專利名稱：青藤堿在制備治療慢性腎炎藥劑中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種藥物的新用途，具體的說是青藤堿在制備治療慢性腎炎藥物當中的應用，特別是鹽酸青藤堿在制備治療慢性腎炎藥劑當中的應用。
青藤堿(sinomenine)是從防已科植物青藤Sinomenium acutum(Thunb.)R.et Wils.的莖和根中提取的生物堿之一，是一種已知的藥用物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理學研究表明，青藤堿具有多種藥理作用。概括起來講，目前已經(jīng)知道的青藤堿的主要藥理作用如下鎮(zhèn)痛、抗炎、降壓、抑制中樞、抗心律失常等作用[張士善，等，清風藤堿甲的藥理作用I.鎮(zhèn)痛、消炎作用及急性毒性實驗，藥學學報1960，8177；凌秀珍，等，藥學學報1962，9(7)393；趙德化，等，藥學學報，1985，20(11)856；張明發(fā)，陜西新醫(yī)藥，1981，10(10)57]；對機體非特異性免疫、細胞免疫和體液免疫均有抑制作用，尤其是對T淋巴細胞的功能有較強的抑制作用[彭慧敏，等，青藤堿的免疫抑制作用，中國藥理學報1988，9(4)377-380]；青藤堿又是一種組織胺釋放劑(馮經(jīng)義，等，青藤堿的藥理作用VII.對胃腸活動的影響及其機制，藥學學報1965；12492)；臨床上用于治療類風濕關節(jié)炎療效顯著(張欣，等，陜西中醫(yī)，1980，513；湖南省淑浦縣中醫(yī)院科研組，赤腳醫(yī)生雜志，1975，12612)；有人還對青藤堿治療類風濕性關節(jié)炎的作用機制進行了研究[李嗣英，等，青藤堿對小鼠免疫功能的影響，中草藥，1992，23(2)81-83]。到目前為止，還沒有有關青藤堿治療慢性腎炎的報道。
目前，西醫(yī)在對腎小球疾病的治療上多應用腎上腺皮質(zhì)激素、細胞毒類藥等藥物，并采用抗生素、血管擴張劑、利尿劑等對癥處理。雖可緩解征狀，延緩病變進展。但對于慢性病患者來說，此類藥可削弱正常免疫功能、降低機體抵抗力、并可引起許多并發(fā)癥，導致病癥反復發(fā)作，病情持續(xù)遷延，療效難以鞏固。目前用于治療慢性腎炎的中成藥制劑很少，僅有雷公藤、昆明山海棠片劑、沖劑等少數(shù)品種，而且長期服用屢見不良反應。
鑒于這種情況，本發(fā)明人經(jīng)過大量的實驗研究和臨床觀察，發(fā)現(xiàn)青藤堿在治療慢性腎炎方面具有很好的療效，并將其制成藥劑。
本發(fā)明的目是提供青藤堿的一種新用途，具體說是青藤堿在制備治療慢性腎炎的藥物中的應用。
經(jīng)過我們的實驗研究表明，青藤堿，特別是鹽酸青藤堿，具有良好的抗炎作用，且具有對體液免疫抑制強而對細胞免疫抑制弱的獨特機理，阻斷免疫復合物的形成，在治療慢性腎炎上有較好療效。
本發(fā)明所述的慢性腎炎包括了臨床上常見的各種類型的慢性腎炎，例如腎小球腎炎。
青藤堿作為一種治療藥物，已經(jīng)有產(chǎn)品出售，例如，湖南黔陽地區(qū)制藥廠生產(chǎn)的青藤堿(sinomenine，SIN)，武漢市中聯(lián)制藥廠生產(chǎn)的鹽酸青藤堿粉劑，等。
因此，青藤堿作為治療慢性腎炎的治療藥物，按照常規(guī)的制劑方法，可以制備成適合于臨床上使用的任何藥物劑型，例如，片劑、丸劑、膠囊劑、沖劑、口服液、乳劑、混懸劑、注射劑、栓劑、膏劑，等。
除了本發(fā)明所說的青藤堿之外，青藤堿的藥物學上可接受的鹽，例如鹽酸青藤堿，同樣具有治療慢性腎炎的作用，因此，青藤堿及其藥物上可接受的鹽用于制備治療慢性腎炎的藥物，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
青藤堿及其藥物學上可接受的鹽在用于制備治療慢性腎炎的藥物時，可以添加藥物學上常用的賦性劑，如，粘合劑、崩解劑、填充劑、潤滑劑、增溶劑、防腐劑、調(diào)味劑、溶劑、乳化劑，等。
青藤堿及其藥物學上可接受的鹽在用于制備治療慢性腎炎的藥物時，也可以和其他相容的治療藥物一起制成藥劑。
實施例1鹽酸青藤堿粉劑25000mg，購自武漢市中聯(lián)制藥廠，藥用淀粉250g，酒精適量造粒，干燥，進壓片機壓片，制成1000片，每片片重為275mg，含鹽酸青藤堿25mg。
實施例2青藤堿20000mg，淀粉180g，二者充分混合，裝膠囊，制成2000粒膠囊，每粒0.1g重，含鹽酸青藤堿10mg。
本發(fā)明公開了青藤堿及其藥物學上可接受的鹽在制備治療慢性腎炎的藥物中的應用。根據(jù)常規(guī)的制劑技術(shù)，可以將青藤堿、鹽酸青藤堿等制成各種藥劑，用于治療慢性腎炎。
實驗例1鹽酸青藤堿片治療腎小球腎炎的藥效學研究為了了解鹽酸青藤堿對慢性腎炎的作用，我們采用C-BSA復制模性腎小球腎炎動物模型，對鹽酸青藤堿片的治療作用進行了研究，并對利尿作用進行了觀察，現(xiàn)將實驗結(jié)果報告如下材 料鹽酸青藤堿片由白云山正清制藥股份有限公司提供，批號950908，實驗時用蒸餾水配制成24毫克/毫升、12毫克/毫升、6毫克/毫升作高、中、低劑量。每日按2.5毫升/公斤體重給藥。
雷公藤多甙片由江蘇泰州制藥廠生產(chǎn)，批號950814，10毫克/片，實驗時用蒸餾水配制成6毫克/毫升，每日按2.5毫升/公斤體重給藥。
氫氯噻嗪片由湖南制藥廠生產(chǎn)，批號950315，實驗時用生理鹽水配成懸液。
BSA由北京奶牛研究所提供，批號950701。
碳化二亞胺鹽酸鹽由中科院上海生化所東風生化技術(shù)公司提供，批號950612C。
β2-MG測定藥盒由中國原子能研究所提供。
生化檢測所用試劑為北京中生公司生產(chǎn)。
日本大耳白家兔，體重2kg左右，購自湖南中醫(yī)學院動物室。
SD系大鼠由本院動物室提供。
方法一、對兔C-BSA腎炎的影響(一)陽離子化牛血清白蛋白(C-BSA)的制備[1][2]將天然牛血清白蛋白用化學方法使之陽離子化，經(jīng)等電聚焦電泳測定具等電點PI為8.5，透析冷凍干燥，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> (二)兔腎炎模型的制備將大腸桿菌內(nèi)毒素和陽離子化牛血清白蛋白混合，使最終濃度為每毫升溶液中含1μg大腸桿菌內(nèi)毒素和1mg牛血清白蛋白，每只兔耳靜脈注射2ml進行預先免疫，7天后開始免疫造型，每只每日耳靜脈注入C-BSA25mg(溶于生理鹽水2ml溶液中)，共8周。正常對照組每日注射生理鹽水2ml。
(三)實驗分組與給藥注入C-BSA2周后，凡尿蛋白“++”及以上者，進行實驗編組分別為模型對照組；鹽酸青藤堿片高劑量組；鹽酸青藤堿片中劑量組；鹽酸青藤堿片低劑量組；雷公藤多甙片組。鹽酸青藤堿片高、中、低劑量分別為每日60mg、30mg、15mg/kg，雷公藤多甙片每日15mg/kg，正常對照組及模型對照組給予鹽酸青藤堿片輔料，體積均為2.5ml/kg，給藥途徑為灌胃，整個療程為6周。
(四)主要觀察項目1.尿蛋白定性，每周一次，采用試紙法測定。24小時定量，每2周一次，采用苦味酸法。
2.血清學檢查給藥前及給藥第3周、第6周時分別取血測尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、總膽固醇(Cho)、總蛋白(SP)、白蛋白(A)用美國Encor-II全自動生化分析儀測定，循環(huán)免疫復合物(CIC)測定按PEG沉淀法，上海721型光電比色計比色。用放射免疫方法測血及尿中β2-MG含量。
3.病理學檢查實驗結(jié)束后取家兔腎臟標本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，HE染色，在光鏡下觀察①腎小球直徑(長徑與橫徑之和的平均數(shù))，求均值。
②腎小球內(nèi)細胞數(shù)，求其均值。每只兔測5個最大腎小球。
③形態(tài)觀察。
二、利尿試驗(代謝籠法)1.對正常大鼠尿量的影響取禁食(不禁水)18h的大鼠48只，雌雄各半，體重180-240g，按性別體重分層隨機分為6組，分別灌服用生理鹽水配制的藥物懸液氫氯噻嗪5mg/kg，鹽酸青藤堿20、40、80mg/kg，雷公藤多甙20mg/kg。體積均為10ml/kg。對照組灌服等體積生理鹽水。輕壓大鼠下腹部使膀胱排空，立即放入自制的代謝籠內(nèi)，用濾紙收集排出的尿液。給藥后5h，同上法排盡動物膀胱中余尿。將含尿濾紙稱重，減去已知濾紙即為動物排尿量。
2.對水負荷大鼠尿量的影響禁食(不禁水)18h的大鼠48只，雌雄各半，190-240g/只。分組、給藥途徑及劑量同上。每只動物灌胃給藥前腹腔注射生理鹽水3ml/100g體重作為水負荷，實驗其他過程同上，比較各組尿量。
結(jié)果一、對兔C-BSA腎炎模型的影響(一)對尿蛋白含量的影響實驗動物在模型制備前尿蛋白定性均為陰性。致病免疫后2周造模動物出現(xiàn)明顯蛋白尿，定性為++-+++，定量高達102-110mg/dl，各組尿蛋白均多于正常對照組(P＜0.01)，表明兔腎炎模型的建立成功，造模后，模型組動物尿蛋白持續(xù)維持在較高水平無明顯變化。鹽酸青藤堿片組給藥3周后與同期模型組比較有降低尿蛋白的作用，并維持到第6周實驗結(jié)束。隨著劑量的增大，其作用漸增強。15mg/kg雷公藤多甙也于給藥3周后出現(xiàn)降低尿蛋白的作用(表1、表2)。
表1 鹽酸青藤堿片對腎炎兔尿蛋白定性(量化)的影響給藥后不同時間(周)尿蛋白各級反應分數(shù)組別及劑量 注C-BSA后(mg/kg)1 2 3 4 5 6正常組 1.05±0.19 1.05±0.19 1.05±0.16 1.06±0.17 1.13±0.23 1.19±0.26 1.12±0.23(10) (10) (10) (10)(9)(8) (8)模型組 3.30±0.48*** 3.40±0.52*** 3.40±0.84*** 3.60±0.70*** 3.50±0.71*** 3.33±0.50*** 3.32±0.51***(10) (10) (10) (10)(10) (9) (9)鹽酸青藤堿片組(60) 3.40±0.52*** 3.11±0.32*2.80±0.79*2.50±0.52## 2.44±0.53### 1.81±0.59### 1.43±0.49###(10) (10) (10) (10)(10) (9) (8)鹽酸青藤堿片組(30) 3.11±0.32*** 3.10±0.32*2.90±0.70*2.88±0.78#2.63±0.74## 2.00±0.71### 1.75±0.70###(10) (10) (10) (10)(10) (9) (8)鹽酸青藤堿片組(15) 3.11±0.31*** 3.10±0.30*3.10±0.87*3.00±0.87#3.01±0.76#2.50±0.53## 2.25±0.85###(10) (10) (10) (10)(10) (9) (8)雷公藤多甙片組(15) 3.31±0.48*** 3.20±0.42*2.70±0.85*2.56±0.53## 2.67±0.71## 2.06±0.86### 1.88±0.79###(10) (10) (10) (10)(10) (9) (8)與正常組比較 *P＞0.05 **P＜0.05 ***P＜0.01與模型組比較 #P＞0.05 ##P＜0.05 ###P＜0.01注-(1分)±(1.5分)+(2分)++(3分)+++(4分)括號內(nèi)數(shù)字為樣本數(shù)表2 鹽酸青藤堿對腎炎兔24 h尿蛋白含量的影響給藥后不同時間(周)尿蛋白含量(mg/dlx±SD)組別及劑量注C-BSA后(mg/kg) 2 4 6正常組8.35±4.804.61±2.866.74±2.068.88±2.70(10) (10) (9)(8)模型組 110.80±21.95*** 129.00±50.62*** 127.10±42.82*** 120.89±34.44***(10) (10) (10) (9)鹽酸青藤堿片組(60) 102.14±16.43*** 89.60±23.48# 81.11±22.08##44.00±12.59###(10) (10) (10) (8)鹽酸青藤堿片組(30) 103.05±21.87*** 84.10±32.56# 85.88±30.81##51.25±17.93###(10) (10) (10) (8)鹽酸青藤堿片組(15) 103.19±20.09*** 82.30±14.21# 89.37±29.93# 63.63±15.82###(10) (10) (10) (8)雷公藤多甙片組(15) 108.70±18.40*** 77.80±34.55# 83.88±32.38##53.87±13.51###(10) (10) (10) (8)與正常組比較 *P＞0.05 **P＜0.05 ***P＜0.01與模型組比較 #P＞0.05 ##P＜0.05 ###P＜0.01括號內(nèi)數(shù)字為樣本數(shù)
(二)對血清肌酐與尿素氮的影響注C-BSA后各組動物血Cr與BUN均明顯升高，給藥后模型組動物血Cr與BUN仍維持在較高水平直至實驗結(jié)束。給藥3周后鹽酸青藤堿片均不同程度的降低血Cr與BUN，其中，30mg/kg鹽酸青藤堿片給藥6周后降低BUN作用與模型組比較有顯著性差異。60mg/kg鹽酸青藤堿片在給藥3周后，對降低血Cr、BUN與模型組比較均有顯著性差異。15mg/kg雷公藤多甙片也有降低血Cr與BUN的作用，(表3、表4)表3鹽酸青藤堿片對血清肌酐的影響組別及劑量 注C-BSA后 給藥后不同時間(周)Cr含量(umoi/Lx±SD)(mg/kg)3 6正常組 78.87±15.08 89.93±12.03 88.11±20.49(10) (10)(8)模型組112.28±21.02**141.51±31.77**123.89±32.28**(10) (10)(9)鹽酸青藤堿片組60 109.19±20.08**110.45±13.43## 91.79±20.43##(10) (10)(8)鹽酸青藤堿片組30 110.03±24.48**128.39±21.04# 99.05±11.51#(10) (10)(8)鹽酸青藤堿片組15 111.13±18.11**132.76±26.51# 108.31±29.03#(10) (10)(8)雷公藤多甙片組15 109.56±22.64**114.22±11.96## 95.66±10.93##(10) (10)(8)與正常組比較 *P＞0.05 **P＜0.05 與模型組比較 #P＞0.05 ##P＜0.05括號內(nèi)數(shù)字為樣本數(shù)表4 鹽酸青藤堿片對血BUN的影響給藥后不同時間(周)BUN含量(mmoi/LX±SD)組別及劑量 注C-BSA后(mg/kg) 36正常組 8.51±2.66 7.93+3.437.06±1.26(10) (10) (8)模型組16.25±2.16**14.29±3.68**14.09±3.65**(10) (10) (9)鹽酸青藤堿片組60 16.43±3.33**11.14±2.83## 8.13±2.11##(10) (10) (8)鹽酸青藤堿片組30 16.03±2.67**13.64±3.54# 8.93±2.19##(10) (10) (8)鹽酸青藤堿片組15 16.06±2.45**13.90±3.09# 10.89±3.72#(10) (10) (8)雷公藤多甙片組15 15.99±3.23**12.17±3.31# 8.43±2.64##(10) (10) (8)與正常組比較 *P＞0.05 **P＜0.05與模型組比較 #P＞0.05 ##P＜0.05括號內(nèi)數(shù)字為樣本數(shù)(三)對血漿總蛋白(SP)、白蛋白(A)、白/球(A/G)比值的影響注C-BSA后模型組動物由于大量蛋白從尿中丟失，故血漿總蛋白(SP)、A均明顯低于正常組。模型組雖后期血漿SP、A有所回升但仍較正常組明顯偏低，且A/G比值也明顯低于正常。鹽酸青藤堿片各劑量組給藥3周后使SP不同程度提高，給藥6周后，60mg/kg劑量組較同期模型組有顯著性差異。鹽酸青藤堿片對血漿白蛋白與A/G比值無明顯影響，15mg/kg雷公藤多甙能明顯提高血漿白蛋白，對A/G比值無明顯影響(表5、表6、表7)
表5 鹽酸青藤堿片對血漿總蛋白的影響組別及劑量注C-BSA后 給藥后不同時間(周)sp含量(g/lx±SD)(mg/kg)36正常組62.20±9.11 68.00±5.60 70.13±8.87(10)(10) (8)模型組45.00±9.18** 51.20±6.94**53.78±10.75**(10)(10) (9)鹽酸青藤堿片組60 45.70±13.8** 57.60±6.70# 63.19±5.94##(10)(10) (8)鹽酸青藤堿片組30 44.40±10.71** 56.78±8.21# 59.13±4.61#(10)(10) (8)鹽酸青藤堿片組15 43.20±10.29** 56.77±4.89# 57.00±6.95#(10)(10) (8)雷公藤多甙片組15 42.40±10.37** 58.33±5.22# 66.25±8.03##(10)(10) (8)與正常組比較 *P＞0.05 **P＜0.05 與模型組比較 #P＞0.05 ##P＜0.05括號內(nèi)數(shù)字為樣本數(shù)表6鹽 酸青藤堿片對血漿白蛋白的影響組別及劑量 注C-BSA后 給藥后不同時間(周)A含量(g/lx±SD)(mg /kg)36正常組33.00±7.80 30.00±4.44 32.13±4.91(10) (10) (8)模型組21.70±5.83**20.70±4.27**22.89±5.71**(10) (10) (9)鹽酸青藤堿片組60 21.81±8.30**22.30±4.79# 27.63±4.84#(10) (10) (8)鹽酸青藤堿片組30 20.70±7.80**21.56±4.67# 25.38±3.50#(10) (10) (8)鹽酸青藤堿片組15 19.30±8.27**21.67±4.98# 24.25±4.33#(10) (10) (8)雷公藤多甙片組15 19.60±6.50**23.22±1.39# 28.63±3.20##(10) (10) (8)與正常組比較 *P＞0.05 **P＜0.05 與模型組比較 #P＞0.05 ##P＜0.05括號內(nèi)數(shù)字為樣本數(shù)表7 鹽酸青藤堿片對A/G比值的影響給藥后不同時間(周)A/G比值(x±SD)組別及劑量注C-BSA后(mg/kg) 3 6正常組1.16±0.32 0.79±0.11 0.85±0.14(10) (10)(8)模型組0.94±0.28*0.68±0.10**0.73±0.09**(10) (10)(9)鹽酸青藤堿片組60 0.91±0.33*0.67±0.22# 0.78±0.15#(10) (10)(8)鹽酸青藤堿片組30 0.92±0.41*0.62±0.14# 0.76±0.12#(10) (10)(8)鹽酸青藤堿片組15 0.87±0.57*0.65±0.22# 0.74±0.12#(10) (10)(8)雷公藤多甙片組15 0.89±0.31*0.68±0.12# 0.79±0.21#(10) (10)(8)與正常組比較 *P＞0.05 **P＜0.05與模型組比較 #P＞0.05括號內(nèi)數(shù)字為樣本數(shù)(四)鹽酸青藤堿片對血清CIC、β2-MG的影響注C-BSA后的動物2周后血中CIC均明顯增加，與正常組比較有顯著性差異。模型組至實驗結(jié)束血中CIC持續(xù)偏高，用藥3周后，鹽酸青藤堿片使血中CIC明顯降低，其作用隨劑量的增加而增強。第3周時30mg/kg與60mg/kg劑量組、用藥6周時60mg/kg劑量組與同期模型組比較有顯著性差異。15mg/kg雷公藤多甙片能明顯降低兔C-BSA腎炎模型血中CIC含量(表8)
表8鹽酸青藤堿片對血CIC的影響組別及劑量 注C-BSA后 給藥后不同時間(周)血CIC測定的OD(×102)值(x±SD)(mg/kg) 3 6正常組 7.00±4.16 7.51±1.47 8.94±2.68(10) (10) (8)模型組18.70±9.17**17.21±2.36*** 16.06±3.87***(10) (10) (9)鹽酸青藤堿片組60 18.20±3.01**13.19±2.21### 12.74±2.79##(10) (10) (8)鹽酸青藤堿片組30 17.90±4.18**14.16±3.19## 14.89±2.49#(10) (10) (8)鹽酸青藤堿片組15 18.20±3.33**14.59±3.51# 15.30±2.43#(10) (10) (8)雷公藤多甙片組15 18.10±4.56**13.66±3.69## 12.26±3.01##(10) (10) (8)與正常組比較 *P＞0.05 **P＜0.05 ***P＜0.01與模型組比較 #P＞0.05 ##P＜0.05 ###P＜0.01括號內(nèi)數(shù)字為樣本數(shù)注射C-BSA后，模型組和各藥物組血及尿中的β2-MG含量明顯高于正常對照組，模型組在整個實驗過程中血及尿中的β2-MG始終維持在較高的水平。用藥3周后，30、60mg/kg鹽酸青藤堿片與15mg/kg雷公藤多甙片均使血β2-MG明顯降低。各劑量鹽酸青藤堿片及雷公藤多甙片均對尿中β2-MG無明顯影響。給藥6周后.鹽酸青藤堿片各劑量組與雷公藤多甙片組的血β2-MG含量接近正常組水平。而15、30mg/kg鹽酸青藤堿片、15mg/kg雷公藤多甙片使尿中β2-MG含量減少(表9)
表9鹽酸青藤堿片對兔C-BSA腎炎模型β2-MG的影響x±SD注C-BSA后(ng/L)用藥后(ng/kg)藥物 劑量 3周 6周mg/kg 血 尿 血 尿 血尿正常對照 - 139±37 46±14 108±45 45±15 111±1633±10(10) (10) (10) (10)(8) (8)模型對照 - 189±37*** 68±15*** 279±77*** 94±59** 171±85** 71±20***(10) (10) (10) (10)(9) (9)鹽酸青藤堿片 15 196±56*** 72±11*** 247±82*** 49±19*117±31* 52±13***(10)## (10)#(10)# (10)# (8)# (8)##鹽酸青藤堿片 30 189±35*** 66±16***91±13*71±41*114±30* 45±13**(10)# (10)#(10)###(10)# (8)# (8)###鹽酸青藤堿片 60 187±26*** 77±13*** 112±35*54±21*114±15* 52±18***(10)# (10)#(10)###(10)# (8)# (8)#雷公藤多甙片 15 185±45** 69±15***83±50*58±21*116±27* 39±11*(10)# (10)#(10)###(10)# (8)# (8)###與正常組比較 *P＞0.05 **P＜0.05 ***P＜0.01與模型組比較 #P＞0.05 ##P＜0.05 ###P＜0.01括號內(nèi)數(shù)字為樣本數(shù)
(五)腎組織病理檢查光鏡觀察模型組動物，腎小球炎癥現(xiàn)象明顯，腎小球直徑及腎小球內(nèi)細胞數(shù)均明顯增大(增多)，與正常對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。各劑量鹽酸青藤堿片組腎小球直徑及腎小球內(nèi)細胞數(shù)均明顯小于模型組，并有顯著性差異。雷公藤多甙片也能明顯改善C-BSA腎炎模型的腎臟病理狀態(tài)。(表10、表11)表10 鹽酸青藤堿片對腎組織病理學的影響腎小球 腎間質(zhì) 腎小管組別及劑量動物數(shù) 毛細管 Wbc 新月體 纖維化 炎細胞 萎縮 變性 管型(mg/kg)(只) 腔狹窄 浸潤正常組 8 0/80/8 0/80/81/80/8 1/8 0/8- - - - ± -±-模型對照 9 9/99/9 0/90/99/90/9 9/9 9/9+～++ +～++ - - + -++ +～++鹽酸青藤堿片組60 8 0/83/8 0/80/84/80/8 3/8 1/8- ±- - ±～+ -±～+ ±鹽酸青藤堿片組30 8 0/82/8 0/80/82/80/8 1/8 1/8- ±- - ±～+ -±±鹽酸青藤堿片組15 8 0/81/8 0/80/82/80/8 1/8 1/8- ±- - ± -±±雷公藤多甙片組15 8 0/80/8 0/80/81/80/8 1/8 0/8- - - - ± -±-
表11對腎小球直徑及腎小球內(nèi)細胞數(shù)的影響組別及劑量 動物數(shù)腎小球(mg/kg) (只) 直徑(μm)x±SD 細胞數(shù)(個)x±SD正常組8 84.73±6.11 66.45±8.86模型對照 9124.17±12.19*** 96.01±11.51**鹽酸青藤堿片組60 8 92.89±7.58### 80.35±11.54#鹽酸青藤堿片組30 8101.79±11.64## 74.65±8.01##鹽酸青藤堿片組15 8 97.95±9.79##68.00±8.69##雷公藤多甙片組15 8101.57±8.73##71.90±6.64##與正常組比較 *P＞0.05 **P＜0.05 ***P＜0.01與模型組比較 #P＞0.05 ##P＜0.05 ###P＜0.01二、對正常與水負荷大鼠尿量的影響與生理鹽水比較，5mg/kg氫氯噻嗪能明顯增加正常與水負荷大鼠的排尿量，較生理鹽水組均有極顯著性差異。隨劑量的加大，鹽酸青藤堿片能逐漸增加正常大鼠的排尿量，但均無統(tǒng)計學顯著性差異。鹽酸青藤堿片能增加水負荷大鼠的排尿量，并隨劑量加大，其作用增強，80mg/kg時較生理鹽水組有顯著性差異。20mg/kg雷公藤多甙片對正常與水負荷大鼠尿量的影響與生理鹽水組比較無明顯差異(表12)
表12 鹽酸青藤堿片對大鼠尿量的影響X±SD n＝8藥物 劑量 5h尿量(g/100g體重)mg/kg 正常 水負荷正常對照 - 1.29±0.18 2.28±0.20氫氯噻嗪 5 2.38±0.15***3.93±0.49***鹽酸青藤堿片 201.26±0.78 2.44±0.26鹽酸青藤堿片 401.47±0.19 2.47±0.44鹽酸青藤堿片 801.60±0.60 2.69±0.32**雷公藤多甙片 201.43±0.46 2.58±0.60與生理鹽水組比較 **P＜0.05 ***P＜0.01
討論慢性腎小球腎炎是臨床常見的難治性疾病之一，目前真正有效的治療藥尚不多見。
鹽酸青藤堿片臨床用于治療風濕與類風濕性關節(jié)炎已有十余年的歷史，其療效已得到了廣大醫(yī)生與患者的肯定。大量的實驗研究證實鹽酸青藤堿的治療作用主要與其抗炎、免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)作用有關，一般認為腎小球腎炎基本的發(fā)病機理是免疫介導的炎癥反應。其主要病理改變?yōu)槟I小球血管基底膜免疫復合物沉積，血管通透性改變，腎小球濾過率降低。臨床以蛋白尿、血尿、管型尿、水腫及高血壓或伴有血肌酐、尿素氮升高等腎功能減退為主要表現(xiàn)。為了尋找治療慢性腎小球腎炎的有效藥物，本研究用C-BSA復制家免膜性腎小球腎炎動物模型，觀察了鹽酸青藤堿片的治療作用。
實驗結(jié)果表明鹽酸青藤堿片可明顯減少由C-BSA誘發(fā)的腎炎動物循環(huán)免疫復合物(CIC)的形成，明顯減輕實驗動物的蛋白尿。尿蛋白的輕重反映腎小球基底膜的病變程度，說明本品有減輕免疫損傷和腎小球病變程度的作用。
尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)的代謝絕大部分由腎小球濾過后排出體外，當腎小球濾過功能受損時，血中BUN與Cr必將隨之而升高。β2-MG是一種與免疫有關的低分子蛋白，正常時以極微量存在于體液中，易于從腎小球濾過并幾乎全部在近端腎小管重吸收和分解代謝。若腎小球濾過障礙則血中Cr、BUN、β2-MG升高。尿中β2-MG升高表明腎小管重吸收功能受損。鹽酸青藤堿片能有效地降低血BUN、Cr與血及尿中β2-MG含量，表明其具有改善腎小球濾過功能的作用。
腎小球直徑及腎小球內(nèi)細胞數(shù)可反映腎小球炎癥的程度。前者反映腎小球的腫脹情況，后者表明細胞的增殖與浸潤情況。實驗證實鹽酸青藤堿片對改善腎小球的炎癥現(xiàn)象有一定作用。光鏡下形態(tài)定量分析，鹽酸青藤堿片治療組腎小球平均直徑和腎小球內(nèi)細胞數(shù)均低于模型組。表明腎小球內(nèi)炎癥減輕，濾過膜的通透性得到改善。
鹽酸青藤堿是從中藥青風藤中提取的有效部位，“祛風濕、通經(jīng)絡、利小便”和“行水利尿”是青風藤的主要功效之一。對這一作用的認識，古籍早已有記載。本研究表明，鹽酸青藤堿在增加動物尿量方面顯示出了良好的作用趨勢，對水負荷大鼠有一定利尿作用，使青風藤的行水利尿功效得到了實驗證實。水腫是慢性腎炎的常見癥狀之一，鹽酸青藤堿的這一作用將有益于慢性腎炎癥狀的改善。
以上結(jié)果表明鹽酸青藤堿片具有減少免疫復合物的形成、改善腎小球血管通透性和濾過功能及減輕腎小球炎癥反應的功效。故可用于慢性腎炎的治療。一般認為，慢性腎炎是一種免疫介導的炎癥反應，屬自身免疫性疾病。由于抗原抗體復合物在腎小球基底膜沉積，并引發(fā)一系列特異性與非特異性炎癥反應，造成了對腎小球的破壞，形成各種病理反應。鹽酸青藤堿的抗炎作用人們已早有認識。具對免疫功能的影響，我們的實驗研究(見附件)和不少的研究報道證實，[4][5][6]鹽酸青藤堿對細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫均有抑制作用。鹽酸青藤堿的抗炎與免疫作用可使慢性腎炎病變中腎小球的免疫性炎癥得到控制和緩解，有助于濾過膜通透性和濾過功能改善，從而可以促進腎炎病變的消退。由此推測，鹽酸青藤堿治療慢性腎炎有效可能是與其抗炎與免疫抑制作用有關。
實驗例2鹽酸青藤堿片對免疫作用的實驗研究實驗材料1、藥物鹽酸青藤堿片，由湖南正清新藥開發(fā)中心提供，批號941218；環(huán)磷酰胺片，上海天平制藥廠提供，批號930501A；雷公藤多甙片，中國湖南株洲市制藥三廠出品，批號950301；鹽酸左旋咪唑片，上海延安制藥廠出品，批號940201。
2、動物BALB/C純系小鼠，體重18-22克，雌雄兼用，由上海B.K實驗動物中心提供。(合格證號碼0001750)。
方法與結(jié)果1、鹽酸青藤堿對小鼠免疫器官重量的影響將體重18-22克的小鼠雌雄各半，隨機分成六組，分別為鹽酸青藤堿20、40、80毫克/公斤組，環(huán)磷酰胺30毫克/公斤組，雷公藤多甙40毫克/公斤組及蒸餾水對照組。動物按等體積20毫升/公斤灌胃給藥，每天一次，連續(xù)給藥10天。末次給藥后24小時，處死動物，取胸腺、脾臟稱重。
結(jié)果表明，鹽酸青藤堿能明顯減輕小鼠胸腺和脾臟的重量，對胸腺的影響較脾臟強，與對照組比較有顯著性差異。(見表1)表1 鹽酸青藤堿對小鼠免疫器官重量的影響(X±SD)組別 劑量 動物數(shù) 胸腺系數(shù) 脾臟系數(shù)(n) (mg/10g) (mg/10g)對照組--10 28.20±5.5952.23±7.59鹽酸青藤堿組 2010 22.04±4.19※47.74±6.27鹽酸青藤堿組 4010 17.37±5.44※※※41.63±10.43※鹽酸青藤堿組 8010 20.72±7.46※45.32±10.71環(huán)磷酰胺組3011 10.20±4.87※※※32.26±12.42※※※雷公藤多甙組 4010 20.43±5.82※※47.84±5.22注※與對照組相比 ※P＜0.05 ※※P＜0.01 ※※※P＜0.0012、鹽酸青藤堿對小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能的影響18～22g小鼠，雌雄各半分組及給藥方法同前。按文獻方法[2]，無菌條件下取脾臟制成脾細胞懸液。用Hank’s液洗細胞2次，用含10％小牛血清RPMI-1640將細胞調(diào)至所需濃度，加入到96孔板中培養(yǎng)，每孔100μl，每個樣品設三個復孔，加入ConA10ug/ml，培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前6h，加入3H-Tdk0.5μci/孔，用多頭細胞收集器收集細胞，加入閃爍液，于Beckman液閃儀上測定樣品的放射強度(cpm)。
結(jié)果表明，鹽酸青藤堿對激活劑conA誘導轉(zhuǎn)化細胞的3H-Tdk摻與均有抑制作用。(見表2)3、鹽酸青藤堿對小鼠白細胞介素II(IL-2)的影響按文獻方法[2]，上述淋轉(zhuǎn)實驗時，同時將脾臟進行IL-2依賴細胞株(CTLL2)培養(yǎng)，CTLL2細胞在條件培養(yǎng)基中于24孔板中傳代。然后在96孔板中稀釋標本，稀釋度為1∶2，1∶4，1∶16，1∶32，1∶64，體積為0.1ml，每一稀釋度3個復孔，將CTLL2細胞從24孔板中吸入離心管中，加RPMI-1640，2000×10分鐘離心，重復三次洗滌細胞，用含10％小牛血清RPMI-1640調(diào)整細胞濃度為1×105/ml，將調(diào)整好濃度的CTLL2細胞加入到已稀釋標本96孔板中，每孔0.1ml，輕輕混勻，放5％CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)17hr，加入3H-Tdk0.5μci/孔，繼續(xù)培養(yǎng)6hr，用多頭細胞收集器收獲細胞，加入閃爍液，于Beckman液閃儀上測cpm。以不同稀釋度IL-2標本用cpm值作直線回歸，即用Y＝a+b X公式計算IL-2活性單位。
結(jié)果表明，鹽酸青藤堿能明顯抑制IL-2的活性，與蒸餾水對照組相比有顯著性差異。其抑制強度隨藥物濃度升高而增強，作用較30mg/kg環(huán)磷酰胺組更為明顯，80mg/kg鹽酸青藤堿抑制IL-2生成的作用較40mg/kg雷公藤多甙有顯著性差異。(見表2)
表2 鹽酸青藤堿對淋巴細胞轉(zhuǎn)化率及IL-2的影響(X±SD)組別 劑量 動物數(shù) 淋轉(zhuǎn) IL-2(n)(刺激指數(shù)) (生長指數(shù))對照組-- 10 3.22±0.69 15.72±3.17鹽酸青藤堿組 20 10 2.19±0.93※6.04±2.14※※※鹽酸青藤堿組 40 10 2.30±0.76※5.93±3.61※※※鹽酸青藤堿組 80 10 3.00±1.29 4.16±1.78△△※※※環(huán)磷酰胺組30 11 1.52±0.45※※※9.19±2.18※※※雷公藤多甙組 40 10 1.74±0.37※※※8.16±2.97※※※注※與對照組相比 ※P＜0.05 ※※P＜0.01 ※※※P＜0.001·與環(huán)磷酰胺組相比 ·P＜0.05 ··P＜0.01 ···P＜0.001△與雷公藤多甙組相比 △P＜0.05 △△P＜0.014、鹽酸青藤堿對遲發(fā)型超敏反應的影響18～22g小鼠，雌雄各半，隨機分成六組，分別為鹽酸青藤堿20、40、80mg/kg組，環(huán)磷酰胺30mg/kg組，雷公藤多甙40mg/kg組與蒸餾水對照組。連續(xù)灌胃10天，給藥第5天各組小鼠用1％二硝基氯苯溶液10μl均勻涂于小鼠腹部脫行部位致敏，次日強化一次，致敏后5天，用1％二硝基氯苯溶液10μl均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)進行攻擊，24hr后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下耳殼，在相同部位各打下一直徑8mm的耳片，稱重。以左右耳片重量之差作為判斷反應的指標[3]。
結(jié)果表明，鹽酸青藤堿對二硝莖氯苯誘發(fā)的耳廓遲發(fā)型超敏反應有明顯的抑制作用。40、80mg/kg組與對照組比較有顯著性差異。(見表3)表3 鹽酸青藤堿對遲發(fā)型超敏反應的影響(X±SD)組別 劑量 動物數(shù) 淋轉(zhuǎn)(n)(刺激指數(shù))對照組-- 10 0.15±0.09鹽酸青藤堿組 20 10 0.09±0.05鹽酸青藤堿組 40 10 0.09±0.02※鹽酸青藤堿組 80 10 0.08±0.03※環(huán)磷酰胺組30 11 0.07±0.04※雷公藤多甙組 40 10 0.08±0.03※注※與對照組相比 ※P＜0.05 ※※P＜0.01 ※※※P＜0.001
5、鹽酸青藤堿對巨噬細胞吞噬功能的影響將18～20g小鼠隨機分成七組，按表4所示劑量分別灌胃給藥，連續(xù)10天，除蒸餾水對照組外，其余各組每2天一次按26mg/kg灌胃左旋咪唑溶液，每6天每鼠腹腔注射0.5％淀粉溶液0.5ml，每10天每鼠腹腔注射5％雞紅細胞懸液0.5ml，間隔12小時，頸椎脫臼處死小鼠，采用滴片法[4]，取腹腔液滴于載玻片上，37℃溫育30分鐘，用生理鹽水沖去滴片上懸浮的未被吞噬的雞紅細胞及其它細胞，甲醇固定，Glemsa-Wright染液染色，油鏡下觀察，計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。
結(jié)果表明，鹽酸青藤堿對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞的百分率和吞噬指數(shù)均顯著降低，與對照組比較有顯著性差異，并隨劑量的增大其吞噬百分率和吞噬指數(shù)降低。(見表4)表4 鹽酸青藤堿對巨噬細胞吞噬功能的影響(X±SD)組別 劑量 動物數(shù)吞噬率 吞噬指數(shù)(gm/kg) (n) (％)對照組 -- 10 59.9±9.51 1.71±0.19左旋咪唑組 26 72.3±9.07※※2.01±0.25※※鹽酸青藤堿+左旋咪唑組 20 10 52±14.58 1.49±0.33鹽酸青藤堿+左旋咪唑組 40 10 49.2±11.06※1.41±0.39※鹽酸青藤堿+左旋咪唑組 80 10 48.8±10.18※1.32±0.32※※環(huán)磷酰胺+左旋咪唑組30 10 44.1±12.15※※1.09±0.27※※雷公藤多甙+左旋咪唑組 40 10 47.6±12.38※1.38±0.36※注※與對照組相比 ※P＜0.05 ※※P＜0.01 ※※※P＜0.001
6、鹽酸青藤堿對抗體溶血素產(chǎn)生的影響將18～22g小鼠，雌雄各半，隨機分成五組，分別為鹽酸青藤堿20、40、80mg/kg組，環(huán)磷酰胺30mg/kg組及蒸餾水對照組。連續(xù)灌胃給藥10天，第3天每鼠腹腔注射5％雞紅細胞懸液0.2ml致敏后7天，摘取眼球取血，稀釋血清加雞紅細胞懸液及稀釋豚鼠血清，溫育30分鐘后離心，比色測定光密度。以光密度讀數(shù)作為判定血清溶血素的指標，比較各組的差異[4]。
結(jié)果表明，鹽酸青藤堿劑量為20.40mg/kg時均可明顯降低小鼠抗體溶血素的水平。(見表5)表5鹽酸青藤堿對小鼠溶血素產(chǎn)生的影響(X±SD)組別劑量 動物數(shù)O.D值(mg/kg) (n)對照組 -- 10 0.72±0.24鹽酸青藤堿組 20 12 0.53±0.20※鹽酸青藤堿組 40 90.52±0.13※鹽酸青藤堿組 80 10 0.72±0.16環(huán)磷酰胺組 30 11 0.046±0.017※※※注※與對照組相比 ※P＜0.05 ※※P＜0.01 ※※※P＜0.001
小結(jié)結(jié)果表明，口服一定劑量的鹽酸青藤堿能明顯降低小鼠胸腺和脾臟的重量，對小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，IL-2，遲發(fā)型超敏反應，巨噬細胞的吞噬功能及抗體溶血素的產(chǎn)生均呈免疫抑制作用，提示鹽酸青藤堿對非特異性免疫、體液免疫和細胞免疫均有抑制作用。有文獻報導[1，5]，鹽酸青藤堿注射給藥可明顯抑制機體的免疫功能，本文口服給藥所得的結(jié)果與文獻報導的一致。
胸腺是重要的免疫器官，胸腺淋巴細胞是全身T細胞的來源，T細胞在機體細胞免疫中具有重要功能[6]。鹽酸青藤堿使胸腺重量明顯降低，對淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，IL-2的活性，遲發(fā)型超敏反應有明顯的抑制作用，說明鹽酸青藤堿對細胞免疫的抑制作用主要與抑制T淋巴細胞有關，而對巨噬細胞吞噬功能及抗體溶血素的形成呈現(xiàn)免疫抑制作用，說明對機體非特異性免疫、體液免疫亦有抑制作用。
參考文獻1.彭慧敏等，中國藥理學報，1988年7月；9(4)3772.湖南醫(yī)科大學《免疫學實驗指導》研究生用3.《新藥(西藥)臨床前研究指導原則匯編》中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局，1993，權(quán)利要求
1.青藤堿及其藥物學上可接受的鹽在制備治療慢性腎炎的藥物中的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述的慢性腎炎是腎小球腎炎。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述的青藤堿的藥物學上可接受的鹽是鹽酸青藤堿。
4.青藤堿在制備治療慢性腎炎的藥物中的應用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其中所述的慢性腎炎是腎小球腎炎。
全文摘要
本發(fā)明是關于青藤堿及其藥物學上可接受鹽的新用途，具體說是青藤堿及其藥物學上可接受的鹽在制備治療慢性腎炎的藥物中的應用。
文檔編號A61K31/485GK1142946SQ9610657
公開日1997年2月19日 申請日期1996年6月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月9日
發(fā)明者仇萍, 邱賽紅 申請人:白云山正清制藥股份有限公司