專利名稱：新的胰島素化合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的胰島素化合物及其制備方法，還涉及具有長(zhǎng)效并且至少含有一種本發(fā)明新的胰島素化合物，需要時(shí)還可含有一種速效胰島素的藥物制劑。
自從1922年發(fā)現(xiàn)胰島素以來(lái)，已有許多種胰島素用于治療糖尿病。在開始時(shí)，僅僅使用那種胰島素活性迅速而又很快終止的胰島素溶液，但在后來(lái)通過(guò)引入鋅鹽和/或魚精蛋白，降低了胰島素的溶解度，研制了一種活性很寬的胰島素制劑。由于生物利用度的原因，所用胰島素都按傳統(tǒng)常規(guī)的方法，由家畜的胰腺提取，最常用的家畜是牛，豬和羊。然而近來(lái)所用的制劑，含有由生物技術(shù)制取的人胰島素，并且已經(jīng)見諸于市。
人胰島素的結(jié)構(gòu)示于式Ⅰ
B鏈(續(xù))Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr252627282930從某些家畜中得到的胰島素在結(jié)構(gòu)上非常與人胰島素相似。狗和豬的胰島素與人胰島素的區(qū)別僅在B鏈30位上是Ala，而不是Thr，兔胰島素的區(qū)別則僅在同一位置上是Ser。這些胰島素按Morihara等(Nature280，1979，412-13)和Marcussen(US-PatentNo.4343898)所述半合成方法，用Thr取代B30-氨基酸殘基即可轉(zhuǎn)化為人胰島素。
含胰島素的溶液制劑通常都是速效制劑，但在注射后幾個(gè)小時(shí)胰島素的活性即終止。因此需要頻繁地進(jìn)行注射，一般每天要注射若干次，使糖尿病患者得以維持正常的血糖水平。
為了克服這種缺陷，配制的長(zhǎng)效胰島素制劑應(yīng)使胰島素活性保持幾個(gè)小時(shí)，以至24小時(shí)，甚至更長(zhǎng)時(shí)間。使用這種長(zhǎng)效制劑，一些糖尿病患者每天僅需要少量注射，例如24小時(shí)內(nèi)注射1次或2次。
將胰島素轉(zhuǎn)化為略可溶解的鹽，例如鋅胰島素或魚精蛋白胰島素，即可獲得上述長(zhǎng)效胰島素。所用的這種略可溶解的胰島素鹽是一種懸浮液，經(jīng)皮下或肌肉注射后，從中逐漸釋放出胰島素。
最近采用了其他一些方法獲得了長(zhǎng)效胰島素，其中一例則是將胰島素結(jié)晶包在聚合血清清蛋白中。另一個(gè)例子則是連續(xù)作用的胰島素裝置，即所謂的胰島素泵，然而這可能會(huì)使患者感到不適和帶來(lái)危險(xiǎn)。
歐洲專利公報(bào)No.EP-132770，EP-132769和EP-135720的說(shuō)明書公開了胰島素衍生物的制備和用途，這種衍生物中，B鏈的C端由至少帶1個(gè)正電荷(尤以Arg-OH或Arg-Arg-OH為佳)使有機(jī)基團(tuán)延長(zhǎng)。含有這種胰島素衍生物懸浮液制劑具有長(zhǎng)效作用。然而這種胰島素化合物并不非常適用于配制新的有用的長(zhǎng)效胰島素制劑，因已發(fā)現(xiàn)，這種長(zhǎng)效非常有限(J/Markussenetal.，ProteinEngineering，1，205-213，1987)。
B鏈的N端由二肽Arg-Arg延長(zhǎng)的胰島素衍生物的性質(zhì)已由R.Geige&F.Enzmann作過(guò)介紹(ProceedingsoftheSymposiumonProinsulin，InsulinandC-peptide，Tokushima，1978;Excerpta，Medica，Amsterdam，1979，p.306-310)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，按等電點(diǎn)為基礎(chǔ)的這種胰島素化合物的溶解度高于一般的胰島素。
為了改進(jìn)胰島素在治療糖尿病中的活性構(gòu)形，可以將取代基引入胰島素分子。歐洲專利公報(bào)No.EP-194864公開了例如用Gln一次或多次取代Glu和/或用與以酯或酰胺形式的C端羧基的封阻相結(jié)合的Arg取代ThrB27，以注射后緩慢釋放的方式，使胰島素沉淀區(qū)移位。
使用這種含內(nèi)氨基酸取代基的胰島素化合物的制劑長(zhǎng)期治療糖尿病，意味著會(huì)給患者帶來(lái)激活免疫系統(tǒng)的嚴(yán)重威脅，導(dǎo)致胰島素抗體進(jìn)入血液。
為了獲得長(zhǎng)效胰島素，以便取代傳統(tǒng)的胰島素制劑，最近幾年來(lái)人們已經(jīng)盡了努力。其起因是由于糖尿病專家們發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的長(zhǎng)效胰島素制劑作用時(shí)間太短，在使用人胰島素時(shí)更是如此，而且使用所謂的胰島素筆(insulinpen)，已被認(rèn)為是一種溶解的長(zhǎng)效胰島素。
本發(fā)明的目在于提供一種新的具有長(zhǎng)效和盡可能低抗原性的胰島素類似物。
現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)。通式Ⅱ的胰島素化合物具有理想的長(zhǎng)期的胰島素藥效和/或抗原性，
B鏈(續(xù))Phe-Tyr-T-Pro-Lys-X-Y252627282930式中E各表示Glu或能由核苷酸順序編碼的天然氨基酸殘基，N表示能由核苷酸順序編碼的氨基酸殘基，T表示Thr或Arg，X表示Thr，Ser，Ala或OH，Y表示OR或NR1R2，其中R，R1和R2各表示氫或低級(jí)烷基，但當(dāng)X表示OH時(shí)Y不存在。
因此，本發(fā)明涉及具有通式Ⅱ的胰島素化合物
B鏈(續(xù))Phe-Tyr-T-Pro-Lys-X-Y252627282930式中E各表示Glu或能由核苷酸順序編碼的天然氨基酸殘基，N表示能由核苷酸順序編碼的氨基酸殘基，T表示Thr或Arg，X表示Thr，Ser，Ala或OH，Y表示OR或NR1R2，其中R，R1和R2各表示氫或低級(jí)烷基，但當(dāng)X表示OH時(shí)Y不存在。
本文中所述“低級(jí)烷基”意指包括1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基。
本發(fā)明具體涉及式Ⅱ的胰島素化合物，其中E各表示Glu或Gln，N表示Asn，Asp，Ser或Gly，T表示Thr或Arg，X表示Thr和Y表示NH2。
本發(fā)明更涉及式Ⅱ的胰島素化合物，其中當(dāng)Y表示OH時(shí)，E，N和T中至少有1個(gè)表示不同于人胰島素相應(yīng)殘基的氨基酸殘基。
本發(fā)明特別涉及式Ⅱ的胰島素化合物，其中E均表示Glu，N表示Asn，T和X均表示Thr，Y表示NH2。
本發(fā)明特別涉及式Ⅱ的胰島素化合物，其中E均表示Glu，N表示Ser，R和X均表示Thr，Y表示NH2。
本發(fā)明特別涉及式Ⅱ的胰島素化合物，其中在B13位上的E表示Gln，其余的E均表示Glu，N表示Asn，T和X均表示Thr，Y表示NH2。
本發(fā)明特別涉及式Ⅱ的胰島素化合物，其中A4位上的E表示Gln，其余的E均表示Glu，N表示Asp，T和X均表示Thr，Y表示NH2。
本發(fā)明特別涉及式Ⅱ的胰島素化合物，其中E均表示Glu，N表示Asn，T表示Arg，X表示OH。
本發(fā)明還涉及制備式Ⅱ胰島素化合物的方法，該方法是將通式Ⅲ的胰島素前體通過(guò)轉(zhuǎn)肽作用或由對(duì)賴氨酸殘基的羧端裂解具有唯一特異性的肽鏈內(nèi)切酶進(jìn)行裂解。通式Ⅲ如下
式中E，N和T的含意如上所述，(AA)n表示具有C端殘基為L(zhǎng)ys和n氨基酸殘基的肽鏈，或n＝0時(shí)表示肽鍵，Z表示氫或具有C端殘基為L(zhǎng)ys的任意長(zhǎng)度的肽鏈。
本發(fā)明還涉及胰島素制劑，其至少含有一種式Ⅱ胰島素化合物，還可任意含有速效胰島素，例如人胰島素、家畜胰島素，或其衍生物或類似物。這類制劑可以是一種待用溶液或可在使用前用無(wú)菌水配制的冷凍干燥制劑。
本發(fā)明胰島素制劑的一個(gè)具有特殊優(yōu)點(diǎn)的例子是一種腸胃施用的長(zhǎng)效制劑，含有至少一種本發(fā)明的胰島素化合物的水溶液，與血清等滲壓，pH2-5.5，可任意含有緩沖液和/或防腐劑，如果需要，還可含速效胰島素。
本發(fā)明胰島素化合物由于對(duì)人胰島素分子略為作了改變，且均為人體所常見，或已經(jīng)過(guò)了幾年的試驗(yàn)，都未發(fā)現(xiàn)引起免疫反應(yīng)，因此可以滿足糖尿病專家們的要求。本發(fā)明胰島素化合物的主要特征在于它們能如人胰島素那樣描述，其中精氨酸殘基與N端和A鏈連接，而其B鏈的C端羧基以酰胺形式封阻。人們總是把胰島素化合物溶解于弱酸溶液中來(lái)使用，而在這些條件下，21位上的天冬酰胺殘基能夠在制劑貯存期內(nèi)產(chǎn)生明顯脫酰氨基作用，從而減弱長(zhǎng)效作用。通過(guò)用谷氨酰胺取代1個(gè)或可能2個(gè)谷氨酸殘基，則這種影響就能被控制。
在胰島素依賴糖尿病的治療中，常用治療量為每天注射2次長(zhǎng)效胰島素制劑，即早餐和晚上睡前各1次，以保持基本的胰島素水平。另外，在主餐前再注射3次速效胰島素制劑。這種治療的缺點(diǎn)在于第二次注射長(zhǎng)效胰島素制劑可導(dǎo)致夜間低血糖危險(xiǎn)。這種危險(xiǎn)通過(guò)飯前注射長(zhǎng)效和速效胰島素混合制劑可予以避免，即使在晚間會(huì)發(fā)生低血糖反應(yīng)，則吃些小吃也就能克服。但是這種治療方法往往會(huì)在早晨引起高血糖，如廣泛使用的長(zhǎng)效胰島素制劑“遲緩胰島素”(Insulatard )和“單緩胰島素”(Monotard )沒有足夠長(zhǎng)的作用時(shí)間。因此，需要為糖尿病患者提供作用時(shí)間長(zhǎng)于目前一般所使用的制劑的胰島素制劑，尤其是提供一種注射1次能夠作用一天甚至幾天的制劑。按本發(fā)明制備的胰島素制劑，比一般所用的長(zhǎng)效胰島素制劑“單緩胰島素”具有更長(zhǎng)的胰島素作用時(shí)間。
本發(fā)明較佳的胰島素化合物用作溶液制劑時(shí)具有特殊的優(yōu)點(diǎn)，因其在pH約5左右時(shí)(在此pH值時(shí)，脫酰氨顯著較低)，溶解度較高，甚至在皮下注射后，仍具有長(zhǎng)效作用。
本發(fā)明特別涉及下列具體的化合物〔ArgAO〕-人胰島素(B30-酰胺)，〔ArgAO，GlnB13〕-人胰島素-(B30-酰胺)，〔ArgAO，GlnA4，AspA21〕-人胰島素-(B30-酰胺)，〔ArgAO，SerA21〕-人胰島素-(B30-酰胺)，〔ArgAO，ArgB27〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素。
本發(fā)明的胰島素化合物可采用化學(xué)合成方法，從在其他胰島素分子A鏈的N端上引入另一個(gè)精氨酸殘基進(jìn)行制備，但困難很大。一個(gè)更吸引人的方法就是單鏈前體的酶催化轉(zhuǎn)化，例如天然胰島素原或前胰島素原或生物合成制備的通式Ⅲ的前體
式中E，N和T的含意如式Ⅱ所述，(AA)n表示具有n氨基酸殘基并且C端殘基為L(zhǎng)ys的肽鏈，但當(dāng)n＝0時(shí)則表示肽鍵;
Z表示氫或C端殘基為L(zhǎng)ys的任意長(zhǎng)度的肽鏈。
用于酶轉(zhuǎn)化的酶應(yīng)是能在賴氨酸殘基羧端上裂解肽鏈的類似胰蛋白酶的肽鏈內(nèi)切酶。胰蛋白酶本身經(jīng)常可以使用，但是對(duì)賴氨酸具有專一性的肽鏈內(nèi)切酶則特別有利，例如由溶菌酶原(Lysobucterenzymog-enes)(BoehringerMannheim)得到的蛋白內(nèi)切酶Lys-C或由裂解無(wú)色桿菌(Achromobacterlyticus)(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.)得到的賴氨酸肽鏈內(nèi)切酶。
反應(yīng)可以按類似于歐洲專利公報(bào)EP-163529所述條件，通過(guò)用蘇氨酸酰胺的轉(zhuǎn)肽作用完成，由此直接產(chǎn)生B30酰胺;但是也能采用兩步反應(yīng)完成，開始用酶解離，生成脫(ThrB30)化合物，再經(jīng)Morihara等(同上)所述偶合反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為B30-酰胺。
本發(fā)明胰島素化合物的前體可通過(guò)生物合成方法，在表達(dá)編碼前體的DNA順序的酵母宿主產(chǎn)生。
為了分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，可將編碼胰島素前體的DNA順序融合到另一個(gè)編碼酵母中的信號(hào)肽功能的DNA順序中。通過(guò)插入到釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)MFα1-前導(dǎo)順序即可分泌(Kurjan&Herskowitz，Cell，30，933-943，1982)。在較佳的構(gòu)建中，采用編碼包括二基部位LysArg的整個(gè)MFα1-前導(dǎo)順序的DNA順序，但不包括用作酵母蛋白酶DPAP(二肽氨基肽酶)底物的肽順序GluAlaGluAla。這樣就能獲得具有校正N端的胰島素前體的有效分泌。
編碼修飾胰島素前體的DNA順序是通過(guò)在表達(dá)盒上離體誘變進(jìn)行構(gòu)建的，該表達(dá)盒包含在表達(dá)質(zhì)粒pYGABA的BamHI限制性片段中(如

圖1所示)。質(zhì)粒在酵母中含有選擇標(biāo)記物和復(fù)制信號(hào)功能和具有1103bp的長(zhǎng)度。按Bitter和Egan所述，BamHI片段含有包括-389至-1位的啟動(dòng)子順序的GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氨酶)下游區(qū)(Gene，32，1984，263-274)，并將其加到下游區(qū)BamHI連接子的5′端，將該啟動(dòng)子順序直接融合到如Kurjan和Herskowitz所述的編碼MFα1-前導(dǎo)順序的85N-端氨基酸的順序。MFα1-前導(dǎo)順序直接與胰島素前體單鏈脫〔ThrB30〕L胰島素(SCT)的編碼順序融合，它是人工合成的構(gòu)建基因，具有下列順序TTCGTTAACCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGT-AAGCAATTGGTTGTGAACACACCAAGAGTGAACCAACTTCGAAACATGAACCAAACACCA-PheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGly-GAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGGGTATTGTTGAACAATGTTGTACTTCTATTTGT-CTTTCTCCAAAGAAGATGTGAGGTTTCCCATAACAACTTGTTACAACATGAAGATAAACA-GluArgGlyPhePheTyrThrProLysGlyIleValGluGlnCysCysThrSerIleCys-SalITCTTTGTACCAATTGGAAAACTACTGTAACTAATAGCGTCGAGAAACATGGTTAACCTTTTGATGACATTGATTATCGCAGCAGCTSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsn終點(diǎn)終點(diǎn)如上所述，胰島素前體基因的轉(zhuǎn)譯末端具有2個(gè)終止密碼子，其后緊接著SalI限制位點(diǎn)。如歐洲專利公報(bào)No.0116201Al所述，終此區(qū)與SalI-BamHI限制片段相同。順序的構(gòu)建完全采用常規(guī)技術(shù)。
所用誘變方法系Zoller和Smith所述的“寡核苷酸控制誘變”法(DNA，Vol.3，NO.6，479-488，1984)。該方法將在下面作扼要說(shuō)明并在實(shí)施例1中給予更詳盡地介紹。將由表達(dá)質(zhì)粒中分離得到的胰島素前體順序插入到單鏈環(huán)狀M13噬菌體載體中。將化學(xué)合成的互補(bǔ)DNA鏈與單鏈基團(tuán)組對(duì)合。DNA鏈含有所需順序，其外層是與環(huán)狀DNA的胰島素順序完全相同的順序。然后以生物化學(xué)上所用的克列諾夫聚合酶將引物加到全長(zhǎng)的環(huán)狀基團(tuán)組上。這個(gè)雙鏈就形成單鏈的噬菌體，當(dāng)其在大腸桿菌中生長(zhǎng)時(shí)，就有可能得到具有所需順序的隔離雙鏈DNA。由該雙鏈DNA中可分離到限制片段，然后再將該片段插入到表達(dá)載體中。
下面參考附圖將更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。
圖1表示表達(dá)質(zhì)粒pYGABA14276，圖2表示酵母載體pAB24，圖3表示皮下貯存的胰島素的吸收。
以下的實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例Ⅰ可用于表達(dá)前體B(1-29)-AKR-A(1-21)的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pYGABA(圖1)的BamHI限制性片段上表達(dá)合的分離將表達(dá)質(zhì)粒與核酸內(nèi)切限制酶BamHI一起溫育。條件20μg質(zhì)粒，50單位BamHI，100mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2和1mM DTT，配制成100μl。溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)。在1%瓊脂糖凝膠上將2個(gè)DNA片段進(jìn)行分離，得到所需要的片段。
M13載體M13mp18的連接將分離得到的限制性片段連接噬菌體載體M13mp18，并在下列反應(yīng)混合物中用核酸內(nèi)切限制酶BamHI切斷0.2μg片段，0.02μg載體，50mMTris-HCl，pH7.4，10mMMgCl，10mMDTT和1mMATP，配制成20μl。將5μl該混合物移到大腸桿菌JM101中。片段在載體中的存在及其取向借助由轉(zhuǎn)化株分離得到雙連M13-DNA的限制酶圖予以測(cè)定。
單鏈(ss)DNA(模板)的分離按Messing所述方法(Gene，19，269-272，1982)，從上述轉(zhuǎn)化株分離出ss-DNA。
誘變引物的5′磷酸化具有順序5′-CAACAA TACCTCTCTTAGCCTTTGGAGTG-3′的誘變引物，其5′端的磷酸化是在含有70mM Tris-HCl，pH7.0，10mM MgCl2，5mM DTT，1mM ATP，100pmol寡核苷酸和3.6單位的T4多核苷酸激酶的30μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行的。在37℃下反應(yīng)30分鐘，然后在65℃下將混合物溫育10分鐘使酶失活。
模板與磷酸化的誘變引物的對(duì)合模板和引物在10μl含有0.5pmol模板，5pmol引物，20mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM DTT中，先在65℃下加溫10分鐘，然后冷卻至0℃進(jìn)行對(duì)合。
擴(kuò)大/連接反應(yīng)在所述制備的反應(yīng)混合物中，加入10μl下述混合物0.3mM dATP，0.3mM dCTP，0.3mM dGTP，0.3mM TTP，1mM ATP，20mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，10mM DTT，3單位T4 DNA連接酶和2.5單位克列諾夫聚合酶。反應(yīng)在16℃下進(jìn)行16小時(shí)。
JM101的轉(zhuǎn)化用常規(guī)技術(shù)將上述反應(yīng)混合物以不同的稀釋度移入經(jīng)CaCl2處理過(guò)的大腸桿菌JM101細(xì)胞中，并以2×YT topagar涂在2×YT瓊脂平板上(2×YT＝16克胰蛋白酶胨/升，酵母膏10g/l，NaCl5g/l。2×YT topagar＝2×YT和0.4%瓊脂糖，并經(jīng)高壓滅菌。2×YT瓊脂板＝2×YT和2%瓊脂，并經(jīng)高壓滅菌)。瓊脂板在37℃下溫育過(guò)夜。
正克隆的鑒定采用空斑雜交的方法，即將硝化纖維素過(guò)濾器置于載有適當(dāng)密度的噬菌體的平板上，使濾紙濕潤(rùn)。然后將濾紙放在下述溶液中浸潤(rùn)處理在1.5MNaCl，0.5MNaOH中30秒鐘;在1.5MNaCl，0.5MTris-HCl，pH8.0中1分鐘，在2×SSC(0.3MNaCl，0.03M檸檬酸鈉)中浸至以后使用。過(guò)濾器在3MM濾紙上干燥，并在80℃真空爐中烘2小時(shí)。
具有順序5′-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGAGTG-3′的誘變引物，其5′端用放射性標(biāo)記，所用30μl放射性標(biāo)記物中含有70mMTris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，5mM DTT，10pmol寡核苷酸，20pmolγ32-P-ATP和3.5單位的T4多核苷酸激酶。混合物在37℃下溫育30分鐘，然后在100℃下保持5分鐘。
干燥濾紙?jiān)?5℃下，于6×SSC，0.2%牛血清白蛋白，0.2%聚蔗糖，0.2%聚乙烯吡咯烷酮，0.2%十二烷基硫酸鈉(SDS)和50μg/ml鮭魚精子DNA預(yù)雜交2小時(shí)。然后將含有標(biāo)記試樣的反應(yīng)混合物加到15ml新鮮的預(yù)雜交混合物，濾紙?jiān)?0℃和緩和搖動(dòng)下浸泡過(guò)夜。雜交后，濾紙?jiān)?×SSC+0.1%SDS中洗滌3次，每次15分鐘，然后進(jìn)行放射自顯影。又在62℃相同溶液中洗滌后，再次進(jìn)行放射自顯影，證明含DNA順序的空斑已經(jīng)互補(bǔ)。
正克隆的再篩選由于所鑒定的克隆是異源雙鏈的結(jié)果，所以再次將空斑涂在平板上，重復(fù)雜交和鑒定。
雙鏈M13噬菌體DNA的純化將經(jīng)過(guò)重復(fù)篩選的克隆用于感染大腸桿菌JM101。含有大約108空斑和5個(gè)JM101菌落的培養(yǎng)物在37℃下于5ml 2×YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)5小時(shí)，然后按Birnboim和Doly所述方法(Nucleic Acids Res.，2，1513，1979)由碎片中純化得到雙鏈環(huán)狀DNA。
含修飾胰島素前體的限制性片段的分離在37℃下將大約5μg上述分離到的DNA制劑用10單位核酸內(nèi)切限制酶BamHI于60μl 100mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2和1mM DTT中消化2小時(shí)。在瓊脂糖凝膠上分離DNA產(chǎn)物，從凝膠中純化得到片段。
酵母載體pAB24的連接(圖2)將分離到的限制性片段在含有片段0.2μg，載體0.02μg 50mM Tris-HCl，pH7.4，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP(總體積為20μl)的反應(yīng)混合物中，連接到經(jīng)核酸內(nèi)切限制酶BamHI消化過(guò)的酵母載體pAB24上。將5μl該反應(yīng)混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061，鑒定其中修飾過(guò)的表達(dá)質(zhì)粒。該質(zhì)粒命名為pYGAB-AKR-A，除了所加密碼子外，與pYGABA相同。
酵母的轉(zhuǎn)化按Ito等所述方法(J.Bact.Vol.153，No.1，163-168，1983)，將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到釀酒酵母JC482∧pep∧Leu2cir°(α，his4，pep4，ura3，leu2，cir°)中。再將轉(zhuǎn)化細(xì)胞置于SC-ura培養(yǎng)基(0.7%酵母氮堿，2.0%葡萄糖，0.5%酪蛋白氨基酸，2.0%瓊脂)上，選擇含質(zhì)粒的細(xì)胞。
實(shí)施例Ⅱ可用于產(chǎn)生前體B(1-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(1-21)的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建使用方法基本上與實(shí)施例1相同，不同之處在于誘變引物的順序?yàn)?′CAACAATACCTCTCTTAGAACCCTTTGGAGTG-3′，雜交溫度42℃，雜交后的洗滌溫度64℃。修飾過(guò)的質(zhì)粒的順序除了加有密碼子外，與pYGABA的順序相同。
實(shí)施例Ⅲ可用于產(chǎn)生前體〔GlnB13〕-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建采用的方法基本上與實(shí)施例1相同，不同之處在于所用模板是克隆M13中pYGAB-AKR-A的BamHI合得到的，誘變引物的順序?yàn)?′-GTACAAAGCTTGAACCAAGTG-3′，雜交溫度31℃，雜交后的洗滌溫度53℃。修飾質(zhì)粒的順序除了交替和所加的密碼子外，與pYGABA的順序相同。
實(shí)施例Ⅳ可用于產(chǎn)生前體〔GlnA4，ASPA21〕-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建采用的方法基本上與實(shí)施例1相同，不同之處在于所用模板是克隆M13中pYGAB-AKR-A的BamHI合得到的，而且用兩步法誘變。第一步中的引物是5′-ACAACATTGTTGAACAATACC-3′，雜交溫度27℃，雜交后的洗滌溫度49℃;第二步中的引物是5′-CGCTATTAGTCAGTACTTT-3′，雜交溫度29℃，雜交后的洗滌溫度51℃。修飾質(zhì)粒的順序除了交替和所加密碼子外，與pYGABA的順序相同。
實(shí)施例Ⅴ可用于產(chǎn)生前體〔SerA21〕-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建采用的方法基本上與實(shí)施例1相同，不同之處在于所用模板是克隆M13中pYGAB-AKR-A的BamHI合得到的，誘變引物的順序?yàn)?′-GACGCTATTAAGTACAGTAGT-3′，雜交溫度29℃，雜交后的洗滌溫度51℃。修飾質(zhì)粒的順序除了交替和所加密碼子外，與pYGABA的順序相同。
實(shí)施例Ⅵ可用于產(chǎn)生前體〔ArgB27〕-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A-(1-21)的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建采用的方法基本與實(shí)施例1相同，不同之處在于所用模板是克隆M13中pYGAB-AKR-A的BamHI合得到的，誘變引物的順序?yàn)?′-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGTCTGTAGAAGA-3′，雜交溫度43℃，雜交后的洗滌溫度65℃。修飾質(zhì)粒的順序除了交替和所加密碼了外，與pYGABA的順序相同。
實(shí)施例Ⅶ前體的表達(dá)和由培養(yǎng)基中進(jìn)行分離將如實(shí)施例Ⅰ-Ⅵ所述轉(zhuǎn)化的酵母，在30℃下，在含基本培養(yǎng)基(無(wú)尿嘧啶)的陪替氏平板上繁殖48小時(shí)。從該陪替氏平板中取出單個(gè)菌落接種到含有基本培養(yǎng)基(無(wú)尿嘧啶)+酪蛋白氨基酸5g/l+琥珀酸10g/l+葡萄糖30g/l的100ml搖瓶中，pH5.0。將搖瓶在30℃下和培養(yǎng)箱中搖動(dòng)培養(yǎng)72小時(shí)。
離心后，將1升沉淀過(guò)的上清液經(jīng)過(guò)濾滅菌，加入5M HCl和水將pH調(diào)至4-4.5，導(dǎo)電率為＜10mS。先用50mM乙酸和用NaOH將pH調(diào)至4.0的50%(體積)乙醇平衡1.6×6cm的S-Sepharose FF層析柱，然后以120毫升/小時(shí)的流速流經(jīng)該層析柱，用60ml緩沖液洗滌該柱，0-0.35M線性梯度的360ml NaCl緩沖溶液洗脫前體，流速為10毫升/小時(shí)。洗脫液分成4ml等份，進(jìn)行紫外光吸收率測(cè)定。含有前體的餾份經(jīng)RP-HPLC分析鑒定和沉淀，用1M乙酸在Sephadex G25柱上脫鹽后，經(jīng)冷凍干燥分離得到前體。
實(shí)施例Ⅷ由前體B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)制備〔ArgAO〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素在4℃下，將按實(shí)施例Ⅰ和Ⅶ的方法制備的B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)250mg溶解于25ml 50mM tris-(羥基甲基)氨基甲烷和用鹽酸將pH調(diào)至10的20%(體積)乙醇中。含有0.8mg固相胰蛋白酶/ml的Sepharose
用相同的緩沖液在玻璃漏斗上洗滌和排液。將緩沖液加到40g排液的凝膠上，將體積調(diào)至75ml。將含有前體的溶液加到懸浮液中，混合物在4℃下，緩和攪拌1小時(shí)后過(guò)濾。
HPLC分析證明61%轉(zhuǎn)化為〔ArgAO〕-脫-〔ThrB30〕-人胰島素。
用50ml緩沖液(不含乙醇)洗滌凝膠并排液，將沉淀的過(guò)濾液的pH調(diào)至6后，使其中的蛋白質(zhì)沉淀。通過(guò)離心和冷凍干燥分離沉淀物。
將4℃下，將沉淀物溶解于pH調(diào)至8.1的20ml 7M尿素中，并將溶液裝在1.6×20cm的Q-Sepharose
FF層析柱上，層析柱事先在4℃下用20mM tris-(羥基甲基)氨基甲烷和用HCl將pH調(diào)至8.1的7M尿素進(jìn)行平衡。以0mM至50mM線性梯度的NaCl緩沖液(緩沖液與上相同)和按40毫升/小時(shí)的流速，洗脫層析柱24小時(shí)。洗脫液用紫外光吸收進(jìn)行檢測(cè)，收集2個(gè)主峰的第一次洗脫液。沉淀物用1M乙酸在Sephadex
G25柱上脫鹽后，冷凍干燥，得到75mg〔ArgAO〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素。
產(chǎn)物的鑒定經(jīng)氨基酸分析，等離子體吸收質(zhì)譜以及分開的乙烯吡啶基化的A鏈和B鏈的Edman順序降解方法得到證實(shí)。
實(shí)施例Ⅸ由前體B(1-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(1-21)制備〔ArgAO〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素將按實(shí)施例Ⅱ和Ⅶ的方法制備的B(1-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(1-21)400mg溶解于50ml的50mM tris-(羥基甲基)-氨基甲烷和用HCl將pH調(diào)至10的20%(體積)乙醇中。含有0.8g固相胰蛋白酶/ml的Sepharose 用相同緩沖液在玻璃漏斗上洗滌并排液，將緩沖液加到排去液體的80g凝膠中，體積調(diào)至150ml。將含前體的溶液加到懸浮液上，混合物在20℃下緩和攪拌30分鐘后過(guò)濾。
HPLC分析證明，50%轉(zhuǎn)化為〔ArgAC〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素。
凝膠用100ml緩沖液(不含乙醇)洗滌并排液，將pH調(diào)至6沉淀出沉淀濾液中的蛋白質(zhì)，經(jīng)離心和冷凍干燥分離沉淀物。
在4℃下通過(guò)pH調(diào)至8.1，將沉淀物溶解在20ml 7M尿素中，再將該溶液裝在1.6×20cm的Q-Sepharose FF層析柱上，層析柱事先在4℃下用20mM tris-(羥基甲基)氨基甲烷和經(jīng)HCl將pH調(diào)至8.1的7M尿素平衡。用0mM至50mM線性梯度的NaCl緩沖液(用相同的緩沖液)以40毫升/小時(shí)流速洗脫層析柱24小時(shí)。洗脫液經(jīng)紫外光吸收檢測(cè)，收集兩個(gè)主峰的第一洗脫液。沉淀物在Sephadex G25柱上用1M乙酸脫鹽后冷凍干燥。得到145mg的〔ArgAO〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素。
產(chǎn)物的鑒定經(jīng)用氨基酸分析，HPLC分析和Edman順序降解等方法得到證實(shí)。
實(shí)施例Ⅹ由豬胰島素原制備〔ArgAO〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素40mg豬胰島素原溶解于800μl0.1MHCl中，加入8ml50mMtris-(羥基甲基)氨基甲烷。制備1單位由溶菌酶原(Lysobacterenzym-ogenes)(BoehringerMannheim)得到的蛋白內(nèi)切酶Lys-C于用HCl將pH調(diào)至8.5的200μl0.1Mtris-(羥基甲基)氨基甲烷的溶液中。將2個(gè)溶液混合并在12℃下放置16小時(shí)。
通過(guò)加1.8ml96%乙醇后將pH調(diào)至6.2終止反應(yīng)，生成的懸浮液在4℃下放置過(guò)夜。將離心分離到的沉淀物再在4℃下溶解于pH調(diào)至8.1的2ml 7M尿素中。將該溶液裝在1.6×20cm Q-Sepharose
FF層析柱上，該層析柱事先用20mM tris-(羥基甲基)氨基甲烷和用HCl將pH調(diào)至8.1的7M尿素。用0mM至50mM線性梯度的NaCl緩沖溶液(相同的緩沖液)以40ml/小時(shí)的流速洗脫層析柱24小時(shí)。洗脫液經(jīng)紫外光吸收檢測(cè)，收集主峰洗脫液，沉淀物用1M乙酸在Sephadex
G25層析柱上脫鹽，冷凍干燥后得到15mg的〔ArgAO〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素。
產(chǎn)物的鑒定經(jīng)氨基酸分析，HPLC分析和Edman順序降解等方法得到證實(shí)。
實(shí)施例Ⅺ〔ArgAO〕-人胰島素-(B30-酰胺)的制備將按實(shí)施例Ⅷ至Ⅹ之一的方法制備的〔ArgAO〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素200mg溶解于400mg蘇氨酰胺，2.0ml乙醇和0.8ml水的混合物中，用乙酸將pH調(diào)至6.3，加入含有3.2mg固相胰蛋白酶的4ml(沉降)體積的Sepharose
。在20℃下緩和攪拌2小時(shí)后，濾去凝膠，加入10體積2-丙醇沉淀出蛋白質(zhì)。將風(fēng)干的沉淀物在4℃下溶解于pH調(diào)至8.1的20ml 7M尿素中，然后將該溶液裝在1.6×20cm的Q-Sepharose
FF層析柱上，該層析柱事先在4℃下用20mM tris-(羥基甲基)氨基甲烷和經(jīng)HCl將pH調(diào)至8.1的7M尿素中平衡。用0mM至50mM線性梯度NaCl緩沖溶液(相同的緩沖液)和40ml/小時(shí)流速洗脫層析柱24小時(shí)。洗脫液經(jīng)紫外光檢測(cè)，收集主峰洗脫液。沉淀物用1M乙酸在Sephadex
G25柱上脫鹽，冷凍干燥后得到80mg的〔ArgAO〕-人胰島素-(B30-酰胺)。
產(chǎn)物的鑒定經(jīng)氨基酸分析，等離子體吸收質(zhì)譜和Edman順序降解等方法得到證實(shí)。
實(shí)施例Ⅻ〔GlnB13，ArgAO〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素的制備將按實(shí)施例Ⅲ和Ⅶ方法制備的〔GlnB13〕-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)250mg與固相胰蛋白酶反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物基本按實(shí)施例Ⅷ的方法純化，得到60mg的〔GlnB13，ArgAO〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素。
產(chǎn)物的鑒定經(jīng)氨基酸分析，等離子體吸收質(zhì)譜和Edman順序降解等方法得到證實(shí)。
實(shí)施例ⅩⅢ〔GlnA4，AspA21，ArgAO〕-人胰島素-(B30-酰胺)的制備將按實(shí)施例Ⅳ和Ⅶ的方法制備的〔GlnA4，AspA21〕-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)500mg與固相胰蛋白酶反應(yīng)，生成的產(chǎn)物基本按實(shí)施例Ⅷ的方法純化，得到175mg的〔GlnA4，AspA21，ArgAO〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素。
將上述產(chǎn)物按實(shí)施例Ⅺ方法，與蘇氨酰胺偶合，轉(zhuǎn)化為B30-酰胺。得到50mg的純〔GlnA4，AspA21，ArgAO〕-人胰島素-(B30-酰胺)。
產(chǎn)物的鑒定經(jīng)氨基酸分析，等離子體吸收質(zhì)譜和Edman順序降解等方法得到證實(shí)。
實(shí)施例ⅩⅣ〔SerA21，ArgAO〕-人胰島素-(B30-酰胺)的制備將按實(shí)施例Ⅴ和Ⅷ的方法制備的〔SerA21〕-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)400mg與固相胰蛋白酶反應(yīng)，生成的產(chǎn)物基本按實(shí)施例Ⅷ的方法純化，得到125mg的〔SerA21，ArgAO〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素。
將上述產(chǎn)物按實(shí)施例Ⅺ的方法，與蘇氨酰胺偶合，轉(zhuǎn)化成B30-酰胺，得到40mg的純〔SerA21，ArgAO〕-人胰島素-(B30-酰胺)。
產(chǎn)物的鑒定經(jīng)氨基酸分析，等離子體吸收質(zhì)譜和Edman順序降解等方法得到證實(shí)。
實(shí)施例ⅩⅤ〔ArgB27，ArgAO〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素的制備將按實(shí)施例Ⅵ和Ⅶ的方法制備的〔ArgB27〕-B-(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)250mg與固相胰蛋白酶反應(yīng)，生成的產(chǎn)物基本按實(shí)施例Ⅷ的方法純化，得到50mg的〔ArgB27，ArgAO〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素。
產(chǎn)物的鑒定經(jīng)氨基酸分析和Edman順序降解等方法得到證實(shí)。
實(shí)施例ⅩⅥ含溶解的〔ArgAO〕-人胰島素-(B30-酰胺)的長(zhǎng)效注射劑的配制將60μmol的〔ArgAO〕-人胰島素-(B30-酰胺)溶解于4ml 0.1M HCl中，加入20ml 1.5%m-甲酚。該溶液與70ml 1%NaCl和3.25ml 0.1M ZnCl2混合，pH調(diào)至40，用水將最終體積調(diào)至100ml，過(guò)濾滅菌。
實(shí)施例ⅩⅦ含〔ArgAO〕-人胰島素-(B30-酰胺)結(jié)晶懸浮液的長(zhǎng)效注射劑的配制將60μmol的〔ArgAO〕-人胰島素-(B30-酰胺)溶解于含0.5%m-苯酚的70ml 1% NaCl溶液中，用1M NaOH將pH調(diào)至9.7，加入325μl 0.1M乙酸鋅。再將pH調(diào)至9.7后用水將體積調(diào)至80ml，溶液經(jīng)過(guò)濾滅菌。
含有0.3%m-苯酚的20ml 65mM NaH2PO4，用NaOH調(diào)pH至6.0，過(guò)濾滅菌。
在無(wú)菌條件下，將兩種溶液混合，生成的懸浮液在20℃下非常緩和地?cái)嚢?小時(shí)，最后用HCl將pH調(diào)至7.3。
實(shí)施例ⅩⅧ大鼠皮下注射后經(jīng)外部γ計(jì)數(shù)測(cè)定長(zhǎng)效作用采用體重約250g和90天令以上的Wistar雌鼠作為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)前使大鼠適應(yīng)環(huán)境約一周并且隨意進(jìn)食。試驗(yàn)前4天，用20mM碘化鉀水溶液作為大鼠的飲用水。
所用的試驗(yàn)制劑如下1.含有〔ArgAO〕-人胰島素-(B30-酰胺)并按實(shí)施例ⅩⅦ制備的懸浮劑。
2.含有〔ArgAO〕-人胰島素-(B30-酰胺)并按實(shí)施例ⅩⅥ制備的溶液制劑。
3.含有半合成的人胰島素(Velosulin
，100單位/ml)的速效溶液制劑。
另外，上述三種制劑還各含有50微居里/毫升的〔單-125Ⅰ〕胰島素或〔單-125Ⅰ〕-胰島素化合物示蹤物，按常規(guī)放射性碘方法制備。
在大鼠腿的背部皮下注射50μl含有3.5nmol胰島素化合物和2.5微居里〔125Ⅰ〕標(biāo)記示蹤物，試驗(yàn)期間，將大鼠固定在夾鼠器中。
注射部位是吸收皮下貯存的胰島素的測(cè)量范圍(C.BinderAbsorp-tionofInjectedInsulin.Munksgaard，Copenhagen1969)。測(cè)量注射部位示蹤物的消失是用2個(gè)固定的MIP-10輻射強(qiáng)度測(cè)量?jī)x和裝有3mmNaI窗式閃爍晶體管的檢測(cè)器E749和60°視角10mm視野的照準(zhǔn)儀(Raytronic)。輻射強(qiáng)度測(cè)量?jī)x與微型記錄器121N(Raytronic)聯(lián)結(jié)。檢測(cè)器固定在注射部位皮膚上部2cm。在注射制劑后的0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，4.5，6，8，12和14小時(shí)，測(cè)量5分鐘的放射性強(qiáng)度。扣除本底計(jì)數(shù)后，將計(jì)數(shù)值轉(zhuǎn)換成起始計(jì)數(shù)值的百分比。
圖3中，殘余的放射性的平均值表示為各制劑的時(shí)間函數(shù)。取50%殘余放射性(T50%)的時(shí)間為長(zhǎng)效測(cè)量值，由曲線得到T50%制劑Ⅰ＞12小時(shí)制劑Ⅱ≈8小時(shí)制劑Ⅲ≈0.5小時(shí)上述結(jié)果說(shuō)明與速效人胰島素制劑相比，含有〔ArgAO〕-人胰島素-(B30-酰胺)的兩個(gè)制劑具有長(zhǎng)效作用。
實(shí)施例ⅩⅨ含有〔ArgAO，ArgB27〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素溶液的長(zhǎng)效注射劑的配制將12μmol〔ArgAO，ArgB27〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素溶解于含有0.5%m-苯酚經(jīng)1M HCl將pH調(diào)至3.5的35ml 1% NaCl溶液，加入650μl 0.1M乙酸鋅，再將pH調(diào)至3.5，用水將體積調(diào)至50ml，溶液經(jīng)過(guò)濾滅菌。
實(shí)施例ⅩⅩ兔子皮下注射后測(cè)定長(zhǎng)效作用按照British Pharmacopoeia(1980)所述方法，測(cè)定含有按實(shí)施例ⅩⅨ方法制備的〔ArgAO，ArgB27〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素0.24mM的溶液制劑在兔體內(nèi)的長(zhǎng)效量。將65μl制劑皮下注射到6個(gè)兔子中，在注射時(shí)和注射后的1，2，4和6小時(shí)，采集血樣測(cè)定血糖水平。血糖值用注射前血糖值的百分率表示。
測(cè)定結(jié)果得到如下平均值注射后的時(shí)間0小時(shí)1小時(shí)2小時(shí)4小時(shí)6小時(shí)開始時(shí)的%血糖值100%68.2%65.0%80.1%79.4%按J.Markussen等所述方法(Protein Engineering，Vol.1，No.3，pp.205-213，1987)測(cè)定長(zhǎng)效指數(shù)，計(jì)算得到的值為42，與表1(文獻(xiàn)同上)結(jié)果相比，含有〔ArgAO，ArgB27〕-脫〔ThrB30〕-人胰島素的溶液制劑具有與普遍在使用的長(zhǎng)效鋅胰島素懸浮液制劑Actrapid Human同樣的長(zhǎng)效作用。
權(quán)利要求
1.制備胰島素制劑的方法，包括將作為活性組份的通式Ⅱ的至少一種胰島素化合物溶解在與血清相等滲壓的水介質(zhì)中，溶液的pH值為2至5.5，
B鏈(續(xù))Phe-Tyr-T-Pro-Lys-X-Y252627282930式中E各表示Glu或能由核苷酸順序編碼的天然氨基酸殘基，N表示能由核苷酸順序編碼的氨基酸殘基，T表示Thr或Arg，X表示Thr，Ser，Ala或OH，Y表示OR或NR1R2，其中R，R1和R2各表示氫或低級(jí)烷基，但當(dāng)X表示OH時(shí)Y不存在，其中通式Ⅱ的胰島素化合物的制備方法包括將通式Ⅲ的胰島素前體通過(guò)轉(zhuǎn)肽作用或由對(duì)賴氨酸殘基的羧端裂解具有唯一特異性的肽鏈內(nèi)切酶進(jìn)行裂解，
式中E，N和T的含意如上所述，(AA)n表示具有C端殘基為L(zhǎng)ys和n氨基酸殘基的肽鏈，或n=0時(shí)表示肽鍵，Z表示氫或具有C端殘基為L(zhǎng)ys的任意長(zhǎng)度的肽鏈。
2.按權(quán)利要求1的方法，在制劑中可任意含有緩沖液和/或防腐劑和速效胰島素。
3.按權(quán)利要求2的方法，其中所述速效胰島素系人胰島素，家畜胰島素或它們的衍生物或類似物。
4.按權(quán)利要求1的方法，其中式Ⅲ中的E各為Glu或Gln，N為Asn，Asp，Ser或Gly，T為Thr或Arg，制取X為Thr和Y為NH2的式Ⅱ胰島素化合物。
5.按權(quán)利要求1的方法，其中式Ⅲ中的E均為Glu，N為Asn，T為Thr，制取X為Thr和Y為NH2的式Ⅱ胰島素化合物。
6.按權(quán)利要求1的方法，其中式Ⅲ中的E均為Glu，N為Ser，T為Thr，制取X為Thr和Y為NH2的式Ⅱ胰島素化合物。
7.按權(quán)利要求1的方法，其中式Ⅲ中的B13位上的E為Gln，其余E均為Glu，N為Asn，T為Thr，制取X為Thr和Y為NH2的式Ⅱ胰島素化合物。
8.按權(quán)利要求1的方法，其中式Ⅲ中A4位上的E為Gln，其余E均為Glu，N為Asp，T為Thr，制取X為Thr和Y為NH2的式Ⅱ胰島素化合物。
9.按權(quán)利要求1的方法，其中式Ⅲ中E均為Glu，N為Asn，T為Arg，制取X為OH的式Ⅱ胰島素化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的具有理想的胰島素作用和/或抗原性的胰島素化合物。新的胰島素化合物用式II表示，式中E，N，R，R
文檔編號(hào)A61K38/00GK1045793SQ9010156
公開日1990年10月3日 申請(qǐng)日期1990年3月19日 優(yōu)先權(quán)日1989年3月20日
發(fā)明者佩·巴爾·施米特, 芬恩·貝內(nèi)德·漢森 申請(qǐng)人:洛沃工業(yè)公司