專利名稱：對眼無刺激的含碘藥劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明是1995年1月1日遞交的序號為08/551,478的部分繼續(xù)申請，其為1994年10月17日遞交的序號為08/324391的部分繼續(xù)申請，并且一般涉及以無毒和無刺激性的殺菌碘為基礎(chǔ)的殺微生物劑的酶的形成，其可殺滅為哺乳動(dòng)物眼組織中和眼組織上的污染物的病原體。
背景技術(shù)：
為了殺滅為哺乳動(dòng)物眼組織中和眼組織上的污染物的病原體，通過過氧化物酶催化的碘化物和過氧化物之間的反應(yīng)，按照本發(fā)明原位產(chǎn)生作為殺生物藥劑的自由分子碘。常見的污染物包括細(xì)菌、病毒和真菌。抗生素通常用于治療眼部感染?？股夭皇菑V譜藥劑。沒有抗生素能有效對抗細(xì)菌、病毒和真菌?？股氐膹V泛使用也導(dǎo)致產(chǎn)生對抗生素耐藥的病原。優(yōu)選的眼部抗感染劑將是廣譜的并且不產(chǎn)生耐藥病原。
在醫(yī)療行業(yè)和生物醫(yī)藥工業(yè)中已使用大量不同的化學(xué)殺菌劑來殺滅不需要的細(xì)菌、病毒和真菌。這些化學(xué)殺菌劑的大部分對有機(jī)體物質(zhì)是有毒性的或有破壞性的，結(jié)果這些消毒劑并不適用于敏感的生物材料，如人的眼睛。美國專利號5,185,371描述了一種消毒血液制品的方法，其有賴于將殺菌劑稀釋到下列成分之一中0.9％氯化鈉水溶液、5％葡萄糖水溶液、糖溶液或其它能改善液體殺菌劑與血液和血液制品的化學(xué)不相容性的稀釋劑。
F.A.Highsmith等(Joumal of Infectious Diseases，1993年，167卷，1027頁)描述了利用化學(xué)改性的聚乙烯吡咯烷酮-碘復(fù)合物的方法。Highsmith描述的該組合物及方法已被用于消毒血液制品。Highsmith的組合物含有大量的，包括自由分子的碘的碘類物質(zhì)。
涉及用碘消除敏感生物材料污染的所有的先有技術(shù)是利用碘伏。碘伏是利用聚維酮-碘或別的化學(xué)復(fù)合物或含碘物質(zhì)與高分子量的聚合物結(jié)合的組合物。與不含有與碘結(jié)合的高分子量聚合物的自由分子碘組合物相比，碘伏的使用增加了滅活病菌所需要的碘類物質(zhì)的絕對濃度。對于敏感生物材料的消毒，碘伏并不是優(yōu)選的碘的形式，因?yàn)樗行问降牡饩卸拘?。就那些組成人眼的敏感的活細(xì)胞而言，殺生物活性與毒性之間存在著沖突。在這點(diǎn)上，先有技術(shù)沒有直接提出需要有效地利用碘來消毒敏感生物材料的臨界參數(shù)。
盡管碘伏已用于消毒人的眼睛，但自由分子碘相對于其它碘類物質(zhì)的比率仍低于1/100。按照本發(fā)明自由分子碘應(yīng)控制在這種水平，即當(dāng)多種碘類物質(zhì)同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，自由分子碘應(yīng)為主要的碘類物質(zhì)，按摩爾計(jì)其具有相對于其它碘類物質(zhì)至少25％以上的自由分子碘的優(yōu)選濃度。優(yōu)選自由分子碘的濃度為5和330ppm之間，并且可以通過在水介質(zhì)中將過氧化物酶、碘化物和過氧化氫進(jìn)行酶反應(yīng)原位形成。在將殺微生物劑用于人眼以前，優(yōu)選過氧化氫對碘化物的比率為不大于4，并且優(yōu)選過氧化氫的最大濃度水平為不大于0.015％，以使治療能有效殺滅人眼中所有不需要的病原體。此外，更優(yōu)選將自由分子碘的水平實(shí)際維持在對眼無損害或刺激的pH和離子強(qiáng)度的條件下。
為了使自由分子碘起效，必須將這一殺生物藥劑的水平實(shí)際維持一段時(shí)間，以使其足以殺滅所有不需要的病原體。然而，也必須控制自由分子碘的化學(xué)活性，以便基本保持重要的生物材料的完整性。由于殺生物活性和生物學(xué)相容性的矛盾屬性，將其它有毒性和化學(xué)不相容性而又不具有必需的殺生物效用的碘類物質(zhì)排除或減至最少則是重要的。此外，其它非殺生物的細(xì)胞毒性化學(xué)制劑的濃度也應(yīng)減至最少，因?yàn)樗鼈兛沙蔀闈撛诘拇碳ず筒幌嗳菪缘膩碓础?br> 與絕大部分這一應(yīng)用下考慮的生物材料最相容的pH是6.8至7.1。盡管并非必需在7.0的pH時(shí)去除眼組織污染，但最優(yōu)選維持pH盡可能地接近7.0以便使?jié)撛诖碳p至最小。中性pH引起另外的因素，使自由分子碘在消毒中的使用變得復(fù)雜。自由分子碘在中性pH中不穩(wěn)定，結(jié)果，治療的持續(xù)時(shí)間就是一個(gè)重要的參數(shù)。
在美國專利號5,185,371中認(rèn)定的消毒劑之一是10％聚維酮-碘(povidone-iodine)，其通常表示為PVP-I2。PVP-I2是碘與聚維酮的復(fù)合物。其含有硫代硫酸鹽可滴定碘的重量不少于9.0％和不大于12％。此外，PVP-I2通常含有碘化物離子的重量不超過6.6％。另外，通常將碘酸鹽和其它無機(jī)類物質(zhì)加入到PVP-I2中。市售PVP-I2來自許多不同的廠家，并且這些產(chǎn)品的pH依廠家不同而變化。然而，在通常范圍為pH3.5和4.5之間的酸性環(huán)境下，PVP-I2被強(qiáng)烈緩沖。
在PVP-I2中碘類物質(zhì)的分布并非有利于其對敏感生物材料的使用。PVP-I2并不是優(yōu)選的用于生物材料的殺菌劑，因?yàn)樵谶@種組合物中僅含有低于0.2％的碘是以自由分子碘的形式存在。此外，這些組合物的pH對在這一應(yīng)用下所考慮的絕大部分的細(xì)胞和組織均有毒性。PVP-I2是被設(shè)計(jì)直接用于未受損的皮膚。哺乳動(dòng)物的表皮由死細(xì)胞構(gòu)成，其與活細(xì)胞相比對刺激的化學(xué)物質(zhì)明顯地較少敏感。
美國專利號5,185,371描述了用濃度范圍為重量的0.01％到0.5％的PVP-I2處理血液和血液制品持續(xù)達(dá)5分鐘。該申請規(guī)定PVP-I2的濃度范圍相當(dāng)于PVP-I2的1/200到1/10,000稀釋液。當(dāng)PVP-I2以生理鹽水稀釋到1/200時(shí)，所得溶液的pH是4.6，并且自由分子碘的水平是10ppm。當(dāng)PVP-I2以生理鹽水稀釋到1/10,000時(shí)，所得溶液的pH是-5.4，并且自由分子碘的水平是-0-0.5ppm。在競爭性生物負(fù)荷(competing bioburden)存在的情況下，美國專利號5,185,371中描述的自由分子碘、pH和接觸時(shí)間的聯(lián)合作用并不足以有效地殺滅絕大部分的目標(biāo)細(xì)菌和病毒。已知需要非常大劑量的碘和/或延長接觸時(shí)間才能完全殺滅非脂質(zhì)包裹的病毒(Highsmith F.A.等，Transfusion，1994年，34卷，322頁)。
因此，目前需要提供一種以碘為基礎(chǔ)的方法來消毒敏感生物材料，如哺乳動(dòng)物的眼組織。已制成以碘為基礎(chǔ)的組合物來消毒敏感生物材料，但這些組合物具有幾個(gè)弊端。碘是一種有效的殺生物劑并且不象其它的殺生物劑那樣，碘對于正常的人類營養(yǎng)和甲狀腺功能是需要的。先前的以碘為基礎(chǔ)的組合物的困難在于其具有不利的pH和離子強(qiáng)度的特性，并且活性殺生物碘(即自由分子碘)是(a)與其它非殺生物的化學(xué)類物質(zhì)結(jié)合，和(b)不是主要的碘類物質(zhì)。
本發(fā)明概述在5和330ppm之間的濃度范圍內(nèi)產(chǎn)生自由分子碘的條件下，通過產(chǎn)生以碘為基礎(chǔ)的消毒劑來完成本發(fā)明的目標(biāo)。這種碘組合物能在與眼組織最大相容的水性環(huán)境中形成。令人驚奇的是，該溶液不僅消毒生物制品，而且可無損害地消毒目標(biāo)材料。目前認(rèn)為本發(fā)明的消毒劑組合物將對諸如人眼這樣的敏感生物材料提供保護(hù)，即殺滅可能存在的有害細(xì)菌、病毒和類病毒物質(zhì)。
以碘為基礎(chǔ)的殺菌劑是本領(lǐng)域熟知的。通常在這一應(yīng)用中生產(chǎn)以碘為基礎(chǔ)的殺菌劑的方法是在碘化物和過氧化氫結(jié)合時(shí)使用過氧化物酶。從Kessler(美國專利號4,227,161，美國專利號5,169,455，美國專利號4,996,146和美國專利號4,937,072)、Orndoff(美國專利號4,370,199)和Montgomery(美國專利號4,576,817)中得知，過氧化物酶、過氧化物和碘化物陰離子的結(jié)合將在水性環(huán)境中形成殺菌劑。當(dāng)過氧化物酶、過氧化氫和碘化物在溶液中反應(yīng)時(shí)，該組合物的殺菌效果取決于發(fā)生的酶的反應(yīng)。已知過氧化物酶引起電子從碘化物到過氧化氫的轉(zhuǎn)移。通過這個(gè)反應(yīng)過氧化氫轉(zhuǎn)化為水。假定碘化物陰離子有幾個(gè)可能的反應(yīng)產(chǎn)物，包括1)碘自由基(Nunez和Pommier，European Journal of Biochemistry，1969年，第7卷，第286-293頁)；2)次碘酸鹽離子(Morrison和Schonbaum，Annual Review ofBiochemistry，1976年，第45卷，第861-888頁)；3)碘鎓離子(Ohtaki，Nakagawa，Kimura和Yamakazi，Journal of Biochemistry，1981年，第256卷，第805-810頁)。
已經(jīng)觀察到，在一定條件下，該反應(yīng)將產(chǎn)生顯著水平的自由分子碘，其中所述自由分子碘在現(xiàn)有的所有碘類物質(zhì)中占有顯著百分比。短語“自由分子碘”是本領(lǐng)域的術(shù)語，指元素碘，以I2表示的化學(xué)物質(zhì)，它可用硫代硫酸鈉滴定。已觀察到使用含有過氧化物酶、過氧化物和碘化物的組合物可能在一個(gè)較大pH范圍內(nèi)產(chǎn)生限定水平的自由分子碘，在這些組合物中可獲得的碘的精確水平與過氧化物、碘化物、過氧化物酶、緩沖劑、pH和其他添加劑的濃度水平相關(guān)。
如果對諸如人眼的材料消毒，則可以理解消毒劑組合物必須基本上等滲，以便將毒性減到最低。消毒劑的濃度和有效殺滅任何病原性微生物所需的時(shí)間取決于終環(huán)境中自由分子碘的水平。自由分子碘的合適濃度與疾病狀態(tài)和治療方案密切相關(guān)，通常自由分子碘的濃度的合適范圍是從5到330ppm。殺滅目標(biāo)致病性微生物所需的時(shí)間與自由分子碘的水平、目標(biāo)病原體和組合物中的生物材料的水平密切相關(guān)。
為將本發(fā)明消毒哺乳動(dòng)物眼睛付諸實(shí)踐，需要考慮幾個(gè)重要因素。高度優(yōu)選將所述組合物制備成與人的淚液等滲?？蛇x擇地，將該組合物的離子強(qiáng)度控制在280和300毫滲透分子之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得可通過在組合物中加入諸如氯化鈉的試劑來達(dá)到上述目的。象許多其它為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的多聚物一樣，諸如羥乙基纖維素、甲基纖維素和聚乙烯醇等多聚物也經(jīng)常被用于眼用組合物中。這些原料對本申請中所公布的組合物是合適的，條件是它們并不是以實(shí)際增加需要達(dá)到所需殺生物活性的碘的總濃度的方式結(jié)合。在本申請下設(shè)計(jì)的所述眼用組合物包括由病毒、細(xì)菌、真菌和棘阿米巴屬引起的疾病。
在自由分子碘接觸目標(biāo)敏感性生物材料后，允許自由分子碘通過在組合物中的水解作用而降解，此外，可通過許多途徑將該組合物中的碘分離出來，這些為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的途徑包括加入象環(huán)化糊精這類可以結(jié)合碘的原料或者將該組合物通過含碘結(jié)合材料的柱，或者通過在組合物中加入碘還原劑如乳糖，可起到緩慢還原碘的作用。本發(fā)明詳述對人眼中不需要的致病性微生物的殺滅是基于一個(gè)不經(jīng)意的發(fā)現(xiàn)，即哺乳動(dòng)物的眼睛對自由分子碘濃度的升高是相容的。
根據(jù)本發(fā)明，自由分子碘是原位產(chǎn)生并且與目標(biāo)眼組織接觸。需要和眼組織接觸的自由分子碘的水平在5和330ppm之間，即相當(dāng)于碘化物陰離子在25ppm和1660ppm之間的輸入水平。自由分子碘的濃度應(yīng)至少是現(xiàn)有的可用硫代硫酸鹽滴定的碘的25％。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，自由分子碘和三碘化物的比例以及自由分子碘和可用硫代硫酸鹽滴定的碘的比例可以是變化的。本領(lǐng)域技術(shù)人員也認(rèn)識到，無論是最小還是最大，不同的濃度限制因素可存在于自由分子碘和三碘化物兩者中，隨特殊應(yīng)用而定。當(dāng)25％表示自由分子碘和總碘的最小比例時(shí)，它也可用于確定配方中的進(jìn)一步的限制，這構(gòu)成與可呈現(xiàn)的被硫代硫酸鹽滴定的碘的最大濃度有關(guān)的本申請，所述限制可用于維持本申請的組合物的可接受的毒理學(xué)范圍。即使自由分子碘超過現(xiàn)有總碘的40％，所述可用硫代硫酸鹽滴定的碘的濃度也不應(yīng)高于650ppm。
水相環(huán)境的pH必須控制在pH5.0和7.1之間，處理目標(biāo)生物材料的優(yōu)選pH范圍在pH6.0和7.0之間，自由分子碘被給予的頻率變化很大，并取決于組合物中有機(jī)原料的水平和疾病狀態(tài)，必須由經(jīng)驗(yàn)推導(dǎo)治療任何特殊疾病狀態(tài)時(shí)給藥的頻率。
通過應(yīng)用過氧化物酶、碘化物和過氧化物源引入自由分子碘。顯然所用自由分子碘的濃度必須足以殺滅污染的病原體；然而，較不明顯的并且同樣重要的是產(chǎn)生以碘為基礎(chǔ)的、其主要成分是自由分子碘的殺菌劑。通過將目標(biāo)材料與主要由自由分子碘組成的碘組合物接觸，可使?jié)撛诘幕瘜W(xué)不相容性和毒性減至最小。在以碘為基礎(chǔ)的殺菌劑在水性環(huán)境中活化后，自由分子碘在存在的所有碘類物質(zhì)的摩爾基礎(chǔ)上應(yīng)至少占有25％。
必須控制含有過氧化物酶催化的碘化物的氧化作用的反應(yīng)物以產(chǎn)生合適的結(jié)果。應(yīng)建立可有效地將碘化物離子轉(zhuǎn)化為自由分子碘的反應(yīng)。此外，優(yōu)選建立這樣的反應(yīng)條件，即能將至少50％的初始濃度的過氧化氫轉(zhuǎn)化為水，并且在酶反應(yīng)開始后，與眼組織接觸的殘留的過氧化氫的濃度不高于0.015％的水平；這就防止了對眼的刺激。為了最佳地將碘化物轉(zhuǎn)化為自由分子碘，應(yīng)將過氧化氫與碘化物的摩爾比最初建立在1/2摩爾比例中。最優(yōu)選限制該比例不大于4。
本發(fā)明優(yōu)選的氧化劑是過氧化氫。當(dāng)混合在水性環(huán)境中時(shí)，任何可起過氧化氫源作用的原料均適合于本發(fā)明。對本發(fā)明來說以及如此處所使用的術(shù)語“過氧化物源”將意味著任何能作為過氧化氫前體的單獨(dú)或結(jié)合的原料，包括金屬過氧化物、過碳酸鹽、過硫酸鹽、過磷酸鹽、過氧酯、過氧化脲、過氧酸、烷基過氧化物、?；^氧化物和過硼酸鹽。可任選甲基、乙基和其它高分子量的過氧化物用于過氧化氫的來源，但這些不是優(yōu)選的。也可使用兩種或多種這些物質(zhì)的混合物。在碘化物的氧化反應(yīng)開始以前的最終組合物中，過氧化氫的優(yōu)選濃度是在0.001和0.01％之間。
本發(fā)明的供體分子是碘化物陰離子。本發(fā)明碘化物陰離子的合適的干燥來源包括碘化鈉和碘化鉀，以及其他碘化鹽?？扇芙庥谒喹h(huán)境中而產(chǎn)生碘化物陰離子的任何化合物都適用于本申請。優(yōu)選簡單的碘化鹽，因?yàn)樗鼈冇谐杀据^低的優(yōu)點(diǎn)。此外，它們在固體和液體形態(tài)中有較長的儲存期。
如果碘化物陰離子在臨用前能保持穩(wěn)定，它就能以液體形式提供給該系統(tǒng)。具體地說，優(yōu)選該碘化物陰離子不與過氧化氫接觸。將產(chǎn)生合適的碘水平的碘化物濃度隨所設(shè)計(jì)制劑的pH而變化。此外，所需碘化物水平將主要根據(jù)過氧化物與碘化物的比例而變化。當(dāng)采用過氧化氫與碘化物的優(yōu)選比例1/2時(shí)，在酶反應(yīng)開始以前最終重新配制的制劑中，碘化物陰離子的優(yōu)選范圍是每升0.0015和0.10克之間。然而，對某些眼部疾病的一般預(yù)防來說，將碘化物較低效地轉(zhuǎn)化為自由分子碘是可能的，因此在酶反應(yīng)開始以前最終重新配制的制劑中，碘化物陰離子的潛在有用的范圍是每升0.025和0.30克之間。這些范圍的碘化物陰離子與其他添加劑的pH和濃度的結(jié)合，預(yù)期能產(chǎn)生5到330ppm范圍內(nèi)的自由分子碘的濃度。
盡管也使用E.C.1.11.1.8的某些成員，但本發(fā)明的過氧化物酶是由國際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)和International Union of Pure and AppliedChemistry通過酶委員會(huì)(Enzyme Commission)鑒定號E.C.1.11.1.7來鑒定的。這些類型的過氧化物酶能從廣泛多樣的來源中獲得，包括牛奶(乳過氧化物酶)、大豆和人類白細(xì)胞(myerloperoxidase)。在這兩種E.C.類型中，進(jìn)一步需要的如在本申請中所定義的合適的過氧化物酶是那些能在4到7.1的pH范圍內(nèi)將碘化物氧化為碘的過氧化物酶。適合于本申請的最便宜的過氧化物酶是辣根過氧化物酶和大豆過氧化物酶?？梢灶A(yù)料，從辣根、牛奶或人類白細(xì)胞或其他適合于本申請的過氧化物酶的來源中可克隆出過氧化物酶。此外，已觀察到化學(xué)修飾的過氧化物酶適用于本申請。對氨基、羧基或碳水化合物部分的修飾可產(chǎn)生包含在本申請中的合適的催化劑。對過氧化物酶的化學(xué)修飾包括酶分子之間相互交聯(lián)、酶與固體表面或與其他蛋白交聯(lián)。用于交聯(lián)的化學(xué)試劑包括戊二醛、馬來酰亞胺、琥珀酰亞胺、碳化二亞胺、二羧酸酯、活性甘醇、亞氨酸酯、光復(fù)活(photoreactive)疊氮化物和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他試劑。
可以干燥形式如市售提供的凍干過氧化物酶或以大量的水相環(huán)境的形式提供前述的過氧化物酶形式，如果所述過氧化物酶是以水相環(huán)境提供，則通常是將它摻入可提高穩(wěn)定性的介質(zhì)中，所述介質(zhì)有如甘油、葡聚糖、或其它多羥基化合物或者是在合適緩沖培養(yǎng)基(最好含鈣)中的糖。無論是以干燥形式還是以水相環(huán)境提供，本申請的過氧化物酶均可與多種添加劑結(jié)合。在最終的組合物中，可以全使用的過氧化物酶的濃度范圍在0.00005和0.005mg/ml之間，在最終的組合物中的優(yōu)選范圍在0.0005和0.01mg/ml之間。
對包括本發(fā)明所設(shè)計(jì)的組合物的合適緩沖劑包括水和氫化乙醇的混合物，該混合物的緩沖配制為甘氨酸-甘氨酸*HCl、鄰苯二甲酸氫鉀-鄰苯二甲酸、檸檬酸-Na2HPO4、檸檬酸-KH2PO4-H3BO3-二乙基巴比士酸-NaOH、檸檬酸-檸檬酸鈉、二甲基戊二酸-二甲基戊二酸鈉、乙酸-乙酸鈉、琥珀酸-琥珀酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀-鄰苯二甲酸二鉀、二甲基胂酸鈉-二甲基胂酸、馬來酸氫鈉-馬來酸二鈉、Na2HPO4-NaH2PO4、碳酸氫鈉-5％二氧化碳、咪唑-鹽酸咪唑、硼酸-硼酸鈉，以及為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的良好緩沖液的下述緩沖液Tris、MES、BIS-TRIS、ADA、ACES和PIPES。
在與哺乳動(dòng)物的眼組織接觸后，可將含碘組合物從眼睛中沖洗掉，然而，因?yàn)閷⒆杂煞肿拥獾臐舛瓤刂圃谙鄬τ谒衅渌N類的碘的濃度水平，所以此處說明的組合物的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)即是沒有必要將其沖洗掉，本申請所包含的實(shí)施例將證實(shí)這一事實(shí)。此外，最大的碘水平和過氧化氫水平也受到控制，因而形成非刺激性治療。本申請中所描述的非刺激性殺菌劑在摩爾基礎(chǔ)上具有至少25％的自由分子碘，并且在將殺微生物劑用于人眼之前，于過氧化氫對碘化物的摩爾比例不大于4和過氧化氫的最大濃度水平為0.015％的狀況中，通過在水性介質(zhì)中過氧化物酶、碘化物和過氧化物的酶反應(yīng)形成5和330ppm之間的自由分子碘的濃度。盡管有pH范圍為3.5到8.5的眼用藥劑存在，優(yōu)選的眼用藥劑的pH是4.5和7.1之間。
通過對下列詳細(xì)的實(shí)施例的思考，將更全面地評價(jià)本發(fā)明的所有前述操作原理和優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例實(shí)施例1制備以碘為基礎(chǔ)的組合物，它主要由自由分子碘組成。通過在pH5.5中孵育辣根過氧化物酶、碘化鈉和過氧化氫制備這些組合物，允許將這些原料孵育限定的一段時(shí)間，然后完成所得的制劑的特性分析。
測定下述三種碘類物質(zhì)的濃度自由分子碘、三碘化物和碘化物陰離子。通過Gottardi(Gottardi W.，F(xiàn)resenius Z.Anal.Chem.，1983年，314卷，582頁)的電勢法測定自由分子碘。將兩個(gè)Corning 345型pH儀用于完成電勢測定。所用的Corning電極包括標(biāo)準(zhǔn)的鉑電極、參比電極和碘化物離子選擇電極。通過用硫代硫酸鈉滴定測定總碘水平，然后從總碘水平中減去自由分子碘的水平的方法測定三碘化物。用Corning碘化物離子選擇電極直接測定碘化物離子的濃度。
在pH5.5時(shí)用檸檬酸鹽緩沖液探測三種狀態(tài)。所有狀態(tài)均使用終濃度為5μg/mL的辣根過氧化物酶。第一種狀態(tài)(治療1號)使用每升60mg的碘化鈉濃度和等量摩爾濃度的過氧化氫，該過氧化氫是用過碳酸鈉(每升0.025克)作為過氧化氫源而產(chǎn)生的。狀態(tài)2和3(治療2號和3號)分別使用每升200和450mg的碘化鈉和每升0.0833和0.187克過碳酸鈉。允許將溶液孵育60分鐘，并進(jìn)行分析測定，結(jié)果顯示于下述表1中。
<p>我們從顯示于表1的數(shù)據(jù)中推出的結(jié)論為，產(chǎn)生以過氧化物酶為基礎(chǔ)的碘殺菌劑(該殺菌劑主要包含自由分子碘)是可能的。表中數(shù)據(jù)顯示了三種優(yōu)勢碘類物質(zhì)的濃度自由分子碘、碘化物陰離子和三碘化物。在所述狀態(tài)下，與列于表1中的三種碘類物質(zhì)的濃度相比，次碘酸和碘酸鹽的濃度并不顯著。實(shí)施例2在pH7.0時(shí)制備以碘為基礎(chǔ)的組合物，其主要由自由分子碘組成。通過在pH7.0時(shí)孵育辣根過氧化物酶、碘化鈉和過氧化氫制備所述組合物。允許將這些組份孵育限定的一段時(shí)間，然后對所得的組合物進(jìn)行分析測定。所采用的化學(xué)組份的重量和體積為0.2克無水檸檬酸、450mg碘化鈉、1.3mL 3％過氧化氫、100mg碳酸氫鈉和3mg辣根過氧化物酶。在如實(shí)驗(yàn)1中所描述的分析測定進(jìn)行之前，允許將所述化合物孵育15分鐘。結(jié)果顯示如下
我們由此推斷的結(jié)論是在pH7.0時(shí)產(chǎn)生主要由自由分子碘組成的以碘為基礎(chǔ)的殺菌劑是可能的。實(shí)施例3在生物負(fù)荷(bioburden)存在的情況下，測試在實(shí)驗(yàn)1中所描述的三種制劑以測定它們的殺滅病原體(如細(xì)菌)的能力。制備每毫升含有106紅細(xì)胞(RBC)的金黃色葡萄球菌懸液。通過顯微鏡檢查測定這些制劑所具有的在紅細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的作用。使用稀釋的10％PVP-I2來進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)；稀釋范圍為1/20到1/10,000。
用Ficoll淋巴細(xì)胞分離方法將全血進(jìn)行分層。收獲紅細(xì)胞(RBC)用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌一次，并在5℃下用Alsevers溶液將濃度保持在3.5×109RBC/mL。
用5mL 0.25摩爾的磷酸鹽緩沖液在pH7.0(PBDW)時(shí)將金黃色葡萄球菌的斜面培養(yǎng)沖洗到100mL的PBDW中，將其接種到瓊脂板上。7塊營養(yǎng)瓊脂板的每一塊均加入1毫升該懸液，使其在35-37℃孵育18-24小時(shí)。使用1mL的PBDW和無菌拭子從瓊脂表面除去細(xì)菌集落。采用Milton-Roy Spec 20分光光度計(jì)標(biāo)準(zhǔn)化該細(xì)菌懸液，設(shè)定為109cfu/mL。
將100mL的每種測試的殺菌劑在25℃水浴中平衡(equilibrated)。在測定開始前2分鐘，加入106RBCs/mL水平的RBCs，加入2.0×108/水平的金黃色葡萄球菌。在暴露30、60、120和300秒以后分別取出1mL樣品并用10mL 0.5％硫代硫酸鹽中和。使用瓊脂計(jì)數(shù)平板按一式四份將1mL和0.1mL的中和樣品傾入平板中。
本實(shí)驗(yàn)測定了所述消毒劑殺滅至少106cfu/mL金黃色葡萄球菌的能力。除了在1/1,000稀釋度下的10％PVP-I2(如10ppm總碘)之外，所有的消毒劑在一定時(shí)間范圍內(nèi)都有抗金黃色葡萄球菌的效應(yīng)，當(dāng)自由分子碘水平在63和114ppm時(shí)，以過氧化物酶為基礎(chǔ)的碘殺菌劑在30秒內(nèi)顯示出對金黃色葡萄球菌6對數(shù)減少(6 log reduction)，當(dāng)自由分子碘水平在13ppm時(shí)，以過氧化物酶為基礎(chǔ)的碘殺菌劑需要5分鐘達(dá)到對金黃色葡萄球菌6對數(shù)殺滅(6 log inactivation)的效應(yīng)。
用以過氧化物酶為基礎(chǔ)的碘殺菌劑處理過的紅細(xì)胞的顯微鏡檢查顯示，紅細(xì)胞無形態(tài)學(xué)改變或細(xì)胞計(jì)數(shù)減少。除了稀釋到1/1000的10％PVP-I2之外，用10％PVP-I2處理的紅細(xì)胞表現(xiàn)出褪色和皺縮，但計(jì)數(shù)無減少，測定10％PVP-I2的1/1000稀釋液中的自由分子碘的水平為6ppm。
本實(shí)驗(yàn)證實(shí)合適地控制主要由自由分子碘組成的制劑，可在保持對敏感性生物材料如獨(dú)特的細(xì)胞和組織的非刺激性的同時(shí)，也可作為有效的殺菌劑。
實(shí)施例4檢查以酶為基礎(chǔ)的碘殺菌劑以測定其在生物負(fù)荷存在下殺滅病原體如病毒的能力。制備以酶為基礎(chǔ)的碘殺菌劑，并在人血清中測定其在高濃度的紅細(xì)胞存在下殺滅病毒的能力。將450mg碘化鈉溶于1升0.05摩爾檸檬酸鹽緩沖液(pH5.5)中，同時(shí)溶解10mg大豆過氧化物酶，制備所述殺菌劑，允許將該溶液孵育10分鐘，然后測定該制劑的殺病毒效應(yīng)。
用Ficoll淋巴細(xì)胞分離方法將全血進(jìn)行處理，收獲紅細(xì)胞(RBC)用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌，并在5℃下用Alsevers溶液將濃度保持在6.5×109RBC/mL。
半數(shù)組織培養(yǎng)物感染劑量(TCID50)是引起50％系列培養(yǎng)物感染的病毒顆粒的濃度，將約107單位的TCID50的水泡性口炎皰疹病毒加入到每毫升含106紅細(xì)胞的混合人血清樣品中，將該樣品與所述殺菌劑一起于4℃和25℃孵育5分鐘，5分鐘后，按下述測定病毒滴度，將樣品按一式四份，用含有10％胎牛血清和0.1％硫代硫酸鈉的非必需氨基酸的最小必需培養(yǎng)基(MEM)以5倍系列稀釋，將該稀釋液加入到含有Vero細(xì)胞(ATCC CRL81)(接近80％融合)的96孔板中。本方法中應(yīng)用的最低稀釋度是原始的處理血清的1∶5倍，37℃下將該培養(yǎng)物于5％二氧化碳環(huán)境下孵育3天，然后檢測各孔的細(xì)胞病變效應(yīng)。
在模擬感染和碘處理的組織培養(yǎng)孔中，在4℃和25℃下，均未觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)，這表明所述殺菌劑在敏感性生物材料存在時(shí)，可有效殺滅脂質(zhì)包裹的病毒。用顯微鏡檢查測定所述制劑在紅細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的效應(yīng)，紅細(xì)胞的顯微鏡檢查表明以酶為基礎(chǔ)的碘殺菌劑不引起紅細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變或減少紅細(xì)胞的數(shù)量，處理的細(xì)胞中沒有一個(gè)出現(xiàn)褪色或皺縮。實(shí)施例5將生長于含20％胎牛血清的RPMI 1640中的細(xì)胞懸液(CEM淋巴母細(xì)胞性白血病細(xì)胞ATCC CCL-21)離心濃縮，該細(xì)胞懸液處于平臺期，約相當(dāng)于2×106細(xì)胞/ml，然后用自由分子碘處理所述細(xì)胞，以便使每個(gè)細(xì)胞得到不同比例的自由分子碘(參見表5a)。
使粘附細(xì)胞(Vero)在T-75瓶中生長至融合，用胰蛋白酶消化使細(xì)胞脫落，并通過離心沉淀，然后用自由分子碘處理所述細(xì)胞，以使每個(gè)細(xì)胞得到不同比例的自由分子碘(參見表5b)。細(xì)胞存活百分率似乎與每個(gè)細(xì)胞中自由分子碘的水平呈反比例關(guān)系，每個(gè)細(xì)胞中自由分子碘比例的高限是明顯的。
所述數(shù)據(jù)有力地提示將敏感性生物材料暴露于抗菌而無細(xì)胞毒性的自由分子碘的濃度中是可行的。
實(shí)施例6制備以酶為基礎(chǔ)的碘殺菌劑，并評價(jià)其對三月齡大的雄性和雌性新西蘭白兔眼內(nèi)的細(xì)菌殺滅能力。該殺菌劑與治療1說明的組合物相同，在實(shí)施例1中，加入足夠的過碳酸鈉以調(diào)節(jié)pH到6.0，其自由分子碘的水平從46降低到32ppm。
在所述殺菌劑滴入試驗(yàn)之前，調(diào)整所有受試和對照眼避免明顯的眼部刺激。用熒光染色處理眼并在暗室中用紫外線觀察以探測或證實(shí)有無任何預(yù)先存在的角膜損傷。將少量殺菌劑樣品(0.1ml)滴入到每只兔的左眼的下結(jié)膜囊中并保持眼瞼閉合一(1)秒鐘。每只兔的對側(cè)眼不予處理并作為比較的對照。
在試驗(yàn)物質(zhì)滴入1小時(shí)后檢測該眼的反應(yīng)，并在1、2、3、4、7、14和21天再次檢測。在每次時(shí)間間期進(jìn)行熒光染色。通過滴眼給予一滴熒光素以評估組織損傷。這些試驗(yàn)的1、14和21天的結(jié)果顯示在下表6中。
在試驗(yàn)期中的任何動(dòng)物中均沒有觀察到角膜混濁和虹膜炎。處理后24小時(shí)內(nèi)，在2/6的動(dòng)物中觀察到輕微短暫的結(jié)膜炎。這種情況在第2天即消除。沒有在任何動(dòng)物中觀察到眼結(jié)構(gòu)周圍有眼眶附件(accessory)生長和炎癥。所得出的結(jié)論是該殺菌劑對眼不引起刺激。<
>進(jìn)行第二項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，將含有106菌落形成單位的金黃色葡萄球菌的鹽水溶液直接滴入到以上采用的每只兔的左眼中。過5分鐘后，用0.1ml殺菌劑滴入每只眼中。每6小時(shí)滴一次殺菌劑持續(xù)24小時(shí)，然后用棉拭子拭抹每只兔的左眼。將棉拭子在瓊脂板上涂板并在37℃孵育該瓊脂板5天。在任何兔眼上均沒有觀察到金黃色葡萄球菌菌落。實(shí)施例7本實(shí)驗(yàn)證明，如果按照本申請的說明書配制，高濃度的自由分子碘并非是必然的眼刺激物。將在實(shí)施例1中所描述的三種酶碘組合物的每一種各制備30份樣品，每天新鮮復(fù)制每種制劑形式的2份樣品，持續(xù)3天。測定每個(gè)樣品的自由分子碘的濃度，并將自由分子碘的平均濃度設(shè)定為處理1的53ppm；處理2的162ppm；和處理3的324ppm。在超過3天的療程中使用兩種不同的用藥方案，采用這三種不同的處理形式(1、2和3)來測定自由分子碘對新西蘭白兔的眼刺激性。
將兔分為6組；每組由4只兔組成。I和II組給予含有53ppm自由分子碘的處理I的碘組合物。III和IV組給予含有162ppm自由分子碘的處理II的碘組合物。V和VI組給予含有324ppm自由分子碘的處理III的碘組合物。處理組I、III和V每2小時(shí)給藥4滴，持續(xù)3天；每天用于這些動(dòng)物的總給藥次數(shù)是4，即16滴。處理組II、IV和VI每小時(shí)給藥8滴，持續(xù)3天；每天用于這些動(dòng)物的總給藥次數(shù)是8，即32滴。
使用在Draize試驗(yàn)(Draize J.H.，G.Woodward，H.O.Calvery，J.Pharmacol.Exp.Ther.1944年，82卷，377-390頁)中所定義的眼損害評分標(biāo)度來檢測眼，其包括結(jié)膜充血和球結(jié)膜水腫、流淚、虹膜炎和角膜混濁。全部的眼刺激標(biāo)度范圍從0到110，包含有下列標(biāo)度0.0-0.5(無刺激)、0.6-2.5(基本無刺激)、2.6-15.0(最小刺激)、15.1-25.0(輕微刺激)、25.1-50.0(中度刺激)、50.1-80.0(重度刺激)、80.1-100.0(非常大刺激)和100.1-110.0(最大刺激)。該刺激結(jié)果顯示于表7a中。也可通過與已知的Betadine稀釋劑眼染色法比較來評估該種眼染色法。使用未稀釋的Betadine和七個(gè)分別在水中兩倍系列稀釋的Betadine作為標(biāo)度范圍為0-4.0的染色法的比較標(biāo)準(zhǔn)。本研究的結(jié)果證明，對于任何類型的或處理方案的試驗(yàn)在處理的任一天中均沒有任何角膜或結(jié)膜的染色。
在這一研究中所試驗(yàn)的自由分子碘的制劑對NZ兔眼的刺激最小。無論自由分子碘的濃度或處理方案怎樣，這些制劑都不對任何兔的角膜造成任何損害。已發(fā)現(xiàn)最高濃度的自由分子碘是三種處理類型所測試的最大的刺激物，甚至于這種刺激程度都是最小的。在處理方案(4滴與8滴使用3天)之間的刺激沒有顯著差異。由這些制劑引起的一些最小的眼刺激可能是因?yàn)椴煌苿┑牡蚿H所致。這些制劑的pH均在酸性范圍內(nèi)(處理1-pH＝4.75，處理2-pH＝4.90，處理3-pH＝5.01)。
這些定義的自由分子碘組合物無論何時(shí)均未對任何兔眼的角膜或結(jié)膜染色。所有角膜均保持透明并且所有結(jié)膜均保持白色。將三種處理制劑的顏色與Betadine稀釋劑的顏色相比較用于碘染色的標(biāo)度，324ppm的I2組合物(處理III)似乎相當(dāng)于0.625％Betadine、162ppm I2組合物似乎相當(dāng)于0.3125％Betadine和53ppm I2組合物似乎相當(dāng)于0.15625％Betadine。
權(quán)利要求
1.一種治療性的處理哺乳動(dòng)物眼睛的方法，用以消毒殺滅所述眼的病原微生物，其包含的步驟為基本上是由碘化物-氧化反應(yīng)的過氧化物酶、過氧化氫源物質(zhì)和碘化物源物質(zhì)組成的組合物在水性介質(zhì)中混合，形成具有多種碘類物質(zhì)的無刺激性的含水殺微生物劑；所述過氧化物酶選自辣根過氧化物酶、乳過氧化物酶、myerloperoxidase和大豆過氧化物酶；該殺微生物劑的過氧化氫與碘化物的摩爾比維持在大約0.5和4.0之間，這樣自由分子碘就是存在的主要的碘類物質(zhì)，并且所述殺微生物劑具有0.015％的過氧化氫的最大濃度和可用硫代硫酸鹽滴定的碘的最大濃度650ppm。
2.權(quán)利要求1所定義的方法，其中所述自由分子碘按摩爾計(jì)至少占所述多種碘類物質(zhì)的25％。
3.權(quán)利要求2所定義的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包含緩沖劑以維持所述殺微生物劑的pH在4.5和7.1之間。
4.權(quán)利要求3所定義的方法，其中所述pH維持在6.0到7.1之間。
5.權(quán)利要求3所定義的方法，其中所述緩沖劑選自甘氨酸、鄰苯二甲酸、檸檬酸、磷酸、硼酸、巴比土酸、戊二酸、二甲基戊二酸鹽、乙酸、乙酸鈉、琥珀酸-琥珀酸鈉、二甲基胂酸、馬來酸氫鈉、碳酸氫鈉或產(chǎn)生的碳酸鹽陰離子是溶液的其它試劑、咪唑以及為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的良好緩沖液的下述緩沖液Tris(三(羥甲基)氨基乙烷)、MES(2-[N-嗎啉代]乙磺酸)、BIS-TRIS(雙[2-羥乙基]亞氨基-三[羥甲基]甲烷；2-雙[2-羥乙基]氨基-2-[羥甲基]-1，3-丙二醇)、ADA(N-[2-乙酰氨基]-2-亞氨基二乙酸；N-[氨基甲?；谆鵠亞氨基二乙酸)、ACES((2-[(2-氨基-2-氧代乙基)-氨基]乙磺酸；N-[2-乙酰氨基]-2-氨基乙磺酸)和PIPES(哌嗪-N，N’-雙[2-乙磺酸]和1，4-哌嗪二乙磺酸)。
6.用于治療眼疾的對眼無刺激的含碘抗感染藥，包含選自辣根過氧化物酶、乳過氧化物酶、myerloperoxidase和大豆過氧化物酶的碘化物-氧化反應(yīng)的過氧化物酶、過氧化氫源物質(zhì)和碘化物源物質(zhì)，其在與水的混合物中具有大約0.5和0.4之間的過氧化氫對碘化物的摩爾比例和0.015％的過氧化氫的最大濃度，這樣自由分子碘就是在所述混合物中產(chǎn)生的主要的碘類物質(zhì)，并且所述混合物具有0.015％的過氧化氫的最大濃度和可用硫代硫酸鈉滴定的碘的最大濃度650ppm。
7.權(quán)利要求6所定義的眼用無刺激的含碘藥劑，其中在殺微生物劑中形成多種碘類物質(zhì)，且自由分子碘按摩爾計(jì)至少占所述多種碘類物質(zhì)的25％。
8.權(quán)利要求7所定義的眼用無刺激的含碘藥劑，其中所述自由分子碘在5和330ppm之間的范圍內(nèi)。
9.權(quán)利要求8所定義的眼用無刺激的含碘藥劑，其中所述組合物進(jìn)一步包含緩沖劑以維持所述殺微生物劑的pH在4.5和7.1之間。
10.權(quán)利要求9所定義的眼用無刺激的含碘藥劑，其中所述pH維持在6.0到7.1之間。
11.權(quán)利要求10所定義的眼用無刺激的含碘藥劑，其中所述緩沖劑選自甘氨酸、鄰苯二甲酸、檸檬酸、磷酸、硼酸、巴比土酸、戊二酸、二甲基戊二酸鹽、乙酸、乙酸鈉、琥珀酸-琥珀酸鈉、二甲基胂酸、馬來酸氫鈉、碳酸氫鈉或產(chǎn)生的碳酸鹽陰離子是溶液的其它試劑、咪唑以及為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的良好緩沖液的下述緩沖液Tris(三(羥甲基)氨基乙烷)、MES(2-[N-嗎啉代]乙磺酸)、BIS-TRIS(雙[2-羥乙基]亞氨基-三[羥甲基]甲烷；2-雙[2-羥乙基]氨基-2-[羥甲基]-1，3-丙二醇)、ADA(N-[2-乙酰氨基]-2-亞氨基二乙酸；N-[氨基甲?；谆鵠亞氨基二乙酸)、ACES((2-[(2-氨基-2-氧代乙基)-氨基]乙磺酸；N-[2-乙酰氨基]-2-氨基乙磺酸)和PIPES(哌嗪-N，N’-雙[2-乙磺酸]和1，4-哌嗪二乙磺酸)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于殺滅污染在如人眼這樣的敏感生物材料中或材料上的病原體的由酶產(chǎn)生的含碘殺微生物劑。得自酶反應(yīng)的所述殺生物劑是自由分子碘,其在5ppm的最低水平生成并且按摩爾計(jì)至少占所存在的總碘類物質(zhì)的25%。
文檔編號A61P31/04GK1248911SQ97182059
公開日2000年3月29日 申請日期1997年5月31日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月24日
發(fā)明者J·凱斯勒 申請人:西姆波朗公司