專利名稱：超聲用氣體懸浮液的貯存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及固定在冷凍水性載體介質(zhì)中的氣泡懸浮液。本發(fā)明還涉及氣泡懸浮液冷藏及用作人和動物超聲成象造影劑的方法。
背景技術(shù)：
近年來，超聲造影劑的迅速發(fā)展產(chǎn)生了在人或動物體器官和組織超聲成象上有用的許多不同的制劑。這些制劑的設(shè)計主要作為靜脈內(nèi)或動脈內(nèi)的注射劑，和醫(yī)用回波描記儀配合使用。這些儀器典型地分成B型成象(根據(jù)反向散射組織性質(zhì)的空間分布)和多普勒(Doppler)信號處理(根據(jù)超聲回波的連續(xù)波或脈沖多普勒處理以確定血液或流體參數(shù))。將來，其它超聲成象法也可得益于這些制劑，如計算機輔助的層面超聲照相術(shù)(Ultrasound Computed Tomography，測量傳輸?shù)乃p)或計算機輔助的層面衍射照相術(shù)(Diffraction Computed To-mography，測量角向反射的散射和衰減參數(shù))。根據(jù)微氣泡在水性載液中的懸浮液，這些可注射的制劑基本上可分為兩類一類水性懸浮液，其中微氣泡被氣/液界面約束，即被包括液體分子和被松弛地約束在氣/液界面的表面活性劑的暫時的包膜所約束；另一類懸浮液，其中微氣泡具有天然或合成聚合物形成的物質(zhì)邊界或有形包膜。在后一種情況下，微氣泡被稱為微氣球。還有另一類超聲造影劑是聚合物或其它固體的多孔顆粒的懸浮液，它們攜帶在微粒的孔內(nèi)截留的微氣泡。這些造影劑在本文中被看作微氣球類的變體。盡管物理學(xué)上不同，但這兩類懸浮液中的微氣泡均用作超聲造影劑。這些不同制劑的更詳細的情況可見EP-A-0 077 752(Schering)，EP-A-0 123 235(Schering)，EP-A-0 324938(Widder et al.)，EP-A-0 474 833(Schneider et al.)，EP-A-0 458745(Bichon et al.)，US-A-4,900,540(Ryan)，US-A-5,230,882(Unger)，etc.
上述超聲造影劑中有些已被開發(fā)并有市售，而其它的則處在臨床試驗的不同階段。然而，不管是已有市售或正在臨床試驗中，這些產(chǎn)品都遇到與貯存有關(guān)聯(lián)的問題。對于懸浮液來說，貯存問題是固有的，由于它們的特殊性質(zhì)，這些懸浮液會發(fā)生相分離或離析、氣泡聚集、氣體擴散，在長期貯存后甚至還有各種添加劑的沉淀。微氣泡或微氣球的離析來自如下事實懸浮液典型地由大小變化于約1μm至約50μm之間的未標(biāo)準(zhǔn)化(uncalibrated)微氣泡構(gòu)成。在已知的懸浮液中大量氣泡大小在1μm和約10μm之間。由于微氣泡大小的分布，這些懸浮液在貯存中經(jīng)歷著離析，其中較大的微氣泡移至頂部，而較小的微氣泡則濃集于較低部分，常導(dǎo)致完全的相分離。通過使用增稠劑解決此問題的嘗試表明，離析率可降低但并未消除。
微氣泡聚集是大氣泡吸收小氣泡從而增大體積的過程。隨著相分離，此過程加速，微氣泡平均大小在例如2-8μm之間的懸浮液一會兒可能演化為微氣泡大小在例如5-12μm之間或更大的懸浮液。在涉及標(biāo)準(zhǔn)化微氣泡的懸浮液和用于左心不透明化的懸浮液的情況下，這是特別不合需要的。大小的變化不僅改變了造影劑產(chǎn)生回波的性質(zhì)，而且使制劑不能應(yīng)用于某些用途，如基于微氣泡通過肺的應(yīng)用。大小超過10μm的微氣泡未必能通過肺毛細血管，因此除增加危險性之外，這樣的懸浮液也不大適合于左心成象。
氣體懸浮液及其貯存的另一個問題出自氣體擴散，它雖以較低速率出現(xiàn)，但隨相分離而加速。氣體從微氣泡懸浮液中不可避免的逃逸因而進一步加重，且在極端情況下可導(dǎo)致介質(zhì)中氣體的完全排盡。因此，氣體懸浮液的這些不同的破壞機制合并的效應(yīng)導(dǎo)致制劑品質(zhì)很快的降低。
在某些超聲成象方法中，這些造影劑的一個合乎需要的方面是微氣泡或含氣體顆粒分布在嚴(yán)格的大小范圍內(nèi)。理由如下。這些制劑增強醫(yī)用超聲探測儀成象對比度的效果主要基于入射超聲能量的散射大大增加，其次基于含這些制劑的組織的衰減性質(zhì)得到改進。對比意味著測量灌注造影劑的區(qū)域與未接受造影劑的區(qū)域得到的相對信號幅度。增強意味著給予造影劑后觀察到的對比值與給予前觀察到的對比值有所增加。如前所述，最直接受益于這些制劑的成象儀的類型是回波描記儀這一類(B型或多普勒)。含該制劑的組織與不含該制劑的組織的不同衰減性也可用來改善成象方法的診斷價值。此外，制劑散射性和衰減性的超聲頻率依賴性也可用來進一步增加組織在空間的辨別力。在這些情況下，支配頻率依賴性的物理定律嚴(yán)格依賴于微氣泡或顆粒的大小。因此，所用的規(guī)律對來源于具有嚴(yán)格大小分布的微氣泡或顆粒的回波起作用時，更為有效。作為例子，有一個這樣的方法利用微氣泡的非線性振動來檢測基本激發(fā)頻率的倍頻回波頻率成分。不含造影劑的組織并不顯示與微氣泡同樣的非線性特性，因此這種方法能明顯地增強含造影劑和不含造影劑的區(qū)域之間的對比度。當(dāng)微氣泡或顆粒大小分布狹窄時，對于每單位體積一定量的顆粒計數(shù)而言，這種增強就更為明顯。但是，制備具有這樣窄的大小分布的產(chǎn)品是費時的；假如能便利地供應(yīng)這些標(biāo)準(zhǔn)化的懸浮液就會大大促進這一技術(shù)的進一步發(fā)展和使用。因此，可靠地、大小分布不變地貯存這些制劑也是受到很大關(guān)注的。
在貯存含磷脂作為微氣泡穩(wěn)定劑的氣體水懸浮液的超聲造影劑時遇到了另一些困難。在貯存中，由于磷脂的水解，穩(wěn)定劑(表面活性劑)的濃度不斷減小，引起微氣泡含量減少，懸浮液產(chǎn)生回波的性能降低。因此，迄今含微氣泡的懸浮液的超聲造影劑的貯存問題仍有待解決。
在食品工業(yè)中，通過冷凍將氣體水懸浮液冷藏已被人們知道相當(dāng)一個時期了。例如，US-A-4,347,707(General Foods Corp.)公開了氣體含量高、貯存穩(wěn)定性好的充氣冰的貯存法，在該方法中，充氣冰的制備是通過將含水液體與會生成水合物的氣體在加壓和一定的溫度下接觸，此壓力和溫度能使懸浮在該液體中的氣體水合物復(fù)合物得以形成，然后有控制地降低溫度和壓力，產(chǎn)生例如具有85-110ml CO2/g的充了碳酸氣的冰。按照該文獻，充氣冰的氣體含量高，在長時間內(nèi)具有貯存穩(wěn)定性，適于以冷凍狀態(tài)商業(yè)銷售，放在水中時，則產(chǎn)生強烈泡沫。
結(jié)果產(chǎn)生這樣的情況，即為了貯存較長時間而將氣體懸浮液冷凍，但需要時重新使用貯存的懸浮液，卻不適合作為超聲造影劑，因為解凍時懸浮的氣體有從載體介質(zhì)中逃逸的傾向。微氣泡的冷凍氣體懸浮液還有一個困難，在于冷凍時載體介質(zhì)的膨脹會產(chǎn)生內(nèi)力直接破壞或壓破微氣泡的包膜，在貯存中或以后在懸浮液解凍時釋出所截留的氣體，使其逃逸。這一問題對于具有實質(zhì)性或有形包膜的微氣泡懸浮液來說尤為嚴(yán)重。
發(fā)明的概述簡單地概括起來，本發(fā)明涉及固定在冷凍的含水載體介質(zhì)中的氣泡的冷凍懸浮液，其中含氣泡和常用的添加劑的載體介質(zhì)是生理上可接受的載體。被固定的氣泡是以暫時的包膜或有形的膜為界的微氣泡，懸浮液在液體狀態(tài)時可注射于機體，用作人和動物患者血池和組織超聲成象的造影劑。
按照本發(fā)明，冷凍的懸浮液的溫度為-1℃至-196℃之間，以-10℃和-76℃之間為較佳，而微氣泡的大小為50μm以下，以10μm以下為較佳。特別有用的微氣泡大小在2μm和9μm之間的懸浮液，而微氣泡大小在3μm和5μm之間的懸浮液更為有用。
鑒于在含由合成或天然聚合物或蛋白質(zhì)形成的膜的有形包膜的氣體微氣球或微氣泡的懸浮液和含具有暫時的包膜的氣體微氣泡的懸浮液之間存在著生物降解性的差異，特別在使用單分子或多分子膜層形式的層狀磷酯時，后者的冷凍懸浮液更為有利。
本發(fā)明還涉及貯存微氣泡懸浮液的方法，其中，懸浮液放進冷卻裝置中，通過將溫度冷卻到懸浮液的凝固點之下，較佳為-1℃至-196℃之間的溫度，更佳為-10℃至-76℃，將微氣泡固定在載體介質(zhì)中，并長時間維持冷凍條件。可任選地將冷凍的懸浮液保持在一種惰性氣體或氣體混合物的氣氛中，其中至少一種氣體是包封在微氣泡中的氣體。該氣體較好的是選自含鹵氣體、空氣、氧氣、氮氣、二氧化碳或它們的混合物。
本發(fā)明還揭示了本發(fā)明的可注射懸浮液在器官和組織超聲回波成象上的應(yīng)用及超聲造影劑的制造。
附圖的簡要說明

圖1是解凍后的SF6和含5％C5F12的空氣的微氣泡在含水載體介質(zhì)中的懸浮液中氣泡濃度(計數(shù))的變化作為貯存溫度的函數(shù)所作的圖。
圖2是解凍后的SF6和含5％C5F12的空氣的微氣泡在含水載體介質(zhì)中的懸浮液中氣體總體積的變化作為貯存溫度的函數(shù)所作的圖。
圖3是解凍后的微氣泡懸浮液的吸光度變化作為所加的外壓和貯存溫度的函數(shù)所作的圖。
圖4是相對吸光度變化作為對于不同溫度貯存后解凍的懸浮液施加的外壓的函數(shù)的曲線圖。
圖5是平均大小為3μm、4μm和6μm的標(biāo)準(zhǔn)化微氣泡的微氣泡大小的數(shù)量分布(圖5A)和氣體體積分布(圖5B)的曲線圖。
圖6是一個非標(biāo)準(zhǔn)化微氣泡樣品的微氣泡大小的數(shù)量分布(圖6A)和氣體體積分布(圖6B)的曲線圖。
發(fā)明的詳述按照本發(fā)明，提供一種氣體微氣泡的冷凍懸浮液，其中微氣泡被固定在冷凍的含水載體介質(zhì)中，該介質(zhì)除了含微氣泡之外還包括通常的添加劑。含水載體是生理學(xué)上可接受的，懸浮液在液體狀態(tài)時可注射于機體中，用作人和動物患者血池或組織成象的超聲造影劑。以暫時的包膜或有形的膜束縛的固定的微氣泡被截留在冷凍的載體介質(zhì)的分子之間，載體介質(zhì)的溫度在-1℃和-196℃之間，以-10℃和-76℃之間為較佳。所用的確切溫度范圍取決于微氣泡中氣體的選擇，也取決于所用添加劑的種類和數(shù)量。因此，例如在空氣或氮氣的情況下，溫度可為-1℃和-196℃之間任一點，而在C4F8的情況下，溫度可為-1℃和-5℃之間。當(dāng)用聚氧丙烯/聚氧乙烯共聚物或聚乙二醇作為添加劑時，根據(jù)在懸浮液中的總量，最高可接受的溫度可為-5℃或甚至-10℃而不是-1℃。
懸浮液中大多數(shù)微氣泡的大小典型地是低于50μm，但對于可靜脈注射的造影劑來說，微氣泡大小以低于10μm為佳。
對于大多數(shù)應(yīng)用，微氣泡大小分布在2μm和9μm之間的懸浮液即可滿足要求，但當(dāng)處理標(biāo)準(zhǔn)化微氣泡的懸浮液時，大小可在該范圍中的任一點，例如，在2-4μm、3-5μm、4-6μm、5-7μm、6-8μm、7-9μm，而以大小范圍在3μm和5μm之間的微氣泡為佳。
因此，本發(fā)明還提供大小分布很窄的微氣泡的懸浮液。標(biāo)準(zhǔn)化微氣泡懸浮液的典型的微氣泡大小分布如圖5所示，其中圖5A是微泡數(shù)目分布(用Coulter計數(shù)器測出)，用5B是微氣泡體積分布(用Coulter計數(shù)器測出)。與含標(biāo)準(zhǔn)化微氣泡的懸浮液相反，含非標(biāo)準(zhǔn)化氣泡的懸浮液，其數(shù)目和體積的大小分布典型地與圖6A和6B所示形式相似。從這些圖容易理解，標(biāo)準(zhǔn)化微氣泡制成的回波探測響應(yīng)懸浮液將更為均勻，與非標(biāo)準(zhǔn)化微氣泡的懸浮液相比提供較少發(fā)散因而輪廓更為鮮明的圖象。正如早已提及的那樣，這些標(biāo)準(zhǔn)化的懸浮液是非常令人滿意的。但它們的使用至今很有限。這些令人滿意的懸浮液目前可通過冷凍懸浮液的簡單轉(zhuǎn)化而方便地得到，冷凍懸浮液可在低溫下長時間貯存而不使它們原來的產(chǎn)生回波的性質(zhì)過分喪失。
本發(fā)明的另一個優(yōu)點出自如下事實，即為了產(chǎn)生兩倍于基本頻率的回波信號成分，倍頻成象需要造影劑具有非線性振動。這樣的特性要求組織某一深度的超聲激發(fā)水平超過一定的聲波閾值。在非線性振動時，發(fā)生頻率的轉(zhuǎn)變，使聲能從基本激發(fā)頻率轉(zhuǎn)變成倍頻。在這類成象中，傳遞給微氣泡的相當(dāng)數(shù)量的能量要求微氣泡有足夠的抗性以在這些條件下能存在。本發(fā)明提供一個容易和方便的途徑以得到具有對壓力變化抗性良好的微氣泡的懸浮液。因為它們現(xiàn)在能提前制備，貯存，并在需要時加以使用。
如所述的那樣，除微氣泡之外，本發(fā)明的冷凍懸浮液還含添加劑，它們包括各種表面活性劑、增稠劑、穩(wěn)定劑等?？砂ǔ赡ず头浅赡さ谋砻婊钚詣┑谋砻婊钚詣┯袑訝罨蚱瑺盍字鼈円阎煞€(wěn)定微氣泡的暫時的氣/液包膜。層狀磷脂可以是單分子或多分子膜層的形式或可以是脂質(zhì)體。
根據(jù)微氣泡的類型，即具有暫時的包膜還是具有有形的膜，載體介質(zhì)可包括作為添加劑的水合劑和/或親水性穩(wěn)定劑化合物，如聚乙二醇，碳水化合物如半乳糖、乳糖或蔗糖、葡聚糖、淀粉和其它多糖，或其它常規(guī)的添加劑，如聚氧丙二醇、聚氧乙二醇及其共聚物；脂肪醇和聚氧二醇的醚；脂肪酸和聚氧烷基化脫水山梨醇的酯；皂類；甘油-聚亞烷基硬脂酸酯；甘油-聚氧乙烯蓖麻醇酸酯；聚二醇的均聚物和共聚物；聚乙氧基化豆油和蓖麻油，以及氫化衍生物；蔗糖或其它碳水化合物與脂肪酸、脂肪醇的醚和酯，它們可任意地聚氧烷基化；飽和或不飽和脂肪酸的甘油一酯、二酯和三酯，也可用豆油的甘油酯和蔗糖。表面活性劑可以是成膜的和不成膜的，可包括亞油酰卵磷脂型可聚合的兩親化合物或聚乙二醇十二烷酸酯。表面活性劑以成膜的為佳，更佳的是選自磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂、鞘磷脂及其混合物的磷脂類。除了所述的成膜的表面活性劑之外，懸浮液還可包括最高達50％(重量)的非層狀的表面活性劑，它們選自脂肪酸，脂肪酸和醇與多元醇的酯和醚，此多元醇如聚亞烷基二醇類、聚亞烷基化糖和其它碳水化合物，及聚亞烷基化甘油。特別合適的物質(zhì)包括磷酸雙十六烷酯、膽甾醇、麥角甾醇、植物甾醇、谷甾醇、羊毛甾醇、生育酚、棓酸丙酯、棕櫚酸抗壞血酸酯和丁基化羥基甲苯。
可以理解，本發(fā)明不僅僅限于有暫時的包膜的微氣泡的懸浮液。任何充滿氣體的合適顆粒，如多孔顆粒，脂質(zhì)體，或具有磷脂、合成或天然聚合物或蛋白質(zhì)形成的包膜的微氣球，都可被方便地使用。已經(jīng)確認，白蛋白制成的微氣球，或脂質(zhì)體囊可被成功地長期貯存于冷凍狀態(tài)。解凍的含這些微氣球的懸浮液已證明具有微氣泡丟失相當(dāng)少的滿意的產(chǎn)生回波的性質(zhì)。用山梨醇或諸如聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物(市售品稱作Pluronic)的非離子型表面活性劑穩(wěn)定的微氣泡的懸浮液已證明在貯存后有同樣好的成象能力。
本發(fā)明的懸浮液所用的添加劑還可包括選自線性或交聯(lián)多糖和寡糖、糖、親水性聚合物和磺化的化合物的增稠劑和/或穩(wěn)定劑。在這種情況下，這些增稠劑和/或穩(wěn)定劑與所含的表面活性劑的重量比在約1∶5至100∶1之間。
按本發(fā)明的用不同氣體或氣體混合物制成的懸浮液通常含微氣泡107-108個/ml、108-109個/ml或109-1010個/ml。在長期貯存即幾個月之后，這些濃度實際上保持相同，如果懸浮液用SF6、C3F8或其混合物，或用空氣與SF6或C5F12的混合物制成，則甚至在反復(fù)進行凍融循環(huán)之后也不改變。
懸浮液中的微氣泡具有有形的膜時，該膜由合成的或天然的聚合物或蛋白質(zhì)制成。構(gòu)成可注射的微氣球的包膜或界膜的聚合物可選自大多數(shù)親水性，可生物降解的、生理學(xué)上相容的聚合物。在這些聚合物中可列舉低水溶性多糖、聚交酯和聚乙交酯及其共聚物、丙交酯和內(nèi)酯的共聚物(如ε-己內(nèi)酯、-戊內(nèi)酯)和多肽。選擇合成聚合物時其多樣性是有益的，因為對于變態(tài)反應(yīng)患者，可能希望避免使用天然蛋白質(zhì)(白蛋白、明膠)制成的微氣球。其它合適的聚合物包括聚原酸酯、乳酸和乙醇酸的共聚物、聚(DL)-丙交酯-共--己內(nèi)酯)、聚(DL-丙交酯-共--戊內(nèi)酯)、聚(DL-丙交酯-共-g-丁內(nèi)酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯；聚酰胺類，聚羥基丁酸；聚二噁烷酮；聚-β-氨基酮類，polyphosp-hazenes和聚酐類。還可使用聚氨基酸，如聚谷氨酸和聚天冬氨酸，以及它們的衍生物，即和低級醇類或二醇類的偏酯。這樣的聚合物一個有用的例子是聚(谷氨酸叔丁酯)。
當(dāng)膜由蛋白質(zhì)類材料制成時，該蛋白質(zhì)為白蛋白。
雖然可與合適的表面活性劑和穩(wěn)定劑一起，可單獨使用含鹵氣體、空氣、氧氣、氮氣或二氧化碳，但近來也有人提出使用含鹵氣體與空氣、氧氣、氮氣和二氧化碳的混合物。含鹵氣體是選自以下化合物的氣體，它們是六氟化硫、四氟甲烷、氯三氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、溴氯二氟甲烷、二溴二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯五氟乙烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷、六氟丁二烯、八氟-2-丁烯、八氟環(huán)丁烷、十氟丁烷、全氟環(huán)戊烷、十二氟戊烷或它們的混合物，較佳的為六氟化硫、四氟甲烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷、六氟丁二烯、八氟-2-丁烯、八氟環(huán)丁烷、十氟丁烷、全氟環(huán)戊烷、十二氟戊烷。
本發(fā)明還涉及貯存微氣泡懸浮液的方法，其中，懸浮液放在冷卻裝置如冰箱中，通過將溫度冷卻到懸浮液的凝固點以下使微氣泡固定在載體介質(zhì)中，溫度以-1℃和-196℃之間為佳，更佳為-10℃和-76℃之間，將這些冷凍條件長期維持。冷凍的懸浮液可任選地保持在惰性氣體或氣體混合物的氣氛中，該氣體混合物中至少一種是被封入微氣泡中的氣體。該氣體較宜選自含鹵氣體、空氣、氧氣、氮氣、二氧化碳或它們的混合物。
現(xiàn)已確認，用于本發(fā)明的冷凍懸浮液的氣體或氣體混合物應(yīng)具有-18℃以下的沸點。這意味著用諸如C4F8和C5F10之類鹵化的氣體單獨制成的懸浮液貯存穩(wěn)定性會很差，在冷凍后實際上會失去它們的產(chǎn)生回波的全部性質(zhì)。這是特別令人吃驚的，因為所有其它鹵化的氣體會產(chǎn)生很穩(wěn)定的冷凍懸浮液，它們經(jīng)幾次凍/融循環(huán)仍然不明顯失去產(chǎn)生回波的特性。甚至將這些氣體摻雜少量其它的鹵化氣體或甚至在室溫下是液體的鹵化物如C5F12的蒸氣，產(chǎn)生的混合物也不能冷凍貯存。另一方面，將空氣與一定量的這些氣體混合，產(chǎn)生的混合物有很好的貯存穩(wěn)定性，在幾次凍/融循環(huán)之后仍有很好的產(chǎn)生回波的性質(zhì)。
如上所述，本發(fā)明的可注射的懸浮液在液體狀態(tài)時作為器官和組織超聲成象的造影劑是有用的。顯然，在使用前將懸浮液解凍，并任意地在室溫下保持一段時間，然后施用于患者。然后將患者用超聲探頭描掃，產(chǎn)生描掃區(qū)域的圖象。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，還有從本發(fā)明的冷凍的可注射的懸浮液制備超聲回波描記造影劑的方法。關(guān)于制備，意思是將標(biāo)準(zhǔn)化或未標(biāo)準(zhǔn)化的微氣泡的濃懸浮液(例如1010-1011個微氣泡/ml或更多)在冷凍狀態(tài)貯存一段時間，需要時將解凍的懸浮液任意加入相同或不同的生理上可接受的液體載體，稀釋成所需的濃度。還設(shè)想此時可加入另外的添加劑或調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明以如下實施例作進一步闡述。
實施例1在一圓底玻璃容器中，將得自Avanti Polar Lipids(USA)的58mg二花生酰磷酯酰膽堿(DAPC)和2.4mg二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)及得自Siegfried公司的3.94g聚乙二醇(PEG4000)于60℃溫度下溶于叔丁醇(20ml)。將此澄清的溶液迅速冷卻至-45℃并凍干。將所得的白色餅狀物的數(shù)份樣品(25mg)放在10ml玻璃小瓶中，用橡皮塞塞住這些小瓶，抽成真空，充填選擇的氣體或氣體混合物(見表1)。然后通過橡皮塞注入鹽水(0.9％NaCl)(每瓶5ml)，劇烈振搖，使凍干物溶解。
將微氣泡懸浮液放在冷藏室(-18℃)中。三天后，將它們在室溫(23℃)下融化，分析氣泡濃度(用Coulter Multisizer)和1/50稀釋液在700nm處的吸光度。700nm處的吸光度是氣泡懸浮液總濁度的度量。
表1

*表示為Bunscn系數(shù)表1所給的結(jié)果表明，對冷凍的穩(wěn)定性取決于氣體的沸點和氣體的水溶性。在氣體沸點高于-18℃的情況下，回收的氣泡較小。對于混點低于-18℃的氣體來說，在水中的溶解度越低，氣泡的回收率越高。也非常有趣地注意到，加入少量高分子量、低水溶性的氣體，如十二氟戊烷(C5F12)，能改善融化后低沸點氣體的氣泡回收率，而對沸點高于-18℃的氣體則無作用。最后，充滿C4F8和C4F10(單獨，或與少量十二氟戊烷的混合物)的微氣泡對凍/融的穩(wěn)定性很差。然而，當(dāng)這些氣體與空氣合用時，含這些混合物的微氣泡的懸浮液顯示出比含空氣的微氣泡的懸浮液更好的結(jié)果，表現(xiàn)在產(chǎn)生回波的能力或微氣泡的丟失上。
實施例2將如實施例1所述制得的SF6微氣泡懸浮液緩緩(約30分鐘)冷凍至-18℃或迅速(在1分鐘內(nèi))冷凍至-45℃。將其它SF6微氣泡懸浮液先保存在室溫下直至所有氣泡升至表面再冷凍。其它懸浮液在氣泡均勻地分布在溶液中時冷凍。冷凍的懸浮液貯存于-18℃和-45℃一個月，然后解凍。
表2

表2結(jié)果表明，冷凍速度對最終結(jié)果影響較小。均勻的懸浮液比經(jīng)潷析的微氣泡的懸浮液回收率好。
實施例3在氯仿-甲醇(2/1)中溶解4.5g氫化的大豆磷脂酰膽堿(HSPC，得自Nat-termann公司)和0.5g磷酸雙十六烷基酯(Fluka，Switzerland)，然后在圓底燒瓶中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將溶劑蒸發(fā)至干，制成多層脂質(zhì)體(MLVs)。將留下的脂質(zhì)膜在真空干燥器中干燥。加入100ml蒸餾水后，將懸浮液于70℃攪拌保溫30分鐘。加入蒸餾水將脂質(zhì)體懸浮液調(diào)整到脂質(zhì)的終濃度為25mg/ml。
將脂質(zhì)體懸浮液的一份樣品(100ml)加到裝有高速機械乳化器(Polytron)的氣密玻璃反應(yīng)器中。反應(yīng)器中的氣相為含5％C5F12的空氣(用密度測定法測定)。在均化(10,000rpm，1分鐘)后，將所得乳狀懸浮液引入潷析漏斗。6小時后，在溶液頂部可見白色氣泡層。除去下層(含脂質(zhì)體的)水相，加入少量新鮮水，將微氣泡層再均化。重復(fù)此過程(潷析)，制得具有不同大小微氣泡的4種樣品(見WO94/09829)。將樣品冷凍至-18℃，24小時后融化至室溫。
表3

從所得結(jié)果(表3)看來，凍/融處理并不影響微氣泡的平均直徑。從實驗中顯示出，直徑較大(＞2.5μm)的微氣泡對凍/融處理的耐受性比直徑較小的微氣泡好。還觀察到，在某些情況下，解凍速率可影響存在于樣品中的微氣泡的終濃度。確切的關(guān)系尚不清楚，但有亦象表明，微氣泡的丟失與解凍速率成反比。初步結(jié)果表明，關(guān)于懸浮液中的微氣泡濃度(計數(shù))和氣體總體積，加速解凍(例如在25℃水浴中進行解凍)比樣品放在5℃或20℃逐漸解凍所得到的結(jié)果要好。氣體體積的最大丟失見于5℃解凍的樣品。
實施例4用表面活性劑的混合物代替MLVs，重復(fù)實施例3所述實驗。表面活性劑混合物是這樣得到的將1g二棕櫚酰磷酯酰甘油(DPPG Na，得自Avanti PolarLipids，USA)和3g PluronicF68(分子量為8400的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物)溶解在蒸餾水(80ml)中。在約70℃加熱后，得到澄清的溶液。將此溶液室溫冷卻，用甘油將體積補至100ml。將此表面活性劑溶液引入裝有Polytron乳化器的氣密反應(yīng)器中。均化(10,000rpm，1分鐘)后，得到頂部有一層泡沫的乳狀懸浮液。棄去泡沫，回收含109個微氣泡/ml的下層水相。將其放置幾小時，然后收集白色微氣泡層。將收集到的微氣泡在蒸餾水中再均化，再次潷析，并如前所述進行凍/融。比較冷凍前后氣泡的特性，未觀察到氣泡總濃度(冷凍前1.3×108個氣泡/ml，冷凍后1.25×108個氣泡/ml)或平均直徑Dn(冷凍前4.0μm，冷凍后3.9μm)有顯著變化。
實施例5如實施例1所述制備SF6氣泡，并如實施例3所述進行潷析。在除去下層水相時，在漏斗中導(dǎo)入等體積SF6氣體。將氣泡層再懸浮于蒸餾水、0.9％NaCl、3％甘油水溶液和100mg/ml海藻糖溶液。在凍-融處理前、后測定氣泡濃度和700nm處的吸光度(稀釋后測)。
表4的結(jié)果顯示不管懸浮介質(zhì)是什么，氣泡回收率都很好。重要的是注意到此處微氣泡回收率為66-96％之間，看來可能與前面表1、2報告的結(jié)果相矛盾。但是，在此例中，首先，微氣泡是標(biāo)準(zhǔn)化的，即比未標(biāo)準(zhǔn)化的更為穩(wěn)定，其次，此例所用的微氣泡的大小在4μm以上。
表4

實施例6如實施例5所述，得到潷析過的SF6微氣泡。以不同的氣泡濃度將微氣泡層懸浮在0.9％NaCl中，然后于-18℃冷凍，貯存約4個月，于室溫下融化。
表5

*括號中是第二次凍/融處理后得到的結(jié)果表5中收集的結(jié)果表明，氣泡濃度對于對凍/融的耐受能力并無明顯作用。甚至于貯存后進行的第二次凍/融處理也不影響終濃度，表明甚至在貯存后這些懸浮液對反復(fù)凍融循環(huán)仍具耐受力，氣泡計數(shù)并無很大的丟失，對樣品產(chǎn)生回波的性質(zhì)也無損害。
實施例7用EP-A-0 324 928(Widder)所述的方法制備聲波均化的白蛋白微球。簡言之，將5ml滅菌的5％人白蛋白溶液(得自the Blood Transfusion Service ofthe Swiss Red Cross，Bern Switzerland)吸入10ml經(jīng)校準(zhǔn)的注射器中。將聲波發(fā)生儀探頭(250型，購自Branson Ultrasonic Corp.USA)浸到4ml刻度處的溶液中。在能量調(diào)到7檔時進行30秒鐘聲波均化。然后將聲波發(fā)生儀探頭升高到6ml刻度(即在液面之上)，以脈沖方式(0.3秒/周期)進行40秒鐘聲波均化。除去泡沫層后，得到每毫升含1.5×108個氣泡、數(shù)均直徑為3.6μm的白蛋白微球的懸浮液。將此懸浮液于-18℃冷凍并在此溫度下放置過夜。次日將懸浮液于室溫下融化。凍/融前后分析懸浮液，表明具有如下特性表6

表6結(jié)果表明，含空氣的微氣泡受凍融循環(huán)一定程度的破壞。用含約5％(體積)C5F12或C3F8的空氣的混合物代替純空氣制備白蛋白微氣泡時，微球抗凍/融引起氣泡計數(shù)下降的穩(wěn)定性顯著改善(見表7)。用白蛋白微球得到的結(jié)果，也可以看到在空氣微氣泡的場合，凍/融循環(huán)對于微氣泡群大小較小時是不利的，即平均大小約為5μm或更大的微氣泡比較小的微氣泡有較大的耐受能力和保存機會。
表7

實施例8按制造商所推薦的那樣，將3g市售的回聲造影劑糖類微粒SHU-454(E-chovist，Schering，Germany)在半乳糖溶液(8.5ml，200mg/ml)中再生并作凍/融處理，在融化后溶液中僅存在極少氣泡。若在加入糖類微粒之前在半乳糖溶液中加入10mg/ml二棕櫚酰磷脂酰甘油和PluronicF68(1∶5，W∶W)的混合物，則可得到濃度為2.5×108個氣泡/ml的穩(wěn)定微氣泡。冷凍和融化后，氣泡濃度約降低3個數(shù)量級，至2.3×105個/ml，表明在處理過程中微氣泡丟失相當(dāng)可觀。但是，如果在再生前用含10％C5F12的空氣混合物代替氣相中的空氣，氣泡便更穩(wěn)定，也更能耐受凍/融處理。在后一種情況下，微氣泡的丟失僅2.3×108個，因為氣泡濃度從3.9×108個/ml降至1.6×108個/ml。
實施例9用EP-A-0 458 745(Bracco International)實施例4中描述的技術(shù)制備聚合物微氣球。在此制備中所用的聚合物是US 4,888,398中描述的聚POMEG。將微氣球以1.8×108顆粒/ml的濃度懸浮于蒸餾水、0.9％NaCl、5％右旋糖和3％甘油中。然后將這些懸浮液的每一種均冷凍，然后融化。融化后無論在總的顆粒濃度上還是平均粒徑上均未觀察到可檢測的變化。
實施例10在200ml圓底燒瓶中，將126mg數(shù)量的卵磷脂和27mg膽甾醇溶于9ml乙醚中。向此溶液中加入含離子載體A23187的0.2摩爾濃度的碳酸氫鈉水溶液3ml，并將得到的兩相系統(tǒng)進行聲波均化直至變成均勻系統(tǒng)。將混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)至干，在含脂質(zhì)沉積物的燒瓶中加入0.2摩爾濃度的碳酸氫鹽水溶液3ml。
靜置片刻后，將所得脂質(zhì)體懸浮液對鹽水透析以消除未截留的碳酸氫鹽并酸化。過一會兒，用蒸餾水洗滌，然后通過階式碳酸鹽濾器數(shù)次。然后將大小低于50μm的脂質(zhì)體懸浮液樣品一分于-18℃冷凍，并貯存于此溫度下。2周后將懸浮液于室溫融化。凍/融前后分析懸浮液，顯示產(chǎn)生回波的性質(zhì)和微氣泡計數(shù)僅有可接受的輕度降低。
實施例11用SF6和含5％C5F12的空氣作為氣相，重復(fù)實施例3的方法，所得懸浮液樣品于-18℃、-45℃、-76℃和-196℃冷凍。在相應(yīng)的冷凍溫度下貯存30天后，將樣品解凍，分析懸浮液。所得結(jié)果見表8。SF6樣品中微氣泡的濃度在冷凍前為11.6×107個/ml，而空氣/5％C5F12混合物的樣品中為9.8×107個/ml，貯存前樣品中各自的氣體體積為2.9μl/ml和5.9μl/ml。兩種氣體的平均微氣泡直徑分別為2.3μm和4.2μm。
從結(jié)果顯示，貯存的溫度越低，解凍時微氣泡濃度和回收的氣體總量丟失得越多。結(jié)果還表明，含有SF6的懸浮液的解凍樣品，其平均直徑起初增加，然后當(dāng)溫度降低時明顯減小。對于空氣/5％C5F12混合物而言，微氣泡直徑的變化相當(dāng)小。結(jié)果還表明，微氣泡平均直徑隨貯存溫度的降低而降低。如圖1所示，對于含有SF6和空氣/C5F12混合物的懸浮液，在-196℃貯存后只回收到初始微氣泡量的51.7％和52％。然而，如圖2所示，貯存后SF6懸浮液回收的氣體總體積為初始時的21.1％，而空氣/C5F12混合物懸浮液回收的體積為46.5％。這表明，在用SF6制成懸浮液的情況下，微氣泡的大小發(fā)生變化，即回收的微氣泡直徑減小。
表8

圖3和4表明冷凍或貯存溫度對含空氣+5％C5F12混合物的微氣泡懸浮液的壓力變化耐受性的影響。在圖3的曲線中，吸光度(于700μm處測定)表示為在不同溫度下貯存3天后施加到懸浮液上的壓力的函數(shù)。此曲線圖顯示貯存溫度的降低對懸浮液的性質(zhì)有影響，貯存于-18℃和-76℃之間的溫度下的懸浮液的性質(zhì)改變明顯，而貯存于-76℃和-196℃之間的樣品的改變相當(dāng)小。因此，維持貯存溫度于-76℃以下看來不會提供更大的優(yōu)點。鑒于所涉及的費用，選擇-76℃以下的溫度僅僅在特殊的情況下可被證明是有道理的。
圖4另一方面還顯示，如果將含空氣/5％C5F12混合物的微氣泡的懸浮液在低溫下貯存3天，它們對壓力變化的耐受性保持相對不變，而在25℃時保存同樣時間的同樣的懸浮液，其對壓力變化的初始耐受性約降低10％。
臨界壓力和吸光度測量的確切方法和重要性已在本文引為參考的EP-A-0 554 213中加以闡述。
實施例12用ACUSON 128XP 5型儀(Acuson Corp.USA)和實施例1、3和7的制品在實驗小豬外周靜脈注射0.04ml/kg體重后進行二維回波心動描記。評估自然狀態(tài)及凍/融樣品使用后對左心室回波對比度的增強作用。甚至在諸如實施例7關(guān)于白蛋白微球所述樣品的情況下也未見明顯差異，表明殘留的氣泡足以產(chǎn)生強的和長時間的回波增強作用。
權(quán)利要求
1.固定在冷凍的含水載體介質(zhì)中的氣泡的冷凍懸浮液，其特征在于含氣泡和常用的添加劑的載體介質(zhì)是生理學(xué)上可接受的載體，被固定的氣泡是以暫時的包膜或有形的膜為界的微氣泡，懸浮液在液體狀態(tài)時可注射，用作機體血池和組織超聲成象的造影劑。
2.如權(quán)利要求1所述的懸浮液，其中冷凍介質(zhì)的溫度在-1℃和-196℃之間，以-10℃和-76℃之間為佳。
3.如權(quán)利要求1或2所述的懸浮液，其中大多數(shù)微氣泡的大小在50μm以下，以10μm以下為佳。
4.如權(quán)利要求3所述的懸浮液，其中微氣泡的大小在2μm和9μm之間，以3μm和5μm之間為佳。
5.如權(quán)利要求1或2所述的懸浮液，其中添加劑包括單分子或多分子膜層形式的層狀磷脂作為表面活性劑。
6.如權(quán)利要求5所述的懸浮液，其中層狀磷脂是單層或多層脂質(zhì)體的形式。
7.如權(quán)利要求5所述的懸浮液，其中層狀磷脂是飽和的磷脂。
8.如權(quán)利要求6或7所述的懸浮液，其中磷脂選自磷脂酸、磷酯酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂和鞘磷脂，或它們的混合物。
9.如權(quán)利要求1或2所述的懸浮液，其中添加劑包括選自磷酸雙十六烷酯、膽甾醇、麥角甾醇、植物甾醇、谷甾醇、羊毛甾醇、生育酚、棓酸丙酯、棕櫚酸抗壞血酸酯和丁基化羥基甲苯的物質(zhì)。
10.如權(quán)利要求1或2所述的懸浮液，其中添加劑包括山梨醇或諸如聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物的非離子型表面活性劑。
11.如前述任一權(quán)利要求所述的懸浮液，其中添加劑包括選自線性和交聯(lián)多糖和寡糖、糖、親水性聚合物和碘化的化合物的增稠劑和/或穩(wěn)定劑，這些增稠劑和/或穩(wěn)定劑與所含表面活性劑的重量比在約1∶5和100∶1之間。
12.如前述任一權(quán)利要求所述的懸浮液，其中添加劑還包含≤50％(重量)的選自脂肪酸、脂肪酸和醇與多元醇的酯和醚的非層狀表面活性劑。
13.如權(quán)利要求12所述的懸浮液，其中多元醇是聚亞烷基二醇類、聚亞烷基化糖和其它碳水化合物，及聚亞烷基化甘油。
14.如權(quán)利要求1或2所述的懸浮液，它們包含107-108個微氣泡/ml、108-109個微氣泡/ml或109-1010個微氣泡/ml。
15.如權(quán)利要求1或2所述的懸浮液，其中膜由合成的或天然的聚合物或蛋白質(zhì)組成。
16.如權(quán)利要求15所述的懸浮液。其中聚合物選自多糖、聚氨基酸及其酯、聚丙交酯和聚乙交酯及其共聚物、丙交酯和內(nèi)酯的共聚物、多肽、聚原酸酯、聚二噁烷酮、聚-β-氨基酮類、Polyphosphazenes、聚酐類、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚烯烴類、聚丙烯酸酯類、聚丙烯腈、不可水解的聚酯類、聚氨酯類和聚脲類、聚谷氨酸或聚天冬氨酸衍生物及它們與其它氨基酸的共聚物。
17.如權(quán)利要求15所述的懸浮液，其中蛋白質(zhì)為白蛋白。
18.如權(quán)利要求1所述的懸浮液，其中氣體選自含鹵氣體、空氣、氧氣、氮氣、二氧化碳或它們的混合物。
19.如權(quán)利要求18所述的懸浮液，其中含鹵氣體選自SF6、CF4、C2F6、C2F8、C3F6、C3F8、C4F6、C4F8、C4F10、C5F10、C5F12和它們的混合物。
20.貯存按權(quán)利要求1-19所述微氣泡懸浮液的方法，其特征在于包括如下步驟a)將懸浮液放進冷卻裝置中，b)通過將溫度冷卻到懸浮液的凝固點之下，較佳的為-1℃至-196℃之間的溫度，更佳為-10℃至-76℃之間的溫度，將微氣泡固定，c)長時間維持冷凍條件。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中冷凍的懸浮液保持在惰性氣體或氣體混合物的氣氛中，而其中至少一種氣體是封在微氣泡中的氣體。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中微氣泡含氣體或氣體混合物，其中至少一種氣體的沸點在-18℃以下。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，懸浮液在使用前解凍并在室溫下維持一段時間。
24.用于器官和組織超聲成象的權(quán)利要求1-19所述的可注射的懸浮液。
25.如權(quán)利要求1-19所述的可注射懸浮液用于超聲回波描記造影劑的制造。
全文摘要
本發(fā)明揭示了固定在含常用添加劑和穩(wěn)定劑的冷凍含水載體介質(zhì)中的微氣泡懸浮液，其中載液是生理學(xué)上可接受的，被固定的微氣泡是以暫時的包膜或有形的膜為界的微氣泡。懸浮液在液體狀態(tài)時是可注射的，用作機體血池和組織超聲成象的造影劑，通過將平均大小在50μm以下、較佳為10μm以下、更佳為2-8μm之間的微氣泡的懸浮液冷凍至-1℃和-76℃之間的溫度，并長期維持在此溫度下，將微氣泡固定在載體中。微氣泡可被諸如層狀磷脂的表面活性劑所穩(wěn)定，或可包含合成或天然聚合物或蛋白質(zhì)組成的膜。本發(fā)明還揭示了微氣泡懸浮液的冷藏及其應(yīng)用。
文檔編號A61K49/00GK1141001SQ95191640
公開日1997年1月22日 申請日期1995年12月14日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月16日
發(fā)明者F·嚴(yán), M·施奈德, J·布洛紹 申請人:勃勒柯研究有限公司