專利名稱：胰島素衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可溶的并具有延長的作用形象的新型胰島素衍生物、這種衍生物的制備方法、含有該衍生物的藥物組合物和這種胰島素衍生物在治療糖尿病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
許多糖尿病患者通過多次日注射胰島素來治療，包括一或兩次日注射長效胰島素來彌補(bǔ)基本需求，并通過大丸注射快速作用胰島素來彌補(bǔ)食物相關(guān)的需求作為補(bǔ)充。
長效胰島素組合物在本領(lǐng)域是眾所周知的。例如，一種主要類型的長效胰島素組合物包括胰島素的晶體或無定型胰島素的可注射水懸液。在這些組合物中，典型使用的胰島素化合物是精蛋白胰島素、鋅胰島素或精蛋白鋅胰島素。
利用胰島素的懸液伴有某些缺點(diǎn)。例如，為了保證一個精確的劑量，在從小瓶中吸出或從注射器藥筒中推出一確定體積的懸液前，必須通過溫和的振蕩使胰島素顆粒均質(zhì)地懸浮。此外，對于胰島素懸液的貯藏，為防止團(tuán)塊形成或凝結(jié)，溫度必須保持在比保存胰島素溶液更窄的范圍內(nèi)。
雖然以前曾認(rèn)為精蛋白是非免疫原性的，但目前已經(jīng)證實(shí)精蛋白在人體中是可以致免疫的，而且它們在醫(yī)療目的上的應(yīng)用可以導(dǎo)致抗體的形成。(Samuel等，利用微補(bǔ)體固定實(shí)驗(yàn)對精蛋白在人和實(shí)驗(yàn)動物中免疫原性的研究，《臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)》(Clin.Exp.Immunol.)33，252-260頁(1978))。
此外，也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)證據(jù)證明精蛋白胰島素復(fù)合物本身是致免疫的(Kurtz等，精蛋白胰島素治療的患者體內(nèi)抗精蛋白的循環(huán)IgG抗體，《糖尿病學(xué)》(Diabetologica)25，322-324頁(1983))。因而，對某些患者必須避免使用含有精蛋白的長效胰島素組合物。
另一類型的長效胰島素組合物是pH低于生理pH的溶液，在溶液被注射時，由于pH值的上升胰島素在生理pH下將沉淀下來。一個缺點(diǎn)是胰島素的固體顆粒作為一種局部的刺激物可引起注射部位組織的炎癥。
WO 91/12817(Novo Nordisk A/S)公布了含有鈷胰島素復(fù)合物(III)的長效可溶胰島素組合物。這些復(fù)合物作用的延長只是中等的，并且生物利用度降低。
人胰島素具有三個伯氨基基團(tuán)A鏈和B鏈的N-端基團(tuán)以及LysB29的ε-氨基基團(tuán)?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)知道幾種這些基團(tuán)中的一個或幾個被取代的胰島素衍生物。例如，US專利3,528,960號(Eli Lilly)涉及胰島素分子的一個、兩個或三個伯氨基基團(tuán)具有羧芳?；鶊F(tuán)的N-羧芳?；葝u素。尚未公布有NεB29特異性取代的胰島素。
根據(jù)GB專利1,492,997號(Nat.Res.Dev.Corp.)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在NεB29處帶有一個氨甲酰取代基的胰島素具有提高的降低血糖的效應(yīng)形象。
日本專利申請公開1-254699號(Kodama Co.，Ltd.)公布了一種在PheB1的氨基基團(tuán)上或LysB29的ε-氨基基團(tuán)上或同時在兩者上都結(jié)合有一個脂肪酸的胰島素。所陳述的衍生化作用的目的是為了獲得一個藥理學(xué)上可接受的穩(wěn)定的胰島素制劑。
在日本專利申請公開57-067548號(Shionogi)中描述了一種胰島素，在其B30位點(diǎn)上為一個可能不是由核苷酸三聯(lián)體編碼的至少具有5個碳原子的氨基酸。這種胰島素類似物據(jù)稱在糖尿病的治療中，特別是在因產(chǎn)生牛或豬胰島素抗體而對胰島素產(chǎn)生抗性的患者中是有效的。
US 5,359,030(Ekwuribe，Protein Delivery，Inc.)描述了用于口服或非腸道用藥的含有與包括一個線性聚亞烷基部分和一個親脂部分的聚合物共價偶聯(lián)的多肽結(jié)合穩(wěn)定的多肽組合物，所說的部分彼此之間被相應(yīng)地安排以致于多肽在體內(nèi)對酶促降解具有提高的抗性。
EP511600 A2(i.a.)涉及式[蛋白質(zhì)][Z]n的蛋白質(zhì)衍生物，其中[蛋白質(zhì)]代表一個具有n個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，每個殘基可由一個氨基基團(tuán)通過移走它的一個氫原子而得來，[Z]是由式-CO-W-COOH所代表的一個殘基，其中W是一個可能也含有某些雜原子的二價長鏈烴，n代表在[Z]和[蛋白質(zhì)]之間酰胺鍵數(shù)量的均值。提到該發(fā)明的蛋白質(zhì)衍生物與其來源蛋白相比具有一個極度延長的半壽期，而且它們不表現(xiàn)絲毫的免疫原性。還提到，胰島素是制備該發(fā)明的衍生物的蛋白質(zhì)之一，但在EP511600中沒有公布特定的胰島素衍生物，也沒有任何關(guān)于優(yōu)選的[Z]或?yàn)楂@得有用的胰島素衍生物[Z]應(yīng)被引入的優(yōu)選位點(diǎn)的描述。
在本說明中，無論何時在復(fù)數(shù)或普通意義上使用胰島素，意在包括天然胰島素，胰島素類似物及它們的衍生物。這里所用的胰島素衍生物意指一種分子結(jié)構(gòu)與人胰島素分子結(jié)構(gòu)相似，包括在CysA7和CysB7之間及在CysA20和CysB19之間的二硫鍵和在CysA6和CysA11之間的鏈內(nèi)二硫鍵并具有胰島素活性的多肽。
然而，仍然有對含有注射后存在于溶液中且具有最小的炎性和免疫原性性質(zhì)胰島素的溶液形式的長效可注射胰島素組合物的需要。
本發(fā)明的一個目的是提供具有延長的作用形象的人胰島素衍生物，它們在生理pH值下是可溶的。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種含有本發(fā)明的人胰島素衍生物的藥物組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種制備本發(fā)明的人胰島素衍生物的方法。
發(fā)明概述令人驚奇的是，已經(jīng)證明某些胰島素衍生物在其B鏈N-末端氨基酸的氨基基團(tuán)上連有一個含12到40個碳原子的親脂取代基或者在其B鏈C-末端氨基酸的羧基基團(tuán)上連有一個含12到40個碳原子的親脂取代基，這些胰島素衍生物具有延長的作用形象，并且在生理性PH值下是可溶解的。
因而，在其最寬的意義上，本發(fā)明涉及一種具有如下序列的胰島素衍生物
B-鏈(續(xù))Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa(序列號2)25 26 27 28 29 30其中，在A21位點(diǎn)上Xaa是除Lys、Arg和Cys外的任何可編碼氨基酸；在B1，B2，B3，B26，B27，B28和B29位點(diǎn)上的Xaa是彼此獨(dú)立的除Cys外的任何可編碼氨基酸或缺失；在B30位點(diǎn)上的Xaa是除Cys外的任何可編碼氨基酸、不含有Cys或Arg的二肽、不含有Cys或Arg的三肽、不含有Cys或Arg的四肽或缺失；而且B鏈N-端氨基酸的氨基基團(tuán)連有一個親脂基團(tuán)W，這個基團(tuán)具有12到40個碳原子并且選擇性地含有一個可帶負(fù)電的基團(tuán)，或者B鏈C-端氨基酸的羧基基團(tuán)連有一個親脂基團(tuán)Z，這個基團(tuán)具有12到40個碳原子并且選擇性地含有一個可帶負(fù)電的基團(tuán)，條件是如果在B1、B2和B3位點(diǎn)上的一個或多個氨基酸缺失，那么通過從始終被定為7號的CysB7向下計(jì)數(shù)來確定N-端氨基酸的數(shù)，且(a)當(dāng)B1-B2-B3是Phe-Val-Asn和A21是Asn及B26-B27-B28-B29-B30是Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr或Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala時，那么所說的W或Z始終含有一個可帶負(fù)電的基團(tuán)；和(b)當(dāng)缺失B29和B30且上面所定義的基團(tuán)Z存在于B鏈的C-端氨基酸上以及B1、B2和B3均沒有缺失時，那么B1-B2不是Phe-Val，或者B26-B27-B28不是Tyr-Thr-Pro，或B1-B2和B26-B27-B28都與所說的序列不同；和(c)當(dāng)缺失B29和B30且上面所定義的基團(tuán)Z存在于B鏈的C-端氨基酸上以及B1、B2或B3中的一個缺失時，那么B鏈N-端氨基酸不是Val，或B26-B27-B28不是Tyr-Thr-Pro，或B鏈的N-端氨基酸不為Val且序列B26-B27-B28不是Tyr-Thr-Pro。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種具有如下序列的胰島素衍生物
B-鏈(續(xù))Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa(序列號2)25 26 27 28 29 30其中，在A21位點(diǎn)上的Xaa是除Lys、Arg和Cys外的任何可編碼的氨基酸。
在B1、B2、B3、B26、B27、B28、B29和B30位點(diǎn)上的Xaa是彼此獨(dú)立的除Cys外的任何可編碼氨基酸或缺失；且B鏈N-端氨基酸的氨基基團(tuán)上連有一個親脂基團(tuán)W，這個基團(tuán)具有12到40個碳原子并選擇性地含有一個可帶負(fù)電的基團(tuán)，或者B鏈C-端氨基酸的羧基基團(tuán)連有一個親脂基團(tuán)Z，這個基團(tuán)具有12到40個碳原子并且選擇性地含有一個可帶負(fù)電的基團(tuán)，條件是如果在B1、B2和B3位點(diǎn)上的一個或多個氨基酸缺失那么通過從始終被定為7號的CysB7向下計(jì)數(shù)來確定N-端氨基酸的數(shù)，和(a)當(dāng)B1-B2-B3是Phe-Val-Asn和A21是Asn及B26-B27-B28-B29-B30是Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr或Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala時，那么所說的W或Z始終含有一個可帶負(fù)電的基團(tuán)；和
(b)當(dāng)缺失B29和B30且上面所定義的基團(tuán)Z存在于B鏈的C-端氨基酸上以及B1、B2和B3均沒有缺失時，那么B1-B2不是Phe-Val或B26-B27-B28不是Tyr-Thr-Pro或B1-B2和B26-B27-B28都與所說的序列不同；和(c)當(dāng)缺失B29和B30且上面所定義的基團(tuán)Z存在于B鏈的C-端氨基酸上以及B1、B2或B3中的一個缺失時，那么B鏈N-端氨基酸不為Val或B26-B27-B28不為Tyr-Thr-Pro或B鏈的N-端氨基酸不為Val且序列B26-B27-B28不為Tyr-Thr-Pro。
當(dāng)一個親脂基團(tuán)W被連于B鏈N-末端氨基酸的α-氨基基團(tuán)上時，在α-氨基基團(tuán)和W之間的鍵優(yōu)選為酰胺鍵，其中由B鏈的N-末端氨基基團(tuán)組成胺部分和在W中所含的一個基團(tuán)組成羧基部分。
當(dāng)一個親脂基團(tuán)Z被連于B鏈C-末端氨基酸的羧基基團(tuán)上時，在羧基基團(tuán)和Z之間的鍵優(yōu)選為酰胺鍵，其中由C-末端羧基基團(tuán)組成羧基部分和在Z中所含的一個氨基基團(tuán)組成胺部分。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種如上面所描述的在B鏈N-末端氨基酸的α-氨基基團(tuán)上連有一個親脂基團(tuán)W的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種如上面所描述的在B鏈C-末端氨基酸的羧基基團(tuán)上連有一個親脂基團(tuán)Z的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在A21位點(diǎn)上的氨基酸選自Ala、Asn、Gln、Glu、Gly和Ser的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在B1位點(diǎn)上的氨基酸是Phe的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在B1位點(diǎn)上的氨基酸缺失的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在B2位點(diǎn)上的氨基酸選自Ala和Val的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在B3位點(diǎn)上的氨基酸 選自Asn、Gln、Glu和Thr的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在B26位點(diǎn)上的氨基酸是Tyr的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在B27位點(diǎn)上的氨基酸是Thr的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在B28位點(diǎn)上的氨基酸是Pro的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在B29位點(diǎn)上的氨基酸是Lys或Thr的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在B28位點(diǎn)上的氨基酸是Lys和在B29位點(diǎn)上的氨基酸是Pro的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在B30位點(diǎn)上的氨基酸是Thr或ε-?；疞ys的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在序列號2中位點(diǎn)30上的Xaa被指定為二肽Thr-Lys的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在序列號2中位點(diǎn)30上的Xaa被指定為二肽Gly-Lys的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在序列號2中位點(diǎn)30上的Xaa被指定為三肽Glu-Ser-Lys的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在序列號2中位點(diǎn)30上的Xaa被指定為三肽Thr-Gly-Lys的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在序列號2中位點(diǎn)30上的Xaa被指定為四肽Thr-Gly-Gly-Lys的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在序列號2中位點(diǎn)30上的Xaa被指定為四肽Thr-Glu-Gly-Lys的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在序列號2中位點(diǎn)30上的Xaa被指定為四肽Gly-Asp-Thr-Lys的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種其B鏈的C-末端氨基酸是ε-酰化Lys且與C-末端氨基酸毗鄰的氨基酸為Gly的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種其親本胰島素為des(B30)胰島素的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種其親本胰島素為des(B30)人胰島素的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種其親本胰島素為des(B28-B30)胰島素的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種其親本胰島素為des(B27-B30)胰島素的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種其親本胰島素為des(B26-B30)胰島素的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在B28位點(diǎn)上的氨基酸為Pro且在B29位點(diǎn)上的氨基酸為Thr的胰島素衍生物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種如上面所提到的在其B鏈N-末端的α-氨基基團(tuán)上連有一個基團(tuán)W的胰島素衍生物，W是通式為CH3(CH2)nCH(COOH)NHCO(CH2)2CO-的一種基團(tuán)，其中n是9到15之間的一個整數(shù)。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種如上面所提到的在其B鏈N-末端的α-氨基基團(tuán)上連有一個基團(tuán)W的胰島素衍生物，W是通式為CH3(CH2)rCONHCH(COOH)(CH2)2CO-的一種基團(tuán)，其中r是9到15之間的一個整數(shù)。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種如上面所提到的在其B鏈N-末端的α-氨基基團(tuán)上連有一個基團(tuán)W的胰島素衍生物，W是通式為CH3(CH2)sCONHCH((CH2)2COOH)CO-的一種基團(tuán)，其中s是9到15之間的一個整數(shù)。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種如上面所提到的在其B鏈的C-末端氨基酸上連有一個基團(tuán)Z的胰島素衍生物，Z是通式為-NHCH(COOH)(CH2)4NHCO(CH2)mCH2的一種基團(tuán)，其中m是8到18之間的一個整數(shù)，也就是說Z是一個Nε-?；嚢彼釟埢?。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種如上面所提到的在其B鏈的C-末端氨基酸上連有一個基團(tuán)Z的胰島素衍生物，Z是通式為-NHCH(COOH)(CH2)4NHCO CH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3的一種基團(tuán)，其中p是10到16之間的一個整數(shù)。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種如上面所提到的在其B鏈的C-末端氨基酸上連有一個基團(tuán)Z的胰島素衍生物，Z是通式為-NHCH(COOH)(CH2)4NHCO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3的一種基團(tuán)，其中q是10到16之間的一個整數(shù)。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種如上面所提到的帶有基團(tuán)Z的胰島素衍生物，Z含部分或完全氫化的環(huán)戊并菲骨架。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種如上面所提到的帶有基團(tuán)Z的胰島素衍生物，Z是一種?；被?，特別是?；嚢彼帷?br> 在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種如上面所提到的在其B鏈的C-末端氨基酸上連有一個基團(tuán)Z的ThrB29人胰島素。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種如上面所提到的在其B鏈的C-末端氨基酸上連有一個基團(tuán)Z的des(B28-B30)人胰島素。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種如上面所提到的在其B鏈的C-末端氨基酸上連有一個基團(tuán)Z的des(B27-B30)人胰島素。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種如上面所提到的在其B鏈的C-末端氨基酸上連有一個基團(tuán)Z的des(B26-B30)人胰島素。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在制備用于治療糖尿病的藥物中本發(fā)明的胰島素衍生物的應(yīng)用。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括治療有效量的本發(fā)明的胰島素衍生物和一種藥學(xué)上可用載體的用于在需要這種治療的患者中治療糖尿病的藥物組合物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括治療有效量的本發(fā)明的胰島素衍生物并混有起效迅速的一種胰島素或胰島素類似物和一種藥學(xué)上可用載體的用于在需要這種治療措施的患者中治療糖尿病的藥物組合物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種含有在生理pH值條件下可溶的本發(fā)明胰島素衍生物的藥物組合物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種含有在大約6.5到8.5之間的pH值條件下可溶的本發(fā)明胰島素衍生物的藥物組合物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種含有本發(fā)明的胰島素衍生物的長效藥物組合物。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種含有從大約120nmol/L到約1200nmol/L，優(yōu)選大約600nmol/L本發(fā)明胰島素衍生物的藥物組合物溶液。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括將治療有效量的本發(fā)明胰島素衍生物和一種藥學(xué)上可用載體一同給予患者，在需要這種的患者中治療糖尿病的方法。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括將治療有效量的本發(fā)明的胰島素衍生物與起效迅速的一種胰島素或胰島素類似物相混合，并和一種藥學(xué)上可用載體一同給予患者，在需要這種的患者中治療糖尿病的方法。
下面是優(yōu)選的本發(fā)明胰島素衍生物的實(shí)例(NεB30-十四烷酰)ThrB29，LysB30人胰島素、(NεB28-十四烷酰)LysB28des(B29，B30)人胰島素、(NεB27-十四烷酰)LysB27des(B28-B30)人胰島素，和(NεB26-十四烷酰)LysB26des(B27-B30)人胰島素。
(NεB32-十四烷酰)GluB30，SerB31，LysB32人胰島素。
(NεB29-乙?；琋εB32-十四烷酰)GluB30，SerB31，LysB32人胰島素。圖的簡單描述參考附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，其中

圖1表示質(zhì)粒pKV153、pKV159、pJB173、pJB174和pJB175的構(gòu)建。
圖2a，由圖2b接續(xù)，展示907到1500位的pMT742序列和在實(shí)施例1中用于PCR1A、PCR1B和PCR1C的寡核苷酸#194、#593、#2371和#3075。與MF-α前前導(dǎo)序列原(氨基酸號1-85)和具有氨基酸序列B(1-29)AlaAlaLysA(1-21)的胰島素前體(其中A(1-21)是人胰島素的A鏈，B(1-29)是Thr(B30)缺失的人胰島素的B鏈)相應(yīng)的138個氨基酸序列在編碼序列(氨基酸號86-138)下列出。
本發(fā)明的詳細(xì)描述術(shù)語這里所用的氨基酸殘基的三個字母的密碼和一個字母的密碼都是那些在《生物化學(xué)雜志》(J.Bool.Chem.)243，3558頁(1968)中所制定的。
在DNA序列中，A是腺嘌呤，C是胞嘧啶，G是鳥嘌呤而T是胸腺嘧啶。
使用了下列縮略詞
DMSO為二甲基亞砜，DMF為二甲基甲酰胺，Boc為叔丁氧羰基，NMP為1-甲基-2吡咯烷酮，TFA為三氟乙酸，X-OSu為一種N-羥基琥珀酰亞胺酯X為一個酰基基團(tuán)，RP-HPLC為反相高效液相層析。
制備親脂胰島素衍生物本發(fā)明的胰島素衍生物可以按照下面的描述來制備1.以在B30位點(diǎn)上的一個可由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基例如蘇氨酸(人胰島素)或丙氨酸(豬胰島素)為特點(diǎn)的胰島素衍生物1.1從人胰島素起始的通過在N-末端的氨基基團(tuán)上連接一個親脂基團(tuán)W來修飾的胰島素將人胰島素用一種Boc試劑(例如二碳酸二叔丁基酯)處理形成(A1，B29)-二Boc人胰島素，即A-鏈的N-末端和LysB29的ε-氨基基團(tuán)被一個Boc-基團(tuán)保護(hù)的人胰島素。經(jīng)選擇性的純化后，例如利用HPLC，通過將產(chǎn)物與一種式W-OSu的N-羥基琥珀酰亞胺酯(其中W如上面所定義是一個在B-鏈的N-末端α-氨基基團(tuán)上可被引入的?；?進(jìn)行反應(yīng)在PheB1的α-氨基基團(tuán)上引入一個酰基。在最后的步驟里，用TFA除去Boc-基團(tuán)并分離產(chǎn)物NαB1-W人胰島素。
2.在B30位點(diǎn)上沒有氨基酸殘基的胰島素衍生物，即des(B30)胰島素2.1從人胰島素或豬胰島素起始在銨緩沖液中用羧肽酶A處理，人胰島素和豬胰島素都可產(chǎn)生des(B30)胰島素。經(jīng)過選擇性的純化后，用一種Boc-試劑(例如，二碳酸二叔丁基酯)處理des(B30)胰島素，形成(A1，B29)-二Boc des(B30)胰島素。經(jīng)選擇性的純化后，例如利用HPLC，通過將產(chǎn)物與一種式W-OSu的N-羥基琥珀酰亞胺酯(其中W是將引入的?；?進(jìn)行反應(yīng)在B1位點(diǎn)氨基酸的α-氨基基團(tuán)上引入一個酰基。在最后的步驟里，用TFA除去Boc-基團(tuán)并分離產(chǎn)物(NαB1-W)des(B30)胰島素。
2.2從一單鏈人胰島素起始可用一種單鏈人胰島素前體作為起始材料，這種單鏈人胰島素前體在B1位點(diǎn)上帶有通過一個精氨酸殘基連接到B1上的一個突出端(Ext)并具有從B26、B27、B28或B30中的一個C-末端賴氨酸到A1的一個橋連。橋連優(yōu)選一種式Y(jié)n-Arg的肽，其中Y是除了半胱氨酸、賴氨酸和精氨酸外的一個可編碼氨基酸，n是0或介于1到35之間的一個整數(shù)。當(dāng)n＞1時，Y可以是不同的氨基酸。從B26、B27、B28或B30上的Lys到A1的橋連優(yōu)選的實(shí)施例是AlaAlaArg、SerArg、SerAspAspAlaArg和Arg(歐洲專利163529號)。對這樣一種通式為Ext-Arg-B(1-Q)-Yn-Arg-A(1-21)的前體，其中Q是26、27、28或30，用一種賴氨酰內(nèi)肽酶如水解無色桿菌蛋白酶來處理，產(chǎn)生Ext-Arg-B(1-Q)-Yn-Arg-A(1-21)胰島素。用一種通式為X-OSu的N-羥基琥珀酰亞胺酯，其中X是一個?；鶊F(tuán)，對這種中間體的酰基化在LysBQ的ε-氨基基團(tuán)上以及A和B鏈N-末端的氨基基團(tuán)上引入?；鶊F(tuán)X，產(chǎn)生(NεBQ-X)X-Ext-Arg-B(1-Q)X-Yn-Arg-A(1-21)胰島素。在由水和一種合適的有機(jī)溶劑如DMF、DMSO或低級醇所組成的混合物中用胰蛋白酶處理這種中間體產(chǎn)生所要的衍生物Z-人胰島素，其中Z為LysεBQ-X。
藥物組合物含有本發(fā)明的人胰島素衍生物的藥物組合物可對需要這種治療的患者非腸道用藥?？衫米⑸淦?，選擇性地利用筆式注射器通過皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)注射來進(jìn)行非腸道給藥。另外，也可利用灌注泵進(jìn)行非腸道給藥。進(jìn)一步的選擇是一種可以將人胰島素衍生物以噴鼻的方式給藥的粉末或液體的組合物。
含有本發(fā)明化合物的藥物組合物可以通過傳統(tǒng)的技術(shù)如在《Remington藥物科學(xué)》(Ramington′s Pharmaceutical Sciences)，1985中所描述的來制備。
例如，本發(fā)明的可注射人胰島素組合物可利用包括將組合物成分適宜地溶解和混合以獲得預(yù)期的終產(chǎn)物的藥物工業(yè)常規(guī)技術(shù)來制備。
例如，根據(jù)一個程序，將人胰島素衍生物溶于比所要制備的組合物終體積稍小的一定量的水中。根據(jù)需要加入等滲劑、防腐劑和緩沖液，并且如果需要的話，利用酸如鹽酸或堿如氫氧化鈉水溶液來調(diào)節(jié)溶液的pH值。最后，用水調(diào)節(jié)溶液的體積，以達(dá)到預(yù)期的組分濃度。
等滲劑的實(shí)例是氯化鈉、甘露醇和甘油。
防腐劑的實(shí)例是苯酚、間位甲酚、對羥基苯甲酸甲酯和苯甲醇。
適宜緩沖液的實(shí)例是乙酸鈉和磷酸鈉。
本發(fā)明的特定胰島素的優(yōu)選藥物組合物是六聚體配合物的溶液。典型的是，六聚體配合物通過在每個六聚體中用兩個或更多的鋅離子和三個或更多分子的酚化合物如苯酚或間位甲酚或它們的混合物來穩(wěn)定。
在一特定的實(shí)施方案中，以可溶性六聚體配合物的形式提供了含有兩種不同胰島素的組合物，其中一個具有延長的作用形象，另一個具有迅速的作用。六聚體配合物典型地是通過在每個六聚體中用兩個或更多的鋅離子和三個或更多分子的酚化合物如苯酚或間位甲酚或它們的混合物來穩(wěn)定。配合物是特定胰島素六聚體的混合物，并且混合的六聚體中兩種不同胰島素的比例從1∶5到5∶1。
例如，用于經(jīng)鼻給藥的一種本發(fā)明胰島素衍生物的組合物可以按照在歐洲專利272097號(to Novo Nordisk A/S)中所描述的方法制備。
本發(fā)明的胰島素組合物可用于治療糖尿病。對任何患者的最適劑量水平將取決于許多因素，包括所用特定人胰島素衍生物的效能、患者的年齡、體重、機(jī)體的活動和飲食，取決于可能聯(lián)合應(yīng)用的其他藥物以及糖尿病的嚴(yán)重程度。建議由那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員按照與已知的胰島素組合物相似的方式為每個單獨(dú)的患者確定本發(fā)明人胰島素的劑量。
方便的是，本發(fā)明的人胰島素衍生物可與其它類型的胰島素混合使用，例如人胰島素或豬胰島素或可以更迅速地發(fā)揮作用的胰島素類似物。例如在公布號EP214826(Novo Nordisk A/S)、EP375437(Novo NordiskA/S)和EP383472(Novo Nordisk A/S)的歐洲專利申請中描述有這種胰島素類似物的實(shí)例。
本發(fā)明由下面的實(shí)施例進(jìn)一步說明，然而這些實(shí)施例不應(yīng)視為對保護(hù)范圍的限制。因而在前面的描述和下面的實(shí)施例中所公布的特征，單獨(dú)地和其任何組合都可能是以多種形式實(shí)施本發(fā)明的材料。
實(shí)施例質(zhì)粒和DNA材料所有的表達(dá)質(zhì)粒均為cPOT型。這種質(zhì)粒在EP專利申請171142號中被描述，并且以含有粟酒裂殖糖酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶基因(POT)用于質(zhì)粒篩選和穩(wěn)定化為特點(diǎn)。一含有POT基因的質(zhì)粒可以從一種保藏的大腸桿菌菌株(ATCC39685)中獲得。此外，質(zhì)粒還含有啤酒糖酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶啟動子和終止子(PTPI和TTPI)。除了EcoRI-XbaI限制性酶切位點(diǎn)所確定的含有MF-α前前導(dǎo)序列原/產(chǎn)物編碼區(qū)的區(qū)域外，它們與pMT742(Egel-Mitani，M等，《基因(Gene)，73(1988)113-120；見圖1)相同。pMT742質(zhì)粒的EcoRI/XbaI片段本身編碼啤酒糖酵母的交配因子(MF)α的前前導(dǎo)序列原的序列，其后跟有帶有一個連接B29和A1的Ala-Ala-Lys橋連的胰島素前體MI3(即B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)(見圖2)。
合成的DNA片段在一個自動化DNA合成儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)型380A(Applied Brosystems Model 380A))上用亞磷酰胺化學(xué)和商品化的試劑合成(Beaucage，S.L和Caruthers，M.H.，《四面體快報》(Tetrahedron Letters)22(1981)1859-1869)所有其它方法和材料都利用本領(lǐng)域的一般知識(見，例如，Sambrook，J，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》，(Molecular CloningA Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版(ColdSpring Harbour Laboratory Press)，紐約，1989)。分析所制備的胰島素前體的分子質(zhì)量通過質(zhì)譜法(MS)測得，或利用Bio-Ion 20設(shè)備(Bio-Ion Nordic AB，Uppsala，Sweden)通過等離子體解吸質(zhì)譜法(PDMS)或利用API III生物分子質(zhì)量分析儀(PerkinElmer Sciex Instraments，Thornhill，Canada)通過電噴射質(zhì)譜法(ESMS)來獲得。
在LiChrosorb RP18(5μm，250×4mm)HPLC柱上利用A)含有10％乙腈的PH7.3的0.1M的磷酸鹽緩沖液和B)50％乙腈水溶液的混合物在40℃通過無梯度洗脫來測定相對人胰島素的胰島素衍生物的親脂性，K′rel。利用在214nm處洗脫物的吸光值對洗脫進(jìn)行監(jiān)控。空隙時間t0通過注射0.1mM硝酸鈉來確定，通過改變A和B溶液的比例將人胰島素的保留時間t人調(diào)節(jié)至至少2t0。K′rel被定義為(t衍生物-t0)/(t人-t0)。
作為對本發(fā)明的化合物長效的衡量，研究了在豬中的清除率，并測定了T50％。T50％是用一外部γ-計(jì)數(shù)儀檢測的當(dāng)50％的A14 Tyr(125I)標(biāo)記的類似物從注射位點(diǎn)消失的時間(Ribel，U等，以豬作為人皮下吸收的模型，M.serrano-Rios和P.J.Lefebre(編輯)《糖尿病》(Diabetes)1985；《國際糖尿病聯(lián)合會第12次大會進(jìn)展》，西班牙馬德里，1985；《醫(yī)學(xué)文摘》(Excerpta Medica)，Amsterdam，(1986)891-96)。
實(shí)施例1利用啤酒糖酵母MFα前前導(dǎo)序列原在酵母菌株yKV153中的Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體的合成。
合成下列寡核苷酸#593 5′-CCAAGTACAAAGCTTCAACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAACGAATCTTGTAGCCTTTGGTTCAGCTTCAGCTTCAGCTTCTTCTCTTTTATCCAAAGAAACACC-3′#94 5′-TAAATCTATAACTACAAAAAACACATA-3′#3075 5′-TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCTAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATTG-3′#2371 5′TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3′利用Gene Amp PCR試劑盒(Perkin Elmer，761 Main Avewalk，CT，USA)按照制造商的說明進(jìn)行下述的兩個聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(見圖2)。
PCR1A0.2μl pMT742質(zhì)粒模板4.0μl寡核苷酸#593(100pmol)4.0μl寡核苷酸#94(100pmol)10.0μl 10×PCR緩沖液10.0μl 2.5mM dNTP
0.5μl Taq聚合酶71.3μl水PCR1B0.2μl pMT742質(zhì)粒模板4.0μl寡核苷酸#3075(100pmol)4.0μl寡核苷酸#2371(100pmol)10.0μl 10×PCR緩沖液10.0μl 2.5mM dNTP0.5μl Taq聚合酶71.3μl水在這兩種情況下都以94℃1分鐘、45℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行兩個循環(huán)。
利用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)(Sambrook等，《分子克隆》(Molecular cloning)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，1989)將20μl每種PCR混合物上樣至2％瓊脂糖凝膠中，并進(jìn)行電泳。從瓊脂糖凝膠將所得到的DNA片段(PCR1A中為452bp和PCR1B中為170bp)切除，并用基因純化試劑盒(Bio101 Inc.，PO BOX2284，La Jolla，CA，USA)按照制造商的說明進(jìn)行分離。將純化的DNA片段溶于100μl水中。
進(jìn)行下列PCRPCR1C1.0μl從PCR1A中分離的DNA片段1.0μl從PCR1B中分離的DNA片段10.0μl 10×PCR緩沖液10.0μl 2.5mM dNTP0.5μl Taq聚合酶69.5μl水以94℃1分鐘、45℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行兩個循環(huán)。
然后加入4μl的寡核苷酸#94(100pmol)和4.0μl的寡核苷酸#2371(100pmol)，并以94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行15個循環(huán)。
將PCR混合物上樣至1％瓊脂糖凝膠中，并將所獲得的594bp的片段按照所描述的利用基因純化試劑盒進(jìn)行純化。將純化的PCR片段溶于20μl水和限制性內(nèi)切酶的緩沖液中，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI(NewEngland Biolabs，Inc.MA，USA)進(jìn)行酶切。將所獲的550bp EcoRI/XbaI限制性酶切片段在瓊脂糖凝膠中電泳，并利用基因純化試劑盒回收和純化。
在兩個獨(dú)立的限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)中，將質(zhì)粒pMT742用i)限制性內(nèi)切酶ApaI和XbaI以及ii)限制性內(nèi)切酶ApaI和EcoRI進(jìn)行酶切。從這些消化反應(yīng)中分離8.6kb的ApaI/XbaI限制性酶切片段和2.1kb的ApaI/EcoRI限制性酶切片段。
將三個片段(即，來自PCR1C的550bp的EcoRI/XbaI限制性酶切片段和來自pMT742的8.6kb的ApaI/XbaI限制性酶切片段和2.1kb的ApaI/EcoRI限制性酶切片段)利用T4 DNA連接酶和標(biāo)準(zhǔn)的條件(Sambrook等，《分子克隆》冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，1989)連接在一起(見圖1)。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(Apr-)，隨后篩選氨芐青霉素抗性菌。利用標(biāo)準(zhǔn)的DNA微型柱技術(shù)(Sambrook等，《分子克隆》冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，1989)從所獲的大腸桿菌集落中提取質(zhì)粒并用合適的限制性內(nèi)切酶(即EcoRI、ApaI和XbaI)進(jìn)行鑒定。通過DNA序列分析(利用U.S.BiochemicalCorp.的測序酶試劑盒按照制造商的建議)證明所篩選的被稱為pKV153的質(zhì)粒含有編碼MFα前前導(dǎo)序列原/Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體的正確序列。
將pKV153轉(zhuǎn)化到啤酒糖酵母菌株MT663中，并按照在公布號214826的歐洲專利申請中的描述來篩選在葡萄糖中生長的菌。
所獲的酵母菌株被稱為yKV153并通過HPLC和質(zhì)譜法被證實(shí)在培養(yǎng)基中產(chǎn)生了Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體。
實(shí)施例2LysB30(Nε-十四烷酰)ThrB29人胰島素的合成
2a.利用啤酒糖酵母MFα前前導(dǎo)序列原在酵母菌株yKV159中的Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-28)-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體的合成。
合成下列寡核苷酸#3881 5′-TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCTACCAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATTGTCG-3′#2371 5′-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3′利用Gene Amp PCR試劑盒按照上面的描述進(jìn)行下述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
PCR20.2μl pKV153質(zhì)粒模板(來自實(shí)施例1)4.0μl寡核苷酸#3881(100pmol)4.0μl寡核苷酸#2371(100pmol)10.0μl 10×PCR緩沖液10.0μl 2.5mM dNTP0.5μl Taq聚合酶71.3μl水以94℃1分鐘、45℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行兩個循環(huán)，隨后以94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行11個循環(huán)。
將PCR混合物上樣至2％瓊脂糖凝膠中，并將所獲得的174bp的片段按所描述的利用基因純化試劑盒進(jìn)行純化。將純化的PCR片段溶于20μl水和限制性內(nèi)切酶的緩沖液中，并用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI進(jìn)行酶切。將所獲的153bp HindIII/XbaI限制性酶切片段在瓊脂糖凝膠中電泳，并利用基因純化試劑盒回收和純化。
在兩個獨(dú)立的限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)中，將質(zhì)粒pMT742用限制性內(nèi)切酶ApaI和XbaI而對pKV153(來自實(shí)施例1)用限制性內(nèi)切酶ApaI和EcoRI進(jìn)行酶切。從這些消化反應(yīng)中分離來自pMT742的8.6kb的ApaI/XbaI限制性酶切片段和來自pKV153的2.1kb的ApaI/EcoRI限制性酶切片段。
如上所述，將三個片段(即，來自PCR2中的550bp的EcoRI/XbaI限制性酶切片段和來自pMT742中8.6kb的ApaI/XbaI限制性酶切片段和來自pKV153的2.1kb的ApaI/EcoRI限制性酶切片段)利用T4 DNA連接酶連接在一起(見圖1)。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(Apr-)隨后篩選氨芐青霉素抗性菌。從所獲的大腸桿菌集落中分離質(zhì)粒并按照所描述的用合適的限制性內(nèi)切酶(即HindIII、ApaI和XbaI)進(jìn)行鑒定。
通過DNA序列分析證明所篩選的被稱為pKV159的質(zhì)粒含有編碼MFα前前導(dǎo)序列原/Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-28)-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體的正確序列。
將pKV159轉(zhuǎn)化到啤酒糖酵母菌株MT663中，并按所描述的來篩選在葡萄糖中生長的菌。
所獲的酵母菌株被稱為yKV159并通過HPLC和質(zhì)譜法被證實(shí)在培養(yǎng)基中產(chǎn)生了Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-28)-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體。
2b.Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-28)-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體的分離。
將yKV159菌株發(fā)酵72小時并收集5升發(fā)酵液。通過離心分離酵母細(xì)胞，用硫酸將pH調(diào)節(jié)至3.0并在填充有300ml Streamline_SP離子交換劑的Pharmacia Strealine_50柱濃縮胰島素前體。經(jīng)過用pH值為3.6的25mM檸檬酸鹽緩沖液洗柱后，用0.5M NH3洗脫前體，并收集從300到600ml的組分。將pH調(diào)節(jié)至2.5，并利用15μ100_孔徑的球形C18二氧化硅，以0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4緩沖液中從23到33％乙腈的梯度通過RP-HPLC來純化前體。在大約27-28％乙腈下洗脫了前體。在0.5M乙酸中將含有前體中央主峰的合并液在Sephadex_G-50 F上通過凝膠過濾脫鹽，并通過冷凍干燥分離前體。產(chǎn)量486mg。
2c.Ala-Thr-Arg-B(1-28)-Thr-Lys，Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素的合成。
將如上所述獲得的486mg單鏈前體溶于30ml pH9.0的0.05M谷氨酸鹽緩沖液中，并加入固定化的水解無色桿菌蛋白酶凝膠(見PCT/DK94/00347，45頁)。在30℃輕輕地攪拌5分鐘后，通過過濾除去凝膠，并通過加入10ml乙醇、845mg二水檸檬酸三鈉和78mg氯化鋅使雙鏈伸展的胰島素結(jié)晶化。將pH值調(diào)節(jié)至6.1并儲存于4℃過夜后，通過離心收集晶體，用異丙醇洗滌兩次，真空干燥。產(chǎn)量450mg。
2d.NαA-5，NαB-3，NεB30-三(十四烷酰)Ala-Thr-Arg-B(1-28)-Thr-Lys，Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素的合成。
將如上所述獲得的450mg雙鏈伸展的胰島素溶于由3.15ml DMSO和0.69ml在NMP中的2M二異丙基乙胺所組成的混合物中。將溶液冷卻至15℃并加入0.69ml 0.3M在DMSO/NMP(1∶1，v/v)中的十四烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。15℃2小時后，通過加入112ml pH被調(diào)節(jié)至10.0的0.01M在乙醇/水(60∶40，v/v)中的甘氨酸緩沖液來終止反應(yīng)。未分離三?；闹虚g產(chǎn)物。
2e.LysB30(Nε-十四烷酰)ThrB29人胰島素的合成。
向前一步所獲得的溶液中加入5ml固定化的胰蛋白酶凝膠(見PCT/DK94/00347，46頁)。在15℃輕輕攪拌16小時后，通過過濾除去凝膠，將pH值調(diào)節(jié)至9.0并將溶液注入一個2.5×25cm的QAE-Sephadex_A-25柱。利用一種用NH3將pH調(diào)節(jié)至9.0的在乙醇/水(60∶40，v/v)中的0.12M NH4Cl緩沖液以17.3ml/h的速率進(jìn)行無梯度洗脫。洗脫650ml后從柱子中出現(xiàn)標(biāo)題化合物，并收集從650到754ml的洗脫液。最后，通過在Sephadex_G-50 Fine上凝膠過濾將緩沖液換為0.01M的NH4HCO3，并且通過冷凍干燥分離干燥狀態(tài)的產(chǎn)物。產(chǎn)量91mg。
通過MS測定的標(biāo)題化合物的分子質(zhì)量6020±6；理論值6018。
通過MS測定的B-鏈的分子質(zhì)量3642±5；理論值3640。
通過MS測定的由V8蛋白酶消化的B-鏈C-末端片段的分子質(zhì)量1326±2；理論值1326。
相對親脂性，K′rel＝113。
豬皮下注射后消失的半壽期，T50％20.3±5.2小時(n＝6)。
實(shí)施例3LysB28(Nε-十四烷酰)des(B29-B30)人胰島素的合成。
3a.利用啤酒糖酵母MFα前前導(dǎo)序列原在酵母菌株yJB173中的Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體的合成。
合成下列寡核苷酸#627 5′-CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTAAGTCTGACGATGCTAG-3′#2371 5′-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3′按照與在實(shí)施例2中相同的方式通過用寡核苷酸#627取代寡核苷酸#3881來構(gòu)建編碼Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)的DNA。
所獲得的質(zhì)粒被稱為pJB173，且表達(dá)Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)的酵母菌株被稱為yJB173。
3b.Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體的分離。
將yJB173菌株發(fā)酵72小時并收集4.8升發(fā)酵液。通過離心分離酵母細(xì)胞，用硫酸將pH調(diào)節(jié)至3.0。電導(dǎo)率為7.8mS/cm。用填充有300mlStreamline_SP離子交換劑的Pharmacia Strealine_50柱濃縮胰島素前體。經(jīng)過用pH值為3.6的25mM檸檬酸鹽緩沖液洗柱后，用0.5M NH3洗脫前體，并收集從300到600ml的組分。在室溫下將游離氨真空蒸發(fā)并用鹽酸將所獲的280ml溶液的pH值調(diào)至9.0。
3c.Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Lys，Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素的合成。
向如上所述獲得的含有118mg單鏈前體的280ml溶液中加入3ml固定化的水解無色桿菌蛋白酶(見PCT/DK94/00347，45頁)。在30℃輕輕攪拌24小時后，通過過濾除去凝膠。將pH值調(diào)至3.5，并通過一個Milipore_0.45μ濾器將溶液過濾。以pH3.5的0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4緩沖液中23-33％乙腈梯度，利用一個2×20cm填充有15μ 100A孔徑的球形C18二氧化硅的柱子以4ml/min和40℃的柱溫進(jìn)行RP-HPLC兩次，純化雙鏈伸展的胰島素。在大約30-31％乙腈下洗脫了雙鏈伸展的胰島素。通過在真空中蒸發(fā)從合并液中除去乙腈，并用一個5×47cm的Sephadex_G-25柱在0.5M乙酸中通過凝膠過濾除去鹽分。通過冷凍干燥分離雙鏈伸展的胰島素。產(chǎn)量110mg。
3d.NαA-5，NαB-3，NεB28-三(十四烷酰)Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Lys，Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素的合成。
將如上所述獲得的110mg雙鏈伸展的胰島素溶于由0.84ml DMSO和0.275ml在NMP中的2M二異丙基乙胺所組成的混合物中。將溶液冷卻至15℃并加入0.185ml在DMSO/NMP(1∶1，v/v)中的0.3M十四烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。15℃2小時后，通過加入32.5ml pH被調(diào)節(jié)至10.0的在乙醇/水(60∶40，v/v)中的0.01M甘氨酸緩沖液來終止反應(yīng)。未分離三酰基化的中間產(chǎn)物。
3e.LysB28(Nε-十四烷酰)des(B29-B30)人胰島素的合成。
向前一步所獲得的溶液中加入1.5ml固定化的胰蛋白酶凝膠(見PCT/DK94/00347，46頁)。在15℃輕輕攪拌18小時后，通過過濾除去凝膠，將pH值調(diào)節(jié)至9.0，并將溶液上樣于一個1.5×21cm的QAE-Sephadex_A-25柱。利用一種用NH3將pH調(diào)節(jié)至9.0的在乙醇/水(60∶40，v/v)中的0.12M NH4Cl緩沖液以10ml/h的速率進(jìn)行無梯度洗脫。洗脫250-390ml后，從柱子中出現(xiàn)標(biāo)題化合物，峰值在330ml。最后，通過在Sephadex_G-50Fine上凝膠過濾將緩沖液換為0.01M的NH4HCO3，并且通過冷凍干燥分離干燥狀態(tài)的產(chǎn)物。產(chǎn)量47mg。
通過MS測定的標(biāo)題化合物的分子質(zhì)量5820±2；理論值5819。
通過MS測定的B-鏈的分子質(zhì)量3444±4；理論值3442。
通過MS測定的由V8蛋白酶消化的B-鏈C-末端片段的分子質(zhì)量1128±2；理論值1128。
相對親脂性，K′rel＝121。
豬皮下注射后消失的半壽期，T50％19.6±3.6h(n＝4)。
實(shí)施例4LysB27(Nε-十四烷酰)des(B28-B30)人胰島素的合成。
4a.利用啤酒糖酵母MFα前前導(dǎo)序列原在酵母菌株yJB174中的Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-26)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體的合成。
合成下列寡核苷酸#628 5-′CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACAAGTCTGACGATGCTAG-3′#2371 5′-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3′按照與實(shí)施例2中相同的方式，通過用寡核苷酸#628取代寡核苷酸#3881來構(gòu)建編碼Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-26)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)的DNA。
所獲得的質(zhì)粒被稱為pJB174，且表達(dá)Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-26)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)的酵母菌株被稱為yJB174。
4b.Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-26)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體的分離。
將yJB174菌株發(fā)酵72小時并收集3.5升發(fā)酵液。通過離心分離酵母細(xì)胞，用硫酸將pH調(diào)節(jié)至3.0，并且為了降低鹽濃度用水將溶液稀釋至8升。導(dǎo)電率為7.9mS/cm。用填充有300ml Streamline_SP離子交換劑的Pharmacia Strealine_50柱濃縮胰島素前體。經(jīng)過用pH值為3.6的25mM檸檬酸鹽緩沖液洗柱后，用0.5M NH3洗脫前體，并收集從300到600ml的組分。在室溫下將游離氨真空蒸發(fā)并用鹽酸將所獲的280ml溶液的pH值調(diào)至9.0。
4c.Ala-Thr-Arg-B(1-26)-Lys，Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素的合成。
向如上所述獲得的280ml單鏈前體的溶液中加入3ml固定化的水解無色桿菌蛋白酶(見PCT/DK94/00347，45頁)。在30℃輕輕攪拌13小時后，通過過濾除去凝膠。將pH值調(diào)至2.5，并通過一個Milipore_0.45μ濾器將溶液過濾。以pH2.5的0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4緩沖液中24-33％乙腈梯度，利用一個2×20cm填充有15μ100A孔徑的球形C18二氧化硅的柱子進(jìn)行RP-HPLC 4次，純化雙鏈伸展的胰島素。在大約30-31％乙腈下洗脫雙鏈伸展的胰島素。通過在真空中蒸發(fā)從合并液中除去乙腈，并用一個5×47cm的Sephadex_G-25柱在0.5M乙酸中通過凝膠過濾除去鹽分。通過冷凍干燥分離雙鏈伸展的胰島素。產(chǎn)量69mg。
4d.NαA-5，NαB-3，NεB27-三(十四烷酰)Ala-Thr-Arg-B(1-26)-Lys，Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素的合成。
將如在4e下所述獲得的62mg雙鏈伸展的胰島素溶于由0.44ml DMSO和0.15ml在NMP中的2M二異丙基乙胺所組成的混合物中。將溶液冷卻至15℃并加入0.096ml在DMSO/NMP(1∶1，v/v)中的0.3M十四烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。15℃2小時后，通過加入17ml pH被調(diào)節(jié)至10.0的在乙醇/水(60∶40，v/v)中的0.01M甘氨酸緩沖液來終止反應(yīng)。未分離三酰基化的中間產(chǎn)物。
4e.LysB27(Nε-十四烷酰)des(B28-B30)人胰島素的合成。
向前一步所獲得的溶液中加入1ml固定化的胰蛋白酶凝膠(見PCT/DK94/00347，46頁)。在15℃輕輕攪拌26小時后，通過過濾除去凝膠，將pH值調(diào)節(jié)至9.0并將溶液注入一個1.5×25.5cm的QAE-Sephadex_A-25柱。利用一種用NH3將pH調(diào)節(jié)至9.0的在乙醇/水(60∶40，v/v)中的0.12M NH4Cl緩沖液以17.3ml/h的速率進(jìn)行無梯度洗脫。洗脫360ml后，從柱子中出現(xiàn)標(biāo)題化合物，并收集從272到455ml的洗脫液。最后，通過在Sephadex_G-50 Fine上凝膠過濾將緩沖液換為0.01M的NH4HCO3，并且通過冷凍干燥分離干燥狀態(tài)的產(chǎn)物。產(chǎn)量38mg。
通過MS測定的標(biāo)題化合物的分子質(zhì)量5720±6；理論值5718。
通過MS測定的B-鏈的分子質(zhì)量3342±4；理論值3340。
通過MS測定的由V8蛋白酶消化的B-鏈C-末端片段的分子質(zhì)量1027±2；理論值1027。
相對親脂性，K′rel＝151。
豬皮下注射后消失的半壽期，T50％15.2±2.2 h(n＝5)。
實(shí)施例5LysB26(Nε-十四烷酰)des(B27-B30)人胰島素的合成。
5a.利用啤酒糖酵母MFα前前導(dǎo)序列原在酵母菌株yJB173中的Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-25)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體的合成。
合成下列寡核苷酸
#629 5′-CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCAAAGTCTGACGATGCTAG-3′#2371 5′-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3′按照與實(shí)施例2中相同的方式通過用寡核苷酸#629取代寡核苷酸#3881來構(gòu)建編碼Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-25)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)的DNA。
所獲得的質(zhì)粒被稱為pJB175，且表達(dá)Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-25)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)的酵母菌株被稱為yJB175。
5b.Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-25)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體的分離。
將yJB175菌株發(fā)酵72小時并收集3.7升發(fā)酵液。通過離心分離酵母細(xì)胞，用硫酸將pH調(diào)節(jié)至3.0，并且為了降低鹽濃度用水將溶液稀釋至8.5升。所得的導(dǎo)電率為7.7mS/cm。用填充有300ml Streamline_SP離子交換劑的Pharmacia Strealine_50柱濃縮胰島素前體。經(jīng)過用pH值為3.6的25mM檸檬酸鹽緩沖液洗柱后，用0.5M NH3洗脫前體，并收集從300到600ml的組分。在室溫下將游離氨真空蒸發(fā)，并用鹽酸將所獲的270ml溶液的pH值調(diào)至9.0。
5c.Ala-Thr-Arg-B(1-25)-Lys，Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素的合成。
向如上所述獲得的單鏈前體的270ml溶液中加入3ml固定化的水解無色桿菌蛋白酶(見PCT/DK94/00347，45頁)。在30℃輕輕攪拌2 3小時后，通過過濾除去凝膠。將pH值調(diào)至2.5，并通過一個Milipore_0.45μ濾器將溶液過濾。以pH3.5的0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4緩沖液中的24-33％乙腈梯度，利用一個2×20cm填充有15μ100A孔徑的球形C18二氧化硅的柱子進(jìn)行RP-HPLC4次，純化雙鏈伸展的胰島素。在大約29-31％乙腈下洗脫雙鏈伸展的胰島素。通過在真空中蒸發(fā)從合并液中除去乙腈，并用一個5×47cm的Sephadex_G-25柱在0.5M乙酸中通過凝膠過濾除去鹽分。通過冷凍干燥分離雙鏈伸展的胰島素。產(chǎn)量81mg。
5d.NαA-5，NαB-3，NεB26-三(十四烷酰)Ala-Thr-Arg-B(1-25)-Lys，Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素的合成。
將80mg雙鏈伸展的胰島素溶于由0.56ml DMSO和0.19ml在NMP中的2M二異丙基乙胺所組成的混合物中。將溶液冷卻至15℃并加入0.124ml在DMSO/NMP(1∶1，v/v)中的0.3M十四烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。15℃2小時后，通過加入21.8ml pH被調(diào)節(jié)至10.0的在乙醇/水(60∶40，v/v)中的0.01M甘氨酸緩沖液來終止反應(yīng)。未分離三?；闹虚g產(chǎn)物。
5e.LysB26(Nε-十四烷酰)des(B27-B30)人胰島素的合成。
向前一步所獲得的溶液中加入1ml固定化的胰蛋白酶凝膠(見PCT/DK94/00347，46頁)。在15℃輕輕攪拌23小時后，通過過濾除去凝膠，將pH值調(diào)節(jié)至9.0并將溶液注入一個1.5×25.5cm的QAE-Sephadex_A-25柱。利用一種用NH3將pH調(diào)節(jié)至9.0的在乙醇/水(60∶40，v/v)中的0.12M NH4Cl緩沖液以19.3ml/h的速率進(jìn)行無梯度洗脫。洗脫320ml后從柱子中出現(xiàn)標(biāo)題化合物，收集320-535ml間的組分。最后，通過在Sephadex_G-50 Fine上凝膠過濾將緩沖液換為0.01M的NH4HC03，并且通過冷凍干燥分離干燥狀態(tài)的產(chǎn)物。產(chǎn)量25mg。
通過MS測定的標(biāo)題化合物的分子質(zhì)量5555±6；理論值5555。
通過MS測定的B-鏈的分子質(zhì)量3179±4；理論值3178。
通過MS測定的由V8蛋白酶消化的B-鏈C-末端片段的分子質(zhì)量864±1；理論值863.5。
相對親脂性，K′rel＝1.51。
豬皮下注射后消失的半壽期，T50％14.4±1.5h(n＝5)。
實(shí)施例6(N(1-羧基十三烷基)-2-酰氨琥珀酰)-PheαB1des(B30)人胰島素的合成。
將A1，B29-二Boc-des(B30)人胰島素(200mg，0.033mmol)溶于DMF(15ml)，并加入三乙基胺(20μl)。加入N(1-甲氧羰基十三烷基)-2-酰氨琥珀酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(16mg，0.033mmol)，室溫4小時后在真空中將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干。通過在室溫下用三氟乙酸(5ml)處理30分鐘除去Boc基團(tuán)。通過在真空中蒸發(fā)除去三氟乙酸。在0℃將殘余物溶于0.1N NaOH(20ml)中。在0℃1小時后，完成甲酯的皂化作用。用乙酸將反應(yīng)混合物的pH調(diào)至5.0，并加入乙醇(5ml)。通過離心分離所形成的沉淀。
用一個2.5×27cm的QAE-Sephadex_A-25柱通過離子交換層析從沉淀中純化標(biāo)題化合物。
通過用氨調(diào)節(jié)pH至9.8將沉淀溶于乙醇/水(60∶40，v/v)，并把溶液上柱。利用一種在乙醇/水(60∶40，v/v)中的0.12-0.18M NH4Cl的線性梯度于pH9.0 NH3/NH4Cl緩沖液中進(jìn)行洗脫，洗脫液總體積為1000ml。在280nm處監(jiān)測洗脫物的UV吸收值，并收集10ml為一份的組分。標(biāo)題化合物從柱子中出現(xiàn)在62到72的組分中。通過用2倍體積的水稀釋洗脫液和調(diào)節(jié)pH值至5.0來沉淀標(biāo)題化合物。離心后，用水洗滌沉淀，并在第二次離心后真空干燥產(chǎn)物。產(chǎn)量10mg。
通過PDMS測定的分子量6032，理論值6032。
相對親脂性，K′rel＝140。
豬皮下注射后消失的半壽期，T50％8.65±1.65小時(n＝5)。
實(shí)施例7PheαB1-十四烷酰-谷氨?；?甘氨酰基de1(B30)人胰島素的合成。
將A1，B29-二Boc-des(B30)人胰島素(200mg，0.033mmol)溶于DMF(15ml)并加入三乙基胺(100μl)。加入十四酰-Glu(γ-OtBu)-Gly N-羥基琥珀酰亞胺酯(95mg，0.17mmol)，室溫4小時后在真空中將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干。通過在室溫下用三氟乙酸(5ml)處理30分鐘除去Boc和tBu基團(tuán)。通過在真空中蒸發(fā)除去三氟乙酸。
利用一個C18二氧化硅柱通過RP-HPLC從沉淀中純化標(biāo)題化合物，在pH7的含有75mM(NH4)2SO4的50mM Tris/磷酸鹽緩沖液中用從16到64％乙腈的線性梯度洗脫。在大約50％乙腈時，從柱中出現(xiàn)標(biāo)題化合物。在真空中蒸發(fā)掉乙腈并加入乙醇到20％(v/v)。調(diào)節(jié)pH值至5.0引起產(chǎn)物沉淀。離心后，將沉淀溶于10mM NH4HCO3中，用Sephadex G-25通過凝膠過濾脫鹽，并冷凍干燥。產(chǎn)量97mg。
通過PDMS測定的分子量6105，理論值6104。
實(shí)施例8GlyB28，ThrB29，LysB30(Nε-十四烷酰)人胰島素的合成。
8a.利用啤酒糖酵母MFα前前導(dǎo)序列原在酵母菌株yKV195中的Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pto-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體的合成。
合成下列寡核苷酸#4790 5′TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAaAGAGGTTTCTTCTACACTGGTACCAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATTGTCG-3′#2371 5′-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3′按照與實(shí)施例2中相同的方式通過用寡核苷酸#4790取代寡核苷酸#3881來構(gòu)建編碼Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pto-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)的DNA。
所獲得的質(zhì)粒被稱為pKV195，且表達(dá)Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pto-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)的酵母菌株被稱為yKV195。
8b.Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pto-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體的分離。
將yKV195菌株發(fā)酵72小時并收集4.4升發(fā)酵液。通過離心分離酵母細(xì)胞，用硫酸將pH調(diào)節(jié)至3.0，并且加入3.6升水以稀釋鹽濃度達(dá)到7.7mS/cm的導(dǎo)電率。用填充有300ml Streamline_SP離子交換劑的PharmaciaStrealine_50柱濃縮胰島素前體。經(jīng)過用3升pH值為3.6的25mM檸檬酸鹽緩沖液洗柱后，用0.5M NH3洗脫前體，并收集從300到600ml的組分。在室溫下將游離氨真空蒸發(fā)并用鹽酸將所獲的280ml溶液的pH值調(diào)至9.0。
8c.Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Thr-Lys，Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素的合成。
向含有300mg單鏈前體的280ml溶液中加入3ml固定化的水解無色桿菌蛋白酶(見PCT/DK94/00347，45頁)。在30℃輕輕攪拌17小時后，通過過濾除去凝膠。將pH值調(diào)至3.5，并通過一個Milipore_0.45μ濾器將溶液過濾。以pH3.5的0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4緩沖液中的23-33％乙腈梯度，利用一個2×20cm填充有10μ 100A孔徑的球形C18二氧化硅的柱子以4ml/min的速度和40℃的柱溫下進(jìn)行RP-HPLC 3次，純化雙鏈伸展的胰島素。在大約30-31％乙腈下洗脫雙鏈伸展的胰島素。通過在真空中蒸發(fā)從70ml的合并液中除去乙腈，并用一個5×47cm的Sephadex_G-25柱在0.5M乙酸中通過凝膠過濾除去鹽分。通過冷凍干燥分離雙鏈伸展的胰島素。產(chǎn)量176mg。
8d.NαA-5，NαB-3，NεB30-三(十四烷酰)Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Thr-Lys，Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素的合成。
將176mg雙鏈伸展的胰島素溶于由1.4ml DMSO和0.275ml在NMP中的2M二異丙基乙胺所組成的混合物中。將溶液冷卻至15℃并加入0.963ml在DMS0/NMP(1∶1，v/v)中的0.3M十四烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。15℃20小時后，通過加入50ml pH被調(diào)節(jié)至10.0的在乙醇/水(60∶40，v/v)中的0.01M甘氨酸緩沖液來終止反應(yīng)。未分離三?；闹虚g產(chǎn)物。
8e.GlyB28，ThrB29，LysB30(Nε-十四烷酰)人胰島素的合成。
向前一步所獲得的溶液中加入2.5ml固定化的胰蛋白酶凝膠(見PCT/DK94/00347，46頁)。在15℃輕輕攪拌5小時后，通過過濾除去凝膠，將pH值調(diào)節(jié)至9.0并將溶液注入一個1.5×26.5cm的QAE-Sephadex_A-25柱。利用一種用NH3將pH調(diào)節(jié)至9.0的在乙醇/水(60∶40，v/v)中的0.12M NH4Cl緩沖液以9.3ml/h的速率進(jìn)行無梯度洗脫。洗脫325-455ml后從柱子中出現(xiàn)標(biāo)題化合物，峰值在380ml。最后，通過在Sephadex_G-50 Fine上凝膠過濾將緩沖液換為0.01M的NH4HCO3，并且通過冷凍干燥分離干燥狀態(tài)的產(chǎn)物。產(chǎn)量50mg。
通過MS測定的標(biāo)題化合物的分子質(zhì)量5979±6；理論值5977。
通過MS測定的B-鏈的分子質(zhì)量3600±4；理論值3600。
通過MS測定的由V8蛋白酶消化的B-鏈C-末端片段的分子質(zhì)量1286±2；理論值1286。
相對親脂性，K′rel＝103。
豬皮下注射后消失的半壽期，T50％17±2h(n＝4)。
實(shí)施例9GlyB28，LysB29(Nε-十四烷酰)人胰島素的合成。
9a.利用啤酒糖酵母MFα前前導(dǎo)序列原在酵母菌株yKV196中的Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體的合成。
合成下列寡核苷酸#4791 5′-TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACCGGTAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATTGTCG-3′#2371 5′-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3′按照與實(shí)施例2中相同的方式通過用寡核苷酸#4791取代寡核苷酸#3881來構(gòu)建編碼Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)的DNA。
所獲得的質(zhì)粒被稱為pKV196，且表達(dá)Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)的酵母菌株被稱為yKV196。
9b.Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素前體的分離。
將yKV196菌株發(fā)酵72小時并收集3.6升發(fā)酵液。通過離心分離酵母細(xì)胞，用硫酸將pH調(diào)節(jié)至3.0并且為加入3.4升水以稀釋鹽濃度達(dá)到一個7.7mS/cm的導(dǎo)電性。用在實(shí)施例8b中所描述的程序?qū)⒁葝u素前體濃縮至300ml。
9c.Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Lys，Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素的合成。
向含有390mg單鏈前體的300ml pH9.0的溶液中加入5ml固定化的水解無色桿菌蛋白酶(見PCT/DK94/00347，45頁)。在30℃輕輕攪拌40小時后，通過過濾除去凝膠。將pH值調(diào)至3.5，并通過一個Milipore_0.45μ濾器將溶液過濾。以pH3.5的0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4緩沖液中的23-33％乙腈梯度，利用一個2×20cm填充有10μ120A孔徑的球形C18二氧化硅的柱子以4ml/min的速度和40℃的柱溫度下進(jìn)行RP-HPLC3次，純化雙鏈伸展的胰島素。在大約29％乙腈下洗脫雙鏈伸展的胰島素。通過在真空中蒸發(fā)從60ml合并液中除去乙腈，并用一個5×47cm的Sephadex_G-25柱在0.5M乙酸中通過凝膠過濾除去鹽分。通過冷凍干燥分離雙鏈伸展的胰島素。產(chǎn)量154mg。
9d.NαA-5，NαB-3，NεB29-三(十四烷酰)Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Lys，Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)胰島素的合成。
將154mg雙鏈伸展的胰島素溶于由1.05ml DMSO和0.329ml在NMP中的2M二異丙基乙胺所組成的混合物中。將溶液冷卻至15℃并加入0.22ml在DMSO/NMP(1∶1，v/v)中的0.3M十四烷酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。15℃2小時后，通過加入40ml pH被調(diào)節(jié)至10.0的在乙醇/水(60∶40，v/v)中的0.01M甘氨酸緩沖液來終止反應(yīng)。未分離三?；闹虚g產(chǎn)物。
9e.GlyB28，LysB29(Nε-十四烷酰)人胰島素的合成。
向前一步所獲得的溶液中加入1.5ml固定化的胰蛋白酶凝膠(見PCT/DK94/00347，46頁)。在15℃輕輕攪拌21小時后，通過過濾除去凝膠，將pH值調(diào)節(jié)至9.0并將43ml在溶液中的產(chǎn)物注入一個1.5×26.0cm的QAE-Sephadex_A-25柱。利用一種用NH3將pH調(diào)節(jié)至9.0的在乙醇/水(60∶40，v/v)中的0.12M NH4Cl緩沖液以9.5ml/h的速率進(jìn)行無梯度洗脫。洗脫190-247ml后從柱子中出現(xiàn)標(biāo)題化合物，峰值在237ml。最后，通過在Sephadex_G-50 Fine上凝膠過濾將緩沖液換為0.01M的NH4HCO3，并且通過冷凍干燥分離干燥狀態(tài)的產(chǎn)物。產(chǎn)量67mg。
通過MS測定的標(biāo)題化合物的分子質(zhì)量5877±2；理論值5876。
通過MS測定的B-鏈的分子質(zhì)量3499±3；理論值3499。
通過MS測定的由V8蛋白酶消化的B-鏈C-末端片段的分子質(zhì)量1184±2；理論值1185。
相對親脂性，K′rel＝118.5。
豬皮下注射后消失的半壽期，T50％25±9 h(n＝4)。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名Novo Nordisk A/S
(B)街Novo Alle(C)城市DK-2880 Bagsvaerd(E)國家丹麥(G)電話+45 44448888(H)傳真+45 444905 55(I)電報37173(ii)發(fā)明題目酰基化胰島素(iii)序列數(shù)2(iv)聯(lián)系地址(A)收信人Novo Nordisk A/S Corporate Patents(B)街Novo Alle(C)城市DK-2880 Bagsvaerd(E)國家丹麥(V)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日期(C)分類(vii)優(yōu)先申請資料(A)申請?zhí)朌K 0276/95
(B)申請日期1995年3月17日(viii)律師/代理人信息(A)姓名Jorgensen，Dan等(C)參考/案卷號4341-WO，DJ(ix)通訊信息(A)電話+45 44448888(B)傳真+45 44493256(2)序列號1的資料(i)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列號1Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1 5 1015Glu Asn Tyr Cys Xaa20(2)序列號2的資料(i)序列特征(A)長度30個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列號2Xaa Xaa Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 510 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30
權(quán)利要求
1.一種含有下述序列的胰島素衍生物
B-鏈(續(xù))Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa(序列號2)25 26 27 28 29 30其中，在A21位點(diǎn)上的Xaa是除Lys、Arg和Cys外的任何可編碼氨基酸；在B1，B2，B3，B26，B27，B28和B29位點(diǎn)上的Xaa是彼此獨(dú)立的除Cys外的任何可編碼氨基酸或缺失；在B30位點(diǎn)上的Xaa是除Cys以外的任何可編碼氨基酸、不含有Cys或Arg的二肽、不含有Cys或Arg的三肽、不含有Cys或Arg的四肽或缺失；而且B鏈N-端氨基酸的氨基基團(tuán)連有一個親脂基團(tuán)W，這個基團(tuán)具有12到40個碳原子并且選擇性地含有一個可帶負(fù)電的基團(tuán)，或者B鏈C-端氨基酸的羧基基團(tuán)連有一個親脂基團(tuán)Z，這個基團(tuán)具有12到40個碳原子并且選擇性地含有一個可帶負(fù)電的基團(tuán)，條件是如果在B1、B2和B3位點(diǎn)上的一個或多個氨基酸缺失，那么通過從始終被定為7號的CysB7向下計(jì)數(shù)來確定N-端氨基酸的數(shù)，和(a)當(dāng)B1-B2-B3是Phe-Val-Asn和A21是Asn及B26-B27-B28-B29-B30是Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr或Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala時，那么所說的W或Z始終含有一個可以帶負(fù)電的基團(tuán)；和(b)當(dāng)缺失B29和B30且上面所定義的基團(tuán)Z存在于B鏈的C-端氨基酸上以及B1、B2和B3均沒有缺失時，那么B1-B2不是Phe-Val或者B26-B27-B28不是Tyr-Thr-Pro或B1-B2和B26-B27-B28都與所說的序列不同；和(c)當(dāng)缺失B29和B30且上面所定義的基團(tuán)Z存在于B鏈的C-端氨基酸上以及B1、B2或B3中的一個缺失時，那么B鏈N-端氨基酸不為Val或B26-B27-B28不為Tyr-Thr-Pro或B鏈的N-端氨基酸不為Val且序列B26-B27-B28不為Tyr-Thr-Pro。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的胰島素衍生物，其中親脂基團(tuán)W被連接在B鏈N-末端氨基酸的氨基上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的胰島素衍生物，其中親脂基團(tuán)Z被連接在B鏈C-末端氨基酸的羧基上。
4.根據(jù)前面的權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的胰島素衍生物，其中在A21位點(diǎn)上的Xaa為選自Ala、Asn、Gln、Glu、Gly和Ser的一個氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)的胰島素衍生物，其中在B1位點(diǎn)上的Xaa為Phe或缺失。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)的胰島素衍生物，其中在B2位點(diǎn)上的Xaa為Ala或Val。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)的胰島素衍生物，其中在B3位點(diǎn)上的Xaa為選自Asn、Gln、Glu和Thr的一個氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)的胰島素衍生物，其中在B26位點(diǎn)上的Xaa為Tyr。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)的胰島素衍生物，其中在B27位點(diǎn)上的Xaa為Thr。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)的胰島素衍生物，其中在B28位點(diǎn)上的Xaa為Pro。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)的胰島素衍生物，其中在B29位點(diǎn)上的Xaa為Lys或Thr。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)的胰島素衍生物，其中在B30位點(diǎn)上的Xaa為Thr或ε-?；疞ys。
13.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)的胰島素衍生物，其中在B30位點(diǎn)上的Xaa缺失。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)的胰島素衍生物，其中在B28位點(diǎn)上的Xaa是Lys且在B29位點(diǎn)上的Xaa為Pro。
15.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)的胰島素衍生物，其中在B28位點(diǎn)上的Xaa是Pro且在B29位點(diǎn)上的Xaa為Thr。
16.根據(jù)權(quán)利要求2的胰島素衍生物，其中W通過一個酰胺鍵連接在N-末端氨基酸的氨基基團(tuán)上。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的胰島素衍生物，其中W是CH3(CH2)nCH(COOH)NH-CO(CH2)2CO-且n是9到15之間的一個整數(shù)。
18.根據(jù)權(quán)利要求3的胰島素衍生物，其中Z通過一個酰胺鍵連接在C-末端氨基酸的羧基基團(tuán)上。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的胰島素衍生物，其中Z是-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)mCH3且m是8到18之間的一個整數(shù)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的胰島素衍生物，其中Z所連接的親本胰島素為ThrB29人胰島素。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的胰島素衍生物，其中Z所連接的親本胰島素為des(B28-B30)人胰島素。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的胰島素衍生物，其中Z所連接的親本胰島素為des(B27-B30)人胰島素。
23.根據(jù)權(quán)利要求19的胰島素衍生物，其中Z所連接的親本胰島素為des(B26-B30)人胰島素。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的胰島素衍生物，其中B鏈的C-末端氨基酸是ε-?；疞ys且與C-末端氨基酸毗鄰的氨基酸為Gly。
25.一種用于在需治療患者中治療糖尿病的藥物組合物，其包括治療有效量的權(quán)利要求1的胰島素衍生物和一種藥學(xué)上可用載體。
26.一種用于在需治療患者中治療糖尿病的藥物組合物，其包括治療有效量的權(quán)利要求1的胰島素衍生物并混有起效迅速的一種胰島素或胰島素類似物和一種藥學(xué)上可用載體。
27.一種在需治療患者中治療糖尿病的方法，其包括將治療有效量的權(quán)利要求1的胰島素衍生物和一種藥學(xué)上可用載體一同給予患者。
28.一種在需治療患者中治療糖尿病的方法，其包括將治療有效量的權(quán)利要求1的胰島素衍生物與起效迅速的一種胰島素或胰島素類似物相混合，并和一種藥學(xué)上可用載體一同給予患者。
全文摘要
在B鏈N－末端氨基酸上的α－氨基基團(tuán)或B鏈C－末端氨基酸上的羧基基團(tuán)上連有一個具有12到40個碳原子的親脂基團(tuán)的胰島素衍生物具有延長的作用形象。
文檔編號A61K38/28GK1196061SQ9619336
公開日1998年10月14日 申請日期1996年3月18日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月17日
發(fā)明者J·馬庫森, I·約納森, S·哈維魯恩德, J·布朗特, P·庫茲哈爾斯, P·H·翰森, N·C·卡爾邵姆 申請人:諾沃挪第克公司