專利名稱：用于對(duì)抗hiv的多分支型肽構(gòu)建物的制作方法
背景技術(shù)：
人類免疫缺陷病毒(HIV)被推定是獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)之病原體。HIV可在不同類型細(xì)胞中建立一持續(xù)性的感染；許多細(xì)胞可表現(xiàn)出一種抗原CD4受體作為其表面的結(jié)合。在此種細(xì)胞中，細(xì)胞感染的第一步驟通過HIV被膜糖蛋白與細(xì)胞CD4表面抗原結(jié)合而產(chǎn)生病毒接合。在該接合後隨後發(fā)生一連串有關(guān)病毒被膜與靶細(xì)胞膜之融合與內(nèi)含化的事件，通過這一系列事件細(xì)胞受到感染。HIV感染的細(xì)胞可感染其它細(xì)胞，且形成合胞體(巨大多核細(xì)胞)。在HIV-1感染細(xì)胞與未感染的CD4+細(xì)胞(該細(xì)胞具有CD4受體)間的合胞體形成涉及在CD4受體與HIV表面被膜糖蛋白間的相互作用。此步驟可被水溶性CD4、抗-CD4抗體與抗-V3抗體所阻斷。
在活體中與細(xì)胞-細(xì)胞間病毒散布有關(guān)的細(xì)胞融合步驟可使血漿中和抗體漸不明顯，且導(dǎo)致病毒由因淋巴細(xì)胞耗盡而已受損的免疫系統(tǒng)中逃逸。由HIV所活化的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生不同的抗體群。一些抗體不干擾gP120-CD4的相互作用，但可阻礙膜的融合，即與細(xì)胞感染有關(guān)的步驟。這些抗體基本上是針對(duì)被膜糖蛋白V3環(huán)的。
由於在不同的HIV-1分離株中V3環(huán)為高變化性的，抗V3抗體一般僅中和已產(chǎn)生抗體之分離株。因此中和作用僅限於該分離株，被稱為對(duì)分離株特異性的。這些抗體通過抑制細(xì)胞融合而起作用，而對(duì)細(xì)胞-病毒結(jié)合不具任何活性。
現(xiàn)已進(jìn)行了一些嘗試，用V3環(huán)相關(guān)的肽抑制HIV的感染，但這樣的肽會(huì)引起功效問題。例如De Rossi等人[Virology184，187-196(1991)]發(fā)現(xiàn)一些V3環(huán)可增強(qiáng)病毒的感染力。其它從V3環(huán)合成的肽，無論環(huán)型或非環(huán)型，在細(xì)胞融合的重要步驟上均無作用。因此，與該病毒分離株無關(guān)的可阻礙病毒-細(xì)胞融合和細(xì)胞-細(xì)胞融合的拮抗劑肽尚未被開發(fā)出來。
近來，一些研究已顯示出HIV-1及HIV-2的與CD4無關(guān)的細(xì)胞感染途徑，提示至少有一可替代的病毒受體之存在。近來這些推定為非CD4的HIV受體之一已於CD4-腦衍生細(xì)胞及直腸上皮細(xì)胞上鑒定出。此受體為中性糖脂類，稱為半乳糖基神經(jīng)酰胺(GalCer)。腦與腸中CD4-/GalCer+細(xì)胞的HIV感染可解釋在這些器官中與HIV相關(guān)的一些疾病。再者，在一些粘膜上皮細(xì)胞頂側(cè)上有GalCer的存在可有助於性交時(shí)病毒的進(jìn)入。尚未由V3環(huán)衍生的肽顯示具有阻斷GalCer受體的能力。
為克服上述問題，在聚合物中使用賴氨酸構(gòu)架的徑向分支系統(tǒng)已被J.P.Tam所使用[Proc Natl.Acad.Sci.USA，85，5409-5413(1988)]，以發(fā)展出無需使用載體的抗原。這些抗原被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生對(duì)抗各種疾病的疫苗。更具體地說，用於產(chǎn)生對(duì)抗HIV感染的疫苗的抗原已被Tam在PCT申請(qǐng)案WO93/03766中所描述，該抗原基本上包含有IGPGR序列(此為對(duì)氨基酸的IUPAC傳統(tǒng)單字母命名)，且長度為11個(gè)氨基酸者在引起有用的免疫反應(yīng)上是有效的。Id.第13頁，第29-31行。但是，這樣的抗原被認(rèn)為并非是對(duì)任何疾病的直接潛在治療方法，而是旨在激發(fā)體內(nèi)免疫原反應(yīng)。發(fā)明的摘要本發(fā)明包括用於治療HIV感染患者的方法和肽構(gòu)建物。按照該方法，用於治療給藥的多分支型肽包含有一接合有2至64個(gè)肽的核心基質(zhì)，每一個(gè)肽包含有氨基酸序列GPGR，在該序列前有0至4個(gè)氨基酸殘基，該序列後有2至4個(gè)氨基酸殘基。附圖的簡要說明

圖1為推測的HIV與CD4+或CD4-細(xì)胞的結(jié)合機(jī)構(gòu)。
圖2為顯示多分支型肽構(gòu)建物(MBPCs)對(duì)於以三株不同HIV進(jìn)行人體外周血液淋巴細(xì)胞(PBLs)感染上的功效測定的結(jié)果，其量為p24(Pg/ml)，或反轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性對(duì)三種不同的MBPCs作圖，1-無；2-[GPGRAF]8-多賴氨酸核心(MLC)；3-[RKSIHIGP-GRAFYT]4-MLC4-[PPPYVEPTTTQC]4-MLC。
圖3為MBPCs對(duì)人體巨噬細(xì)胞感染的結(jié)果，以MBPCs對(duì)p24(Pg/ml)的量作圖，使用五種不同的MBPCs1-無；2-[GPGRAF]8-MLC；3-[GPGRAF]-MLCD；4-[GPG(R)DAF]9-MLC；5-[RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC；6-[PPPYVEPTTTQC]4-MLC。
圖4A描繪在無任何MBPCs時(shí)感染培養(yǎng)物的合胞體形成。
圖4B顯示在以[GPGRAF]8-MLC處理的巨噬細(xì)胞中不存在合胞體的形成。
圖5A顯示MBPCs通過GalCer受體對(duì)人體上皮細(xì)胞感染的作用。
圖5B顯示MBPCs阻斷gp120與GalCer受體結(jié)合的能力。
圖6A、6B、7A、7B及7C均顯示與用長的MBPC所免疫的家兔血清相比，用短的MBPC免疫的家兔血清相對(duì)無反應(yīng)性。發(fā)明的詳細(xì)說明I.結(jié)構(gòu)本發(fā)明涉及多分支型肽構(gòu)建物(MBPCs)，它可抑制HIV感染與HIV感染的擴(kuò)散與延續(xù)。MBPCs具有肽共價(jià)結(jié)合于其上的核心基質(zhì)。該核心基質(zhì)為樹枝狀聚合物，實(shí)際上是具有分支的，較佳為其每一分支均相同。該核心基質(zhì)以至少具有兩官能團(tuán)的核心分子作為基礎(chǔ)，而具有末端官能團(tuán)的分子分支共價(jià)結(jié)合至該核心基質(zhì)的官能團(tuán)上。合適的核心分子包含氨或乙二胺。合適的分子分支包含在核心分子上聚合的丙烯酸酯單體。這種分子可被創(chuàng)建而呈現(xiàn)出多少不等的分支，這取決于從中心分子所分支出的單體數(shù)目。此處欲使用者為具有2至64分支，較佳是4至16分支之MBPCs。
用於形成該核心基質(zhì)的例子為賴氨酸。一個(gè)中心賴氨酸殘基與兩個(gè)賴氨酸殘基相結(jié)合，這兩個(gè)賴氨酸中每一個(gè)通過其羰基與中心賴氨酸殘基上的一個(gè)氨基結(jié)合。這提供一個(gè)具有4個(gè)氨基的分子，該分子可以是具有4個(gè)肽的MBPC的核心基質(zhì)?；蛘?，可提供具有8個(gè)分支的分子，通過它們的羧基將4個(gè)賴氨酸殘基結(jié)合到接合於中心賴氨酸的賴氨酸殘基上的一個(gè)氨基上而制成。此分子可用作為具有8個(gè)肽的MBPC的核心基質(zhì)，或者可得到8個(gè)賴氨酸殘基以形成具有16個(gè)肽的MBPCs的核心基質(zhì)?？扇菀椎乜吹剑缬行枰?，同樣可構(gòu)建出更大的MBPCs，例如具有32個(gè)分支者。
肽的C-端共價(jià)結(jié)合到核心基質(zhì)的每一分支上，以形成MBPC。這些肽可以相同(較佳)，或彼此不同。所得的分子在其表面上具有一簇肽，其內(nèi)部核心未呈現(xiàn)出來，因此不具抗原性。具有肽但不同於在此所欲的結(jié)構(gòu)的例子，參見J.P.Tam[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5409-5413(1988)]及Tam的美國專利第5229490號(hào)及其所引述的參考資料。
如果需要，在肽與核心基質(zhì)間可包含隔子。第一個(gè)賴氨酸殘基的羧基可呈游離狀、被酰胺化、或偶聯(lián)到β-丙氨酸或另一阻礙化合物上。
肽可包括D-或L-氨基酸殘基。D-氨基酸在活體中持續(xù)較久，因其較難為蛋白酶所切割，但是L-氨基酸如下所討論的具有較佳活性。
此外，肽類似物-使用肽的碳骨架但省略-CONH-肽鍵的合成構(gòu)建物可用來取代肽。因此應(yīng)該理解，有關(guān)此處所述的肽的文獻(xiàn)亦可被認(rèn)為包含肽類似物。一般相信肽類似物對(duì)肽酶均具有較高的抗性，且在活體中持續(xù)較久。
本發(fā)明的MBPCs包括從HIV-1病毒表面被膜糖蛋白gpl20的V3環(huán)所衍生出的肽，且包括其一致(consensus)氨基酸序列GP-GR(以IUPAC單字母氨基酸命名方式，相當(dāng)于Gly-Pro-Gly-Arg)。該MBPCs在不同細(xì)胞類型的人體細(xì)胞培養(yǎng)物中，對(duì)抑制HIV感染是有效的。該抑制顯然與病毒株無關(guān)，而且甚至在對(duì)抗HIV-2上亦有效。因此，它們具有極令人吃驚的治療性質(zhì)。
應(yīng)當(dāng)注意的是，相應(yīng)的單體肽不具有任何治療效應(yīng)。據(jù)信，這種差異的發(fā)生是由于該核心基質(zhì)會(huì)引起該肽的構(gòu)象改變。特別是，且意想不到的是，發(fā)現(xiàn)了當(dāng)GPGR單體接合至核心基質(zhì)上時(shí)，在該肽中GPGR後的兩個(gè)氨基酸會(huì)彎曲。因此，較佳是在接合於核心基質(zhì)的肽中，GPGR後至少有兩個(gè)氨基酸。但是，若該肽太長會(huì)使MBPC變得具有抗原性，不合要求的是在GPGR序列後具有4個(gè)以上氨基酸且在該序列前具有4個(gè)以上氨基酸。因此，該肽具有12個(gè)或更少的氨基酸。
顯示對(duì)HIV-1和HIV-2反轉(zhuǎn)錄病毒所致感染有抑制活性的特殊MBPCs包含如下使用IUPAC命名氨基酸所述的肽表1-例示MBPCsMBPC.1(GPGRAFY)8-(K)4-(K)2-K-βA-OH或(GPGRAFY)8-(K)4-(K)2-K-βA-NH2MBPC.3(GPGRAF)8-(K)4-(K)2-K-βA-OH或(GPGRAF)8-(K)4-(K)2-K-βA-NH2MBPC.12 (GPGRAF)16-(K)8-(K)4-(K)2-K-βA-OH或(GPGRAF)16-(K)8-(K)4-(K)2-K-βA-NH3
上述β-丙氨酸上所顯示出的OH未端是指羧基，其氨基已接在賴氨酸殘基的羧基上。而NH2末端則為β-丙氨酸的羧基之修飾，以形成羧酰胺未端；該β-丙氨酸仍然以其氨基接合到賴氨酸的羧基上。在下述的實(shí)施例中是使用OH形式的。
雖然肽應(yīng)含有具有所需療效的一致序列GPGR，但在GPGR前包含異亮氨酸的構(gòu)象序列，例如IGPGR或IXXGPGR(其中X為任意的氨基酸殘基)，系衍生自V3環(huán)，被發(fā)現(xiàn)當(dāng)包含IGPGR序列的肽為12或更少個(gè)氨基酸殘基時(shí)，會(huì)使該MBPC在治療上效用變差或不具效用，故較佳的是在此不使用該序列。在GPGR前3個(gè)氨基酸內(nèi)存在的異亮氨酸(I)序列是相當(dāng)保守的，是在約98％的HIV基因組中發(fā)現(xiàn)的，然而，令人吃驚的是，去發(fā)現(xiàn)它不是所需要的。
除了MBPCs含有IGPGR或IXXGPGR序列是不佳的外，若復(fù)制的肽長於12個(gè)氨基酸殘基時(shí)，則具有該肽的MBPCs被發(fā)現(xiàn)會(huì)阻礙合胞體的形成。例如，一可阻礙合胞體形成之較大MBPC為結(jié)合到一四分支MBPC的每一分支上的肽為RKSIHIGPGRAFYT。然而，如此大的MBPCs是不合理想的，因?yàn)槿绱说拇蠓肿右扬@示會(huì)產(chǎn)生抗體，即使是在低濃度下(10M-4)，且為HIV感染之病人的抗體所識(shí)別并抑制，而這兩種現(xiàn)象使該大分子被排除在長期用於HIV感染病人之外。這些MBPCs在接近其有效濃度時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)物上亦顯示毒性。而且，這些MBPCs的大小會(huì)使其在制造上困難且昂貴，且對(duì)蛋白酶的降解更為敏感。
因此，本發(fā)明提供一種MBPC，它包含一核心基質(zhì)，在該核心基質(zhì)上接有2至64個(gè)肽，以4至32個(gè)肽為佳，每一個(gè)肽包含有氨基酸序列GPGR，在該序列前有0至4個(gè)氨基酸殘基，在該序列後有2至4氨基酸殘基。較佳者為，在G前三個(gè)氨基酸內(nèi)不含有I序列，如IGPGR或IXXGPGR，其中X為氨基酸殘基。較佳的是，接合到8或16分支核心基質(zhì)上的肽為GPGRAF。但是，一般相信當(dāng)取代的氨基酸具有相同性質(zhì)時(shí)，在AF上的取代是可能的，而是合乎要求的，因?yàn)锳F顯然對(duì)蛋白酶敏感，因此在活體中是易損壞的。II.MBPCs的制備具有肽結(jié)合于其上的分支核心MBPC結(jié)構(gòu)體先前被稱為多抗原性肽)的制造在現(xiàn)有技術(shù)中屬已知的。參見于Tam等人J.Im-mun.148，914-920(1992)及Wang等人Scinece，254，285-288(1991)。對(duì)制備少量(在1公斤以下)而言，較佳者為使用固相方法得到該MBPCs。該肽鍵的逐步組合可自動(dòng)地在4-(氧甲基)-苯基-乙酰氨基甲基共聚(苯乙烯-1％二乙烯苯)上進(jìn)行?？墒褂迷揃oc/苯基技術(shù)，該技術(shù)包含用羥基苯并三唑活性酯(Boc-氨基酸-OBt)進(jìn)行的系統(tǒng)雙偶聯(lián)。由樹脂上裂解出的最後步驟是以無水氟化氫所達(dá)成(0℃下1小時(shí))。然后將MBPC以乙醚洗滌，并溶於水中。在冷凍乾燥後，可將MBPC在以0.1N乙酸平衡的P2或G15型分子過濾柱上作預(yù)純化。將洗脫級(jí)分回收。純化步驟可使用C8或C18反向HPLC來完成。在酸解(在115℃下6N HCl中24小時(shí))和電噴霧式(eletrospray)質(zhì)譜分析後，以MBPC的氨基酸含量將其定性。III.治療效應(yīng)與應(yīng)用本發(fā)明提供一種治療HIV感染的方法，系給予病人MBPCs，該MBPCs包含一核心基質(zhì)，該核心基質(zhì)上接有2至64個(gè)肽，較好為4-32個(gè)肽，每一個(gè)肽包含有氨基酸序列GPGR，在該序列前有0至4個(gè)氨基酸殘基，該序列後有2至4個(gè)氨基酸殘基，較佳者為該氨基酸序列不是IGPGR或IXXPGR(其中X為一氨基酸殘基)。所給MBPCs應(yīng)為使血清中量在10-3M至10-7M間，較佳為在10-6M。
按照本發(fā)明所制得的MBPCs，在活體中，可抑制HIV感染和HIV引起的細(xì)胞病理作用，因此，可抑制在宿主機(jī)體中的病毒多重復(fù)制與病毒散布。
按照本發(fā)明的MBPCs可中和病毒被膜-細(xì)胞膜間之融合步驟還抑制合胞體形成所必須的感染細(xì)胞膜-未感染細(xì)胞膜的融合步驟，此兩步驟的任一步被認(rèn)為是在宿主機(jī)體中的細(xì)胞感染、病毒多重復(fù)制及病毒散布所不可缺少的。MBPCs能夠封鎖諸如淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的細(xì)胞(包含HIV的89.6株)上存在的CD4受體，該封鎖顯然地是由于接合到CD4受體的CDR3區(qū)域上。因此，本發(fā)明的MBPCs可阻礙由HIV-1和HIV-2所引起的合胞體形成，并可抑制人體外周血液淋巴細(xì)胞(PBLs)和巨噬細(xì)胞的感染。這樣的阻礙并不會(huì)造成細(xì)胞失去被其它抗原或分裂素所活化的能力，即該淋巴細(xì)胞之功能被MBPCs所維持。
用本發(fā)明，使得淋巴細(xì)胞功能保留，可避免非天然AIDS的潛在問題。因此，本發(fā)明的MBPCs接合于融合受體，而非活化T細(xì)胞的受體，這是本發(fā)明優(yōu)於任何在先抗HIV治療之主要進(jìn)步所在。
除了預(yù)防HIV感染，本發(fā)明的MBPCs已顯示出可抑制在治療前即已受感染的細(xì)胞中HIV的產(chǎn)生。
本發(fā)明MBPCs特別是較佳的8×GPGRF與16×GPGRAFMBPCs，有一完全無法預(yù)期的特性，即它們顯示出可結(jié)合于作為HIV受體的GalCer受體的能力。該受體已被證明存在於直腸上皮細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)CD4細(xì)胞。該結(jié)合導(dǎo)致MBPCs抑制人小腸細(xì)胞被HIV-1和HIV-2兩者關(guān)系甚遠(yuǎn)的分離株所感染。
本發(fā)明MBPCs的另一優(yōu)點(diǎn)為被發(fā)現(xiàn)在高劑量下對(duì)嚙齒動(dòng)物、家兔與猴無毒，因此，當(dāng)其作治療使用時(shí)不會(huì)傷害病人，而不同於現(xiàn)今許多AIDS的治療。
本發(fā)明的MBPCs的另一優(yōu)點(diǎn)為在10-4M或更低濃度下不具有免疫原性，因此它們不是疫苗，不同於現(xiàn)有技術(shù)使用衍生于V3環(huán)的肽或其構(gòu)建物所作的各種嘗試。MBPCs之缺乏免疫原性為一優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)?，免疫反?yīng)會(huì)導(dǎo)致可抑制或破壞MBPCs的抗體產(chǎn)生。這樣的免疫原性MBPCs，如先前提到的RKSIHIGPGRAFYT，在相同的個(gè)體僅可使用幾次，其後會(huì)變得無效。A.CD4受體的阻斷實(shí)驗(yàn)資料顯示本發(fā)明的MBPCs，特別是MBPC.3和MBPC.12，對(duì)CD4+細(xì)胞的HIV感染過程有特殊的抑制效應(yīng)，并對(duì)由HIV-1及HIV-1所誘發(fā)的合胞體形成具有總的阻斷效應(yīng)。在體外可觀察到具抑制作用的MBPC濃度，對(duì)MBPC.3與MBPC.12為10-6M，對(duì)其它MBPCs則為較高的濃度。該中和作用已見于所有HIV受試株，即MN、Lai、NDK和HIV-1的89.6與HIV-2的Rod。與之相反，即使在非常高的濃度下，例如5×10-4M下，用于MBPCs的各個(gè)肽片斷對(duì)抑制合胞體形成也不具活性。
MBPCs可與細(xì)胞的分子相互作用，該分子涉及細(xì)胞感染所需的后結(jié)合過程即融合階段，且為呈現(xiàn)出各式各樣的V3環(huán)的關(guān)系較遠(yuǎn)的分離株所使用。該推測的V3結(jié)合部位的好的候選者為CD4的V1區(qū)的CDR3區(qū)域，因?yàn)閕)對(duì)該區(qū)域具專一性的抗CD4抗體(例如13B8-2)可阻斷HIV-感染中的融合步驟，ii)來自CDR3的合成肽在融合試驗(yàn)上有某些抑制作用，且iii)MBPCs可識(shí)別對(duì)應(yīng)于CD4的CDR3區(qū)域的合成肽。
本發(fā)明的MBPCs結(jié)合到淋巴細(xì)胞上而不改變病毒被膜的結(jié)合(通過CDR2區(qū)域)，然而，卻可防止HIV感染作用。此MBPCs亦可結(jié)合于可溶性的CD4。因此，MBPCs的結(jié)合在水溶性CD4存主下受到抑制。
研究了在自然環(huán)境下，本發(fā)明的MBPCs在抗CD4抗體特異結(jié)合區(qū)域和CD4受體間相互作用上的效應(yīng)。該抗CDR3單克隆抗體(MAb)13B8-2對(duì)巨噬細(xì)胞上表達(dá)的CD4的原位結(jié)合，在本發(fā)明MBPCs的存在下，顯著且特異性地被降低。在有或無MBPCs存在下，其它抗CD4 MAb，包括識(shí)別gp120結(jié)合部位的MAb(Leu3a和OKT4a MAb)是相同的。這些資料證明，MBPCs結(jié)合于CD4的CDR3區(qū)域，因此至少部分通過阻斷gp120V3環(huán)和CD4的此區(qū)域之間的相互作用而起作用。
除了HIV-1的V3環(huán)被認(rèn)為是在HIV-1與其靶細(xì)胞間融合過程的重要決定子，在本發(fā)明前未有可能在治療上開發(fā)出該特性。其主要理由在于V3為在HIV-1分離株中顯示出高度變化的高度可變區(qū)。中和抗-V3抗體一般是類型特異性的，在最佳的情況下，僅可中和密切相關(guān)的分離株。因?yàn)楸景l(fā)明的MBPCs針對(duì)細(xì)胞而非病毒決定子，故可避開被膜變化性所固有的問題。因此，用于本發(fā)明的MBPCs，雖然是來自HIV-1V3環(huán)的一致序列，亦可中和各種HIV-1株(包括高度變化的HIV-1(NDK))以及不相關(guān)的HIV-2 ROD株。更令人驚奇的是，本發(fā)明的MBPCs亦被發(fā)現(xiàn)可抑制初級(jí)HIV-1分離株的感染，也就是直接由病人收集而得者，包括抗AZT、J-1之種株。
下述實(shí)施例并非想要限制前面所述，僅為例示說明在HIV感染上，及其與CD+淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的結(jié)合與融合上使用本發(fā)明的MBPCs的效能、實(shí)用性和范圍。實(shí)施例1-合胞體形成的阻斷在含5％CO2的濕環(huán)境下，以添加5％胎牛血清、1％谷氨酸、1％鏈霉素-青霉素之RPMI1640(Gibco of Irvine，Scotland)培養(yǎng)細(xì)胞。CEM或C8166細(xì)胞分別以HIV-1 Lai或HIV-2 Rod或HIV-1MN慢性感染。將感染的細(xì)胞(1×10-4)在96孔的平板上以各種濃度的MBPCs培育2小時(shí)。而後加入在100μl培養(yǎng)基中的未感染Molt-4細(xì)胞(4×104)。在37℃下18小時(shí)後，計(jì)算該合胞體數(shù)。其結(jié)果顯示如下表。
表2-合胞體的形成MBPCMBPC濃度HIV-IMN HIV-iLaiHIV-2Rod
MBPC.35×10-6M ---10-6M ++-10-7M +++ ++++ +MBPC.55×10-6M --+ -10-6M +++++ -10-7M ++++ +MBPC.45×10-6M ++++ +++ ++++10-6M ++++ ++++ ++++10-7M +++ ++++ ++++Mono.310-5M ++++ ++++ ++++10-6M ++++ ++++ ++++10-7M ++++ ++++ ++++MBPC.4為(IGPGRAF)4-(K)2-K-βA-OH。Mono3為六肽GP-GRAF，MBPC.5為十四肽MBPC(RJSIHIGPGRAFYT)4-(K)2-K-βA-OH。MBPC.3如上所述。
出現(xiàn)合胞體以+號(hào)表示，其分配與計(jì)算出的數(shù)量大致成正比。
MBPC.3顯示出在濃度為約為10-6M下體外抑制由HIV所誘發(fā)的合胞體形成的效應(yīng)，MBPC.5顯示在略高濃度下的抑制效應(yīng)。MBPC.12(結(jié)果未顯示出)產(chǎn)生相似於MBPC.3的結(jié)果。與其不同的是單體性的Mono.3完全不具活性；對(duì)于Mono.3已在較高的10-4M濃度下加以確認(rèn)。實(shí)施例2 PBLs感染的預(yù)防以RT缺乏的HIV-I(IIIB)分離株慢性感染的50×1038E5細(xì)胞，於96孔平板中，在所示肽的存在下，與刺激人體外周血液淋巴細(xì)胞(PBLs)的植物凝血素(PHA)共培養(yǎng)。所用的MBPCs以其接合于核心賴氨酸基質(zhì)(被稱為MLC)上的肽及其數(shù)目加以描述，本實(shí)驗(yàn)所使用的所有氨基酸皆為右旋型。
MBPCs的化學(xué)合成按上述固相技術(shù)進(jìn)行。該肽鏈可在4-(氧甲基)PAM樹脂上，使用最佳化的叔丁氧基羰基/苯甲基化學(xué)技術(shù)，加以逐步延長。純化的MBPCs的氨基酸分析與所推定的氨基酸比例相吻合。8-MLC由電噴霧式質(zhì)譜分析(實(shí)驗(yàn)的Mr＝5672Da)進(jìn)一步定性。
在連續(xù)地在該肽存在下培育24小時(shí)后，測定合胞體的數(shù)目，結(jié)果顯示于下表3。+++表示在孔中存在的合胞體數(shù)目與未處理孔相似；-表示在孔中完全缺乏合胞體；±表示在孔中偶爾存在一些合胞體。在此測試中合胞體的形成被抗-CD4抗體OKT4A(抗CDR2)和13B8-2(抗CDR-3)抗體所阻斷，這與先前的報(bào)告相吻合。在此測試中，該核心賴氨酸結(jié)構(gòu)體(被稱為MLCs)自身不誘發(fā)合胞體的形成。由MTT分析(如下所述)或錐蟲藍(lán)排除技術(shù)評(píng)估毒性。
表3 MBPCs對(duì)HIV-1誘發(fā)細(xì)胞融合的抑制濃度(M)肽 5×10-75×10-65×10-5GPGRAF+++ +++ +++[GPGRAF]8-MLC ± --[IGPGRAF]8-MLC +++±-[GPGRA]8-MLC +++ +++ +++[GPGR]8-MLC +++ +++ +++[GPG(R)DAF]8-MLC+++- 有毒性[GPGRAF]8-MLCD+++ +++ +++[Ac-GPGRAF]8-MLC +++ +++ -4-+++ -有毒性MLC[RKSIHKGPGRAFYT]4-+++ -有毒性MLC[RKSIHTGPGRAFYT]4-+++ -有毒性MLCRAFVTIGK +++ +++ -在這些實(shí)驗(yàn)條件下，濃度低至5×10-7M的[GPGRAF]8-MLC對(duì)合胞體形成產(chǎn)生顯著抑制作用，而相應(yīng)的單體肽GPGRAF，在高於所使用的濃度(直至5×10-5M)下，亦不具活性。N-未端乙?；?[Ac-GPGRAF]8-MLC)、加入異亮氨酸([IGPGRAF]8-MLC)和在GPGRAF序列中插入D-氨基酸皆導(dǎo)致活性顯著的喪失。少於6個(gè)殘基的MBPCs(即[GPGRA]8-MLC或[GPGR]8-MLC)以及具有互關(guān)序列的MBPCs均不抑制細(xì)胞融合，表明生物活性并不涉及核心基質(zhì)。4-ML(C可在5×10-6M濃度下抑制合胞體的形成。因?yàn)樵贕PGRAF要素序列前的異亮氨酸在HIV-1分離株中被高度保存，兩個(gè)相關(guān)的構(gòu)建物是以賴氨酸或蘇氨酸代替異亮氨酸加以合成的。這三個(gè)構(gòu)建物抗融合活性的顯著差異被觀察到了。但是應(yīng)注意的是，[RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC與其衍生物當(dāng)使用濃度為5×10-5M時(shí)會(huì)引起一些毒性，因此在人體治療中是不合要求的。
在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，更強(qiáng)的抗HIV MBPC看來是[GPGRAF]8-MLC。在另外的試驗(yàn)中，此分子也能阻斷HIV-1(LAI)、HIV-1(NDK)或HIV-2慢性感染的T淋巴母細(xì)胞樣CEM細(xì)胞和HTLV-I-構(gòu)象MT-2細(xì)胞之間的融合。實(shí)施例3 MBPCs對(duì)淋巴細(xì)胞功能性的作用a)MBPCs對(duì)抗體和分裂素誘發(fā)細(xì)胞增生的效應(yīng)將來自3位HIV血清陰性健康供血者的外周血液淋巴細(xì)胞(PBL)，從用Ficoll-Hypaque技術(shù)而肝素化的血液中分離出。培養(yǎng)基為添加1％谷氨酸、1％抗生素和10％經(jīng)熱失活的胎牛血清的RP-MI1640。將細(xì)胞(105)在有或無抗原(制念珠菌素，PPD)或分裂素(PHA)的MBPCs(5×10-6M)存在下培育。將抗原或分裂素處理的細(xì)胞以1mCi的[3H]胸腺嘧啶核苷脈沖8小時(shí)。而后回收細(xì)胞，計(jì)算DNA中摻入的[3H]胸腺嘧啶核苷。
b)混合物的淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)在此試驗(yàn)中，將來自三位健康供血者的外周血液淋巴細(xì)胞和來自10位血清陰性供血者的混合血而得的105個(gè)細(xì)胞，在各種濃度MBPCs存在或不存在下，于微量平板孔中，以最終體積為200μl進(jìn)行培育。淋巴細(xì)胞混合物在第6天以1μCi[3H]胸腺嘧啶核苷脈沖8小時(shí)。回收細(xì)胞，用β計(jì)數(shù)器計(jì)算摻入DNA中的[3H]胸腺嘧啶核苷。結(jié)果見下表，以MBPC.5如第一個(gè)試驗(yàn)所述。
表4 PBL抗原和分裂素誘發(fā)之增生[3H]胸腺嘧啶核苷摻入量(cpm)對(duì)照組 MBPC.3 MBPC.5供血者3PHA1 203000 162000 228000PHA2 183000 154000 188000PPD1 5900 39004000PPD2 3200 31002400
Cand1 39003200 3700Cand2 17001200 1100供血者2PHA1115000 87000 115000PHA2112000 95000 111000PPD138000 24000 24000PPD233000 27000 26000供血者1PHA1＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝PHA2＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝PPD112001300 1300PPD215003100 2100Cand1 74000 87000 80000Cand2 79000 10000085000處理組與對(duì)照組細(xì)胞中胸腺嘧啶核苷的摻入量相似，若PBLs的功能有負(fù)的影響，該細(xì)胞復(fù)制的標(biāo)記胸腺嘧啶核苷的摻入，在MBPC處理平板中會(huì)增加相當(dāng)量。因此，結(jié)果表明，當(dāng)其喪失對(duì)抗原或分裂原的反應(yīng)能力時(shí)，未見PBLs增生。實(shí)施例4 MBPCs對(duì)人體PBLs感染的作用外周血液淋巴細(xì)胞(PBLs)來自健康供血者，以植物凝血素刺激，在含有10％胎牛血清和白介素-2的RPMI1640(完全培養(yǎng)基)中培養(yǎng)。將6×106個(gè)細(xì)胞/ml的樣品以所示MBPC在濃度為10-5M下處理或不處理，并37℃下暴露于HIV-1或HIV-2(100TCID50)1小時(shí)。徹底洗滌后，將PBLs在含有10-5M相應(yīng)MBPC的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在HIV-1分離株感染10天后，用RT活性測定(對(duì)HIV-1與HIV-2兩者)和HIV-1p24gag的測量(Coulter試劑盒，分裝成10pg/ml)評(píng)估感染狀況。處理使用的MBPCs如下，1-無；2-[GPGRAF]8-MLC；3-[RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC；4-[PP-PYVEPTTTQC]4-MLC(非HIV相關(guān)性MBPC)(MLC表示核心賴氨酸結(jié)構(gòu))。圖2所示結(jié)果代表三個(gè)分別的實(shí)驗(yàn)。所使用的病毒分離株的性質(zhì)以PCR(HIV-1對(duì)HIV-2分離株)與可在HIV-1(LAI)和HIV-1(NDK)間作區(qū)分的RIPA加以檢測。
通過測量培養(yǎng)上清液中反轉(zhuǎn)錄酶(RT)的活性所作評(píng)估，表明[GPGRAF]8-MLC和[RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC處理一致地引起病毒子代產(chǎn)生的延遲在感染後10天和13天，MBPCs處理組樣品的RT活性比對(duì)照組低90％以上。因該肽并不干擾RT分析，因而這與MBPCs所引起的病毒產(chǎn)生抑制作用相一致。當(dāng)病毒產(chǎn)生後，對(duì)在培養(yǎng)上清液中作p24gag濃度測定，亦得到相同結(jié)果(對(duì)于HIV-1分離株)。對(duì)HIV-2感染的抑制而言，[RKSIHIGP-GRAFYT]4-MLC比[GPGRAF]8-MLC的強(qiáng)度弱。不含來自V3環(huán)的一致序列的MBPCs并不抑制PBLs的感染。實(shí)施例5 MBPC對(duì)巨噬細(xì)胞中合胞體形成的抑制作用用高度細(xì)胞病理之巨噬細(xì)胞-熱帶分離株HIV-1(89，6)，對(duì)MBPCs阻斷人體初級(jí)巨噬細(xì)胞感染的能力作出評(píng)估。單核細(xì)胞是由利用Ficoll-Hypaque密度分離而使單細(xì)胞富增之白血球泳動(dòng)單位中分離而得。巨噬細(xì)胞是在添加有10％胎牛血清和5％人體AB血清的RPMI1640中，粘著于塑料而加以純化的。在GM-CSF(1ng/ml)存在下，將粘著細(xì)胞培養(yǎng)5天，該粘著細(xì)胞對(duì)人體巨噬細(xì)胞標(biāo)記物(Boehringer Mannheim，25F9克隆)呈陽性反應(yīng)。將5×105個(gè)細(xì)胞以所示的MBPC在5×10M-5的濃度下處理45分鐘，而後暴露于10,000TCID50巨噬細(xì)胞-熱帶分離株HIV-1(89.6)。所使用的MBPCs如下所示1-無；2-[GPGRAF]8-MLCD；4-[GPG(R)DAF]8-MLC；5-[RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC；6-[PP-PYVEPTTTQC]4-MLC，它所具有的氨基酸，除非指明為D型，否則皆為L型。在徹底洗滌后，將細(xì)胞再次以培養(yǎng)基培養(yǎng)，在感染4天後，對(duì)HIV-1p24gag的產(chǎn)生與合胞體的形成作分析。結(jié)果顯示于圖3，該圖以MBPCs對(duì)p24量(ng/ml)作圖。亦如圖3所示，每孔相對(duì)合胞體數(shù)目(+++為無抑制作用；++50％的抑制作用；±＞95％抑制作用)與p24gag的濃度有相互關(guān)系。
圖4A所示巨噬細(xì)胞是未處理的對(duì)照組，顯示在感染的培養(yǎng)物中有許多合胞體存在。圖4B(100×)所示巨噬細(xì)胞是以[GPGRAF]8-MLC預(yù)處理的，顯示出很少量的巨大細(xì)胞。[RKSIHIGP-GRAFYT]4-MLC和[GPGRAF]8-MLC能抑制感染，用如下事實(shí)加以評(píng)估，i)在暴露於10,000TCID50的HIV-1(89.4)之巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中，在MBPCs存在下可觀察到的細(xì)胞病理作用大為降低，ii)在培養(yǎng)上清液中HIV-1p24gag濃度和RT活性測量值。對(duì)照組MBPCs并不明顯影響巨噬細(xì)胞被HIV-1(89.6)感染的速率。有趣的是，[GPGRAF]8-MLCD(即具有D-氨基酸殘基的[GPGRAF]8-MLC)與[GPG(R)DAF]8-MLC在巨噬細(xì)胞感染上，顯著地比[GPGRAF]8-MLC活性低。B.GalCer受體本發(fā)明的MBPCs，特別是MBPC.3和MBPC.12及其衍生物，亦可結(jié)合于第二受體-半乳糖基神經(jīng)酰胺受體(見於Harouse等人，Science，253，320-323(1991))，且可完全地阻斷HIV對(duì)人直腸細(xì)胞的感染力。相應(yīng)的單體肽在該受體上是不具活性的。
為了用MBPC中的GPGRAF肽得到在小腸細(xì)胞中GalCer感染路徑的完全阻斷，該MBPCs的聚合程度必須至少為8。這提示在GalCer識(shí)別上V3環(huán)的構(gòu)象要求比結(jié)合于CD4的CDR3更為嚴(yán)格。CDR3是一酸性區(qū)域(在第87位置上包含一谷氨酸殘基，據(jù)報(bào)道，這是融合步驟中所必須的)，它可能與V3環(huán)上堿性氨基酸借助靜電效應(yīng)而相互作用。相對(duì)地，GalCer的半乳糖頭基，已知其涉及gP120的結(jié)合，是中性極性的，對(duì)于較佳相互作用，可要求V3結(jié)構(gòu)上不同的原子空間排列。因此，令人吃驚的是，阻斷CD4通路的HIV感染的治療亦可與GalCer受體起作用。
MBPCs的活性可以如下所述的交替感染方式加以評(píng)估HT-29細(xì)胞(5×105細(xì)胞)以MBPCs(5×10-6)培育45分鐘，而後在37℃下暴露於100TCID50的HIV-1(LAI)、HIV-1(NDK)或HIV-2(ROD)1小時(shí)。用三次連續(xù)的胰蛋白酶作用使殘馀的接種物失活，而感染的評(píng)估如下i)直接測量培養(yǎng)上清液中HIV-1p24gag(對(duì)于HIV分離株)和RT活性(對(duì)于HIV-1和HIV-2分離株)。
ii)與人PBLs共培養(yǎng)。用如下所示的MBPCs處理細(xì)胞1-無；2-[GPGRAF]8-MLC；3-[GPGRAF]8-MLCD；4-[GPG(R)DAF]8-MLC；5-[GPGRAF]16-MLC；6-[RKSIHIGP-GRAFYT]4-MLC；7-[PPPYVEPTTTQC]4-MLC，所有氨基酸除非指明否則皆為L型。圖5A所示結(jié)果，對(duì)應(yīng)於以HIV-1(NDK)所感染者，代表三個(gè)分別的實(shí)驗(yàn)，所使用的MBPC以X軸上的數(shù)字表示。在以PBLs共培養(yǎng)期間測量p24gag(pg/ml)的濃度(+++為感染後10天＞10ng/ml；++為感染后13天＞1ng/ml；+為感染後16天＞1ng/ml；-為感染後1個(gè)月未檢出p24gag)。用HIV-1(LA1)和HIV-2(ROD)也可得到相似的結(jié)果。
在以相同的MBPCs進(jìn)行的另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，利用高效液相薄層色譜(HPTLC)結(jié)合分析法分析MBPCs對(duì)gP120結(jié)合于GalCer的影響。將MBPCs(10-4M)在室溫下與GalCer預(yù)培育1小時(shí)。在徹底洗滌后，將HPTLC平板與HIV-1重組gp120(2.5μg/ml)一起培育，而後與家兔抗gp120和125I-山羊抗家兔IgG一起培育。將平板在PBS中清洗，且暴露于Amersham超薄膜(hyperfilm)MP中8小時(shí)。如圖5B所示，以活性MBPCs處理HT-29細(xì)胞，可保護(hù)該細(xì)胞免受HIV-1(NDK分離株)所感染。該抗病毒功效與其阻斷gp120結(jié)合于GalCer上的能力有關(guān)連。單體V3肽與對(duì)照MBPCs均不顯示出任何抗病毒活性，且不會(huì)抑制gp120與GalCer的結(jié)合。
因此，本發(fā)明還提供一MBPC，它包含有一接合有2至64個(gè)肽(較佳為4至32個(gè))的核心基質(zhì)，每個(gè)肽來自HIV-1病毒的表面糖蛋白gP120的V3環(huán)，該MBPC能抑制HIV病毒在CD4+/GalCer4-和CD4-/GalCer+細(xì)胞中的感染力，C.抗原性、毒性與免疫原性本發(fā)明的MBPCs在體外對(duì)人PBLs不具毒性，或者，在體內(nèi)對(duì)無論以腹腔、靜脈或皮下反復(fù)注射10-3M MBPCs的小鼠，皆不具毒性。此外，猴(macaca sylvana)靜脈注射一次，而後皮下注射，每天給予5mg/kg劑量，在30天後，并不顯示出任何毒性作用的征兆。此外，注射[GPGRAF]8-MLC的家兔和小鼠不產(chǎn)生抗GPGRAF抗體的顯著滴度，這與肽的每一分支上具少于10個(gè)氨基酸殘基的MBPCs，在低于10-3M的濃度下(所欲使用的濃度下)不具免疫原性之觀念相吻合。再者，PBLs在體外保留被其它抗原或分裂素激活的能力。1.抗原性MBPCs免疫原性的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)在ELISA中，測試MBPC.1、MBPC.2和單體V3一致序列肽對(duì)HIV-1+血清或HIV-1-血清的免疫反應(yīng)性。此測試中，MBPC.2為(RKSIHIGPGRAFYT)4-(K)2-K-βA-OH，MBPC.1為(GPGRAF)8-(K)4-(K)2-K-βA-OH。使用血清/血漿中抗HIV-1抗體檢測用的New Lav Blot試劑盒(Diagnostic Pasteur)，用Western印跡試驗(yàn)先確認(rèn)血清的陽性。將96孔微滴定板以500ng/孔肽加以被覆。在飽和且清洗後，加入HIV-1+血清(1/100稀釋度)50μl，在37℃下保溫2小時(shí)、以過氧化酶偶聯(lián)的豬抗家兔IgG進(jìn)行染色。將30份HIV-1陽性反應(yīng)血清和3份HIV-1陰性反應(yīng)血清對(duì)來自北美/歐洲一致(V3 Cons)序列的V3肽和V3MBPCs在ELISA分析中作分析比較。其結(jié)果如下表5所述。
在30份HIV-1陽性反應(yīng)血清中，26份與V3 Cons和MBPC.2反應(yīng)強(qiáng)烈，一份與這兩種肽反應(yīng)微弱，一份選擇性地與MBPC.2反應(yīng)，兩份血清不與這兩個(gè)肽中的任一個(gè)反應(yīng)。
有趣的是，MBPC.1不與任何一份HIV-1陽性反應(yīng)血清反應(yīng)。與MBPC.2相比，MBPC.1在阻斷HIV-1和HIV-2感染上顯示出較佳的作用，與較低的毒性。MBPC.1不被HIV-1陽性反應(yīng)血清識(shí)別的事實(shí)提示該MBPC可能不干擾抗V3-抗體的中和活性。因此，可協(xié)同中和HIV-1感染。
表5
2.毒性利用使用3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴化物的MTT分析(細(xì)胞存活力比色測定)評(píng)估MBPCs對(duì)細(xì)胞存活力的作用。在96孔微量滴定板的孔中，在各種濃度MBPCs存在下，以添加了5％胎牛血清、1％谷氨酸、1％鏈霉素-青霉素的終體積為200μl的RPMI(得自Gibco of Irvine，Scotland)作培養(yǎng)基，在含5％CO2的潮濕氛圍下培養(yǎng)CEM和C8166細(xì)胞(5×104)。每3至4天，對(duì)100μl的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行MTT分析，將MBPCs加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，使體積最終為200μl 。[GPGRAF]8-MLC，在濃度于10-7至10-4M下，對(duì)此測試細(xì)胞不具毒性。其它的結(jié)果顯示於上表3。如上所示，包含IGPGR序列的十四肽MLC具有毒性，因此不適於本申請(qǐng)所考慮的治療應(yīng)用。3.抗原性對(duì)MBPCs的免疫原性研究四只C57/BL6黑鼠每天注射劑量為4mg/ml(1mg)的MBPC.3250μl，注射36天，注射途徑為腹腔注射。由眼眶下穿刺收集血液樣品。該血液樣品在37℃下維持1小時(shí)，而後4℃下過夜，所得的上清液(血清樣品)與塊狀物分離。利用ELISA對(duì)血清測試，找尋特異性的抗MBPC.3抗體。
此外，用[GPGRAF]8-MLC免疫兩只新西蘭家兔，將400μg[GPGRAF]8-MLC在1ml PBS(pH7.4)中，與等體積完全Freund佐劑混合，在第0天皮內(nèi)注入每只家兔。在第30、60、90和120天時(shí)以不完全Freund佐劑皮下注射重復(fù)該步驟。用ELISA作血清測試，找尋特異性的抗MBPC.3抗體。此處所提出的資料來自最後的血清樣品(120＋7天)。
96孔微量滴定板(Munc Rotskild，Denmark)每孔以pH7.4之各種濃度的[GPGRAF]8-MLC(500至25ng[GPGRAF]8-MLC，在50μl PBS中)在37℃下被覆2小時(shí)。以400μl酪蛋白(5g/100ml)飽和後，加入不同稀釋度的血清，37℃下2小時(shí)。對(duì)照組為得自未免疫過的家兔和小鼠的血清。在淋洗(5×)後，加入1∶5000的過氧化酶-標(biāo)記的豬抗家兔IgG或抗小鼠IgG(Dakopatts，Copenhagen，Denmark)5μl，在37℃下1小時(shí)。進(jìn)一步淋洗后(5×)，加入100μl鄰苯二胺，於暗室室溫下30分鐘。該反應(yīng)由加入50μl 4N的硫酸而終止，在492/620nm下測定出光密度(OD)比率。
下表6至10列出結(jié)果，表6列出用光密度比率(×10)，由家兔所得結(jié)果的概要。Mo為10μg/ml的GPGRAF單體。
表6血清稀釋度1∶101∶1001∶1000[GPGRAF]8-MLC(μg/ml)10 家兔A +++ + -家兔B + - -5 家免A +++ - -家兔B + - -1 家兔A +++ - -家兔B + - -0.5家兔A + - -家兔B - - --，光密度(OD)＜0.2；+，O.D.＝0.2-0.4；++，O.D.＝0.4-0.8；+++，O.D.＞0.8
表7-微量滴定板n°1
說明S10＝10μg MBPC.3/ml；S5＝5μg MBPC.3/mlS1＝1μg MBPC.3/ml；S.5＝0.5μg MBPC.3/ml；Mo＝GPGRAF單體，10μg/mlM10-2＝[10-2]小鼠；R10-2＝[10-2]家兔Mctrl＝[10-2]未免疫小鼠；Rctrl＝[10-2]未免疫家兔；表8微量滴定板n°2
說明S10＝10μg MBPC.3/ml；S5＝5μg MBPC.3/mlS1＝1μg MBPC.3/ml；S.5＝0.5μg MBPC.3/ml；Mo＝GPGRAF單體，10μg/mlM10-2＝[10-2]小鼠；R10-2＝[10-2]家兔Mctrl＝[10-2]未兔疫小鼠；Rctrl＝[10-2]未免疫家兔；表9微量滴定板n°3
說明S10＝10μg MBPC.3/ml；S5＝5μg MBPC.3/mlS1＝1ug MBPC.3/ml；S.5＝0.5μg MBPC.3/ml；Mo＝GPGRAF單體，10μg/mlM10-2＝[10-2]小鼠；R10-2＝[10-2]家兔Mctrl＝[10-2]未免疫小鼠；Rctrl＝[10-2]未免疫家兔；
表10微量滴定板n°4
說明Sl0＝10μg MBPC.3/ml；S5＝5μg MBPC.3/mlS1＝1μg MBPC.3/ml；S.5＝0.5μg MBPC.3/ml；Mo＝GPGRAF單體，10μg/mlM10-2＝[10-2]小鼠；R10-2＝[10-2]家兔Mctrl＝[10-2]未免疫小鼠；Rctrl＝[10-2]未免疫家兔；RABU＝[10-2]家兔，加有肽Abu(無關(guān)氨基酸)。
鑒於在一部份結(jié)果可觀察到高的背景反應(yīng)值，故須要進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)以證實(shí)用MBPC.1免疫的血清不具反應(yīng)性。
得自以MBPC.1或MBPC.2免疫的家兔的血清，在ELISA中測試其對(duì)MBPC.1、MBPC.2、Mono.1(MBPC.1之單體形式)和北美/歐洲一致V3序列(V3Cons或Cs)的結(jié)合能力。
圖6A顯示得自以MBPC.2免疫的家兔的血清顯著地可識(shí)別MBPC.1與V3 Cons，然而并未觀察到對(duì)MBPC.1或相應(yīng)單體肽的反應(yīng)活性。圖6B表明從MBPC.1免疫的家兔得到的血清并不對(duì)MBPC.1(除從家兔A所得的血清有微弱的反應(yīng)性外)、MBPC.2、V3 Con或Mono.1起反應(yīng)，用作陽性對(duì)照的兔疫前血清，同樣不對(duì)MBPC、V3 Con或Mono.1起反應(yīng)。
在另一組實(shí)驗(yàn)中，對(duì)從MBPC.1或MBPC.2免疫的小鼠所得的血清(1/100至1/1000稀釋度)測試其對(duì)各種濃度之MBPC.1、MBPC.2和V3 Con的作用。圖7A、7B和7C清楚表明，從MBPC.2免疫的家兔得到的血清對(duì)MBPC.2和V3 Con呈劑量依賴方式的反應(yīng)。未檢出對(duì)MBPC.1的反應(yīng)性。相對(duì)地，由從MBPC.1免疫的小鼠得到的血清對(duì)MBPC.2不反應(yīng)，而對(duì)MBPC.1有微弱反應(yīng)(注意由家兔A得到的血清對(duì)MBPC.1有微弱反應(yīng)，但由家兔B得到的血清則無反應(yīng))。有趣的是，後者血清不與單體V3 Cons反應(yīng)，此單體V3 Cons為34個(gè)氨基酸的直鏈抗原決定基，該抗原決定基模擬如存在於gp120的一致序列。
這些結(jié)果顯示MBPC.1，一短V3 MBPC，在家兔中不會(huì)誘發(fā)顯著的抗體反應(yīng)，而MBPC.2，最長的V3肽構(gòu)建物，則會(huì)引起此反應(yīng)。這些觀察結(jié)果與HIV-1感染病人血清的MBPC.1免疫反應(yīng)性結(jié)果相吻合。
在小鼠，重覆注射10-3M，偶然會(huì)在稀釋度為1∶100的血清中檢出滴度很低的抗體，在低血清稀釋度下基本上無抗體被檢出。在家兔中，有一個(gè)動(dòng)物在血清稀釋度為1∶100時(shí)可檢測出抗體。在其它血清稀釋度下，抗體滴度與對(duì)照組動(dòng)物所得者可相比擬。如此弱的抗原性表明本發(fā)明的MBPCs不具有被用作引發(fā)有效抗體反應(yīng)的抗原的潛能，而這是先前已知肽構(gòu)建物的用途。事實(shí)上，本發(fā)明的MBPCs的所欲治療濃度為約10-6M，在該濃度被預(yù)期不會(huì)有抗體反應(yīng)。然而，給予缺少抗原性的MBPCs可給藥直至10-3M。
權(quán)利要求
1.一種多分支型肽構(gòu)建物，其特征在于包含一接合有2-64個(gè)肽的核心基質(zhì)，每一個(gè)肽包含有氨基酸序列GPGR，在該序列前有0-4個(gè)氨基酸殘基，該序列后有2-4個(gè)氨基酸殘基，但基本上不具有氨基酸序列IGPGR或IXXGPGR，其中X為氨基酸殘基。
2.按權(quán)利要求1所述的肽構(gòu)建物，其中具有接合于核心基質(zhì)的4-32個(gè)肽。
3.按權(quán)利要求1或2所述的肽構(gòu)建物，其中每一個(gè)肽是相同的。
4.按權(quán)利要求1或2所述的肽構(gòu)建物，其中每一個(gè)肽為GP-GRAF。
5.按權(quán)利要求4所述的肽構(gòu)建物，其中含有8或16個(gè)肽GP-GRAF。
6.按前面任一權(quán)利要求所述的肽構(gòu)建物，其中核心基質(zhì)包含賴氨酸殘基。
7.按前面任一權(quán)利要求所述的肽構(gòu)建物，其中核心基質(zhì)和肽之間有間隔物。
8.按權(quán)利要求1所述的肽構(gòu)建物，其中肽為肽類似物。
9.按權(quán)利要求1所述的肽構(gòu)建物，其中肽或某些肽包含一個(gè)或一個(gè)以上右旋型氨基酸殘基。
10.一種多分支型肽構(gòu)建物，其特征在于包含一接合有2-64個(gè)肽的核心基質(zhì)，每一個(gè)肽均來自HIV病毒的表面被膜糖蛋白gP120的V3環(huán)，該多分支型肽構(gòu)建物在低于10-4摩爾的血清濃度下無免疫原性，且能抑制HIV病毒在CD4+/GalCer-和CD4-/Gal-Cer+細(xì)胞中的感染力。
11.一種藥物，包含按前面任一權(quán)利要求所述的多分支肽構(gòu)建物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。
12.包含一接合有2-46個(gè)肽的核心基質(zhì)，每一個(gè)肽包含有氨基酸序列GPGR，在該序列前有0-4個(gè)氨基酸殘基，該序列后有2-4個(gè)氨基酸殘基的多分支型肽構(gòu)建物在制備治療HIV病毒感染藥物上的應(yīng)用。
13.治療HIV感染的方法，其特征在于給患者施用包含一接合有2-64個(gè)肽的核心基質(zhì)，每一個(gè)肽包含有氨基酸序列GPGR，在該序列前有0-4個(gè)氨基酸殘基，該序列后有2-4個(gè)氨基酸殘基的多分支型肽構(gòu)建物。
14.治療HIV感染的方法，其特征在于給患者施用按權(quán)利要求1-10之一所述的肽構(gòu)建物。
15.治療HIV感染的方法，其特征在于給患者施用按權(quán)利要求11所述的肽構(gòu)建物。
16.一種多分支型肽構(gòu)建物的制備方法，該多分支型肽構(gòu)建物包含一接合有2-64個(gè)肽的核心基質(zhì)，每一個(gè)肽包含有氨基酸序列GPGR，在該序列前有0-4個(gè)氨基酸殘基，該序列后有2-4個(gè)氨基酸殘基，但基本上不具有氨基酸序列IGPGR或IXXGPGR，其中X為氨基酸殘基，該方法的特征在于在樹脂上的肽鏈固相逐步延長，然后從樹脂上裂解下該多分支型肽構(gòu)建物。
17.按權(quán)利要求16所述的方法，其中樹脂為4-氧甲基-苯基乙酰氨基甲基共聚(苯乙烯-1％二乙烯苯)。
18.按權(quán)利要求16或權(quán)利要求17所述的方法，其中使用Boc/benzyl技術(shù)，包括與羥基苯并三唑活性酯系統(tǒng)雙偶聯(lián)(Boc-氨基酸-OBt)。
19.按權(quán)利要求16-18之一所述的方法，其中從樹脂上裂解是在0℃用氟化氫進(jìn)行的。
20.按權(quán)利要求16-19之一所述的方法，其中所制備的肽構(gòu)建物是有4-32個(gè)肽接合于核心基質(zhì)的肽構(gòu)建物。
21.按權(quán)利要求16-20之一所述的方法，其中所制備的肽構(gòu)建物是每個(gè)肽都相同的肽構(gòu)建物。
22.按權(quán)利要求16-21之一所述的方法，其中所制備的肽構(gòu)建物是每個(gè)肽都是GPGRAF的肽構(gòu)建物。
23.按權(quán)利要求22所述的方法，其中所制備的肽構(gòu)建物是有8或16個(gè)肽GPGRAF的肽構(gòu)建物。
24.按權(quán)利要求16-23之一所述的方法，其中所制備的肽構(gòu)建物是核心基質(zhì)含賴氨酸殘基的肽構(gòu)建物。
25.按權(quán)利要求16-24之一所述的方法，其中所制備的肽構(gòu)建物是在核心基質(zhì)和肽之間有間隔物的肽構(gòu)建物。
26.按權(quán)利要求16-19之一所述的方法，其中所制備的肽構(gòu)建物是其中的肽為肽類似物的肽構(gòu)建物。
27.按權(quán)利要求16-19之一所述的方法，其中所制備的肽構(gòu)建物是其中的肽或肽中的幾個(gè)包括一個(gè)或一個(gè)以上右旋型氨基酸殘基的肽構(gòu)建物。
全文摘要
多分支型肽構(gòu)建物，系由來自HIV-1的gp120糖蛋白上的V3環(huán)的肽所形成，其包含一致序列GPGR，在該序列前有0至4個(gè)氨基酸殘基，該序列后有2至4個(gè)氨基酸殘基，較佳的是在GPGR前的3個(gè)氨基酸中不包含I，最佳者為GPGRAF，該多分支型肽構(gòu)建物顯示出受體親和力增加，且可防止細(xì)胞—細(xì)胞的融合。其具有直接的病毒靜電作用。因該構(gòu)建物呈現(xiàn)出相同肽構(gòu)建物序列好幾次，一些MBPCs在活體外能中和好幾株HIV-1和HIV-2的病毒被膜/細(xì)胞膜融合和感染細(xì)胞膜/未感染細(xì)胞膜融合的不同階段產(chǎn)物。令人注意的是，它們可有效地阻斷淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的CD4受體與直腸上皮細(xì)胞的GaCer受體。這些結(jié)果在HIV-1與HIV-2感染的治療上開辟了具有潛力的用途。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1130911SQ94193388
公開日1996年9月11日 申請(qǐng)日期1994年9月13日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月13日
發(fā)明者J·M·薩巴捷, A·本約亞, N·亞希, E·弗努耶, K·麥布羅克, J·C·格盧克曼, J·凡瑞特徹騰, H·路卡特 申請(qǐng)人:阿爾梅爾股份有限公司