專利名稱：治療突變引起的疾病的方法和化合物的制作方法
Ⅰ．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明的領(lǐng)域涉及突變引起的疾病的治療，所述突變引起造血細(xì)胞或可從受治療者人體取出、培養(yǎng)和再植入的其它類型細(xì)胞中的突變基因的異常水平或異常產(chǎn)物。通過(guò)突變基因和嵌合修復(fù)載體(CRV)的同源重組使病人突變基因配對(duì)實(shí)現(xiàn)治療，CRV是既有脫氧核糖核苷酸又有核糖核苷酸的核酸。更詳細(xì)地講，該領(lǐng)域涉及引起鐮刀形紅細(xì)胞病、β-地中海貧血和高歇氏病的突變的修復(fù)。
Ⅱ．發(fā)明背景A．造血細(xì)胞表達(dá)基因的突變引起的疾病及其用骨髓移植的治療1．血紅蛋白病和高歇氏病已知有500多種血紅蛋白的結(jié)構(gòu)變異體。有變異血紅蛋白的許多人是無(wú)癥狀的或是只有輕微的影響。三個(gè)常見(jiàn)的變異體就和重要的疾病有關(guān)。HbS(鐮狀細(xì)胞性貧血紅蛋白)和HbC兩種血紅蛋白是編碼β-珠蛋白Glu6的密碼子中發(fā)生了點(diǎn)突變，這兩種珠蛋白在非洲人及其后裔中有發(fā)現(xiàn)。HbC是由于第6個(gè)密碼子的第一位發(fā)生G→A的置換，而HbS則是由于第6個(gè)密碼子的第二位發(fā)生了A→T置換，分別產(chǎn)生了Lys6和Val6。與疾病有關(guān)的血紅蛋白的第三種常見(jiàn)的變異體HbE，是由于編碼Glu26的第26個(gè)密碼子的第一位置發(fā)生了G→A的置換，結(jié)果產(chǎn)生了Lys26，HbE最初是在東南亞人群及其后裔中發(fā)現(xiàn)的。
HbS、HbC或HbE雜合的人沒(méi)有明顯的病癥。然而，HbS純合體、HbS/HbC雜合體及HbC或HbE與β-地中海貧血病的等位基因的雜合體就有嚴(yán)重影響，并需經(jīng)常的醫(yī)療照顧。
地中海貧血是一類血紅蛋白病，其中α-珠蛋白與β-珠蛋白合成速度不均衡。地中海貧血病根據(jù)突變基因可分為α或β型，并根據(jù)受影響蛋白是完全還原還是部分還原分為例如α0和β0(完全還原)或者如α+和β+(部分還原)。
在單倍體人類基因組中有兩個(gè)緊密相連的功能α-珠蛋白基因。α-地中海貧血病的最普遍的原因是相連的α-珠蛋白基因或者α-珠蛋白基因座控制區(qū)發(fā)生了缺失或重排。
相反，β-地中海貧血病的普遍原因是點(diǎn)突變。最普遍原因是β-珠蛋白基因110位發(fā)生G→A置換，在第一個(gè)內(nèi)含子(IVSI)中產(chǎn)生一個(gè)新的剪接接受位點(diǎn)。
已經(jīng)特征記述了大約100種不同類型的β-地中海貧血病。已描述特性的突變中只有14種是顯性的，即與野生型β-珠蛋白等位基因雜合時(shí)引起顯著的臨床病況。其余的突變與第二個(gè)β-地中海貧血病基因純合或雜合時(shí)導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床病況，稱為重型地中海貧血病。血紅蛋白病的詳細(xì)綜述見(jiàn)Weatherall等著的《遺傳病的新陳代謝和分子基礎(chǔ)》(THE METABOLIC AND MOLECULAR BASIS OF INHERITEDDESEASE)第七版第113章(McGraw-Hill，紐約，1995)。
高歇氏病是溶酶體糖脂貯積病。有三種公認(rèn)的類型。1型高歇氏病在阿什哈巴德(東歐)的猶太人及其后裔中最普遍；2型是panethinc；3型在瑞典北部最普遍。高歇氏病的病因是葡糖腦苷酯酶有缺陷，該酶也叫酸性葡糖苷酶。葡糖腦苷脂酶在源于骨髓的巨噬細(xì)胞/單核白細(xì)胞的細(xì)胞類型中表達(dá)。
有三種不同的引起高歇氏病的常見(jiàn)突變mRNA的第1225位核苷酸發(fā)生A→G的置換，導(dǎo)致葡糖腦苷脂酶第370位殘基發(fā)生Asn→Ser的置換(N370S突變)；mRNA第1448位核苷酸發(fā)生T→C置換，導(dǎo)致葡糖腦苷脂酶第444殘基發(fā)生Leu→Pro置換(L444P突變)；及第位核苷酸G的重復(fù)導(dǎo)致移碼突變(84GG突變)。N370S和84GG突變與阿什哈巴德人群有關(guān)，而L444P突變與瑞典北部人群有關(guān)且是偶爾發(fā)生的突變。
引起高歇氏病的編碼序列的不常見(jiàn)但并不罕見(jiàn)的突變已鑒定如下于754位T→C；于1192位，C→T；于1193位，G→A；于1297位，G→T；于1342位，G→C；于1504位，C→T；及于1604位，G→A。
引起高歇氏病的突變是隱性的，即有一個(gè)野生型葡糖腦苷脂酶等位基因的個(gè)體沒(méi)有癥狀。N370S突變純合的個(gè)體通常在其生命晚期發(fā)展成輕微的病。相反，L444P突變的純合個(gè)體患有比較嚴(yán)重的2型和3型高歇氏病。84GG突變?cè)诩兒蠣顟B(tài)時(shí)導(dǎo)致產(chǎn)物沒(méi)有酶活性，且導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床疾病。在不常見(jiàn)的突變中，于核苷酸754、1192、1297和1342的突變與嚴(yán)重形式的疾病相關(guān)。高歇氏病的詳細(xì)綜述見(jiàn)Beutler,E.和Grabowski《遺傳疾病的新陳代謝和分子基礎(chǔ)》(THEMETABOLIC AND MOLECULAR BASIS OF INHERITED DESEASE)第7版、第86章(McGraw-Hill，紐約，1995)。
2．通過(guò)骨髓移植治療突變引起的疾病通過(guò)HLA匹配的具有正常β-珠蛋白基因的骨髓的同種異體骨髓移植治療嚴(yán)重的β-地中海貧血的病例已報(bào)道是有臨床益處的。Giardini,C等，1995,Annu.Rve.Med.46:319-30(地中海貧血病)；Lucarelli,G等，1991,Hematol.Oncoi.Clin.North Am.5:549(地中海貧血病)；Kalinyak,K.A等1995,Am.J.of Hemat.48:256-61(鐮刀形細(xì)胞)；Abboud,M.R.等1994,Am.J.ofPed.Hem/Onc 16:86-89(鐮刀形細(xì)胞)；Kirkpatrick,D.V等1991,Semi.Hematol.28:240(鐮刀形細(xì)胞)。臨床結(jié)果顯示移入成功時(shí)是有療效的。移入可以是持久的；有報(bào)導(dǎo)在隨后的3-8年中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)排斥作用。然而，由于移植物抗宿主病的發(fā)展和如環(huán)孢菌素的免疫抑制藥物的維持劑量，失敗的比率是明顯的。獲得HLA匹配的骨髓也可能有相當(dāng)?shù)睦щy。
治療1型高歇氏病的同種異體骨髓移植已產(chǎn)生了與上述地中海貧血病大致相同的結(jié)果。Ringden,O.等1995,Transplantation 59:864)；Chan,K.W.等1994,Bone Marrow Transplantation 14:327。骨髓移植用于治療更嚴(yán)重的涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的2型和3型高歇氏病據(jù)報(bào)道也已獲得滿意的結(jié)果。Tsai,P.等1992,Pediatr.Res.31:503；Svennerholm,L.等1991,Dev.Neurosci.13:345-51。與珠蛋白基因相對(duì)比，用病毒表達(dá)載體可以獲得有效水平的葡糖腦苷脂酶表達(dá)，這就提示轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓的自體移植對(duì)高歇氏病是有效的療法。Karlsson,S.和Correll,P.H.,1993,Bone Marrow Transplantation 11(增刊11):124-7。B．具DNA·RNA堿基對(duì)的嵌合寡核苷酸具有互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸并含與噬菌體M13mp19的片段同源序列的寡核苷酸，在Kmiec.E.等1994年11月Mol.and Cell.Biol.14:7163-7172中有描述。該寡核苷酸有單一相鄰的核苷酸區(qū)段。Kmies等指出，該寡核苷酸是源于玉蜀黍黑粉菌的REC2同源配對(duì)酶的底物。
1995年6月15日公布的并為相應(yīng)的于1994年12月9日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)08/353,657的專利說(shuō)明書(shū)WO 95/15972，描述了在原核細(xì)胞中引進(jìn)遺傳改變的嵌合修復(fù)載體(CRV)。在玉蜀黍黑粉菌基因和鼠ras基因中已有實(shí)例報(bào)道。后一例子設(shè)計(jì)用來(lái)把轉(zhuǎn)化突變引入到ras基因，使得ras基因在NIH 373細(xì)胞中的成功突變能使細(xì)胞集落生長(zhǎng)(“轉(zhuǎn)化”)。WO 95/15927說(shuō)明書(shū)報(bào)告了NIH 373的最大轉(zhuǎn)化率小于0.1％，即每106個(gè)細(xì)胞大約100個(gè)轉(zhuǎn)化子受到ras CRV的作用。在玉蜀黍黑粉菌系統(tǒng)中轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)頻率大約是600個(gè)/106。設(shè)計(jì)把突變引入人bcl-2基因的嵌合載體在Kmiec,E.B.,1996年2月，Seminar inOncology 23:188中有描述。
設(shè)計(jì)修復(fù)K-ras的密碼子12中突變的CRV在Kmiec,E.B 1995年2月，Advanced Drug Delivery Reviews 17:333-40中有描述。用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法體把CRV引入Capan2細(xì)胞，在源自人胰腺癌的細(xì)胞系Capan 2中檢測(cè)CRV。接觸CRV 24小時(shí)后，收獲細(xì)胞并提取基因組DNA；含K-ras密碼子12的片段用PCR擴(kuò)增，并通過(guò)與等位基因的特異性探針雜交估計(jì)轉(zhuǎn)化率。報(bào)道轉(zhuǎn)化率接近18％。
設(shè)計(jì)修復(fù)編碼肝/骨/腎型堿性磷酸酶基因突變的CRV在Yoon,K.等，1996年3月，Proc.Natl.Acad.Sci 93:2071中有報(bào)道。所述堿性磷酸酶基因用質(zhì)粒瞬時(shí)引入CHO細(xì)胞、6小時(shí)后引入CRV。CRV引入24小時(shí)后回收質(zhì)粒并進(jìn)行分析。結(jié)果顯示用CRV修復(fù)近30-38％的堿性磷酸酶基因。
Ⅲ．發(fā)明概述本發(fā)明提供了治療靶基因突變引起的人類受治療者遺傳病的方法。本發(fā)明包含了受治療者細(xì)胞類型基因的致病突變的修復(fù)，其中可以從受治療者取出細(xì)胞類型，進(jìn)行培養(yǎng)并通過(guò)把CRV引入到細(xì)胞類型的細(xì)胞中進(jìn)行體外修復(fù)，然后再植入受治療者體內(nèi)，其中再植入細(xì)胞或者其子代的突變修復(fù)是有療效的。一般來(lái)講，細(xì)胞類型的細(xì)胞群體25％以上的隱性突變的修復(fù)和50％以上的顯性突變的修復(fù)是治療上有效的修復(fù)率。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，靶基因是在下文中統(tǒng)稱為“造血細(xì)胞”的骨髓髓細(xì)胞或骨髓細(xì)胞的后代中正常表達(dá)的類型。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是這樣一種方法，包括把受治療者的造血干細(xì)胞(HSC)置于培養(yǎng)基中，把嵌合修復(fù)載體(CRV)引入HSC中修復(fù)靶突變，再把包含CRV的HSC移植入受治療者體內(nèi)等的步驟。
本發(fā)明包含了除大段缺失或插入(即大約6個(gè)以上堿基的缺失或插入)、易位和染色體內(nèi)重排外的任何突變的修復(fù)。在最佳實(shí)施方案中，本發(fā)明包括單個(gè)堿基置換(“點(diǎn)突變”)和1、2或3個(gè)相鄰堿基的缺失或插入的修復(fù)。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案是CRV,CRV為大約40到100個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其中大約12到46個(gè)核苷酸具有2’-羥基或2’-羥甲基。所述CRV包含與靶基因野生型序列相同的區(qū)段，該區(qū)段跨越引起受治療者疾病的突變。該CRV是由一個(gè)雙鏈寡核苷酸組成的，即除了使寡核苷酸組成發(fā)夾末端的大約4個(gè)未配對(duì)核苷酸的兩個(gè)區(qū)外，其核苷酸堿基是Watson-Crick配對(duì)的。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明包括具人類葡糖腦苷脂酶基因和珠蛋白基因和人類β-珠蛋白啟動(dòng)子的序列的CRV。
Ⅳ．附圖簡(jiǎn)述

圖1．嵌合修復(fù)載體實(shí)施方案的一般形式。
圖2A和2B．圖2A顯示了寡核苷酸Dh1(SEQ ID NO:91)和嵌合寡核苷酸Ch1(SEQ ID NO:88)、Ch2(SEQ ID NO:89)和Ch3(SEQID NO:90)的序列和結(jié)構(gòu)。圖2B闡明了CRV Ch1的序列和堿性磷酸酶基因(SEQ ID NO:92)之間的關(guān)系。DNA的核苷酸是大寫(xiě)；RNA的核苷酸是小寫(xiě)。
圖3．βS-珠蛋白(SEQ ID NO:93的核苷酸1-25)、βA-珠蛋白(SEQ ID NO:94的核苷酸1-25)、δ-珠蛋白(SEQ ID NO:98)及嵌合載體SC1-SC5(SEQ ID NO:93-97)的密碼子3-9和密碼子2和10的相鄰二核苷酸的序列。DNA和RNA的核苷酸如圖2A所示。
圖4A和4B．圖4A和4B顯示在EB轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞培養(yǎng)中分別隨nM SC1和nM SC2而變的由βS轉(zhuǎn)變?yōu)棣翧的β-珠蛋白拷貝的函數(shù)及βA轉(zhuǎn)變?yōu)棣耂的β-珠蛋白拷貝的函數(shù)。
圖5．圖5顯示了隨加入到cd34+造血干細(xì)胞中的ng SC2而變的由βA-βS的β-珠蛋白拷貝的函數(shù)。
Ⅴ．發(fā)明詳述本發(fā)明提供了嵌合修復(fù)載體(CRV)與其應(yīng)用方法，該方法稱為“嵌合整復(fù)術(shù)(chimeroplasty)”，用來(lái)校正來(lái)自人類受治療者的可瞬時(shí)置于細(xì)胞培養(yǎng)中的無(wú)轉(zhuǎn)化細(xì)胞類型的有害突變。嵌合整合術(shù)是這樣一個(gè)過(guò)程把適當(dāng)細(xì)胞群體(靶細(xì)胞)置于培養(yǎng)中，進(jìn)行或不進(jìn)行生長(zhǎng)，再把培養(yǎng)的細(xì)胞暴露于CRV，然后把細(xì)胞再移植到該受治療者體內(nèi)。本發(fā)明部分基于此發(fā)現(xiàn)應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的CRV導(dǎo)致30％以上的靶基因得到修復(fù)，而且可以導(dǎo)致50％以上的靶基因得到修復(fù)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶細(xì)胞是造血細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞。這里用的造血細(xì)胞包括紅細(xì)胞類、淋巴樣單核細(xì)胞樣(巨噬細(xì)胞)和粒性白細(xì)胞的譜系的前體和成熟細(xì)胞。這里使用的造血干細(xì)胞(HSC)包括在骨髓或外圍血中發(fā)現(xiàn)的而且能種群恢復(fù)骨髓區(qū)(bone marrowspace)并產(chǎn)生造血譜系后代的所有細(xì)胞。A．對(duì)本發(fā)明治療敏感的疾病本發(fā)明可用于治療造血細(xì)胞中突變引起的異?；虍a(chǎn)物的產(chǎn)生或正常基因產(chǎn)物表達(dá)過(guò)量或表達(dá)不足引起的遺傳疾病，其中所述突變不包括大段插入或缺失突變或染色體內(nèi)重排或易位。
大段插入或缺失突變是與正?；蛞吧托蛄邢啾扔谐^(guò)6個(gè)相鄰核苷酸插入或缺失的突變。能用本發(fā)明治療的突變類型包括核苷酸被不同核苷酸置換引起的突變，包括多至3個(gè)和多至6個(gè)相鄰核苷酸的置換；多至3個(gè)相鄰核苷酸的插入或缺失引起的任何突變；或者是多至6個(gè)相鄰核苷酸插入或缺失引起的突變。能用本發(fā)明治療的突變類型在這里稱為“CRV可修復(fù)突變”。
CRV可修復(fù)突變可以是任何的人類基因。這里用的基因指的是或者是結(jié)構(gòu)基因，如編碼蛋白質(zhì)的基因的外顯子和間插序列；或者是控制元件，如結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。本發(fā)明還包含同一基因內(nèi)的幾個(gè)CRV可修復(fù)突變引起的疾病的治療。單一CRV能校正相互之間在大約30個(gè)核苷酸內(nèi)的非相鄰點(diǎn)突變?；蛘咄ㄟ^(guò)把多個(gè)CRV的混合物引入受治療者的HSC，以便用混合物中的一個(gè)CRV修復(fù)每一個(gè)CRV可修復(fù)突變，使疾病得到治療。本發(fā)明包含能修復(fù)任何這樣的突變的人類基因的CRV序列，所述突變的人類基因在造血細(xì)胞或HSC子代中的表達(dá)或缺乏表達(dá)或表達(dá)過(guò)量是該受治療者的病因。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明消除了ras基因，見(jiàn)Taparowski,E.1982 Nature 300:762；Sukumar,S.等，1983,Nature 306:658；在可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明消除了ras基因和堿性磷酸酶基因，Weiss,M.J.等1988,Proc.Natl.Acad.Sci.85:7666。
能用本發(fā)明治療的非限定病例包括珠蛋白結(jié)構(gòu)基因中CRV可修復(fù)突變引起的血紅蛋白病，如鐮刀形細(xì)胞貧血病；β-地中海貧血病，為β-珠蛋白啟動(dòng)子或β-珠蛋白結(jié)構(gòu)基因中CRV可修復(fù)突變引起β-珠蛋白基因表達(dá)不足的疾病；在葡糖腦苷脂酶結(jié)構(gòu)基因中一個(gè)或多個(gè)CRV可修復(fù)突變引起的高歇氏病類型。這里使用的名詞“結(jié)構(gòu)基因”指編碼基因產(chǎn)物的DNA；名詞“基因”包括調(diào)節(jié)序列(即啟動(dòng)子和增強(qiáng)子)、內(nèi)含子和外顯子。名詞“基因序列”指基因的編碼鏈序列。因此其互補(bǔ)序列是非編碼鏈序列。
任何受治療者中的一個(gè)或多個(gè)CRV可修復(fù)突變的位置用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)來(lái)鑒定。鐮刀形細(xì)胞病(SCD)的突變位置在編碼β-珠蛋白的第6個(gè)密碼子的密碼子中。
除了負(fù)責(zé)的突變位置是熟知的少數(shù)情況外，需要對(duì)受治療者的靶基因進(jìn)行測(cè)序，以便確定點(diǎn)突變的位置。例如已經(jīng)描述了珠蛋白基因的500多個(gè)點(diǎn)突變。(Bunn,H.F.&Forget.B.G.,1986,HEMOGLOBIN:MOLECULAR,GENETIC AND CLINICAL ASPECTS,W.B.Saunders,Phil.)。同樣，沒(méi)有一個(gè)突變引起高歇氏病(Hong,C.M.等，1990 DNA CellBiol 9:233-41)或β-地中海貧血病(Kazazian,H.H.,1990,Seminars inHematology 27:209-228)。本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員熟知鑒定特定點(diǎn)突變的技術(shù)。B．HSC的回收、培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)在熟知或發(fā)展的技術(shù)，從受治療者外周血或骨髓回收造血干細(xì)胞(HSC)。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的技術(shù)用單采血液成分術(shù)的方法很方便從受治療者獲得HSC。在一個(gè)實(shí)施方案中，受治療者提前3天給與粒細(xì)胞集落刺激因子且在細(xì)胞單采血液成分術(shù)的四天期間連續(xù)服用。單采血液成分術(shù)的單核細(xì)胞通過(guò)密度梯度離心或相當(dāng)?shù)倪^(guò)程分離，取出附著的細(xì)胞，用抗CD34的抗體分離HSC。以CellPro和Isolex商標(biāo)市售的柱子或它們的等價(jià)物適合實(shí)施本發(fā)明。
鐮刀形細(xì)胞病病人易受能通過(guò)給與G-CSF沉淀的鐮刀形細(xì)胞危象(crisis)的影響。因此，在單采血液成分術(shù)前危象(pre-apheresis crisis)開(kāi)始以前，受治療者應(yīng)該給予預(yù)防性交換輸血。
可以通過(guò)現(xiàn)在已知的或開(kāi)發(fā)用于用DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的任何技術(shù)，用CRV轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這些技術(shù)包括電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移和磷酸鈣沉淀。在一個(gè)實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)染用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移化合物如DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲銨甲磺酸鹽，Boehringer-Mannheim)或其等價(jià)物來(lái)完成。CRV的量對(duì)本發(fā)明的實(shí)施不是決定性的，用10nM/105個(gè)細(xì)胞就可以得到很好的結(jié)果?？梢允褂玫谋嚷适敲?05個(gè)細(xì)胞含500ng CRV的3μg DOTAP?？梢允褂孟旅鎸?shí)施例1-3中的轉(zhuǎn)染技術(shù)，改進(jìn)為在無(wú)血清培養(yǎng)基、補(bǔ)加了人類血清白蛋白或人血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，單采血液成分術(shù)的HSC分離后立即暴露于CRV和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移化合物的混合物中，溫育大約6-16小時(shí)使其轉(zhuǎn)染。然后洗滌轉(zhuǎn)染的細(xì)胞除去未吸收的脂質(zhì)體，根據(jù)骨髓移植領(lǐng)域熟知的技術(shù)低溫保存。低溫保存在含10％DMSD的培養(yǎng)基中完成，冷卻速率大約是3℃/分鐘。C．修復(fù)的HSC的移植現(xiàn)在用來(lái)在鐮刀形細(xì)胞病和β-地中海貧血病的病人中進(jìn)行HLA匹配的骨髓前體細(xì)胞異體轉(zhuǎn)移技術(shù)的任何技術(shù)，均可以用來(lái)將修復(fù)的HSC移植入受治療者中。在單采血液成分術(shù)獲得骨髓細(xì)胞后，該受治療者立即經(jīng)受細(xì)胞還原過(guò)程?？傮w需800-1200Rads劑量的照射。或者使用骨髓細(xì)胞毒性劑?？梢允褂檬苤委熣邷?zhǔn)備接受骨髓移植使用的制度?？梢允褂眠@樣的制度移植前四天使用白消安3.5mg/Kg/天和環(huán)磷酰胺50mg/Kg/天的組合物?；蛘?，如果宿主骨髓沒(méi)有完全脫離，就使用4.0mg/Kg/天白消安的劑量再加少量或不加環(huán)磷酰胺，以獲得顯著效果。修復(fù)的HSC可以通過(guò)外周靜脈輸注。輸注的修復(fù)CD34+細(xì)胞的總劑量可以是對(duì)重建病人骨髓有效的任何劑量。有效劑量通常是大約1-4×106個(gè)CD34+細(xì)胞(HSC)/Kg。
修復(fù)的HSC輸注后，前48小時(shí)靜脈給與重組10μg/k/天粒細(xì)胞集落刺激因子，直到嗜中性粒細(xì)胞絕對(duì)數(shù)連續(xù)三天達(dá)到1.5×109/L。地中海貧血病和鐮刀形細(xì)胞病的骨髓移植領(lǐng)域由下述文獻(xiàn)進(jìn)行說(shuō)明Giardini,C.等,1995,Ann.Rev.Medicine 46:319-30；Abboud,M.R.,American.J.of Ped.Hematol./Oncol.16:86-89；Storb,R.等，1991,Seminars in Hematology 28:235-39。D．嵌合修復(fù)載體的結(jié)構(gòu)嵌合修復(fù)載體(CRV)是3’,5’-連接的核酸，至多有一個(gè)3’末端和一個(gè)5’末端，大約有40-100個(gè)核苷酸。在可選擇的實(shí)施方案中，3’和5’末端可以共價(jià)連接。3’和5’末端沒(méi)有連接時(shí)，就說(shuō)CRV是有切口的。CRV含有未配對(duì)的核苷酸，形成1個(gè)或2個(gè)發(fā)夾轉(zhuǎn)折，所述轉(zhuǎn)折把CRV分成兩條鏈，使得第一條鏈的至少15個(gè)堿基與第二條鏈的堿基是Watson-Crick配對(duì)的。CRV的另一特征為存在許多至少三個(gè)相鄰堿基的區(qū)段，這些區(qū)段由2’-O或2’-烷基醚核糖核苷酸組成，這些核糖核苷酸與第二條鏈的脫氧核糖核苷酸是Watson-Crick配對(duì)的。
這里使用的名詞“區(qū)”指多核苷酸的一部分，它的序列有某些特定的來(lái)源，例如CRV有一個(gè)至少15個(gè)核苷酸的區(qū)具有人類β-珠蛋白基因片段的序列。區(qū)段是有結(jié)構(gòu)意義的CRV的一部分。給定的區(qū)段或給定區(qū)包含2’-脫氧核苷酸和核糖核苷酸。然而，“核糖核苷酸區(qū)段”或“2’-脫氧核糖核苷酸區(qū)段”只含核糖核苷酸和2’-脫氧核糖核苷酸。
圖1顯示了一個(gè)實(shí)施方案的CRV的結(jié)構(gòu)，該CRV具有區(qū)段(a)-(h)。圖解的目的是為了說(shuō)明CRV的3’末端在區(qū)段(a)的3’末端，5’末端顯示在區(qū)段(h)的5’末端，即切口位于(a)和(h)區(qū)段之間的邊界處。然而，如果有切口，切口的位置和相對(duì)于所述區(qū)段的CRV 3’和5’方向的定向不是關(guān)鍵的。按順序給所述區(qū)段標(biāo)上(a)-(h)。在圖1的實(shí)施方案中，第一區(qū)包含區(qū)段(c)、(d)和(e)，與由(a)區(qū)段組成的第二區(qū)是互補(bǔ)的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述區(qū)段的長(zhǎng)度和特性如下區(qū)段(a)為16-40個(gè)核苷酸，最好是20-30個(gè)核苷酸。區(qū)段(a)區(qū)的序列可以是包含要修復(fù)的點(diǎn)突變基因(靶基因)的正常(即野生型)等位基因編碼鏈的序列或非編碼鏈的序列。這里用的陳述一個(gè)區(qū)具有特定基因序列片段的序列，意思是它有源于該基因的編碼鏈序列，當(dāng)一個(gè)區(qū)段或區(qū)的序列與編碼鏈或非編碼鏈的片段序列相同時(shí)，就說(shuō)該區(qū)段或該區(qū)與所述基因是完全同源的。這里用的野生型等位基因的序列包括與受治療者疾病無(wú)關(guān)的靶基因的任何等位基因序列；因此，多態(tài)性基因有多個(gè)野生型序列。區(qū)段(a)序列的位置必須包括靶基因的含有要修復(fù)突變的部分。除非靶基因在靶細(xì)胞不能正常轉(zhuǎn)錄，否則，區(qū)段(a)的序列最好是野生型靶基因的編碼鏈序列。當(dāng)靶基因在靶細(xì)胞中不轉(zhuǎn)錄時(shí)，那么最好既不使用編碼鏈序列也不使用非編碼鏈序列。區(qū)段(a)的序列決定區(qū)段(c)-(e)的序列和結(jié)合的長(zhǎng)度，區(qū)段(c)-(e)必須與區(qū)段(a)互補(bǔ)。
區(qū)段(a)與區(qū)段(c)和(e)堿基配對(duì)的部分的核苷酸可以是已知的或?qū)⒀兄频娜魏?’-脫氧核糖核苷酸。稱為核糖核苷酸區(qū)段的區(qū)段(c)和(e)的核苷酸可以是任何2’-O-核糖核苷酸，即含有2’-羥基或烷基醚部分的核苷酸。這里用的名詞“核糖核苷酸”指任何具有2’-O或2’-烷基醚的核苷酸。在最佳實(shí)施方案中，稱為間插區(qū)段的區(qū)段(d)的核苷酸是2’-脫氧核糖核苷酸。區(qū)段(d)也可選擇由核糖核苷酸組成；如果這樣，區(qū)段(c)、(d)和(e)的界限就不確定。區(qū)段(b)和(f)-(h)可以是任何類型的核苷酸?；蛘呙撗鹾颂呛塑账峄蛘吆颂呛塑账衢g的連接部分可以是磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵或是這樣的任何其它連接基團(tuán)它們?cè)试S形成雙鏈體核酸，便于轉(zhuǎn)染入細(xì)胞并且不干擾同源重組。
在最佳實(shí)施方案中，區(qū)段(c)和(e)的序列與靶基因完全同源。在一最佳實(shí)施方案中，區(qū)段(d)的序列與靶基因的野生型等位基因完全同源；且是與一個(gè)或多個(gè)靶突變以外的靶基因同源。
區(qū)段(b)和(g)的長(zhǎng)度大約為4個(gè)核苷酸，且形成單鏈的發(fā)夾轉(zhuǎn)折，所述轉(zhuǎn)折使得區(qū)段(a)和(c)-(e)以及區(qū)段(f)和(h)形成Watson-Crick堿基對(duì)，即形成雙鏈體核酸。
區(qū)段(c)和(e)也稱第一和第二核糖核苷酸區(qū)段，在一最佳實(shí)施方案中，是由2’-O-甲基核糖核苷酸組成。在一最佳實(shí)施方案中，區(qū)段(c)和(e)的長(zhǎng)度各自為6-13個(gè)核苷酸。
區(qū)段(d)也稱為間插區(qū)段，在一個(gè)實(shí)施方案中，其長(zhǎng)度是4-20個(gè)核苷酸。區(qū)段(d)必須與靶基因包含要修復(fù)的點(diǎn)突變的片段同源，在這種情況下就說(shuō)所述間插區(qū)段跨越該突變。區(qū)段(d)最好包含點(diǎn)突變核苷酸的3’和5’端，在這種情況下就說(shuō)所述間插區(qū)段包括該點(diǎn)突變。如果靶基因包含有由少于15個(gè)核苷酸隔開(kāi)的兩個(gè)或兩個(gè)以上的點(diǎn)突變，那么每個(gè)點(diǎn)突變都可以用同一CRV修復(fù)。
區(qū)段(f)和(h)形成雙鏈體，使得在區(qū)段(a)和(h)間有切口的CRV 3’和5’末端并列。在一個(gè)實(shí)施方案中，3’末端和5’末端可以是脫磷酸的。在可選擇的實(shí)施方案中，3’和5’末端可以由磷酸二酯鍵或與其相當(dāng)?shù)逆I共價(jià)連接，使得CRV是閉合環(huán)狀的寡核苷酸?？梢詮拈]合環(huán)狀的CRV中可任選地缺失區(qū)段(f)和(h)。E．涉及非造血細(xì)胞的本發(fā)明的實(shí)施方案本發(fā)明可以用于修復(fù)突變或是把突變引入到可從受治療者體內(nèi)取出、培養(yǎng)并再植入到該受治療者中的任何類型細(xì)胞。肝細(xì)胞、尤其是肝補(bǔ)充(干)細(xì)胞的取出、培養(yǎng)和再植入技術(shù)描述于Naughton,G.B.和Sibanda,B.1994年4月28日的專利說(shuō)明書(shū)WO 94/08598中?？梢酝ㄟ^(guò)修復(fù)肝細(xì)胞的突變治療的遺傳疾病包括由LDL受體突變引起的家族性高膽甾醇血癥；α1-抗胰蛋白酶基因突變引起的肺氣腫；及由凝結(jié)因子Ⅷ和Ⅸ突變引起的血友病和克里斯馬斯氏病。F．本發(fā)明的具體實(shí)施方案在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)建CRV，使得所述CRV的序列包含人β-珠蛋白基因的正常等位基因序列的至少15個(gè)核苷酸片段的序列。人β-珠蛋白最常見(jiàn)等位基因的序列參見(jiàn)Lawn等1980,Cell 21:647的圖2，該序列通過(guò)引用結(jié)合到本文中。包含β-珠蛋白片段序列的CRV可用來(lái)修復(fù)引起鐮刀形細(xì)胞病、HbC和β-地中海貧血病的突變。
適于修復(fù)HbC和鐮刀形細(xì)胞病突變的實(shí)施方案包含下列序列中的至少15個(gè)核苷酸片段的序列5’-CAC CTG ACT CCT GAG GAGAAG TCT GCC-3’(SEQ ID NO:1)。適于修復(fù)HbE突變的實(shí)施方案包含下列序列中至少15個(gè)核苷酸片段的序列5’-GAA GTT GGT GGTGAG GCC CTG GGC AGG-3’(SEQ ID NO:2)。在HbC、HbS和HbE中突變的核苷酸下劃?rùn)M線。
在本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)建CRV使得所述CRV序列包含人葡糖腦苷酯酶基因正常等位基因序列的至少15個(gè)核苷酸片段的序列。葡糖腦苷酯酶最常見(jiàn)的等位基因序列見(jiàn)Tsuji等，1986,J.Biol.Chem 261:50-53的圖2，該序列通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
下面的表Ⅰ包括在高歇氏病和β-地中海貧血病中發(fā)現(xiàn)的更占優(yōu)勢(shì)的突變、所述突變的位置和用于CRV中來(lái)修復(fù)所述突變的野生型等位基因片序列的一覽表。表Ⅰ的序列是以常規(guī)的5’→3’方向給出的編碼鏈的序列。所述突變的大約位置用下劃線核苷酸表明。
Ⅵ．實(shí)施例實(shí)施例1．應(yīng)用CRV修復(fù)附加型堿性磷酸酶獲得了包含人類肝/骨/腎堿性磷酸酶cDNA的表達(dá)質(zhì)粒，所述cDNA受SV40早期啟動(dòng)子控制，該質(zhì)粒命名為pHAP。獲得了該cDNA突變形式的相同質(zhì)粒并命名為p711。圖2A圖示了用于pHAP和p711序列相互轉(zhuǎn)換的CRV的設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)CRV Ch1以修復(fù)第711位的錯(cuò)義突變。野生型序列中對(duì)應(yīng)于該突變位點(diǎn)具有一個(gè)G殘基。Ch2的設(shè)計(jì)和Ch1相同，只是對(duì)應(yīng)于位置711由A取代G。Ch3和Ch1的序列相同，只是核糖核苷酸區(qū)段的序列是堿性磷酸基因編碼鏈的序列，而不是非編碼鏈的序列。寡核苷酸Dh1包含與Ch1相同的序列，只是僅含有2’-脫氧核苷酸。
在圖2B中p711的圖解表明堿性磷酸酶cDNA編碼區(qū)第711位的單一點(diǎn)突變A、SV40的早期啟動(dòng)子(PE)、SV40復(fù)制起點(diǎn)(ori)、多腺苷酸加入位點(diǎn)和用于剪接的小t內(nèi)含子序列(SV40 polyA)。圖2B中的虛線框表明pBR322編碼復(fù)制起點(diǎn)和β-內(nèi)酰胺酶(AmpR)基因的序列。用p711轉(zhuǎn)染CH細(xì)胞，6小時(shí)后，將CRV、Ch1引入預(yù)先轉(zhuǎn)染了p711的CHO細(xì)胞。兩種轉(zhuǎn)染都用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法進(jìn)行。轉(zhuǎn)化成野生型表型的程度通過(guò)分光光度測(cè)定、組織化學(xué)染色和Hirt DNA分析在生物化學(xué)和DNA序列兩個(gè)水平上監(jiān)測(cè)。材料和方法寡核苷酸的合成和純化在ABI 394 DNA/RNA合成儀上，用1000寬孔CPG在0.2μmole范圍合成所述嵌合寡核苷酸。DNA亞膦酰胺(Applied Biosystems,Foster City,CA)的外向環(huán)氨基用苯甲酰保護(hù)腺嘌呤和胞嘧啶，用異丁酰保護(hù)鳥(niǎo)嘌呤。2’-O-甲基RNA亞磷酰胺(GlenResearch,Sterllng,VA)用苯氧乙?；Ｗo(hù)腺嘌呤，用二甲基甲脒保護(hù)鳥(niǎo)嘌呤，用異丁?；Ｗo(hù)胞嘧啶。合成完成后，通過(guò)在乙醇∶濃氫氧化銨(1∶3)中于55℃加熱20小時(shí)去掉堿基保護(hù)基。粗品寡核苷酸與7M尿素和10％甘油混合，加熱到70℃，加樣于含7M尿素的聚丙烯酰胺凝膠上。凝膠電泳后，DNA條帶用紫外照射(shadowing)顯示，從膠上切下條帶、壓碎并在TE緩沖液(10mM Tris-Hcl和1mM EDTA,pH7.5)中邊震蕩邊洗脫過(guò)夜。含有凝膠塊的洗脫液用0.45μm的離心濾器(spinfilter)(Millipore,Bedford,MA)離心，并用乙醇沉淀。樣品用G-25離心柱(spin column)(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)進(jìn)一步脫鹽，發(fā)現(xiàn)95％以上純化的寡核苷酸是全長(zhǎng)的。
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和組織化學(xué)染色在含10％FBS(B.R.L.,Bethesda,MD)的DMEM中保持CHO細(xì)胞。通過(guò)加入每孔中加入的1ml OPTIMEM中的10μg脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑，進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。寡核苷酸轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，測(cè)定堿性磷酸酶活性。對(duì)于組織化學(xué)染色，細(xì)胞用0.15M NaCl洗滌三次，用染色液溫育20分鐘，然后用50％乙醇固定。染色液組成為溶于50ml水中的2mg Fast Violet、2ml Naphtol AS-MX堿性磷酸鹽溶液(Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)。
堿性磷酸活性的分光光度測(cè)定通過(guò)將1μg質(zhì)粒p711與含1μg脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑的100αl的OPTIMEN(B.R.L,Betbesda,MD)加入1×104個(gè)CHO細(xì)胞中，以三份在96孔板上進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。6小時(shí)后，將不同量的Ch1或其它CRV與含1μg脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑的100μl OPTIMEM混合，再加到每個(gè)孔中。18小時(shí)后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入含10％FBS的200μl DMEM。嵌合寡核苷酸轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，測(cè)定堿性磷酸活性。用Elisa Amplication System(B.R.L,Betbesda,MD)進(jìn)行分光光度測(cè)定。細(xì)胞用0.15M NaCl洗滌三次，于100μl NP40緩沖液中裂解，所述NP40緩沖液含10mM NaCl、0.5％NP40、3mM MgCl2和10mMpH7.5的Tris-HCl。一部分細(xì)胞裂解液(20μl)與50μl Elisa底物和50μlElisa放大劑(B.R.L,Betbesda,MD)溫育。用放大劑溫育5分鐘后，加入50μl 0.3M H2SO4停止反應(yīng)。反應(yīng)的程度在檢測(cè)方法的線性范圍內(nèi)進(jìn)行。在490nm波長(zhǎng)下，用Elisa讀板儀(B.R.L,Betbesda,MD)讀出吸收值。
Hirt DNA分離、菌落雜交和PCR片段的直接DNA測(cè)序用嵌合寡核苷酸轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收獲細(xì)胞，以通過(guò)改進(jìn)的堿裂解法分離載體DNA。通過(guò)胰酶消化、洗滌、再懸浮于含50mM Tris-HCl,pH 8.0、10mM EDTA的10μl溶液和含5mM Tris-HCl,pH 8.0、10mM EDTA和10μg/ml的RNA酶A的110μl溶液中，使細(xì)胞分離。加入等體積的細(xì)胞裂解液(0.2N NaOH和1％SDS)，緊接著再加入100μl中和溶液(3MKAc,pH 5.5)。室溫溫育10分鐘后，以10,000rpm離心10分鐘。上清液用等體積的苯酚-氯仿抽提，用乙醇沉淀。將Hirt DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α細(xì)胞(B.R.L,Betbesda,MD)中。就設(shè)計(jì)的每個(gè)探針特異性雜交方面篩選Hirt DNA菌落，以辨別點(diǎn)突變。讓菌落在氨芐青霉素平板上生長(zhǎng)，以雙份影印到硝酸纖維素濾紙上，經(jīng)處理用于菌落雜交。所述印跡與P32-末端標(biāo)記的寡核苷酸探針711-A(5’-CCGCCTACACCCACTCG-3’(SEQ ID NO:3))或711-G(5’-CCGCCTACGCCCACTCG-3’(SEQ ID NO:4))于37℃在含5×Denhardts、1％SDS、2×SSC和100μg/ml變性鮭精DNA的溶液中雜交。印跡于52℃在TMAC溶液(3.0M氯化四甲銨/50mM Tris-HCl,pH 8.0、2mM EDTA和0.1％SDS)中洗滌。使用Qiagen小量制備試劑盒(Chatworth,CA)，從顯示與711-G或711-A雜交的20個(gè)菌落制備質(zhì)粒DNA。每個(gè)質(zhì)粒的第711位兩側(cè)的幾百個(gè)堿基通過(guò)自動(dòng)測(cè)序(ABI 373A,Applied Biosystem,Foster City,CA)從兩個(gè)方向測(cè)序。采用相應(yīng)于所述堿性磷酸酶cDNA第711位兩側(cè)的630-650位和803-822位的兩個(gè)引物(5’-CAATGTCCCTGATGTTATGCA-3’(SEQ ID NO:5)和5’-CGCTGGGCCAAGGACGCT-3’(SEQ ID NO:6)，用VentR聚合酶(New England Biolabs,Beverly,MA)產(chǎn)生190個(gè)bp的PCR擴(kuò)增片段。將所述擴(kuò)增片段凝膠純化，然后進(jìn)行自動(dòng)DNA測(cè)序(ABI 373A,Applied Biosystem,Foster City,CA)。
寡核苷酸穩(wěn)定性的檢測(cè)將10ng32P-末端標(biāo)記的寡核苷酸與500ng未標(biāo)記寡核酸混合，并如上進(jìn)行轉(zhuǎn)染。為降低寡核苷酸的非特定結(jié)合，細(xì)胞用PBS和含1M NaCl/HAc pH2.5的溶液徹底洗滌。在含10mM Tris-HCl pH7.5、0.5mM MgCl2和0.5％Trito X-100的溶液中裂解細(xì)胞，制備粗裂解液，然后用苯酚-氯仿抽提。裂解液用含7M尿素的15％聚丙烯酰胺凝分析，接著進(jìn)行放射自顯影。在含10％FBS的DMEM中溫育的寡核苷酸用同樣方式處理和分析。
在我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，將各種嵌合寡核苷酸引入預(yù)先用p711轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。轉(zhuǎn)化成野生型表型的程度用組織化學(xué)染色監(jiān)測(cè)；紅色顏料沉積在細(xì)胞上表示有活性酶。當(dāng)含突變基因的細(xì)胞用11nM Ch1轉(zhuǎn)染時(shí)，紅色細(xì)胞出現(xiàn)的頻率平均來(lái)說(shuō)幾乎占受轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的1/3。相反，Ch2和Dh1都不引起酶活性增加。當(dāng)細(xì)胞用Ch3轉(zhuǎn)染時(shí)，觀察到轉(zhuǎn)化成野生型的頻率低。通過(guò)野生型質(zhì)粒pHAP的表達(dá)測(cè)得的轉(zhuǎn)染率估計(jì)是30％。
酶活性也用上述的分光光度法測(cè)定。p711質(zhì)粒存在時(shí)，觀察到高至17nM Ch1時(shí)堿性磷酸酶活性的劑量依賴性增加。用17nM Ch1處理的細(xì)胞，其酶活性接近用野生型質(zhì)粒pHAP轉(zhuǎn)染細(xì)胞酶活性的60％。這種增加是序列特異性的，因?yàn)榈攘康腃h1并沒(méi)有影響用pHAP轉(zhuǎn)染細(xì)胞的酶活性。此外，與序列Ch1只差一個(gè)堿基對(duì)的Ch2沒(méi)有引起酶活性增加。含有與Ch1相同的序列、但不含核糖核苷酸區(qū)段的寡核苷酸Dh1顯示酶活性沒(méi)有增加。因此，堿性磷酸酶酶活性分光光度法測(cè)定與組織化學(xué)染色法結(jié)果一致。
用嵌合寡核苷酸校正靶DNA序列的點(diǎn)突變?yōu)榱俗C實(shí)DNA序列水平的變化，在嵌合寡核苷轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，用改進(jìn)堿裂解法(Wang,G.等，1995,Mol Cell Biol.15,1759)，從用p711和各種寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞制備Hirt抽提物。Hirt DNA有效地轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，從106個(gè)受轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞產(chǎn)生104個(gè)AmpR茵菌。在與設(shè)計(jì)辨別點(diǎn)突變(A)和野生型(G)序列的探針特異性雜交方面篩選DH5α轉(zhuǎn)化體，所述點(diǎn)突變序列和野生型序列分別相應(yīng)于突變cDNA和正常cDNA的第703-719位，Weiss,MJ.,2988,Proc.Natl Acad.Sci 85:7666。從至少兩次獨(dú)立的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的多個(gè)平板的500多個(gè)茵菌，通過(guò)與711-G探針或711-A探針雜交的菌落的平均數(shù)測(cè)定校正率(表Ⅰ)。通過(guò)獨(dú)立合成制備的兩批Ch1觀察到相近的轉(zhuǎn)化率。從用p711和Ch1轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備的Hirt DNA產(chǎn)生的近70％茵菌與711A探針雜交，而30％的菌落顯示與711-G探針雜交(表Ⅰ)。因此，在11nM Ch1下可重復(fù)觀察到30％的校正率。雜交是特異的，在兩種群體之間沒(méi)有觀察到交叉雜交。應(yīng)用相應(yīng)于所述堿性磷酸酶cDNA第711位兩側(cè)的第630-650位和第803-822位的兩個(gè)引物5’-CAATGTCCCTGATGTTATGCA-3’(SEQ ID NO:7)和5’-CGCTGG GCCAAGGACGCT-3’(SEQ ID NO:8)，從兩個(gè)方向用這些菌落中的20個(gè)菌落制備的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序。在每種情況下均證實(shí)了序列轉(zhuǎn)化，而且在靶核苷酸周圍的數(shù)百個(gè)堿基內(nèi)沒(méi)有觀察到其它序列改變。來(lái)自從Ch2或Dh1處理細(xì)胞制備的Hirt提取物的所有菌落只與711-A探針雜交(表Ⅰ)。來(lái)自Ch3的Hirt提取物的某些菌落與野生型探針雜交，但其程度比Ch1小很多(表Ⅱ)。這些結(jié)果證實(shí)，顯示的不同堿性磷酸酶活性是由于在DNA序列水平上校正點(diǎn)突變(A→G)產(chǎn)生的。
表Ⅱ．從p711質(zhì)粒和11nM的各種寡核苷酸雙重轉(zhuǎn)染制備的Hirt提取物得到的轉(zhuǎn)化體的雜交模式
用于繁殖質(zhì)粒DNA的RecA缺陷型大腸桿菌菌株能夠用附加型DNA(21)修復(fù)和進(jìn)行同源配對(duì)。為了排除序列轉(zhuǎn)化是由大腸桿菌介導(dǎo)的可能性，進(jìn)行Hirt DNA PCR擴(kuò)增片段的直接DNA測(cè)序。通過(guò)VentR聚合酶的作用，用第711位兩側(cè)的兩個(gè)引物產(chǎn)生190bp的PCR擴(kuò)增片段。結(jié)果表明，當(dāng)從p711和Ch1的組合物的轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備Hirt DNA樣品時(shí)，第711位是A(70％)與G(30％)的混合物。相反，當(dāng)從寡核苷酸Dh1制備Hirt DNA時(shí)，在711位沒(méi)有觀察到混合序列。這些結(jié)果清楚地證實(shí)了，用嵌合寡核苷酸進(jìn)行的序列校正在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)生。
嵌合寡核苷酸的穩(wěn)定性測(cè)定胞內(nèi)和含10％FBS的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中所述嵌合寡核苷酸的穩(wěn)定性。將10ng放射性標(biāo)記的寡核苷酸Ch1加入進(jìn)行組織化學(xué)染色和Hirt DNA分析的相同轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中(參見(jiàn)參考材料和方法)。所述嵌合寡核苷酸極其穩(wěn)定。當(dāng)嵌合寡核苷酸于含10％FBS的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中溫育時(shí)，溫育24小時(shí)后，沒(méi)有觀察到可檢測(cè)的降解。此外，在同樣的溫育時(shí)間期間，從細(xì)胞分離的寡核苷酸也沒(méi)有顯示任何降解。當(dāng)溫育24小時(shí)后從細(xì)胞分離時(shí)，只檢測(cè)到嵌合寡核苷酸的單體。因此，在這里用的實(shí)驗(yàn)條件下，沒(méi)有觀察到嵌合寡核苷酸的首尾連接(Litigation)。實(shí)施例2．用CRV修復(fù)EB-轉(zhuǎn)化細(xì)胞的β-珠蛋白基因設(shè)計(jì)了用于修復(fù)在鐮刀形細(xì)胞病β-珠蛋白基因中發(fā)現(xiàn)的突變的CRV，即圖3的SC1。該分子由含有兩個(gè)間插塊的DNA殘基組成，所述間插塊為5個(gè)DNA的短序列側(cè)翼的10個(gè)2’-O-甲基RNA殘基組成。當(dāng)該分子折疊為雙鏈體構(gòu)象時(shí)，一條鏈只含DNA殘基，而另一條鍵含RNA/DNA塊。這樣，內(nèi)部序列和βS-珠蛋白序列中跨越βS突變位點(diǎn)的25個(gè)殘基序列上的序列互補(bǔ)，粗體并用星號(hào)標(biāo)明的單堿基(T)除外。側(cè)翼為5個(gè)DNA殘基的RNA的中心大約位于βS編碼序列中突變T殘基。除了標(biāo)示粗體和星號(hào)的堿基(A)外，用同樣方式設(shè)計(jì)了對(duì)照嵌合寡核苷酸(SC2)。βA、βS和密切相關(guān)的δ-珠蛋白基因的基因組序列也顯示在圖3A中，βS突變的特定位點(diǎn)用粗體印刷。
如下制備類淋巴母細(xì)胞細(xì)胞。從鐮刀形細(xì)胞病病人和一個(gè)既無(wú)該病病史也無(wú)癥狀的調(diào)查者的一次性臨床材料獲得肝素處理的血液。通過(guò)在Ficoll中進(jìn)行密度梯度離心，從血液(≈8ml)獲得單核細(xì)胞，并用在狨猴細(xì)胞系B95-8(Coriell Intitute for Medical Research#GM07404D)中繁殖的EB病毒感染。在T25燒瓶中，在10ml補(bǔ)加了20％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中加入0.1mg的白細(xì)胞凝集素PHA-L進(jìn)行感染。從第5天開(kāi)始，每周2次給培養(yǎng)物送養(yǎng)料，一旦在第21天時(shí)有60-70％的細(xì)胞保持存活就認(rèn)為建立了培養(yǎng)物。βA和βS類淋巴母細(xì)胞在含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中保持。
如下把所述CRV引入到βS等位基因純合的上述類淋巴母細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)前一天，在24孔組織培養(yǎng)板上，每孔1ml培養(yǎng)基接種細(xì)胞1×105個(gè)細(xì)胞/ml。通過(guò)將嵌合寡核苷酸與含3mg DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲銨甲磺酸鹽，Boehringer-Mannheim)的20ml 20mM HEPES,pH 7.3混合，于室溫溫育15分鐘，然后加到培養(yǎng)的細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。6小時(shí)后，離心收獲細(xì)胞，洗滌，并制備用于按E.S.Kawasaki的方法(PCR Protocols，編輯M.A.Innis,D.H.Gelford,J.J.Sninsky和T.J.White，第146-152頁(yè)，Acadamic Press,1990)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
利用熟知的由βS突變引起的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性估價(jià)單堿基突變的校正，參見(jiàn)R.F.Greeves等，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.78:5081；J.C.Chang和Y.W.Kan,1982,N.Eng.J.Med.307:30；S.H.Orkin等，出處同上，第32頁(yè)；J.T.Wilson等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.79:3628)。βS等位基因中T→A的顛換導(dǎo)致Bsu36I限制酶切位點(diǎn)(CCTGAGG)的喪失。因此，Bsu36I酶切的基因組DNA Southern雜交分析可以檢測(cè)βS等位基因。正常存在的β-珠蛋白基因的1.2kbp Bsu36IDNA片段在βS等位基因中不存在，并由1.4kpb的診斷片段取代。當(dāng)從純合的βS類淋巴母細(xì)胞中回收的基因組DNA用這種方法分析時(shí)，觀察到預(yù)期的1.4kbp。然而，在用SC1 CRV轉(zhuǎn)染細(xì)胞的DNA中，觀察到兩個(gè)片段。除了1.4kbp片段外還存在1.2kbp片段，表明βS等位基因的部分校正是以劑量依賴性方式進(jìn)行的。
為了快速、靈敏地測(cè)定校正率，我們采用基于PCR的RFLP分析。為了分析β-珠蛋白基因序列，使用引物BG02(5’-TCCTAAGCCAGTGCCAGAAGA-3’(SEQ ID NO:9))和BG05(5’-CTATTGGTCTCCTTAAACCTG-3’(SEQ ID NO:10))和擴(kuò)增Taq聚合酶(BoehringerMannheim)，從粗細(xì)胞裂解液擴(kuò)增制備345bp的PCR片段。為了分析δ-珠蛋白基因，在擴(kuò)增反應(yīng)中用相同的細(xì)胞提取物和引物DG06(5’-CTCACAAACTAATGAAACCCTGC-3’(SEQ ID NO:11))和DG07(5’-GAAAACAGCCCAAGGGACAG-3’(SEQ ID NO:12))，產(chǎn)生一個(gè)335bp的片段。凝膠用SYBRTM綠(FMC Bioproducts)染色，而熒光強(qiáng)度用Molecular Dynamics的熒光成象器來(lái)定量。用ABI 373A測(cè)序儀在兩個(gè)方向上進(jìn)行DNA測(cè)序。
設(shè)計(jì)上面的引物，在PCR擴(kuò)增基因組DNA后以產(chǎn)生一個(gè)跨越βS突變位點(diǎn)的345個(gè)bp片段。正常細(xì)胞的片段包含Bsu36I識(shí)別序列，并產(chǎn)生228bp和117bp的片段，而來(lái)自βSDNA的DNA包含序列CCTGTGG，且難以酶切。分析指出從SC1處理的βS細(xì)胞擴(kuò)增的345bpDNA片段用Bsu36I部分酶切，表明了突變的校正只是在一些染色體上發(fā)生，并不是在所有染色體上發(fā)生。電泳分離后并用熒光染料SYBRTM綠染色后，通過(guò)比較三個(gè)DNA片段的相對(duì)強(qiáng)度獲得定量測(cè)量。用激光熒光成象器使著色帶成象，并計(jì)算它們的相對(duì)水平。通過(guò)用熒光成象器掃描cyber green染色的瓊脂糖凝膠，定量測(cè)定轉(zhuǎn)化率。劑量為2.5-25.0pM SC1/105個(gè)βS類淋巴母細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明，βS→βA的轉(zhuǎn)化率大約為40-50％(圖4A)。
鐮刀形突變通過(guò)CRV SC2的引入頻率用上面提出的方法測(cè)定。分析表明，在輸入嵌合分子的最高水平25nM下，校正水平超過(guò)50％，但是即使在2.5nM下，觀察到30％的β-蛋白基因也得到校正(圖4B)。
PCR擴(kuò)增的345bp片段的直接測(cè)序證實(shí)在編碼鏈中T→A的改變。在來(lái)自βS的DNA樣品中，細(xì)胞用高于12nM/105個(gè)細(xì)胞的較高濃度的嵌合分子SC1轉(zhuǎn)染。序列分析顯示了在βS突變位點(diǎn)上A和T殘基幾乎相等的混合物。用SC1處理時(shí)，未處理的βS細(xì)胞的DNA在該位點(diǎn)只含有T，而βA細(xì)胞的DNA只含A。用對(duì)照CRV SC2轉(zhuǎn)染的βS細(xì)胞的處理沒(méi)有引起β-珠蛋白基因序列的改變。然而，正如該序列在預(yù)期的序列位點(diǎn)上為T(mén)和A殘基的混合物所證明，SC2轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞的DNA部分轉(zhuǎn)化成βS突變序列。
通過(guò)相關(guān)δ-珠蛋白基因的測(cè)序估價(jià)CRV作用的特異性，所述相關(guān)δ-珠蛋白基因90％以上與β-珠蛋白基因同源。β和δ珠蛋白基因在SC15bp DNA的核心靶區(qū)上相同。在圖3中在兩個(gè)不同的單堿基下劃線。為了確定SC2是否改變了δ-珠蛋白基因，如上進(jìn)行了序列分析。結(jié)果顯示與觀察到的由SC2在βA-珠蛋白序列中指導(dǎo)的改變相反，SC2CRV沒(méi)有在δ-珠蛋白基因中引入改變。實(shí)施例3．CRV修復(fù)HSC的β-珠蛋白基因的實(shí)驗(yàn)用法材料和方法干細(xì)胞分離和轉(zhuǎn)染連續(xù)5天一天兩次皮下給與正常志愿者G-CSF 300μg。在G-CSF治療的第四天和第五天，他們利用COBE波譜除去儀(spectra pheresis machine)經(jīng)過(guò)4小時(shí)干細(xì)胞單采血液成分術(shù)。通過(guò)在Ficoll-Hypaqne(密度1.077g/ml,Pharmacia)上的密度梯度離心(2000rpm,10分鐘，室溫)制備單核細(xì)胞。粘附到塑料上后除去大部分單核細(xì)胞(30分鐘，37℃,5％CO2，含10％FBS的RPMI)。通過(guò)旋轉(zhuǎn)以取出松散粘附在塑料上的細(xì)胞，收獲細(xì)胞，用PBS洗滌三次。該群體在含生物素化鼠抗CD34抗體的PBS/1％BSA中于室溫溫育25分鐘，濃度為100×106個(gè)細(xì)胞/ml。使抗體處理過(guò)的細(xì)胞通過(guò)抗生物素蛋白柱，收集通過(guò)柱子的細(xì)胞進(jìn)行分析。隨后用PBS洗滌柱子，粘附在柱子上的CD34+細(xì)胞通過(guò)擠壓柱子回收。最后的純度通過(guò)FACS來(lái)估價(jià)。
將細(xì)胞再懸浮于含10％熱失活FCS的RPMI中，將1×105個(gè)細(xì)胞/ml鋪平板于24孔板中，每孔接受1×105個(gè)細(xì)胞。將所示量的嵌合寡核苷酸與20μl 20mM pH7.3 HEPES中的3μg DOTAP混合?；旌衔锉?5分鐘，然后加到細(xì)胞中。于37℃5％CO2下培養(yǎng)16小時(shí)后，收獲細(xì)胞，將其沉淀，用PBS洗滌，并用裂解緩沖液裂解。
PCR擴(kuò)增和分析．分別用PCD2(5’-TCCTAAGCCAGTGCCAGAAGA-3’(SEQ ID NO:13))和PCO5(5’-CT ATTGGTCTCCTTAAACCTG-3’(SEQ ID NO:14))和擴(kuò)增Taq聚合酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)在50μl的反應(yīng)中，于94℃30秒、于52.5℃30秒、于72℃30秒進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，PCR擴(kuò)增基因組DNA，產(chǎn)生一個(gè)345bp的片段。對(duì)于對(duì)δ基因座，5’引物是5’-CTCAC AAACCTAATGAAACCCTGC-3’(SEQ ID NO:15),3’引物為5’-GAA AACAGCCCAAGGGACAG-3’(SEQ ID NO:16)，于94℃30秒、于59℃30秒、于72℃30秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。
PCR產(chǎn)物用DdeI或BSU36I限制性核酸內(nèi)切酶(New EnglandBiolabs,Beverly,MA)消化，加樣到1.2％瓊脂糖凝膠(1×TBS)進(jìn)行電泳。該凝膠于含1∶20,000 cyber green strain(FMC,Rockland,ME)的200ml 1×TBE中暗處染色20分鐘，通過(guò)熒光成象器(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)定量。PCR產(chǎn)物通過(guò)Qiaquick PCR純化離心柱(purification spin colume)(Qiagen,Chatsworth,CA)在水中離心，真空干燥至5μl，并且用260nm的O.D分光測(cè)定其濃度。DNA樣品(30μg)通過(guò)自動(dòng)Applied Biosystems Model 373A DNA測(cè)序系統(tǒng)(AppliedBiosystems,Foster Cify,CA)直接測(cè)序。
寡核苷酸的合成和純化采用1000寬孔CPG，在ABI 394DNA/RNA合成儀上在0.2μmol范圍合成嵌合寡核苷酸。在這種構(gòu)成物中，DNA亞磷酰胺(Applied Biosystem)的外向環(huán)氨基用苯甲?；Ｗo(hù)腺嘌呤和胞嘧啶，用異丁?；Ｗo(hù)鳥(niǎo)嘌呤。2’-甲氧基RNA亞磷酰胺(Glen Research,Sterling.VA)用苯氧乙酰基保護(hù)腺嘌呤，用二甲基甲脒保護(hù)鳥(niǎo)嘌呤，用異丁?；Ｗo(hù)胞嘧啶。合成后，通過(guò)在乙醇∶濃氫氧化銨(1∶3)中于55℃加熱20小時(shí)除去堿基保護(hù)基。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳純化粗品寡核苷酸，該樣品與7M脲素和10％甘油混合，加熱到70℃，然后加到含7M脲素的聚丙烯酰胺凝膠上。凝膠電泳后，通過(guò)UV照射使DNA條帶可見(jiàn)，從該凝膠上切下DNA條帶，壓碎并在TE緩沖液(10mM Tris-HCl和1mM EDTA pH7.5)中振蕩過(guò)夜洗脫。含凝膠碎片的洗脫液通過(guò)0.45μm離心濾器(Millipore,Bedfod,MA)離心，并用乙醇沉淀。樣品于G-25離心柱(Boehringer Mannheim)進(jìn)一步脫鹽，并且發(fā)現(xiàn)95％以上的純化寡核苷酸是全長(zhǎng)的。結(jié)果分離的CD34+富集群體首先用于寡核苷酸吸收實(shí)驗(yàn)。除了放射性標(biāo)記置于該寡核苷酸的5’末端外，在上述條件下將嵌合分子SC2與脂質(zhì)體制劑DOTAP混合。將增加量的標(biāo)記的和未標(biāo)記的寡核苷酸與所述脂質(zhì)體溫育15分鐘。然后該混合物與細(xì)胞溫育6小時(shí)后，細(xì)胞用PBS徹底洗脫，以降低非特異性結(jié)合。然后離心細(xì)胞，沉淀部分用0.2M甘油(pH4.5)洗滌，以除去殘留的非特異性結(jié)合。用閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定細(xì)胞沉淀中的放射活性。細(xì)胞以劑量依賴性方式吸收所述嵌合寡核苷酸。因?yàn)槲覀兊膶?shí)驗(yàn)策略集中在nM濃度上，所以我們不能將曲線延伸超過(guò)25nM?；诜派湫詷?biāo)記的嵌合寡核苷酸的比活，且假定每個(gè)細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化有同樣的接受能力，我們估計(jì)至大約50％的CD34+細(xì)胞群體受該底物轉(zhuǎn)染。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，背景水平可通過(guò)放射性標(biāo)記的嵌合分子在沒(méi)有DOTAP時(shí)與細(xì)胞混合來(lái)進(jìn)行估價(jià)，并且該水平從不會(huì)超過(guò)0.05％。
用不同量的SC2和3μg/ml的DOTAP轉(zhuǎn)染含有βA基因型的兩個(gè)等位基因的CD34+富集細(xì)胞群體。如上述轉(zhuǎn)染16小時(shí)后，分離基因組DNA,βA→βS的轉(zhuǎn)化程度通過(guò)限制性酶多態(tài)性和直接DNA測(cè)序來(lái)測(cè)定。從105個(gè)細(xì)胞分離的基因DNA，用兩個(gè)引物PCO2和PCO5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生一個(gè)345bp的片段。用限制性內(nèi)切酶DdeI酶切βA特異性序列，產(chǎn)生分別為192bp、108bp和45bp的三個(gè)片段，而βS序列只酶切一次，產(chǎn)生300bp和45bp的片段。觀察到未酶切的300bp片段的水平隨SC2濃度的增大而增加，表明βA→βS基因型的轉(zhuǎn)化，參見(jiàn)圖5。在相對(duì)低濃度(600ng=30nM×1ml)的嵌合寡核苷酸下觀察到50％的轉(zhuǎn)化率。相反，在用SC1處理的細(xì)胞中沒(méi)有觀察到轉(zhuǎn)化，SC1為與βA位點(diǎn)配對(duì)的完全互補(bǔ)的嵌合分子。
為了證明在正常細(xì)胞中DNA序列的改變(A→T)，進(jìn)行345bp片段的直接DNA測(cè)序。如上述用23nM SC2轉(zhuǎn)染含純合βA等位基因的CD34+群體。分離基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)樣品進(jìn)行自動(dòng)DNA測(cè)序。單獨(dú)的βADNA序列和SC1處理的βADNA序列都包含T。相反，用SC2處理的βA細(xì)胞的DNA序列在預(yù)期位置上顯示A→T的劑量依賴性轉(zhuǎn)化。SC2 CRV包含一個(gè)與β-珠蛋白基因編碼鏈相同的(a)區(qū)段。命名為SC5的CRV包含一個(gè)與β-珠蛋白基因的非編碼鏈片段相同的(a)區(qū)段。我們用SC2和SC5重復(fù)上述的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖5，表明盡管沒(méi)有SC2活性強(qiáng)，但SC5是有活性的，在低于20nM下似乎無(wú)活性。
來(lái)自已經(jīng)用SC2處理的βA細(xì)胞的基因組DNA用兩個(gè)δ-珠蛋白特異引物PCO6和PCO7進(jìn)行PCR擴(kuò)增。只發(fā)現(xiàn)了野生型δ-珠蛋白序列，這證明了SC2 CRV對(duì)β-珠蛋白是特異性的。
表Ⅰ
該信息摘自The Metabolie and Molecular Bases of Inherited Disease,Chartes R.Seriver編輯(John B.Stanbury,James M.Wyngaarden,Donald S.Frederickson，顧問(wèn)編輯)第七版，McGraw-Hill,Health Profesions Division，紐約，1995.
<p>序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人(A)收信人Thomas Jeffrson University(ⅱ)發(fā)明名稱治療突變引起的疾病的方法和化合物(ⅲ)序列數(shù)100(ⅳ)通信地址(A)收信人Pennie &amp; Edmonds(B)街道1155 Avenue of the Americas(C)城市紐約(D)州紐約(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼10036-2711(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本1.30(ⅵ)當(dāng)前中請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朠CT/US97/(B)提交日期1997年5月1日(C)分類(ⅶ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)提交日期(ⅷ)代理律師/代理人資料(A)姓名Friebel,Thomas E(B)注冊(cè)號(hào)29,258(C)參考/檔案號(hào)7991-011-228(ⅸ)電訊資料
(A)電話(212)790-9090(B)傳真(212)869-9741/8864(C)電報(bào)66141 PENNIE(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CACCTGACTC CTGAGGAGAA GTCTGCC27(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:GAAGTTGGTG GTGAGGCCCT GGGCAGG27(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:CCGCCTACAC CCACTCG 17(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:CCGCCTACGC CCACTCG 17(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:CAATGTCCCT GATGTTATGC A 21(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:CGCTGGGCCA AGGACGCT 18(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:CAATGTCCCT GATGTTATGC A 21(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:CGCTGGGCCA AGGACGCT 18(2)SEQ ID NO:9的信息
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:TCCTAAGCCA GTGCCAGAAG A 21(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:CTATTGGTCT CCTTAAACCT G 21(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:CTCACAAACT AATGAAACCC TGC 23(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:GAAAACAGCC CAAGGGACAG 20(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:TCCTAAGCCA GTGCCAGAAG A 21(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:CTATTGGTCT CCTTAAACCT G 21(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:CTCACAAACC TAATGAAACC CTGC 24(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:GAAAACAGCC CAAGGGACAG20(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知
(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:GCCCTGTGGG GCAAGGTGAA CGTGGAT27(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:TACCCTTGGA CCCAGAGGTT CTTTGAG 27(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:GTTACTGCCC TGTGGGGCAA GGTGAAC27(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:CACTTTGGCA AAGAATTCAC CCCACCA27(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:GTGGTCTACC CTTGGACCCA GAGGTTC27(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:CAGAGGTTCT TTGAGTCCTT TGGGGAT27(2)SEQ ID NO:23的信息
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:AACCCTAAGG TGAAGGCTCA TGGCAAG27(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:CTGCTGGTGG TCTACCCTTG GACCCAG27(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:ACAGACACCA TGGTGCACCT GACTCCT27(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:GTGCACCTGA CTCCTGAGGA GAAGTCY27(2)SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:CACCTGACTC CTGAGGAGAA GTCYGCN27(2)SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:ACTCCTGAGG AGAAGTCYGC NGTTACT27(2)SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29:ACTCCTGAGG AGAAGTCYGC NGTTACT27(2)SEQ ID NO:30的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30:GAGAAGTCTG CCGTTACTGC CCTGTGG27(2)SEQ ID NO:31的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知
(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31:GCCGTTACTG CCCTGTGGGG CAAGGTGAAC 30(2)SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32:ACTGCCCTGT GGGGCAAGGT GAACGTG27(2)SEQ ID NO:33的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:33:GTTGGTGGTG AGGCCCTGGG CAGGCTGCTG 30(2)SEQ ID NO:34的信息(ⅱ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:34:CTGCCTGGTGG TCTACCCTTG GACCCAG 27(2)SEQ ID NO:35的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35:CTGGTGGTCT ACCCTTGGAC CCAGAGGTTC 30(2)SEQ ID NO:36的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36:GTGGTCTACC CTTGGACCCA GAGGTTCTTT 30(2)SEQ ID NO:37的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37:TGGACCCAGA GGTTCTTTGA GTCCTTTGGG 30(2)SEQ ID NO:38的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38:AGGTTCTTTG AGTCCTTTGG GGATCTG27(2)SEQ ID NO:39的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39:GAGTCCTTTG GGGATCTGTC CACTCCT27(2)SEQ ID NO:40的信息(ⅱ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:40:GTGAAGGCTC ATGGCAAGAA AGTGCTC27(2)SEQ ID NO:41的信息:
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:41:GTGCTCGGTG CCTTTAGTGA TGGCCTG27(2)SEQ ID NO:42的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知
(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:42:GTGCTCGGTG CCTTTAGTGA TGGCCTGGCT 30(2)SEQ ID NO:43的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:43:AGTGATGGCC TGGCTCACCT GGACAAC27(2)SEQ ID NO:44的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:44:CTGGACAACC TCAAGGGCAC CTTTGCCACA 30(2)SEQ ID NO:45的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:45:GAGCTGCACT GTGACAAGCT GCACGTG27(2)SEQ ID NO:46的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:46:AACTTCAGGC TCCTGGGCAA CGTGCTGGTC 30(2)SEQ ID NO:47的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:47:CTCCTGGGCA ACGTGCTGGT CTGTGTG27(2)SEQ ID NO:48的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:48:TTCACCCCAC CAGTGCAGGC NGCCTAT27(2)SEQ ID NO:49的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:49CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACT27(2)SEQ ID NO:50的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:50:CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACT27(2)SEQ ID NO:51的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:51:GAGGCCCTGG GCAGGTTGGT ATCAAGG27(2)SEQ ID NO:52的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ IDNO:52:GAGGCCCTGG GCAGGTTGGT ATCAAGG27(2)SEQ ID NO:53的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:53:GAGAACTTCA GGGTGAGTCT ATGGGAC27(2)SEQ ID NO:54的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:54:GCCCTGGGCA GGTTGGTATC AAGGTTA27(2)SEQ ID NO:55的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:55:GCCCTGGGCA GGTTGGTATC AAGGTTA27(2)SEQ ID NO:56的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知
(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:56:TTTCCCACCC TTAGGCTGCT GGTGGTC 27(2)SEQ ID NO:57的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:57:ATCTTCCTCC CACAGCTCCT GGGCAAC27(2)SEQ ID NO:58的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:58:ATCTTCCTCC CACAGCTCCT GGGCAAC27(2)SEQ ID NO:59的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:59:TTTCCCACCC TTAGGCTGCT GGTGGTC27(2)SEQ ID NO:60的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:60:CTGGGCAGGT TGGTATCAAG GTTACAA27(2)SEQ ID NO:61的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:61:CTGGGCAGGT TGGTATCAAG GTTACAA27(2)SEQ ID NO:62的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:62:CTGGGCAGGT TGGTATCAAG GTTACAA 27(2)SEQ ID NO:63的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:63:GAGGCCCTGG GCAGGTTGGT ATCAAGG27(2)SEQ ID NO:64的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:64:GAGGCCCTGG GCAGGTTGGT ATCAAGG27(2)SEQ ID NO:65的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:65:GGTGAGGCCC TGGGCAGGTT GGTATCA27(2)SEQ ID NO:66的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:66:ATCTTCCTCC CACAGCTCCT GGGCAACGTG 30(2)SEQ ID NO:67的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知
(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:67:TATTTTCCCA CCCTTAGGCT GCTGGTGGTC 30(2)SEQ ID NO:68的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:68:TCTCTCTGCC TATTGGTCTA TTTTCCC27(2)SEQ ID NO:69的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO:69:TGCCTATTGG TCTATTTTCC CACCCTT27(2)SEQ ID NO:70的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:70:AAATTGTAAC TGATGTAAGA GGTTTCA27(2)SEQ ID NO:71的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:71:AGCAGCTACA ATCCAGCTAC CATTCTGCTT 30(2)SEQ ID NO:72的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:72:TTTCTGGGTT AAGGCAATAG CAATATT27(2)SEQ ID NO:73的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:73:GAAGTTGGTG GTGAGGCCCT GGGCAGG27(2)SEQ ID NO:74的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:74:GTGGATGAAG TTGGTGGTGA GGCCCTG27(2)SEQ ID NO:75的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:75:GTTGGTGGTG AGGCCCTGGG CAGGCTG27(2)SEQ ID NO:76的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:76:CTGTGGGGCA AGGTGAACGT GGATGAAGTT 30(2)SEQ ID NO:77的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:77:AGCATCATCA CGAACCTCCT GTACCAT27(2)SEQ ID NO:78的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:78:CAGAAGAACG ACCTGGACGC AGTGGCA27(2)SEQ ID NO:79的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:79:CCTAAAAGCT TCGGCTACAG CTCGGTG27(2)SEQ ID NO:80的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:80:TGTCGTGGGC ATCAGGTGAG TGAGTCA27(2)SEQ ID NO:81的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:81:TGGGCCAGAT ACTTTGTGAA GTTCCTG27(2)SEQ ID NO:82的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:82:GGCTCCTGGG ATCGAGGGAT GCAGTAC27(2)SEQ ID NO:83的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:83:GGCTCCTGGG ATCGAGGGAT GCAGTAC27(2)SEQ ID NO:84的信息(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:84:GGACCCAATT GGGTGCGTAA CTTTGTC27(2)SEQ ID NO:85的信息(ⅱ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:85:GACATCACCA AGGACACGTT TTACAAA27(2)SEQ ID NO:86的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:86:GTCGTGCTAA ACCGCTCCTC TAAGGAT27(2)SEQ ID NO:87的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:87:TACCTGTGGC GTCGCCAGTG ATGGAGC27(2)SEQ ID NO:88的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Ch1(B)位置1...68(D)其他信息(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:88:AGCGCCGCCT ACGCCCACTC GGCTGTTTTC AGCAGCGUGG GCGTAGGCGG CGCUGCGCGT 60TTTCGCGC 68(2)SEQ ID NO:89的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Ch2(B)位置1...68(D)其他信息(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:89:AGCGCCGCCT ACACCCACTC GGCTGTTTTC AGCCGAGUGG GTGTAGGCGG CGCUGCGCGT60TTTCGCGC 68(2)SEQ ID NO:90的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Ch3(B)位置1...68(D)其他信息(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:90:GCGCGTTTTC GCGCAGCGCC GCCUACGCCC ACUCGGCUGT TTTCAGCCGA GTGGGCGTAG 60GCGGCGCT 68(2)SEQ ID NO:91的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Dh1(B)位置1...68(D)其他信息(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:91:AGCGCCGCCT ACGCCCACTC GGCTGTTTTC AGCCGAGTGG GCGTAGGCGG CGCTGCGCGT60TTTCGCGC 68(2)SEQ ID NO:92的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:92:ACCCCCAGCG CCGCCTACAC CCACTCGGCT GACCGG 36(2)SEQ ID NO:93的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞SC1(B)位置1...68
(D)其他信息(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:93:ACCTGACTCC TGAGGAGAAG TCTGCTTTTG CAGACUUCUC CTCAGGAGUC AGGUGCGCGT60TTTCGCGC 68(2)SEQ ID NO:94的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞SC2(B)位置1...68(D)其他信息(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:94:ACCTGACTCC TGTGGAGAAG TCTGCTTTTG CAGACUUCUC CACAGGAGUC AGGUGCGCGT60TTTCGCGC 68(2)SEQ ID NO:95的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞SC3(B)位置1...68(D)其他信息
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:95:ATCTGACTCC TGAGGAGAAG ACTGCTTTTG CAGUCUUCUC CTCAGGAGUC AGAUGCGCGT60TTTCGCGC 68(2)SEQ ID NO:96的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞SC4(B)位置1...68(D)其他信息(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:96:ACCTGACTCC TGAGGAGAAG ACTGCTTTTG CAGUCUUCUC CTCAGGAGUC AGGUGCGCGT 60TTTCGCGC 68(2)SEQ ID NO:97的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞SC5(B)位置1...68(D)其他信息
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:97:GCGCGTTTTC GCGCACCUGA CUCCTGTGGA GAAGUCUGCT TTTGCAGACT TCTCCACAGG 60AGTCAGGT 68(2)SEQ ID NO:98的信息:
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞δ(B)位置1...25(D)其他信息(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:98:ATCTGACTCC TGAGGAGAAG ACTGC25(2)SEQ ID NO:99的信息:
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:99:CACCTGACTC CTGAGGAGAA GTCTGCC27(2)SEQ ID NO:100的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:100:GAAGTTGGTG GTGAGGCCCT GGGCAGG 2權(quán)利要求
1．最多具有一個(gè)3’端和一個(gè)5’端的核酸，它具有一個(gè)未配對(duì)堿基的區(qū)段，該區(qū)段的配置使得所述未配對(duì)堿基將該核酸分成了第一條鏈和第二條鏈，所述第一條鏈和第二條鏈分別包含第一區(qū)和第二區(qū)，每個(gè)區(qū)有至少15個(gè)核苷酸，其中(a)所述第一區(qū)的每個(gè)核苷酸與所述第二區(qū)的一個(gè)核苷酸是Watson-Crick配對(duì)的；(b)第一區(qū)包含至少8個(gè)核糖核苷酸，與2’-脫氧核苷酸是Watson-Crick配對(duì)的，這些核糖核苷酸形成至少一個(gè)核糖核苷酸區(qū)段，所述區(qū)段至少有3個(gè)核糖核苷酸。(c)所述第一區(qū)或所述第二區(qū)的序列是人類基因野生型等位基因片段的序列。
2．權(quán)利要求1的核酸，提供的人類基因不是ras基因。
3．權(quán)利要求1的核酸，其中所述第一區(qū)或所述第二區(qū)的序列是5’-AGC GCC GCC TAC GCC CAC TCG GCT GT-3’(SEQ ID NO:88的核苷酸1-26)或其片段。
4．權(quán)利要求2的核酸，提供的人類基因不是編碼堿性磷酸酶的基因。
5．權(quán)利要求1的核酸，其中所述第一區(qū)由至少6個(gè)相鄰核糖核苷酸的第一核糖核苷酸區(qū)段、至少3個(gè)核糖核苷酸的第二核糖核苷酸區(qū)段及在第一和第二核糖核苷酸區(qū)段之間配置的間插區(qū)段組成，所述插入?yún)^(qū)段包含至少有3個(gè)2’-脫氧核糖核苷酸。
6．權(quán)利要求4的核苷酸，其中所述第二區(qū)包含大約20-100個(gè)2’-脫氧核糖核苷酸。
7．權(quán)利要求5的核酸，其中所述第一和第二核糖核苷酸區(qū)段各由大約6至大約13個(gè)核糖核苷酸組成，所述間插區(qū)段由大約4-20個(gè)2’-脫氧核糖核苷酸組成。
8．權(quán)利要求5的核酸，其中所述第一和第二核糖核苷酸區(qū)段各由大約8-12個(gè)核糖核苷酸組成，所述間插區(qū)段由大約4-15個(gè)2’-脫氧核糖核苷酸組成。
9．權(quán)利要求5的核酸，其中所述第一和第二核糖核苷酸區(qū)段分別由大約10個(gè)核糖核苷酸組成，所述間插區(qū)段由大約5個(gè)2’-脫氧核糖核苷酸組成。
10．權(quán)利要求3的核酸，其中所述人類基因選自β-珠蛋白基因和葡糖腦苷酯酶基因。
11．權(quán)利要求9的核酸，其中所述第一或第二區(qū)的序列選自表Ⅰ的序列或?yàn)槠淦巍?br> 12．權(quán)利要求9的核酸，其中所述第一或第二區(qū)的序列是5’-CACCTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT GCC-3’(SEQ ID NO:99)或者5’-GAA GTT GGT GGT GAG GCC CTG GGC AGG-3’(SEQ ID NO:100)或者是其片段。
13．修復(fù)人類受治療者的細(xì)胞突變的方法，包括從患有CRV可修復(fù)細(xì)胞突變的存在引起的疾病的受治療者中取出細(xì)胞，并把核酸引入到取出的細(xì)胞中，其中所述核酸最多具有一個(gè)3’端和一個(gè)5’端，并包含一個(gè)未配對(duì)堿基的區(qū)段，該區(qū)段的配置使得所述未配對(duì)堿基將該核酸分成了第一條鏈和第二條鏈，所述第一條鏈和第二條鏈分別包含第一區(qū)和第二區(qū)，每個(gè)區(qū)有至少15個(gè)核苷酸，其中(a)所述第一區(qū)的每個(gè)核苷酸與所述第二區(qū)的一個(gè)核苷酸是Watson-Crick配對(duì)的；(b)所述第一區(qū)包含至少8個(gè)核糖核苷酸，與2’-脫氧核苷酸是Watson-Crick配對(duì)的，這些核糖核苷酸形成至少一個(gè)區(qū)段，所述區(qū)段至少有3個(gè)核糖核苷酸；并且(c)所述第一區(qū)或所述第二區(qū)的序列是人類基因野生型等位基因片段的序列，所述片段包含CRV可修復(fù)突變。
14．權(quán)利要求12的方法，其中所述第一區(qū)或所述第二區(qū)的序列是5’-AGC GCC GCC TAC GCC CAC TCG GCT GT-3’(SEQ ID NO:88的核苷酸1-26)或者是其片段。
15．權(quán)利要求12的方法，它還包括把修復(fù)的細(xì)胞再植入所述受治療者體內(nèi)的步驟。
16．權(quán)利要求13的方法，其中所述核酸的第一區(qū)由至少6個(gè)相鄰核糖核苷酸的第一核糖核苷酸區(qū)段、第二核糖核苷酸區(qū)段及在所述第一和第二核糖核苷酸區(qū)段之間配置的間插區(qū)段組成，所述插入?yún)^(qū)段包含至少3個(gè)2’-脫氧核糖核苷酸，并且其中所述細(xì)胞是造血干細(xì)胞。
17．權(quán)利要求14的方法，其中所述間插區(qū)段包含所述CRV可修復(fù)突變。
18．權(quán)利要求14的方法，其中所述人類基因選自β-珠蛋白基因和葡糖腦苷酯酶基因。
19．權(quán)利要求16的方法，其中所述第一區(qū)或第二區(qū)的序列選自表Ⅰ的序列或者是其片段。
20．權(quán)利要求16的方法，其中所述第一區(qū)或第二區(qū)的序列是5’-CAC CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT GCC-3’(SEQ ID NO:99)或5’-GAA GTT GGT GGT GAG GCC CTG GGC AGG-3’(SEQ ID NO:100)或是其片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有2’－脫氧核糖核苷酸和核糖苷酸的雙鏈體寡核苷酸的用途,其中在兩種類型的核苷酸間形成堿基對(duì)。選擇所述寡核苷酸的序列,使得所述寡核苷酸的3’和5’的大多數(shù)區(qū)與預(yù)先選定細(xì)胞的靶基因序列同源(相同)。同源的兩個(gè)區(qū)包含一個(gè)與靶序列異源的區(qū)。將所述寡核苷酸引入細(xì)胞引起靶基因改變,使得改變的靶基因序列是異源區(qū)的序列。所述本發(fā)明的寡核酸被稱為嵌合突變載體(CMV)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,所述靶基因是珠蛋白基因,所述靶細(xì)胞是造血干細(xì)胞。該實(shí)施方案可以用于校正某些血紅蛋白病,諸如鐮刀形細(xì)胞病、β－地中海貧血病和高歇氏病。珠蛋白基因的校正率足夠高,以致不需選擇處理的造血干細(xì)胞,則獲得顯著的治療效果。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述CMV的核糖核苷酸含有甲基化的2’－O。
文檔編號(hào)A61K31/70GK1223660SQ97195949
公開(kāi)日1999年7月21日 申請(qǐng)日期1997年5月1日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月1日
發(fā)明者E·B·克米?？? A·科勒－斯特勞斯, K·尤恩 申請(qǐng)人:托馬斯杰弗遜大學(xué)