并且對(duì)澄清的初乳乳清進(jìn)行進(jìn)一步的分離。
在體外評(píng)估每一種分離技術(shù)來源的每一樣品的B細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性。這樣，每一樣品在寬的濃度范圍來評(píng)估它刺激小鼠脾來源的高懸浮密度，靜止的B細(xì)胞增殖的能力，這正如以前所述(《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol)131:581,1983)。在這些分析中均采用成分明確的無血清培養(yǎng)基〔IMDM(Gibco)，補(bǔ)充5×10-52-β-巰基乙醇，5μg/ml鐵飽和的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Boehringer,Lewes,GB),0.5mg/ml脫脂BSA(Boehringer),100U/ml青霉素(Gibco),100μg/ml鏈霉素(Gibco)，和必需氨基酸〕。同時(shí)結(jié)合亞有絲分裂濃度的LPS(0.25μg/ml)，直接檢測(cè)下述分離計(jì)劃中獲得的樣品。因?yàn)長(zhǎng)AIT蛋白接近純凈，所以表現(xiàn)它直接的促有絲分裂特性，這將在以下加以描述。
(ⅱ)利用在(NH4)2SO4中的系列沉淀來完成初乳乳清制備物中所含蛋白質(zhì)的鹽析。所采用的增加的鹽濃度的順序是42％:50％:62％:65％(v/v)硫酸銨(AS)。這樣，在42％沉淀的沉淀物上清中的AS濃度增加到50％；回收在50％沉淀的物質(zhì)，然后在剩余上清中的AS濃度增加到62％，以此類推。每次AS沉淀的小團(tuán)溶于10mMTris-HCl pH8.0，它含0.15M NaCl和1mM AEBSF(TNAEBSF)。這些樣品進(jìn)行脫鹽并用10DG柱將緩沖液換成TNAEBSF，然后測(cè)定生物活性。根據(jù)以上步驟大部分B細(xì)胞的增殖促進(jìn)活性分離于62％ AS的沉淀物(數(shù)據(jù)未列)。
(ⅲ)隨后富集活性，并用三步系列蛋白質(zhì)分離技術(shù)最終將其純化。50mg 62％ AS富集的樣品加到陰離子交換柱上，用溶于10mMBis-tris丙烷的50mM～400mM NaCl的鹽梯度來分離蛋白質(zhì)，同時(shí)pH梯度7.5～9.5。圖1A表示從這個(gè)柱上得到的洗脫圖，而表1A表示含高峰活性的樣品，樣品#57。然后20mg樣品#57加到已在含0.45M NaCl pH8.0的20mM Tris-HCl中平衡的分子篩柱上。該分離的洗脫圖見圖1B，高峰樣品#38的活性見表1B。
然后將1mg樣品#38加以1mM NaCl的羥基磷灰石柱上，并用pH6.8 1-500mM的梯度磷酸鉀洗脫。洗脫圖見圖1C，相關(guān)活性見表1C。
圖1C中的插入代表銀染之后具有高峰活性的樣品的SDS-PAGE分析，并且證實(shí)了具有相對(duì)分子量46-50kD的單一主要條帶。牛LAIT蛋白的序列分析對(duì)純化的nBo-LAIT進(jìn)行序列分析。發(fā)現(xiàn)N末端是封閉的。用溴化氰，或胰蛋白酶水解該物質(zhì)。獲得5個(gè)片斷并在測(cè)序前用反相HPLC，或SDS-PAGE然后電轉(zhuǎn)到PVDF上來純化這些片斷。
如圖2所示，5個(gè)片斷均與人CD14對(duì)比，具有明顯的同源性。從牛和人初乳中親和純化LAIT蛋白用經(jīng)典蛋白質(zhì)分離技術(shù)分離的nBo-LAIT被用于制備兔(#842)多克隆抗體。該抗血清的IgG部分在蛋白質(zhì)A-Sepharose上純化，然后偶聯(lián)于Sepharose4B。
nBo-LAIT和人CD14(HuCD14)的序列同源性表明Bo-LAIT可能是CD14的牛同源物。通過用可獲得的HuCD14特異的單克隆抗體(mAb)制備親和柱來對(duì)此進(jìn)一步探索。該抗體，63D3(PNAS77:6764,1980)，是在包含已偶聯(lián)于Sepharose 4B的mAb 187.1〔大鼠抗小鼠Kappa(雜交瘤1:5,1981)〕的親和柱上從相應(yīng)的雜交瘤上清中純化的，然后將純化的mAb偶聯(lián)于Sepharose 4B。
如上所述，用硫酸銨對(duì)牛澄清的初乳乳清進(jìn)行系列鹽析。人初乳乳清在Sephacryl S 100 HR柱上進(jìn)行分離。然后含高峰B細(xì)胞增殖促進(jìn)活性的樣品用針對(duì)牛來源物質(zhì)的842-Sepharose柱，或用針對(duì)人來源物質(zhì)的63D3-Sepharose柱加以親和純化。
親和純化的初乳Bo-LAIT，和親和純化的人初乳CD14的SDS-PAGE分析見圖3，相關(guān)的B細(xì)胞增殖促進(jìn)活性見表2。正如所示，從兩種初乳制備物，p46-50牛物質(zhì)(圖3，泳道3)和p50-52人分子(圖3，泳道4)，中分離出優(yōu)勢(shì)條帶。
>*數(shù)字代表培養(yǎng)40小時(shí)時(shí)的cpm×10-3。
表2所示的生物活性證明親和純化的Bo-LAIT在濃度100ng/ml時(shí)，能刺激靜止小鼠B細(xì)胞的增殖。當(dāng)以10ng/ml加入時(shí)該物質(zhì)不再是促有絲分裂的，但是同時(shí)加入亞促有絲分裂濃度的LPS，或小鼠IgM,b-7-6特異的mAb時(shí)可獲得共刺激(《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)14:753,1984)。親和純化的人物質(zhì)在檢測(cè)的濃度本身不是促有絲分裂的，但是在10ng/ml時(shí)，B細(xì)胞增殖被激活，具有與牛物質(zhì)同樣有效的共刺激。
nBo-LAIT的生物活性是熱不穩(wěn)定的。如圖4A所示，親和純化的Bo-LAIT在95℃處理10分鐘消除其相關(guān)的B細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性。對(duì)LPS進(jìn)行相似處理不影響其活性(圖4A的插入)。再者，多克隆抗體-Bo-LAIT,#842，有效地阻斷nBo-LAIT的B細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)活性，然而不影響LPS的活性。見圖4B和插入?；蚪M牛CD14的分子克隆用人CD14cDNA(從R.Ulevitch,Scripps研究所獲得)1.5kb的片斷來篩選?；蚪MEMBL3 SP6/T7λ文庫(kù)(Clontech)。獲得15個(gè)陽(yáng)性信號(hào)，選擇最強(qiáng)的信號(hào)，克隆“B2”來進(jìn)一步分析和克隆牛CD14。
從克隆B2分離和純化的噬菌體DNA具有大約15kb的插入片斷。純化的DNA被酶解，獲得的7.1kb的EcoRl-Xhol片斷-含人CD14的同源序列-被亞克隆進(jìn)pBluescriptSK+(Stratagene)。用多種酶酶切再與人CD14探針酶切獲得的限制性圖譜能在克隆片斷內(nèi)定位牛CD14基因(圖5A)。限制性圖譜進(jìn)一步用于將更短的四個(gè)片斷(Ⅰ-Ⅳ)亞克隆進(jìn)pBluescriptSK+，并且隨后測(cè)序大約5kb含全長(zhǎng)牛CD14基因的片斷(圖5C)。片斷Ⅰ(EcoRl-BamHl；3.2kb)；Ⅱ(Pstl-Pstl,1.35kb)；Ⅲ(Pstl-Pstl,0.3kb)；和Ⅳ(Pstl-Xhol,0.95kb)被用于構(gòu)造巢式重疊的單向缺失。這些片斷提供了牛CD14位點(diǎn)的相鄰序列。圖5B描述了牛CD14基因組片斷的結(jié)構(gòu)。牛CD14 cDNA的分子克隆從牛外周血單核細(xì)胞中分離Poly(A+)RNA，并且用GigapackⅡPackaging Extract(Stratagene)來包裝重組λ噬菌體DNAs。采用帶節(jié)省時(shí)間cDNA合成試劑盒的Excell EcoRl/CIP載體(Pharmacia)來制備cDNA文庫(kù)。
通過PCR用從?；蚪MCD14片斷的編碼翻譯區(qū)來源的探針篩選文庫(kù)(詳見以下描述攜帶牛CD14片斷的桿狀病毒重組表達(dá)載體的制備部分)。探針通過隨機(jī)六核苷酸引物第二鏈的合成用32P標(biāo)記(Oligolabelling試劑盒，Pharmacia Biotech)。篩選過程是在高度嚴(yán)格的條件下進(jìn)行(0.1×SSC,1％SDS,65℃3小時(shí))。所獲得的克隆之一(ExCell/BoCD14-1)，含1.4kb的插入片斷，它被亞克隆進(jìn)pBluescriptSK+，并用含漸進(jìn)重疊單向缺失的pBS/BoCD14亞克隆(Nested Deletion試劑盒，Pharmacia)進(jìn)行測(cè)序。
該牛CD14 cDNA克隆由1327bp組成。ATG起始密碼子的下游是1116nt的開放閱讀框架，TAA終止密碼子在核苷酸1202。開放閱讀框架的旁側(cè)是82bp的5′非翻譯序列和122bp的3′非翻譯序列。多聚腺苷酸信號(hào)，5′- ATTAAAA-3′，位于終止密碼子3′的105bp處。
牛CD14基因組和cDNA序列的序列比較表明它們從5′cDNA的起始點(diǎn)開始是共線性的(colinear)，直至緊挨ATG起始密碼子之后的第一個(gè)和唯一的內(nèi)含子(88bp)。編碼序列的其余部分未受影響。這樣，以前對(duì)人和小鼠CD14描述的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)在牛CD14中是明確保守的。牛CD14 cDNA翻譯的核苷酸序列與人和小鼠CD14cDNA的相同區(qū)比較表明在編碼區(qū)分別有74.2％和62.6％的核苷酸相同(圖6)。
牛CD14蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是從cDNA序列中推導(dǎo)出來的，由374個(gè)氨基酸組成。第一蛋氨酸之后是15個(gè)疏水和/或中性的殘基，典型的真核細(xì)胞信號(hào)肽。牛CD14氨基酸序列與人和小鼠CD14的序列比較表明分別有73.1％和62.3％的相同(圖7)。有三個(gè)潛在的N鍵糖基化位點(diǎn)(Asn-X-Thr/Ser)，所有這些位點(diǎn)在人和小鼠CD14中均是保守的。再者，牛CD14包括富含10個(gè)亮氨酸的重復(fù)基元(LXXLXL)，與人和小鼠CD14相同(《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol 145:331,1990)。重組牛CD14在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)在制備編碼重組CD14蛋白的DNA片斷的過程中，CD14翻譯區(qū)的全長(zhǎng)片斷通過PCR進(jìn)行制備。根據(jù)從牛CD14 cDNA獲得的序列信息來設(shè)計(jì)特異的PCR引物對(duì)。5′端的PCR引物包括Nhel的兩個(gè)識(shí)別序列；一個(gè)Kozak序列；ATG起始密碼子；和翻譯編碼區(qū)最初的17-21核苷酸。3′端的PCR引物包括Nhel的兩個(gè)識(shí)別序列；翻譯編碼區(qū)最后的21-24個(gè)核苷酸直至但不包括TAA終止密碼子(圖8A)。
牛CD14的翻譯區(qū)用7.1kb的EcoRl-Xhol基因組CD14片斷(見上述)作為模板來進(jìn)行擴(kuò)增。PCR用Pwo DNA聚合酶(Boehringer)進(jìn)行。擴(kuò)增方法包括在100μl的終體積中加入5ng的模板DNA,10mMTris-HCl pH8.85,25mM KCl,5mM(NH4)2SO4,2mMMgSO4,250mM的每種dNTP,250nM的每種引物，和5個(gè)單位的DNA聚合酶。用DNA Therma+Cycler(Perkin Elmer)在70℃退火溫度對(duì)樣品擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。
擴(kuò)增的片斷用Nhel酶切，并亞克隆進(jìn)桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pETL-HA(C.Richardson,OC1/Amgen)中多面體啟動(dòng)子的下游。該載體來自pETL(《分子生物學(xué)方法》(Methods in Molecular Biology)39:161,1995)，并含編碼流感凝集素(HA)來源的非肽的3′30bpNhel-BamHl DNA片斷，隨后是終止密碼子TAG(5′-TAC CAATAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT TAG-3′)(SEQ ID NO:13)。重組轉(zhuǎn)移載體每個(gè)與野生型桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV,Linear Transfection Module,Invitrogen)共轉(zhuǎn)染進(jìn)Sf9細(xì)胞中(《分子生物學(xué)方法》(Methods in Molecular Biology)39:161,1995)。根據(jù)已建立的方案篩選出重組桿狀病毒克隆并純化(《分子生物學(xué)方法》(Methods in Molecular Biology)39:161,1995)。以5-10:1的倍數(shù)用重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞。
分析時(shí)間過程以測(cè)定感染的Sf9細(xì)胞分泌重組CD14蛋白所必須的最適時(shí)間段。用抗-HA單克隆抗體12CA5(《細(xì)胞》(Cell)57:787,1984)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)所收集的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行免疫雜交分析表明在96小時(shí)時(shí)重組CD14蛋白的表達(dá)達(dá)到最大水平。在隨后的實(shí)驗(yàn)中選擇該時(shí)間段以制備生物試驗(yàn)用的重組蛋白(見下)。Sf9來源的重組牛CD14的Western雜交分析見圖9所示。重組牛CD14在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)我們采用改變版的pBPV Episomal哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(Pharmacia)以獲得重組牛CD14在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)。為了能夠直接篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，pBPV通過包括新霉素抗性基因而進(jìn)行改良。該抗性基因插入到表達(dá)框上游3.4kb處。為此，來自pBCMGSneo(《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol)18:98,1988),1.95kb的HindⅢ-Xbal片斷被亞克隆進(jìn)pCRⅡ(Invitrogen)。重組構(gòu)建體，pCRⅡ-neo，被純化，并通過PCR擴(kuò)增克隆的片斷。設(shè)計(jì)PCR引物以使Sall的識(shí)別序列包含在5′和3′端。引物序列互補(bǔ)于pCRⅡ載體的多聚連接子區(qū)，位于HindⅢ(引物A)和Xbal(引物B)克隆位點(diǎn)的旁側(cè)。
引物A:5′-GCA GTC GAC ACT ATA GAA TAC TCA AGC-3′(SEQ ID NO:14)引物B:5′-TTC GTC GAC ATT GGG CCC TCT AGA-3′(SEQ ID NO:15)終產(chǎn)物用Sall酶切，凝膠純化，并亞克隆進(jìn)pBPV的Sall克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄方向與所含的表達(dá)框的方向相同。進(jìn)行改良表達(dá)載體，pBPVneo-13，的質(zhì)粒制備(Plasmid Maxi試劑盒，Quiagen)。
編碼牛CD14翻譯區(qū)的DNA片斷通過PCR擴(kuò)增pETL-HA載體中的基因來制備。該擴(kuò)增反應(yīng)中所用的5′端PCR引物包括Xhol識(shí)別序列；隨后是Nhel識(shí)別序列(含在pETL-HA載體中)；Kozak序列；ATG起始密碼子；和翻譯區(qū)最初的11-13個(gè)核苷酸。3′端的核心PCR引物包括被延伸的HA編碼序列，對(duì)5′序列來說，包括一個(gè)Xhol識(shí)別序列。引物見圖8B。
PCR用Pwo DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)進(jìn)行。擴(kuò)增方法包括在100μl的終體積中加入5ng DNA模板，10mMTris-HCl pH8.85,25mM KCl,5mM(NH4)2SO4,2mM MgSO4,250mM的每種dNTP,250nM的每種引物，和5個(gè)單位的Pwo DNA聚合酶。樣品在70℃退火溫度用DNA Thermal Cycler(PerkinElmer)擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。
擴(kuò)增的片斷用Xhol酶切并且凝膠純化。這些片斷然后亞克隆進(jìn)pBPVneo-13中小鼠金屬硫蛋白1啟動(dòng)子的下游。亞克隆之前，pBPVneo-13用適當(dāng)?shù)南拗菩悦割A(yù)處理，并用牛小腸磷酸酶去磷酸化。重組質(zhì)粒用Plasmid Maxi試劑盒(Quiagen)進(jìn)行制備。
以20μg DNA/107個(gè)細(xì)胞，將重組質(zhì)粒(pBPVneo13-BoCD14)轉(zhuǎn)入小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞系，C127(PNAS78:2727,1981)。用Gene pulser(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室)在960μF/280v通電穿孔來完成DNA轉(zhuǎn)移。在1.5mg/ml G418(Life Technologies)的存在下篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。
高表達(dá)膜CD14的轉(zhuǎn)染體(未轉(zhuǎn)染的C127對(duì)CD14是陰性的)通過免疫染色，隨后用Becton Dickenson FACStar Plus進(jìn)行熒光激活的細(xì)胞分類來加以富集。外源蛋白質(zhì)的膜表達(dá)水平與轉(zhuǎn)染的C127細(xì)胞48小時(shí)匯合培養(yǎng)物上清中回收的分泌CD14的量密切相關(guān)。不象昆蟲細(xì)胞中合成的重組物質(zhì)的純化，已發(fā)現(xiàn)用12CA5-Sepharose親和柱親和純化C127來源的物質(zhì)是不可能的。這可能是由于C127細(xì)胞來源的重組蛋白質(zhì)上缺失了C末端HA標(biāo)志。因此，C127來源的重組牛CD14在842-Sepharose上親和純化。C127來源的重組牛CD14的免疫雜交分析見圖9所示。比較nBo-LAIT和LPS的增殖和分化促進(jìn)活性示于圖10的結(jié)果說明了天然Bo-LAIT支持高懸浮密度的，靜止的，小鼠脾B細(xì)胞的增殖，效率大約為L(zhǎng)PS的200倍。這樣，nBo-LAIT在50ng/ml誘導(dǎo)DNA合成，水平與10μg/ml LPS存在時(shí)所觀察到的結(jié)果相當(dāng)。
nBo-LAIT誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖的能力與它誘導(dǎo)高懸浮密度，靜止的，小鼠B細(xì)胞分化至免疫球蛋白分泌細(xì)胞的能力相一致。如圖11所示，nBo-LAIT 500ng/ml累積誘導(dǎo)的IgM量可與10μg/ml LPS誘導(dǎo)的量相當(dāng)。評(píng)估培養(yǎng)24小時(shí)內(nèi)的IgM分泌量。500ng/ml的nBo-LAIT在48-72小時(shí)培養(yǎng)的24小時(shí)之內(nèi)；72-96小時(shí)；和96-120小時(shí)分別誘導(dǎo)956±10ng/ml；754±8.7ng/ml；和25±1.4ng/ml IgM。10μg/ml LPS刺激的培養(yǎng)所獲得的相應(yīng)值分別為1442±71ng/ml；874±32ng/ml；和183±3ng/ml。這樣，nBo-LAIT以效率可比于用目前已知的最強(qiáng)刺激物刺激B細(xì)胞時(shí)所觀察的效率，具有誘導(dǎo)高懸浮密度靜止的小鼠B細(xì)胞分泌免疫球蛋白的能力。再者，它在LPS濃度的1-10％時(shí)仍具有誘導(dǎo)的能力。
nBo-LAIT誘導(dǎo)小鼠靜止B細(xì)胞獨(dú)特型轉(zhuǎn)換的能力進(jìn)行了評(píng)估。上述培養(yǎng)物來源的上清也評(píng)定了IgG獨(dú)特型的存在。已觀察到500ng/mlnBo-LAIT和10μg/ml LPS分別誘導(dǎo)IgG1累積量(ng/ml第5天)是7.0±0.1和5.6±0.6；IgG2a:358±3和406±8；IgG2b:8±1和11±2；IgG3:75±5和75±0.5；以及IgA:6.5±1.5和5.0±0.3。這樣，nBo-LAIT在缺乏T細(xì)胞時(shí)有能力誘導(dǎo)靜止小鼠B細(xì)胞的某些獨(dú)特型轉(zhuǎn)換。比較nBo-和rBo-LAIT蛋白的增殖促進(jìn)活性昆蟲細(xì)胞和哺乳細(xì)胞來源的重組形式的牛CD14，均具有誘導(dǎo)高懸浮密度，靜止的，小鼠B細(xì)胞增殖的能力。如圖12所示，昆蟲細(xì)胞來源的，并在12CA5-Sepharose上純化的rBo CD14在0.2-3μg/ml的濃度時(shí)誘導(dǎo)強(qiáng)烈的DNA合成。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)來源的重組物質(zhì)支持可比的活性，兩種重組形式在ng/ml濃度均支持B細(xì)胞增殖，與初乳來源的nBo-LAIT所觀察到的活性可比。
通過經(jīng)典蛋白質(zhì)分離技術(shù)，或親和純化從牛初乳中分離的nBo-LAIT介導(dǎo)的生物活性，是由被觀察的蛋白質(zhì)所介導(dǎo)的確定證據(jù)來自評(píng)估重組牛CD14介導(dǎo)的生物活性。如圖9所示，沒有重組形式的牛CD14的表觀分子量與nBo-LAIT相同。所觀察到的表觀分子量上有差異的原因是不清楚的，但可能是因?yàn)椴煌霓D(zhuǎn)錄時(shí)和/或轉(zhuǎn)錄后修飾，核心蛋白的不同大小，或兩者兼而有之。單核細(xì)胞來源的可溶性CD14已有文獻(xiàn)報(bào)道并能以三個(gè)已知的機(jī)制之一進(jìn)行制備，每種機(jī)制將會(huì)導(dǎo)致不同分子量的蛋白質(zhì)。它可以全長(zhǎng)分子被分泌(《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur,J.Immunol.)23:2144,1993；《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur,J.Immunol.)25:604,1995)，膜表達(dá)的GPI連結(jié)的形式可被磷脂酶裂解(《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)141:547,1988；EMBO J.13:1741,1994)，以及膜表達(dá)的GPI連結(jié)的形式可被絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶裂解，假設(shè)它本身可以表達(dá)在單核細(xì)胞的外漿膜上，并以尚未理解的方式被激活(《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)147:1567,1991)，仍需確定rBo-LAITs和初乳來源的nBo-LAIT不同的表觀分子量是否是因?yàn)樗鼈兏髯缘谋磉_(dá)系統(tǒng)所支持的重組物質(zhì)不同的轉(zhuǎn)錄時(shí)和/或轉(zhuǎn)錄后修飾，或不同的核心蛋白大小，或兩者兼而有之。nBo-LAIT的增殖促進(jìn)活性是B細(xì)胞特異的檢測(cè)已經(jīng)觀察到的nBo-LAIT對(duì)小鼠B細(xì)胞的生物活性，對(duì)小鼠T細(xì)胞生理功能的影響。分離純化的B細(xì)胞的確對(duì)nBo-LAIT發(fā)生反應(yīng)的事實(shí)不能排除Bo-LAIT也能激活T細(xì)胞的可能性。
按以前所述(《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur,J.Immunol.)24:976,1994)淋巴結(jié)T細(xì)胞在抗Ig柱上(Biotex Labora)通過陰性選擇來加以分離。根據(jù)免疫熒光染色和FACS分析，所獲得的流出細(xì)胞群含＞95％CD3+細(xì)胞和＞0.5％mlg+細(xì)胞。高懸浮密度的脾B細(xì)胞也從同一小鼠中分離，淋巴結(jié)T細(xì)胞和脾B細(xì)胞均被評(píng)估它們對(duì)nBo-LAIT的反應(yīng)。通過分析它們對(duì)B細(xì)胞特異性有絲分裂原LPS的反應(yīng)，和T細(xì)胞特異性有絲分裂原，刀豆蛋白A(ConA)，的反應(yīng)來功能性評(píng)估這些細(xì)胞群的純度。如圖13的右側(cè)所示，是B細(xì)胞，而不是T細(xì)胞，對(duì)LPS反應(yīng)，伴隨大量的DNA合成，是T細(xì)胞，而不是B細(xì)胞，對(duì)刀豆蛋白A發(fā)生反應(yīng)。如左側(cè)所示，在檢測(cè)的劑量范圍T細(xì)胞不對(duì)nBo-LAIT發(fā)生反應(yīng)，而B細(xì)胞對(duì)濃度為10ng/ml或更高的nBo-LAIT發(fā)生反應(yīng)。LAIT蛋白誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖和胎牛血清最近已經(jīng)證實(shí)單核細(xì)胞對(duì)從腎病病人的尿中所分離的可溶性CD14(sCD14)發(fā)生反應(yīng)，伴隨產(chǎn)生炎癥前(pro inflammatory)細(xì)胞因子(《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur,J.Immunol.)24:17790,1994)，這是在缺乏血清來源的脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)的條件下發(fā)生的。相比之下，低濃度的LPS刺激表達(dá)CD14的單核細(xì)胞產(chǎn)生這些相同細(xì)胞因子的能力是血清依賴性的(《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)176:719,1992)。高濃度的LPS可以克服該血清依賴性。因此，10ng/ml LPS誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子是嚴(yán)格依賴血清/LBP的，然而50μg/mlLPS所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子合成則不需要。
為了確定胎牛血清LBP的存在是否影響低濃度nBo-LAIT誘導(dǎo)高懸浮密度小鼠B細(xì)胞增殖的能力，500ng/ml nBo-LAIT所誘導(dǎo)的反應(yīng)在寬的FBS濃度范圍內(nèi)進(jìn)行評(píng)估，與50μg/ml LPS誘導(dǎo)的反應(yīng)相比較。如圖14所示，B細(xì)胞對(duì)這兩種刺激物的反應(yīng)不受培養(yǎng)基中存在的高達(dá)9％的FBS的影響。LAIT誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖和mCD14B細(xì)胞和單核細(xì)胞對(duì)LPS介導(dǎo)的激活的不同敏感性可能與后者表達(dá)膜CD14(mCD14)有關(guān)。已經(jīng)直接證實(shí)反應(yīng)細(xì)胞上存在mCD14可以大大增強(qiáng)LPS介導(dǎo)的激活的敏感性。具體地說，已經(jīng)證實(shí)一旦被迫表達(dá)外源性GPI聯(lián)結(jié)的mCD14,mCD14陰性的前B細(xì)胞系對(duì)LPS的敏感增加大約1000倍(《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)175:1697,1992)。原代(primary)B細(xì)胞是否表達(dá)mCD14仍是有爭(zhēng)論的。在B細(xì)胞的激活中，與LPS相比的Bo-LAIT的高特異性活性與它不依賴mCD14的激活方式相一致。
為了直接評(píng)估m(xù)CD14的表達(dá)在Bo-LAIT介導(dǎo)的B細(xì)胞激活中的參與情況，在用作反應(yīng)細(xì)胞的高懸浮密度小鼠B細(xì)胞群中評(píng)估CD14特異性的mRNA的存在情況。從三種脾來源的細(xì)胞群的每種107個(gè)細(xì)胞中分離總RNA未分離的脾細(xì)胞；T細(xì)胞缺失的，Percoll分離的，高懸浮密度細(xì)胞，那些常規(guī)用于LAIT蛋白介導(dǎo)的生長(zhǎng)試驗(yàn)的細(xì)胞；以及從高懸浮密度的T細(xì)胞缺失的細(xì)胞群中分離出來的膜Ig表達(dá)細(xì)胞，其分離方法包括用FITC偶聯(lián)的小鼠IgK特異的大鼠mAb標(biāo)記的免疫熒光染色〔187.1(雜交瘤1:5,1981)〕以及隨后用Becton DickinsonFACStar Plus細(xì)胞分類儀進(jìn)行純化。如圖15所示，這三種細(xì)胞群分別含59.2％；83.5％；和99.8％mlg+細(xì)胞。從這種細(xì)胞群中分離的RNA在1.2％的甲醛凝膠上分離，并按順序轉(zhuǎn)移到尼龍膜(GeneScreen)上，交聯(lián)，預(yù)雜交，并與兩探針雜交。
小鼠CD14探針通過PCR來自基因組DNA。具體地說，擴(kuò)增方法包括Pwo DNA多聚酶(Bcehringer Mannheim)加到0.4μg的Balb/c基因組DNA中，同時(shí)加入正向引物5′-CTA GAA TTC TCT CCCGCC CCA CCA GAG CCC TGC G-3′(SEQ ID NO:11)；和反向引物5′-CTA GAA TTC TTA AAC AAA GAG GCG ATC TCCTAG G-3′(SEQ ID NO:12)。樣品在DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer)上以55℃的退火溫度擴(kuò)增30循環(huán)。擴(kuò)增的片斷通過瓊脂糖凝膠電泳分離，從膠上切下，并純化。L32探針(《核酸研究》(Nucl.Acid.Res.)16:10751,1988)用于RNA負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)化。每種探針(100ng)用寡核苷酸標(biāo)記試劑盒(Pharmacia)進(jìn)行標(biāo)記至特異性活性0.2-1×109cpm/μg DNA。膜與探針雜交并在0.2×SSC,1％SDS中于65℃沖洗2小時(shí)，然后曝光。
如圖15所示，從未分離的脾細(xì)胞，和T細(xì)胞缺失的高懸浮密度脾細(xì)胞中分離的RNA含有CD14特異的mRNA，然而FACS純化的B細(xì)胞則不含。在T缺失的高懸浮密度脾細(xì)胞-在此之前稱為靜止B細(xì)胞-中的CD14信號(hào)可能是由于污染的單核細(xì)胞，因?yàn)楦鶕?jù)免疫熒光染色和FACS分析的評(píng)估這些細(xì)胞85-90％為mIg+，而且＞98％為MHCⅡ類+。因此有可能在該細(xì)胞群中Bo-LAIT介導(dǎo)的B細(xì)胞增殖是間接的，并且是通過所含的單核細(xì)胞的激活來介導(dǎo)的。
比較T缺失的，Percoll分離的脾細(xì)胞，和從該細(xì)胞群來源的FACS純化的mlg+細(xì)胞對(duì)nBo-LAIT，和LPS誘導(dǎo)的增殖的反應(yīng)。如圖16所示，兩細(xì)胞群對(duì)兩種刺激物均強(qiáng)烈反應(yīng)。用99.8％純度的B細(xì)胞群所獲得的高10倍的刺激指數(shù)是因?yàn)樵谶@些培養(yǎng)物中降低的非刺激背景(圖16)。LAIT蛋白誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖和CD14如上所述，已經(jīng)觀察到CD40特異的mAbs，其在B細(xì)胞膜上表達(dá)，能誘導(dǎo)小鼠B細(xì)胞的增殖(Sem,in Immunol6:267,1994；PNAS83:4494,1986；《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)140:1425,1988)。
為了確定抗CD40和LAIT蛋白誘導(dǎo)的B細(xì)胞激活之間是否存在某種關(guān)系，檢測(cè)rBo-LAIT刺激高懸浮密度脾B細(xì)胞增殖的能力，其中B細(xì)胞是從常規(guī)C57BL/6小鼠或者已通過靶基因破壞而除去CD40表達(dá)的C57BL/6小鼠中分離的(《免疫力》(Immunity)1:167,1994)。如圖17所示，在檢測(cè)的rBo-LAIT濃度范圍內(nèi)未觀察到這些B細(xì)胞的反應(yīng)中有差異。
這些結(jié)果表明CD40本身不必參與LAIT蛋白的信號(hào)傳遞，但是CD40和LAIT蛋白假定的膜受體共享第二位使產(chǎn)生系統(tǒng)的可能性不能排除。比較分析人、牛和小鼠CD14檢測(cè)已經(jīng)觀察到的nBo-LAIT和rBo CD14對(duì)小鼠B細(xì)胞的活性，從體液而不是初乳中分離的小鼠CD14(Mo)和人CD14(Hu)的活性。已經(jīng)證實(shí)Hu-CD14存在于腎病人的尿中(《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur,J.Immunol.)24:1779,1994)。Hu-CD14是用改良法分離的。尿液通過加入飽和(NH4)2SO4至終濃度45％(v/v)來加以沉淀，并且沉淀物質(zhì)在14000g離心30分鐘來澄清。然后該離心上清中的(NH4)2SO4濃度增加到75％(v/v)。沉淀物在14000g離心30分鐘聚集成小團(tuán)，然后溶于含10mM Tris,150mM NaCl，和“完全”蛋白酶抑制劑雞尾酒(Boehringer Mannheim)的TN緩沖液pH8.0中。不溶物在13000g離心15分鐘去除。該離心的上清在已于TN緩沖液pH8.0中平衡的G-10柱(Bio Rad)上脫鹽。然后將其通過人CD14特異性mAb,3C10(《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)15:126,1983)，已經(jīng)偶聯(lián)的Sepharose 4B。結(jié)合物在100mM乙酸鹽，150mMNaCl,pH2.8中洗脫，并立即加入10倍體積的1M Tris,pH8.0加以中和。洗脫液在Speed-vac中濃縮，并比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
小鼠CD14從小鼠雜交瘤OKT3(PNAS USA77:4914,1980)的上清中分離。在細(xì)胞群篩選分析CD14特異性mRNA表達(dá)的過程中，觀察到每種測(cè)定的雜交瘤均含信號(hào)。因此，如果供體和融合配體均是鼠源的，那么所產(chǎn)生的CD14也是鼠源的。雜交瘤OKT3滿足這些標(biāo)準(zhǔn)。為了評(píng)估CD14蛋白是否能被OKT3產(chǎn)生，并達(dá)到足夠的量允許分離，1升OKT3培養(yǎng)上清中所含的物質(zhì)在3C10-Sepharose上親和純化，按以上對(duì)人尿來源的CD14的描述進(jìn)行。3C10的特異性已定位到人CD14的殘基7-10上(《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)270:361,1995)。這些殘基在牛和小鼠CD14中是高度保守的。
圖18的左側(cè)比較親和純化的人尿CD14(nHu)，初乳牛CD14(nBo)，和OKT3起源的小鼠CD14(nMo)每種1μg的銀染分析。圖18的右側(cè)比較相同三種CD14每種250ng的免疫雜交分析，用mAb3C10作探針檢測(cè)。正如所示，所有這三種制品的純度是可比的，它們與mAb3C10的反應(yīng)性也一樣。
伴隨各自cDNAs編碼的氨基酸數(shù)目有差異的這三種CD14在分子量上的明顯差異可能是由于轉(zhuǎn)錄時(shí)和/或轉(zhuǎn)錄后修飾的緣故。在本文中，明顯看出小鼠，人，和牛CD14s分別含5,4和3個(gè)潛在的N糖基化位點(diǎn)。
評(píng)估這三種CD14制品刺激小鼠B細(xì)胞增殖的能力。如圖19所示，從這三種屬中分離的CD14具有可比的特異性活性，并且在ng/ml濃度范圍是有活性的。結(jié)果也證實(shí)同源物質(zhì)是功能性的，具體地說，小鼠CD14可以激活小鼠B細(xì)胞。結(jié)果也證實(shí)初乳CD14在其刺激B細(xì)胞的能力方面不是奇特的，因此不可能是泌乳的特定環(huán)境中所產(chǎn)生的特定分子形式。nBo-LAIT對(duì)人臍血B細(xì)胞的增殖促進(jìn)活性檢測(cè)已觀察到的nBo-LAIT對(duì)小鼠B細(xì)胞的多種生物活性，對(duì)人B細(xì)胞生理功能的影響。采用兩種來源的B細(xì)胞。因?yàn)長(zhǎng)AIT蛋白的一個(gè)可能作用是參與增強(qiáng)新生兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育，所以需要評(píng)估其刺激來自新生兒的B細(xì)胞，具體地說，是從臍血分離的B細(xì)胞，發(fā)生增殖的能力。
臍血在磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)中1∶1稀釋，并加在ρ=1.077的Percoll(Pharmacia)之上。如圖1A所述進(jìn)行梯度離心。收集ρ=1.077/1.000的界面并在補(bǔ)充了5％胎牛血清(FBS)的PBS中沖洗兩次。然后用已偶聯(lián)了B細(xì)胞膜標(biāo)記物CD72特異的mAb的熒光素對(duì)所獲得的淋巴細(xì)胞染色。隨后通過FACS陽(yáng)性篩選CD72陽(yáng)性的臍血淋巴細(xì)胞，純度＞98％。其后這些陽(yáng)性選擇的B細(xì)胞培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基，正如對(duì)小鼠B細(xì)胞的處理一樣。在小鼠和人B細(xì)胞增殖試驗(yàn)中的唯一區(qū)別是后者是在60小時(shí)用胸苷處理，維持12小時(shí)，而不是在40小時(shí)，維持6小時(shí)。
如圖20A所示，nBo-LAIT在其誘導(dǎo)新生兒B細(xì)胞增殖的能力方面與Igκ和Igλ特異性mAb發(fā)生作用。盡管固化的(培養(yǎng)板結(jié)合的)抗輕鏈mAbs和2μg/ml nBo-LAIT單獨(dú)均可誘導(dǎo)超過背景的胸苷攝入增加，但兩者的組合支持5倍的增加。
這些結(jié)果表明在缺乏完全發(fā)育的T細(xì)胞區(qū)時(shí)，有可能乳汁喂養(yǎng)的新生兒所消耗的LAIT蛋白作為T細(xì)胞的替代物發(fā)揮功能，幫助刺激已遇到抗原的B細(xì)胞增殖和分化成Ig分泌細(xì)胞(《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)169:2149,1989；《科學(xué)》(Science)245:749,1989；Intl,Immunol.2:859,1990；Intl Immunol.2:869,1990)。人初乳和正常血清中的CD14為了測(cè)定在初乳和正常血清中存在的CD14的濃度，用特異性ELISA(IBL-Hamburg)測(cè)定來自兩位供者的初乳，和來自五位健康供者的血清樣品中CD14的存在。如表3所示，來自該健康個(gè)體群體的血清所包含的CD14濃度為1.7-3.2μg/ml，并且是性別非依賴性的。這些結(jié)果與Grunwald等人報(bào)道的結(jié)果非常符合(《免疫學(xué)方法雜志》(J.Immunol.Method)155:225,1992)。
>*2.6-3.4μg/ml根據(jù)ELISA試劑盒制造商(IBL,Hamburg)如圖21所示，分娩后22小時(shí)采集的初乳(A.D.)，以及分娩后4天采集的早期乳奶(S.B.)中含的CD14均大約是正常血清中所含量的20倍。在試驗(yàn)的篩選期中，從一位供者(S.B.)獲得延長(zhǎng)到分娩后78天的多份樣品，盡管CD14的濃度與第4天所觀察到的相比已大大下降，但它們?nèi)匀皇钦Ｑ逯兴^察到的大約3～5倍(圖21)。
在泌乳婦女中關(guān)于血清CD14濃度的資料仍不能得到。因此，仍需確定在初乳和乳奶中所觀察到的高濃度CD14是限于這些體液，還是反映了泌乳婦女所有體液中CD14濃度的普遍增加。
可能是新生兒免疫系統(tǒng)對(duì)初乳CD14的B細(xì)胞增殖和分化活性的短暫暴露在新生兒免疫反應(yīng)機(jī)制的發(fā)育中發(fā)揮部分作用。該活性在初乳中存在的生理相關(guān)性符合該觀察結(jié)果，正如以上所述，在新生兒中T細(xì)胞功能是受損的，這可能是由于在初乳和早期乳奶中存在高濃度的TGFβ1和TGFβ2(《細(xì)胞生物學(xué)雜志》(J.Cell.Biol.)105:1039,1987；《細(xì)胞》(Cell)49:437,1987；EMBO J.6:1633,1987)。如表2所示，亞促有絲分裂濃度的CD14與亞促有絲分裂濃度的膜免疫球蛋白特異的mAb組合，支持B細(xì)胞的活化。CD14在發(fā)育的新生兒免疫系統(tǒng)中可能作為T細(xì)胞的替代物發(fā)揮功能。因此，在缺乏合成的飲食配方時(shí)，通過暴露于CD14的免疫刺激效果新生兒可從CD14作為嬰兒飲食配方添加劑的應(yīng)用中獲益。nBo-LAIT對(duì)人扁桃體B細(xì)胞的增殖促進(jìn)活性評(píng)估nBo-LAIT對(duì)從成年人分離的B細(xì)胞的生物活性，單獨(dú)，以及與固化的(培養(yǎng)板結(jié)合的)抗輕鏈mAbs組合，以刺激從人扁桃體中分離的B細(xì)胞。
扁桃體B細(xì)胞通過陰性選擇來加以制備。扁桃體淋巴細(xì)胞按照對(duì)臍血淋巴細(xì)胞的處理進(jìn)行制備。所得到的細(xì)胞群用生物素化的CD3ε特異的mAb標(biāo)記(Becton Dickenson)，然后用含鐵的“微珠”標(biāo)記。沖洗1次后，標(biāo)記的細(xì)胞群通過MACS(Becton Dickenson)，并收集流出液。根據(jù)系特異性mAbs免疫熒光染色的評(píng)估，該細(xì)胞群含＜1％T細(xì)胞，和＞97％B細(xì)胞。這些B細(xì)胞然后在Percoll不連續(xù)密度梯度上進(jìn)一步分離，與分離高懸浮密度小鼠B細(xì)胞所用的步驟相同。所述的試驗(yàn)采用在ρ=1.085/1.079界面上的那些B細(xì)胞。這些陰性選擇的，密度分離的靜止B細(xì)胞按以下所述培養(yǎng)，脈沖處理，并按對(duì)臍血B細(xì)胞的處理來收集。
如圖20B所示，與用新生兒分離的B細(xì)胞所獲得的結(jié)果相比，nBo-LAIT在300ng/ml的低濃度時(shí)，單獨(dú)激活這些靜止扁桃體B細(xì)胞的強(qiáng)烈增殖。再者，當(dāng)與固化的抗輕鏈mAbs組合時(shí)，在一些濃度下的nBo-LAIT反應(yīng)被大大增強(qiáng)(圖20B)。
成熟人B細(xì)胞對(duì)nBo-LAIT的增殖促進(jìn)活性是敏感的，當(dāng)與B細(xì)胞抗原受體的同時(shí)結(jié)合相組合時(shí)，該活性被放大。這些結(jié)果表明了LAIT蛋白潛在應(yīng)用于疫苗載體，幫助增加它們的佐劑性，或可能降低對(duì)佐劑的需要。
接種技術(shù)的限制是特定抗原制劑的免疫原性。某些佐劑被認(rèn)為是通過聚集和激活抗原特異性T細(xì)胞來發(fā)揮功能。CD14，作為抗原特異性B細(xì)胞反應(yīng)的T細(xì)胞替代物，可提供改善的方式來激活抗原特異性B細(xì)胞以使它們不僅僅擴(kuò)增和分化成抗體分泌細(xì)胞，而且一旦激活，將會(huì)作為聚集T細(xì)胞的有效APC來發(fā)揮功能。這會(huì)增特異性免疫反應(yīng)的放大和T細(xì)胞介導(dǎo)的獨(dú)特型轉(zhuǎn)換。
T細(xì)胞的免疫缺陷是已知的。由于缺乏gp39(CD40L)(已定位至X染色體)的表達(dá)而致的與T細(xì)胞功能障礙有關(guān)的免疫缺陷已被鑒定(ⅰ)X連鎖的高IgM綜合征(HIM)；(ⅱ)常見多變型免疫缺陷(CVI)；和(ⅲ)X連鎖的無丙種球蛋白血癥(XLA)。在某些這些疾病中(HIM)，已經(jīng)證明從病人中分離的T細(xì)胞不能夠激活B細(xì)胞(《科學(xué)》(Science)259:990,1993)，并且該表型與功能性gp39(CD40L)的缺乏有關(guān)。在這些情況下，CD14，或者目的為誘導(dǎo)特異性體液反應(yīng)，或者作為多克隆B細(xì)胞激活劑來使用，均能發(fā)揮功能以誘導(dǎo)/維持同系Ig的水平，這與抗?jié)撛诘沫h(huán)境病原體的每日屏障的保護(hù)相一致。
CD14在初乳中的存在是與它在乳兒中發(fā)揮刺激B細(xì)胞的作用相一致。CD14在輔助新生兒免疫系統(tǒng)發(fā)育中的有效性可在動(dòng)物模型中加以評(píng)估。
CD14缺陷的雌性動(dòng)物，通過CD14位點(diǎn)的有意破壞來制備，將與異源性的或CD14缺陷的雄性動(dòng)物交配。這將能夠在表達(dá)或不表達(dá)CD14的幼狗中評(píng)估初乳CD14的缺乏對(duì)B細(xì)胞發(fā)育的影響。具體地說，將比較B細(xì)胞的個(gè)體發(fā)育和血清IgM和IgG水平的累積發(fā)展，以及這些幼狗增強(qiáng)特異性免疫反應(yīng)的能力。
再者，評(píng)估血清CD14(sCD14)在維持“天然”IgM循環(huán)量中發(fā)揮的作用。循環(huán)的IgG和IgM量是處在不同的調(diào)控下。血清IgG在無抗原環(huán)境中飼養(yǎng)的小鼠中實(shí)際上是缺乏的，然而IgM卻不受影響。為說明sCD14在血清IgM水平調(diào)控中潛在作用，來自上述交配的CD14充足和缺乏的小鼠將限菌飼養(yǎng)。
sCD14的表達(dá)調(diào)節(jié)障礙與特定疾病的病理學(xué)相關(guān)。sCD14量在患類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的病人的血清中是增加的(Clin.Exp.Immunol91(2):207,1993)。也已經(jīng)報(bào)道活化CD14+單核細(xì)胞的數(shù)目在RA病人的滑液中有增加(Br.J.Rheumatol,29(2):84,1990；《風(fēng)濕病學(xué)》(J.Rheumatol),22(4):600,1995)。盡管仍需確定sCD14的量在RA病人的滑液中是否是增加的，但是CD14+單核細(xì)胞一旦激活，就能表達(dá)膜相關(guān)的能裂解膜CD14的蛋白酶，導(dǎo)致產(chǎn)生sCD14(《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur,J.Immunol.)25:604,1995)。與sCD14激活人B細(xì)胞的能力相一致，RA病人滑液中含有大量的活化B細(xì)胞，至少一部分B細(xì)胞能產(chǎn)生類風(fēng)濕因子(《臨床免疫學(xué)與免疫病理學(xué)》(Clin Immunol.Immunopathol31(2):272,1984；Clin.Exp.Immunol.55(1):91,1984)。這樣，出現(xiàn)一種模型，它涉及sCD14在RA病人合成增加，以及它可能參與B細(xì)胞的激活，導(dǎo)致類風(fēng)濕因子產(chǎn)生。因此抗體介導(dǎo)的sCD14的清除可使癥狀緩解，該緩解是由B細(xì)胞激活和RA病人中類風(fēng)濕因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)障礙所介導(dǎo)的。再者，抗體介導(dǎo)的sCD14的清除會(huì)緩解炎癥，該炎癥是由sCD14誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生炎癥前細(xì)胞因子所支持的(《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur,J.Immunol.) 24:1779,1994)。
常規(guī)制備人單克隆抗體(mAbs)存在多種困難，非常重要的是不能夠富集所需抗原特異性的活化人B細(xì)胞。sCD14具有誘導(dǎo)所需抗原特異性的人B細(xì)胞的能力。sCD14在體外誘導(dǎo)人B細(xì)胞增殖和分化的能力使之可能用于制備抗原特異性mAbs。在此我們表明高濃度(0.5-1μg/ml)的sCD14以多克隆的方式激活人B細(xì)胞。然而，亞最適量促有絲分裂濃度的sCD14被證明能與B細(xì)胞抗原受體(BcR)特異的mAb協(xié)同發(fā)揮作用。因此，亞最適量促有絲分裂濃度的sCD14優(yōu)選激活那些通過BcR收到互補(bǔ)信號(hào)的B細(xì)胞。在這些情況下，BcR特異的mAb作為抗原替代物發(fā)揮功能。如果特異性是強(qiáng)加在BcR信號(hào)的傳遞過程中，那么隨之發(fā)生的B細(xì)胞反應(yīng)也將是特異的。因此，當(dāng)抗BcR由特異性抗原替代時(shí)，sCD14同時(shí)存在所提供的協(xié)同刺激將會(huì)全部集中在抗原特異性B細(xì)胞上。這樣，隨之發(fā)生的抗體的合成將是抗原特異的。以該方式激活的B細(xì)胞群對(duì)活化的，抗原特異的B細(xì)胞來說是高度富集的，因此有利于制備分泌所需特異性的mAb的人雜交瘤。
CD14在接種技術(shù)中作為佐劑的有效性可用動(dòng)物模型加以評(píng)估。Bo和Hu-CD14將用半抗原TNP加以改良。半抗原化的物質(zhì)將被評(píng)估其體外誘導(dǎo)多克隆B細(xì)胞激活的能力，以確保半抗原化沒有改變CD14的生物活性。偶聯(lián)物將進(jìn)行皮下或肌肉內(nèi)注射，并隨著時(shí)間，測(cè)定血清中特異性抗體的含量。使用另外系列的小鼠，收集引流的淋巴結(jié)，并計(jì)數(shù)所包含的抗體分泌細(xì)胞。另外，某些受者將用變量的CD14和蛋白質(zhì)或細(xì)胞抗原組成的混合物來進(jìn)行免疫。然后計(jì)算血清抗體滴度，以及抗原特異性的，和所有Ig分泌細(xì)胞的數(shù)目。
CD14的毒性可在小鼠，大鼠和猴的急性靜脈內(nèi)的研究中加以評(píng)估?？梢赃M(jìn)行大鼠的急性皮下灌注研究，以及在長(zhǎng)期研究中，在三種動(dòng)物中涉及多次皮下和靜脈內(nèi)注射的研究。將進(jìn)行大體病理學(xué)(Grosspathologic)和組織病理學(xué)的評(píng)估，以及血清化學(xué)和血液病學(xué)的分析?；蚨拘詽摿稍隗w外哺乳動(dòng)物細(xì)胞，和小鼠小核試驗(yàn)中進(jìn)行。致畸潛力可在受孕小鼠，大鼠，和猴中進(jìn)行評(píng)估。
將CD14施用于人受試者時(shí)，可采用常規(guī)的制藥實(shí)踐。作為嬰兒飲食配方的添加劑，它可以在生產(chǎn)時(shí)加入到飲食配方中。它可以制備成片劑或膠囊，或僅在使用前混合的粉末。在疫苗制劑的情況下，根據(jù)其它標(biāo)準(zhǔn)步驟它可以作為所制備的疫苗的成分而包括在內(nèi)。使用法可以采取任何方便的方式，例如，靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、胃內(nèi)、顱內(nèi)、囊內(nèi)、脊柱內(nèi)、腦池內(nèi)、腹腔內(nèi)，或口服。
腸胃外的制劑可以是液體溶液或懸液的形式。
本領(lǐng)域中已知的用于制備制劑的方法均可見于，如，“雷明頓制藥科學(xué)”(Remington’s Pharmaceutical Sciences)。腸胃外用藥的制劑，例如，可以包含作為賦形劑的無菌水或鹽，聚二醇如聚乙二醇，植物油，氫化萘等。
CD14使用的濃度將根據(jù)，如，使用量和使用途徑，而有所變化。
在CD14天然氨基酸序列的變異方面，至少，可以進(jìn)行保守的替換。保守替換見述于專利文獻(xiàn)，例如，見美國(guó)專利No.5,2264,558。因此期望，例如，非極性脂肪族中性氨基酸甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸和異亮氨酸，之間的互換可能是可行的。同樣，極性脂肪族中性氨基酸絲氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、天門冬酰胺和谷氨酰胺，之間的替換可能是可行的。帶電荷的酸性氨基酸，天門冬氨酸和谷氨酸，之間的替換可能是可行的，帶電荷的堿性氨基酸，賴氨酸和精氨酸，之間的替換也是如此。芳香族氨基酸，包括苯丙氨酸、組氨酸、色氨酸和酪氨酸之間的替換也可能是可行的。這些替換和互換對(duì)本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員來說是熟知的。其它的替換也是很可能的。當(dāng)然，也預(yù)期變異蛋白質(zhì)與天然存在的蛋白質(zhì)的同源性百分?jǐn)?shù)越大，代謝活性的保持也越高。
權(quán)利要求
1．具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的能夠激活哺乳動(dòng)物B細(xì)胞的多肽，或保留該多肽生物活性的該多肽的片斷；或保留該多肽生物活性的該多肽的變體；保守替換的該多肽變體；或具有該多肽生物活性的其片斷或變體的偶聯(lián)物。
2．SEQ ID NO:4的多肽或其保守替換的變體。
3．權(quán)利要求1或2中的多肽，其中多肽是轉(zhuǎn)錄時(shí)和/或轉(zhuǎn)錄后修飾的。
4．包含編碼具有根據(jù)權(quán)利要求1和2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的核酸分子。
5．包含編碼具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的核酸分子。
6．根據(jù)權(quán)利要求4和5的為cDNA的核酸分子。
7．根據(jù)權(quán)利要求4和5的為基因組DNA序列的核酸分子。
8．權(quán)利要求5的核酸分子，它是包含核苷酸序列SEQ ID NO:1的cDNA分子。
9．從牛初乳乳清中制備具有序列SEQ ID NO:4的多肽或其轉(zhuǎn)錄時(shí)和/或轉(zhuǎn)錄后修飾形式的方法，包括從乳清中分離該多肽。
10．權(quán)利要求9的方法，其中分離多肽包括蛋白質(zhì)從澄清的牛初乳乳清中鹽析出來。
11．權(quán)利要求10的方法，其中多肽的進(jìn)一步分離包括陰離子交換層析。
12．權(quán)利要求11的方法，其中多肽的進(jìn)一步分離包括篩柱層析。
13．權(quán)利要求12的方法，其中多肽的進(jìn)一步分離包括羥基磷灰石柱層析。
14．激活B細(xì)胞的方法，利用具有氨基酸序列SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的多肽，或保持該多肽生物活性的該多肽的片斷；或保持該多肽生物活性的該多肽的變體；或該多肽保守替換的變體；或具有該多肽生物活性的其片斷或變體的偶聯(lián)物。
15．權(quán)利要求14的方法，其中多肽SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的類似物來自該多肽的氨基酸替換、缺失或添加，條件是該多肽的三維構(gòu)象得以保存。
16．權(quán)利要求15的方法，其中多肽是SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的保守替換變體。
17．權(quán)利要求14、15或16的方法，其中多肽是轉(zhuǎn)錄時(shí)和/或轉(zhuǎn)錄后修飾的。
18．通過施用根據(jù)權(quán)利要求14、15、16或17的多肽在需要B細(xì)胞激活的哺乳動(dòng)物中激活B細(xì)胞的方法。
19．權(quán)利要求18的方法，其中哺乳動(dòng)物是人受試者。
20．權(quán)利要求19的方法，其中人是嬰兒。
21．權(quán)利要求18的方法，其中需要這種激活的哺乳動(dòng)物具有CD40陰性或CD40缺陷的B細(xì)胞。
22．權(quán)利要求21的方法，其中哺乳動(dòng)物是人受試者。
23．權(quán)利要求22的方法，其中人是嬰兒。
24．權(quán)利要求18的方法，其中哺乳動(dòng)物患T細(xì)胞免疫缺陷，或過敏。
25．權(quán)利要求24的方法，其中哺乳動(dòng)物具有CD40L陰性或CD40L缺陷的T細(xì)胞。
26．權(quán)利要求25的方法，其中哺乳動(dòng)物是人受試者。
27．權(quán)利要求26的方法，其中人是嬰兒。
28．誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖和分化成免疫球蛋白高分泌細(xì)胞的方法，采用具有氨基酸序列SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6的多肽，或保持該多肽生物活性的該多肽的片斷；或保持該多肽生物活性的該多肽的變體；保守替換的該多肽變體；或具有該多肽生物活性的片斷或變體的偶聯(lián)物。
29．權(quán)利要求28的方法，其中多肽SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的類似物來自該多肽的氨基酸替換、缺失或添加，條件是該多肽的三維構(gòu)象得以保存。
30．權(quán)利要求28的方法，其中多肽是SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的保守替換變體。
31．權(quán)利要求28、29或30的方法，其中多肽是轉(zhuǎn)錄時(shí)和/或轉(zhuǎn)錄后修飾的。
32．通過施用根據(jù)權(quán)利要求28、29、30或31的多肽在需要B細(xì)胞激活的哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖和分化的方法。
33．權(quán)利要求32的方法，其中哺乳動(dòng)物是人受試者。
34．權(quán)利要求31的方法，其中人是嬰兒。
35．一種制備具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的純蛋白或其轉(zhuǎn)錄時(shí)和/或轉(zhuǎn)錄后修飾形式包括保守替換變體的方法，包括(ⅰ)培養(yǎng)原核或真核宿主細(xì)胞，它們能夠在培養(yǎng)條件下表達(dá)所述蛋白或轉(zhuǎn)錄時(shí)和/或轉(zhuǎn)錄后修飾形式的所述蛋白；(ⅱ)表達(dá)所述蛋白或轉(zhuǎn)錄時(shí)和/或轉(zhuǎn)錄后修飾形式的所述蛋白；以及(ⅲ)從培養(yǎng)物中回收所述蛋白。
36．權(quán)利要求14、15、16或17的多肽在制備在需要B細(xì)胞激活的哺乳動(dòng)物中激活B細(xì)胞的藥物中的用途。
37．制備嬰兒飲食配方的方法，其中包括將權(quán)利要求14、15、16或17的多肽加入到飲食配方中。
38．制備疫苗的方法，它包括將權(quán)利要求14、15、16或17的多肽加入到疫苗配方中。
39．權(quán)利要求38的方法，包括將抗原和權(quán)利要求14、15、16或17的多肽偶聯(lián)入疫苗配方中的步驟。
40．權(quán)利要求38的方法，進(jìn)一步包括將抗原和權(quán)利要求14、15、16或17的多肽混合入疫苗配方中的步驟。
41．接種病人的方法，包括對(duì)病人施用抗原和權(quán)利要求14、15、16或17的多肽。
42．權(quán)利要求41的方法，其中抗原和權(quán)利要求14、15、16或17的多肽在單一步驟中使用。
43．權(quán)利要求41的方法，其中抗原和權(quán)利要求14、15、16或17的多肽在不同步驟中使用。
44．接種制劑的試劑盒，包括預(yù)定量的抗原和預(yù)定量的權(quán)利要求14、15、16或17的多肽。
45．對(duì)需要以下抗體的哺乳動(dòng)物的施用方法，所述抗體針對(duì)具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的多肽或保留該多肽生物活性的該多肽的片斷；或保留該多肽生物活性的該多肽的變體；該多肽的保守替換體；它能夠結(jié)合該多肽，其片斷或變體，因而降低或抑制人B細(xì)胞的活性，否則B細(xì)胞因?yàn)楦哐逅降木哂蠸EQ ID NO:5氨基酸序列的多肽或其功能性衍生物而是高度活化的。
46．權(quán)利要求45的方法，其中哺乳動(dòng)物是人受試者。
47．富集分泌所需抗原特異性的單克隆抗體的哺乳動(dòng)物B細(xì)胞的方法，其包括根據(jù)權(quán)利要求14、15、16或17在亞最適量與抗體針對(duì)的抗原一起協(xié)同激活該B細(xì)胞。
48．根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中哺乳動(dòng)物B細(xì)胞是人源的。
49．根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中哺乳動(dòng)物B細(xì)胞是小鼠的。
全文摘要
從牛初乳乳清中純化出一種新蛋白質(zhì)并鑒定了已分離的編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列。該分離的牛蛋白被稱為牛泌乳相關(guān)的親免疫(Bo－LAIT)蛋白。Bo－LAIT蛋白的人對(duì)應(yīng)蛋白，Hu－LAIT，也進(jìn)行了描述。激活B細(xì)胞的方法，尤其是在需要該激活的哺乳動(dòng)物，如人，中通過施用LAIT蛋白激活B細(xì)胞的方法被描述。LAIT蛋白可加入到嬰兒飲食配方中。正是通過這種飲食配方喂養(yǎng)嬰兒，LAIT蛋白可施用于嬰兒。LAIT蛋白可以摻入作為接種的成分。LAIT蛋白可以施用于患T細(xì)胞免疫缺陷的病人，例如，病人T細(xì)胞的細(xì)胞表面低表達(dá)或完全缺乏gp39(CD40L)的特定T細(xì)胞的機(jī)能障礙。也描述了包括LAIT蛋白在內(nèi)的用于激活需要該激活的哺乳動(dòng)物中B細(xì)胞的藥物的制備?？梢允褂锰烊换蛑亟M的LAIT蛋白。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1238010SQ97199840
公開日1999年12月8日 申請(qǐng)日期1997年11月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月18日
發(fā)明者M·H·朱利葉斯, D·菲利普, K·阿利扎德-希阿威 申請(qǐng)人:韋爾斯利醫(yī)院基金會(huì)