專利名稱：用粒細胞-巨噬細胞治療肝炎的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過使用有療效劑量的粒細胞-巨噬細胞(GM-CSF)(尤其是人類GM-CSF)治療肝炎的方法。
肝炎是一種涉及肝臟炎癥的疾病，根據(jù)這種病的患病時間和嚴重程度可劃分為急性的和慢性的二種。已發(fā)現(xiàn)這種病涉及四種肝炎病毒因子，即甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)丙型肝炎病毒(HCV)和HBV-伴隨的丁種病毒因子(HDV)。盡管這些病毒因子可以按其抗原性質(zhì)加以區(qū)分，但是這四種病毒在臨床上卻引起類似的疾病。這些病毒的感染癥狀的共同點都是從無癥狀和癥狀不明顯到實發(fā)性和致命。另一個感染特點是從臨床癥狀不明顯的持續(xù)的感染到迅速發(fā)展的慢性肝炎，最后導致肝硬變，甚至肝癌。這個感染特點為HBV、HCV和HDV這三種血生型病毒所共有。
受到肝炎病毒因子感染的早期癥狀是血清轉(zhuǎn)氨酶升高，即天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量的升高，它先于膽紅素含量等級的升高。每一種血清轉(zhuǎn)氨酶的峰值含量都在400至4000IU或更大的范圍內(nèi)變化。處在臨床上黃疽性肝炎階段的病人的血清轉(zhuǎn)氨酶通?？蛇_到上述的數(shù)量。而在急性肝炎的恢復階段的肝炎病人的血清轉(zhuǎn)氨酶的含量則逐漸減小。
HAV是一種RNA病毒。在患急性病時可以檢測到抗HAV抗體(抗-HAV)此時血清ALT和AST活性升高并且在糞便中還有HAV排出。這種早期的抗體應(yīng)答主要是對IgM類，要持續(xù)幾個月。然而，在恢復期IgM類抗-HAV變成為主要的抗體。因此甲型肝炎的診斷是在急性病期間通過顯示高滴度的IgM類抗體完成的。急性階段過后，IgG類抗-HAV仍然可鑒別檢測，而那些攜帶血清抗-HAV的病人對再次感染是免疫的。
HBV是屬于肝炎病毒科的DNA病毒。檢測HBV的方法有很多種，例如檢測乙型肝炎表面抗原(HBsAg)檢測在殼包核酸表面上所表現(xiàn)的抗原[稱為乙型肝炎核抗原(HBcAg)]以及相應(yīng)的抗HBc抗體。HBcAg不與HBsAg交叉反應(yīng)。與乙型肝炎有關(guān)的第三種抗原是乙型肝炎e抗原(HBeAg)。在每一個受急性乙型肝炎傳染的個體中，在病程的初期HBeAg的發(fā)病時間是短暫的。但是，持續(xù)的HBeAg陽性與不斷進行的病毒復制有關(guān)，并可能同慢性肝炎中持續(xù)的疾病活動有關(guān);其消失可能是生化改善和感染消除的先兆。與HBeAg一樣，血清HBVDNA和DNA聚合酶也是HBV復制的指示劑，不過它們更為靈敏。在自身限制的感染中，在HBsAg消失之前，在ALT和AST活性上升到峰值之后的短時間內(nèi)HBeAg變得不可檢測，并且在此后抗HBe變得可檢測，這與相當短的傳染性周期相符。在持續(xù)的HBV感染中，HBeAg可能始終是可檢測的，借此可指示持續(xù)的復制感染。在慢性乙型肝炎中，當缺乏HBeAg而存在抗-HBe時，感染通常是不可復制的。偶爾也有非復制HBV感染又變回復制感染。這樣的自發(fā)的復制過程伴隨有HBeAg和HBVDNA的重復表現(xiàn)，以及伴隨肝損傷的惡化。
慢性肝炎指的是持續(xù)六個月或更長時間的、常會發(fā)展成為肝硬變的幾種類型肝炎中的任意一種，可以根據(jù)它們的起因被稱為慢性甲型、乙型或丙型肝炎。慢性肝炎的病例涉及三種相關(guān)的疾病，即慢性持續(xù)性肝炎、慢性小葉肝炎和慢性活動性肝炎。這些肝炎病的特征在于肝細胞壞死和程度不同的嚴重炎癥的綜合癥。
慢性活動性肝炎這種在臨床上最嚴重的疾病可能導致肝衰竭和死亡，或發(fā)展成為肝硬變。慢性活動性肝炎是急性乙型肝炎主要的晚期并發(fā)癥，發(fā)生慢性活動性肝炎的情況只占急性病例中的一小部分，而更常見的是慢性感染的急性病例。某些臨床和實驗室的征兆提示急性肝炎會發(fā)展成為慢性肝炎，這些征兆是(1)厭食、體重減少、疲勞和持續(xù)性肝腫大沒有完全消失;(2)在被拖延的急性病毒性肝炎過程中根據(jù)肝的活組織檢查發(fā)現(xiàn)存在橋連或多小葉肝壞死;(3)在急性肝炎之后6-12個月內(nèi)血清的ALT和AST膽紅素和球蛋白含量才恢復正常;(4)在急性肝炎之后6個月或更長時間仍存在有HBsAg和/或HBV-DNA和DNA聚合酶，該征兆提示仍然存在對肝的慢性病毒感染。
大多數(shù)患有活動性肝病的人對于HBeAg也呈陽性。這種血清診斷標記在慢性HBsAg攜帶者狀態(tài)發(fā)作時總是存在，隋時間的推移，HBeAg可能消失并被抗-HBe抗體代替。血清的這種變化常常(但不總是)同慢性肝病的活動性降低有關(guān)。那些患有進行中的慢性肝病的帶有抗-HBe抗體的接受治療者一般也具有其他的活性病毒復制的血清診斷跡象，即在肝內(nèi)或者是存在低的、周期性變化的HBV-DNA和DNA聚合酶含量，或者是存在低的、周期性變化的乙型肝炎核抗原含量。對于存在活性HBV復制和伴隨慢性肝炎疾病活動者來說血清診斷標志就是IgM抗-HBc抗體。當HBV-DNA、DNA聚合酶以及HBeAg不再能檢測出時或者其滴度很低時可能存在這種抗體。
HCV是單絲狀體的RNA病毒，帶有大約10，000個核苷酸的一個基因組。它與HBV，或逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，或其他肝炎病毒沒有同系性，然而其基因組尺寸和穩(wěn)定性與其在類脂包覆病毒因子的囊膜病毒族中的包含物相符，該包含物包括蟲媒病毒(例如黃熱病毒和登革熱病毒)以及風疹病毒。HCV的診斷試驗業(yè)已由ChironCorporationOfEmeryvilleCalifornia進行過研究。在得到可靠的丙型肝炎血清診斷試驗之前，對非甲和非乙肝炎的診斷是在按相似的病史分組的情況下利用從血清中排除HAV和HBV感染的方法作出的。既然可以利用專一性抗體試驗，那么就有可能進行專一性的血清診斷;然而在出現(xiàn)可檢測抗體之前延誤1至3個月可能防礙急性病過程中的血清診斷。此外，抗體含量似乎特別低。在非甲、非乙肝炎中，常見的氨基轉(zhuǎn)氨酶含量變化無常的升高的特性曲線，是一個臨床上有用的線索，如果對HBsAg、IgM抗-HBc和IgM抗-HAV的試驗為陰性，這是可以接受的。如果在急性病發(fā)作后1個月或更長的時間內(nèi)獲得跟蹤樣品，就可以進行血液生成非甲、非乙肝炎(丙型肝炎)的專門的血清診斷。
HDV是一種有缺陷的RNA，為了復制表現(xiàn)HDV，需要HBV的輔助機能和協(xié)同感染HBV。HDV比HBV稍小一些，是一種35-37nm的對福爾馬林敏感的具有雜種結(jié)構(gòu)的病毒。其殼包核酸表現(xiàn)HDV抗原，它不與任何HBV抗原形成同系物，并含有一種與HBVDNA不同系但具有植物隨體病毒或類病毒的小的1700-核苷酸的RNA基因組。這種HDV核被一種HBsAg外殼“包裹”，因此，HDV或者可以同時使一個人感染HBV(協(xié)同感染)或者使一個已經(jīng)受HBV感染的人重復感染(雙重感染);當HDV感染由一個帶有一種HBsAg亞型的供體轉(zhuǎn)移到一個帶有不同亞型的HBsAg陽性的受體時，HDV病毒因子表現(xiàn)為受體的(而不是供體的)HBsAg亞型。因為HDV絕對依賴于HBV，所以HDV感染的持續(xù)期是由HBV的持續(xù)期確定并不可能比HBV感染持續(xù)期長。HDV抗原主要以肝細胞核表現(xiàn)并偶爾可以在血清中檢測到。在急性HDV感染期間，IgM類的抗-HDV抗體占優(yōu)勢;在自身限制的感染中，抗-HDV抗體是低滴度的并且是短暫的，在超出HBsAg和HDV抗原的清除率范圍之外很少能檢測出。在慢性HDV感染中，可以檢測到抗-HDV抗體。在HDV復制過程中，在肝臟中可以檢測出HDV抗原并且在血清和肝臟中可以檢測出HDVRNA。
可以通過證實肝內(nèi)的HDV抗原的存在來鑒別HDV感染的存在方式，或更實際的是用一種抗HDV血清轉(zhuǎn)換(抗-HD抗體滴度的上升或重新出現(xiàn)IgM抗-HD抗體)來鑒定。使HDAg循環(huán)(也就是診斷急性感染)。簡單地說只要認真檢測就可以檢測出。由于IgM是一種短暫的抗-HD抗體并且一旦HBsAg消失IgG常常不能檢測，所以對于急性自身限制的同時HBV和HDV感染的追溯血清診斷是困難的。
當一個病人患有急性肝炎并且血清中常有HBsAg和抗-HD抗體時，測定抗-HBc抗體的種類有助于建立感染同HBV和HDV之間的關(guān)系。盡管不能把IgM抗-HBc抗體絕對地區(qū)分為急性和慢性HBV感染，但是它的存在是當下感染的一個可靠的指示。并且它的缺乏也是很久以前患過受感染的一個可靠的指示。同時在受到急性的HBV和HDV感染時，IgM抗-HBc抗體將是可檢測的，而在疊加在慢性HBV感染上的急性HDV感染中的抗-HBc抗體將屬于IgM種。
慢性持續(xù)性和慢性小葉肝炎是由于HBV和HCV感染而引起的。一般說來，這是兩種非進行性疾病，尚未見有肝衰竭，演變成為肝硬變也極為罕見。然而，在自發(fā)緩解過程中可以偶爾遇到患慢性活動肝炎的病人。此時病理組織學的發(fā)現(xiàn)可以提示存在慢性持續(xù)性或慢性小葉性肝炎。在這些情況下，可能出現(xiàn)復發(fā)和發(fā)展成為更為嚴重的潛死的慢性肝炎。慢性持續(xù)性肝炎和小葉性肝炎不再發(fā)展的另一種例外出現(xiàn)在對HBV表面抗原(HBsAg)呈陽性的病人身上，在病人身上，HDV病毒因子雙重感染導致慢性活動性肝炎繼續(xù)發(fā)展。在已知的慢性HBsAg載體上存在臨床上迅速的發(fā)展性肝損傷將暗示確實受到了HDV的感染。
本發(fā)明的一個目的就是提供一種治療肝炎，特別是慢性乙型肝炎的方法。
本發(fā)明提供了一種用于治療哺乳動物所患肝炎的方法，需要進行如下治療給患肝炎的哺乳動物使用有療效劑量的粒細胞/巨噬細胞-菌落激發(fā)因子(GM-CSF)或基本上具有相同的氨基酸順序和天然GM-CSF活性的多肽類似物。
接受治療的哺乳動物最好是人類，并且所使用的GM-CSF最好是人類同種異型之一。GM-CSF最好按照每天每公斤體重0.1-10微克(μg)的量使用。
本發(fā)明的另一個實施例是一種用于治療需要這種治療的哺乳動物肝炎的方法，在這種治療中GM-CSF與α干擾素結(jié)合起來使用。


圖1表示由人類患者身上所獲得的ALT和HBV-DNA的濃度，這些患者患有慢性肝炎并接受了按每日每公斤體重0.5μgrGM-CSF的皮下注射共6周。當停藥兩周后，對每個病人每天皮下注射300萬IU(國際單位)的重組體α-干擾素(rIFN-α)共6周。
圖2表示由人類患者身上獲得的ALT和HBV-DNA濃度，這些患者患有慢性乙型肝炎，并接受了按每日每公斤體重1.0μg的rGM-CSF的皮下注射治療共6周。停藥約兩周后，對每個患者每天皮下注射3百萬IU的rIFN-α共6周。
圖3表示由患者身上所獲得的ALT和HBV-DNA的濃度，這些病人患有肝炎并接受了按每天每公斤體重1.5μg的rGM-CSF的皮下注射治療共6周。停藥約二周后，對每個患者每天皮下注射3百萬IU的rIFN-α共6周。
根據(jù)本發(fā)明，通過使用有效劑量的GM-CSF可以有效地治療患有肝炎的哺乳動物，特別是人類。
本發(fā)明可以使用具有基本上相同的氨基酸順序和天然GM-CSF活性的GM-CSF。已對GM-CSF的互補DNAs(cDMAs)進行過無性繁殖并按實驗室序號進行過編譯編序，例如Gough等人在Nature，309763(1984)(小鼠)中的論述;Lee等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，824360(1985)(人類)中的論述;Wong等人在Science，228810(1985)(人類和吉本)中的論述Cantrell等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，826250(1985)(人類)中的論述Gough等人在Nature，309763(1984)(小鼠)中的論述;Wong等人在Science，228810(1985)(人類和吉本);Cantrell等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，826250(1985)(人類)中的論述。在人類GM-CSFs之中已對核酸順序和氨基蘇氨酸作了觀察。例如，對蘇氨酸和異亮氨酸已在相對于該氨基酸順序的N端位置的人類GM-CSF的100位置處進行過觀測。這些最容易傳染疾病的順序可能具有各種長度和氨基酸組成，這兩個參數(shù)對生物活性可能有影響，也可能沒有影響。用于本發(fā)明治療人類的GM-CSF以人類GM-CSF較為可取，最可取的是Lee等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，824360(1985)中所述的那種GM-CSF，如用美國專利申請07/111886(申請日為1987年10月23日)的方法提取的那種物質(zhì)。
GM-CSF還可以從Immunex，Inc.OfSeattleWashingtonandSchering-PloughCorporationOfKenilworth，NewJersey獲得。
GM-CSF的用法可以采用皮下、靜脈、鼻腔、非腸胃的、肌肉以及其它可接受的方法。較為可取的用藥方式是皮下注射。GM-CSF的有效的劑量一般為每公斤體重病人每天用0.1-10μg最好0.5-3μg。INF-α也可以與GM-CSF配合使用。“配合使用”這一術(shù)語指的是在施用GM-CSF過程中，就在其前或緊接其后同時使用INF-α。如果還使用α-干擾素，則INF-α的有療效的劑量應(yīng)為3百萬IU(也可以按每公斤體重病人每天采用皮下注射)。
人類α干擾素(hINF-α)是一種包括那些指定的α-1和α-2干擾素在內(nèi)的至少十一種成分的天然形成的混合物。
很多INF-α的物種或成分是已知的，并且通常是用一個數(shù)字和前面為希臘字母α的組合來標記的。如同標記的人類α-2干擾素種一樣，人類α-1干擾素也是適合用于本發(fā)明的一種干擾素。按照USAN原則，重組體DNA人類α-2干擾素被稱為干擾素α-2a(它可以按照在Rubenstein，Biochem.Biophys.Acta(1982)，6955-16中公開的內(nèi)容制備)和干擾素α-2b。干擾素α-2b是用于本發(fā)明的較為可取的物種，并且是一種重組體DNA人類α干擾素(以下稱之為rhINF-α)包括在本發(fā)明范圍的另一種適合的rhINF-α是重組體DNA人類干擾素α-2a。
人類干擾素α-2b可以用細菌和其它微生物使用重組體DNA技術(shù)生產(chǎn)，這些技術(shù)包括在Nagata等人在Nature(1980)284，316-319.歐洲專利32134和美國專利4289690中所公開的那些技術(shù)。在美國專利4503035中公開了各種α干擾素物種。
國際單位是通過將所使用的α-干擾素的抗病毒活性與由世界衛(wèi)生組織所規(guī)定的人類同細胞干擾素的國際標準制備物的活性進行比較來確定的。
由以上劑量組成所確定的加工制劑和藥物組合物可以用常規(guī)技術(shù)利用常規(guī)的在藥物學上可接受的賦形劑和添加劑來制備。
準備使用的GM-CSF溶液可以由凍干的粉末重新構(gòu)成，并且它們還另外含有防腐劑緩沖液，分散劑等。GM-CSF最好是用任何通常用于皮下注射的等滲介質(zhì)(例如不含防腐劑的消毒水)來重新制備。GM-CSF的最大濃度最好是不超過每毫升1500微克。當由ALT含量下降指示出對用GM-CSF治療有反應(yīng)的病人應(yīng)該繼續(xù)治療16-24周。所需要用GM-CSF的準確劑量和療程將由臨床護理醫(yī)生根據(jù)該疾病的病因和嚴重程度、病人的條件如性別、年齡以及其它因素確定。
GM-CSF治療肝炎的效果由以下非限制性的人類臨床數(shù)據(jù)來加以說明，這些數(shù)據(jù)不構(gòu)成對本發(fā)明公開范圍的限制。
例用GM-CSF治療受慢性乙型肝炎折磨的病人將九名受慢性活動性肝炎折磨的病人分為三組，每組有三個病人。這些病人有男性也有女性，其年齡分布在18歲至60歲范圍內(nèi)。對于一個已列入本研究課題的病人來說，所包含的判別準則如下1.列入本研究課題的病人必須具備如前所述在開始該研究之前6個月內(nèi)受過肝損傷這樣的條件，這樣的條件導致在病理組織學上被證實了具有或不具有肝硬變的慢性肝病。
2.HBV復制的證據(jù)如由至少在列入本研究課題之前6個月期間所獲得的血清HBeAg和HBV-DNA陽性數(shù)據(jù)所顯示的那樣。
3.每個病人都有證據(jù)(AST/ALT高)表明患有六個月以上的進行性肝病。
用于本例的重組體GM-CSF是從the Schering-Plough Corporation OF Kenilworth，New Jersey購買的。所使用的α-干擾素是干擾素α-2b，商標名稱為INTRON A
，是從Schering-Plough OF Kenilworth，NEW Jersey購買的。INTRON A
的比活性大約為2×108IU/mg蛋白質(zhì)。
第一組對第一組病人按每人每公斤體重每天皮下使用0.5μg的rGM-CSF共6個星期。停藥兩周后，每個病人每天皮下注射3百萬IUrhINF-α再進行6周。
結(jié)果圖1所標數(shù)據(jù)表示GM-CSF按照每公斤體重每天0.5μg的劑量治療慢性肝炎有一定程度的效果，這時，按照這一劑量，如同利用HBV-DNA含量的降低和/或ALT含量的降低所指示的那樣，三個病人當中僅有一個有一點改善。
第二組對第二組病人按每人每公斤體重每天皮下使用1.0μgrGM-CSF共6周，停藥兩周后，每個病人每天皮下注射3百萬IU的rINF-α再進行6周。
結(jié)果圖2中所標數(shù)據(jù)表示這種GM-CSF按照每人每公斤體重每天1.0μg的劑量治療慢性肝炎有效，這對如同利用HBV-DNA含量下降和/或ALT含量下降所指示的那樣，三個病人都有某種程度的改善。
第三組對第三組病人按每人每公斤體重每天皮下使用1.5μgrGM-CSF共6周。停藥兩周后，每個病人每天皮下注射3百萬IU的rINF-α再進行6周。
結(jié)果圖3中所標數(shù)據(jù)表示GM-CSF按照每人每公斤體重每天1.5μg的劑量治療慢性肝炎有效，這時，如同利用HBV-DNA含量下降和/或ALT含量下降所指示的那樣，三個病人當中有二個顯示出有某種程度的改善。
權(quán)利要求
1.一種用于治療哺乳動物肝炎的方法，包括對需要進行這樣的治療的哺乳動物使用有療效劑量的粒細胞/巨噬細胞-菌落激發(fā)因子(GM-CSF)或具有基本上相同的氨基酸順序和天然GM-CSF活性足以滿足治療需要的多肽類似物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所治療的是乙型肝炎。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所治療的是慢性活動性乙型肝炎。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中給哺乳動物所用GM-CSF的劑量按每公斤哺乳動物體重每天從大約0.5μg至10μg。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中GM-CSF是糖基化的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中GM-CSF是非糖基化的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括與GM-CSF配合使用α-干擾素(INF-α)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中哺乳動物是人類。
9.一種需要這種治療的哺乳動物的治療肝炎的方法，包括給需要這種治療的哺乳動物與α-干擾素(INF-α)配合使用有療效劑量的粒細胞/巨噬細胞-菌落激發(fā)因子(GM-CSF)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中用INF-α是在用GM-CSF過程之前或在用GM-CSF之后。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中給哺乳動物用的GM-CSF的劑量是按每公斤體重哺乳動物每天從大約0.5μg至3μg，而用INF-α的劑量為每天大約3百萬IU。
12.GM-CSF在制造用于治療肝炎的藥物組合物中的應(yīng)用。
13.用GM-CSF治療肝炎。
14.一種包括GM-CSF的治療肝炎的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療肝炎的方法，在該方法中是對需要這種治療的病人單獨用有效劑量的粒細胞/巨噬細胞—菌落激發(fā)因子或者同一種α—干擾素(INF—α)配合使用。
文檔編號A61K38/19GK1085802SQ9310573
公開日1994年4月27日 申請日期1993年4月13日 優(yōu)先權(quán)日1992年4月14日
發(fā)明者E·M·邦倫 申請人:先靈公司