專利名稱：干蚯蚓粉和含有干蚯蚓粉作為活性成分的抗高脂血，抗糖尿病，抗高血壓和抗低血壓的制 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)干蚯蚓粉和以干蚯蚓粉作為活性成分的抗高脂血、抗糖尿病和血壓調(diào)節(jié)劑(抗高血壓和/或抗低血壓)的制劑的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及一種新穎的改良方法，該方法用于生產(chǎn)藥物上可接受的干蚯蚓粉和以干蚯蚓粉作為活性成分的抗高脂血、抗糖尿病和血壓調(diào)節(jié)劑(抗高血壓和/或抗低血壓)制劑。所述的干蚯蚓粉不僅具有優(yōu)異的抗高脂血、抗糖尿病(或低血糖)、抗高血壓和/或抗低血壓作用，而且具有高度安全性。因此，根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的干蚯蚓粉可以與藥物上可接受的載體結(jié)合，形成藥物組合物，用于治療或預(yù)防哺乳動物、尤其是人類的高脂血、糖尿病、高血壓和低血壓。
一般認為，高脂血(以及高血壓、糖尿病和吸煙)是引起動脈硬化的重要因素。人們已經(jīng)研制出各種含合成有機化合物的抗高脂血藥物，用來治療和預(yù)防高脂血。其中典型的例子是冠心平和煙酸環(huán)己醇酯。然而，眾所周知，冠心平及其衍生物常常會引起肌肉疼痛、肝功能紊亂和膽石形成。煙酸環(huán)己醇酯同樣具有副作用，例如面溢血和胃腸紊亂。另據(jù)報道，冠心平可能在動物中引起肝細胞瘤〔D.J.Svobodaetal，CancerRes.，Vol.39，P.3419(1979)〕。
除上述安全性問題外，還必須特別注意抗高脂血藥的作用和藥理性質(zhì)。具體地說，隨著對脂類代謝、尤其是對作為血清脂質(zhì)載體的血清脂蛋白的研究的最新進展，人們已經(jīng)不僅重視藥物降低血清中脂濃度的能力，而且也重視藥物對脂蛋白的作用。
血清膽固醇與甘油三酸酯(下文稱之為TG)、磷脂(下文稱之為PL)和脫輔基蛋白一起構(gòu)成脂蛋白。按照密度的不同，將這些脂蛋白分成最低密度脂蛋白(下文稱之為VLDL)、低密度脂蛋白(下文稱之為LDL)和高密度脂蛋白(下文稱之為HDL)。在這些脂蛋白中，據(jù)認為VLDL和LDL能引起動脈硬化，相反，HDL參于膽固醇由周圍血管到肝的轉(zhuǎn)移，膽固醇酯的形成以及TG的分解代謝，因此具有預(yù)防和使動脈硬化消退的作用。
因此，今后在研制抗高脂血藥時，不僅應(yīng)重視其降低總膽固醇(下文稱之為TC)水平的作用，而且也應(yīng)注意其中膽固醇起作用的脂蛋白的類型。特別理想的是，應(yīng)研制這樣的藥，即它不僅具有降低LDL中膽固醇(下文稱之為LDL-C)水平和升高HDL中膽固醇(下文稱之為HDL-C)水平的作用，而且應(yīng)具有降低動脈硬化指數(shù)(下文稱為為AI)的作用。所述動脈硬化指數(shù)由式(TC-HDL-C)/HDL-C計算。
按慣例，普遍將有機合成化合物如磺酰脲類化合物和雙胍化合物用作口服抗糖尿病藥。一般而言，抗糖尿病藥是用于使病態(tài)代謝恢復(fù)正常的藥品，而它本身并不是能治愈糖尿病的藥物。就糖尿病性昏迷或青少年糖尿病而言，口服抗糖尿病藥是無效的，只有胰島素是有效的。而對于能用胰島素治愈的幾種糖尿病(例如，酮酸中毒或嚴重感染型糖尿病)而言，口服抗糖尿病藥不起作用。口服抗糖尿病藥主要適應(yīng)癥是早期糖尿病，該病不能通過營養(yǎng)療法得到完全控制。在上述情況中，這類口服抗糖尿病藥還往往會產(chǎn)生副作用，如低血糖、肝功能紊亂和厭食，并且必須在醫(yī)生的嚴格控制下使用。因而，迫切需要一種不帶副作用的抗糖尿病藥。
近年來，出現(xiàn)了大量患有高血壓或低血壓的病人(與年齡無關(guān))。為治療這些病人，通常將降壓藥施用于高血壓患者，將增壓劑(或前體藥物)施用于低血壓患者，雖然療效不大。
特別是隨著近來高血壓患者數(shù)量的增加，人們一直在研制和采用種類繁多的治療高血壓藥(或降壓藥)。一旦高血壓患者開始服用降壓藥，若停止服用，則可能使癥狀比服用前更重。因此，通常需要連續(xù)服藥很長一段時間。同樣，對低血壓患者的用藥來說，通常也必須持續(xù)很長一段時間。因此，迫切需要一種沒有副作用的藥。
例如，已知降壓藥肼苯噠嗪具有使周圍血管擴張的作用，顯示出優(yōu)異的降壓活性。然而，它可能導(dǎo)致心動過速的副作用，因此要將它與β-阻斷劑配伍使用。由于降壓藥和增壓藥的使用時間較長，因此，非常希望提供沒有副作用的此類藥物。
尤其在東方國家，從上古時代起蚯蚓就被用作藥物。文獻上已報道過蚯蚓的以下藥理學(xué)作用。
(1)ShinryuOfuchi〔“Mimizu-to-Jinsei(EarthwormsandHumanLife)”，MakiShobo，October30，1947，PP.223～226〕和NikijiHatai〔“Mimizu(Earthworms)，ReprintedEdition”，ScientistCo.，April30，1980，PP.160～163)已報道，蚯蚓具有多種藥理學(xué)活性，即能有效地減小膀胱結(jié)石的體積，并使其從體內(nèi)消除，治療黃疸，以及用作催產(chǎn)劑、恢復(fù)藥、毛發(fā)生長劑、補藥和退熱藥。另一方面，他們也報道了蚯蚓的某些毒性作用。也就是說，蚯蚓毒素會損害神經(jīng)系統(tǒng)，造成溶血(或者破壞紅血細胞)。
(2)下面的描述見中華人民共和國衛(wèi)生部藥典編輯委員會編的“中華人民共和國藥典”(1977年版，第一部分，197～198頁)。
習(xí)慣上一般將蚯蚓分成兩類。一類是wide蚯蚓(Lumbricuskwangtungesis)。這類蚯蚓的制制備如下將每條蚯蚓的軀體切開，洗掉內(nèi)臟和污物，在太陽處、陰涼處或室溫下脫水。另一類是soil蚯蚓(Lumbricusnativus)，其制備方法如下在植物灰粉中處死蚯蚓，將其從灰粉中取出，在太陽下、陰涼處或室溫下脫水。由此制得的脫水蚯蚓體內(nèi)帶有污物。據(jù)文獻中記載，這兩類蚯蚓以4.5至9克的日劑量使用，作為退熱藥、抗驚厥藥、循環(huán)促催化劑、治療半身不遂的藥、關(guān)節(jié)止痛藥、利尿藥、止喘藥和抗高血壓藥。
(3)據(jù)文獻“OurChineseMedicineSeries3DilongandCuttlebone-ScientificResearchinChina”(Ma-tsuuraYakugyoK.K.，P.7)介紹，蚯蚓酊劑(即蚯蚓的乙醇提取物)具有降壓效果。
(4)據(jù)TakuoOkuda報道(“EncyclopediaofNaturalMedicines”，HirokawaShoten，April15，1986，P.215)，蚯蚓用作退熱藥、止痛藥、利尿藥和解毒藥。
(5)MamotuTanaka報導(dǎo)了用蚯蚓作試驗的結(jié)果〔HokkaidoMedicalJournal，Vol.24，PP.18-24(1949)〕。具體做法是從小段脫水蚯蚓中除去污物，然后用沸水提取。將得到的提取物濃縮后，向其加入乙醇，將沉淀物(蚯蚓退熱堿)溶解于林格氏溶液。當(dāng)將該溶液由靜脈內(nèi)注射入被麻醉的貓時，造成血壓突然下降。此外，觀察到的血凝固加速程度與休克成正比。
(6)KenjiroIkawa〔YamaguchiIgaku，Vol.9，PP.571-576(1960)〕報道，試驗溶液的制備如下用生理鹽水提取蚯蚓，或者用乙醇或丙酮提取蚯蚓，將提取物蒸干，將殘留物溶解于生理鹽水。將這些試驗溶液的每一種由靜脈內(nèi)注射入成年兔子，觀察到血壓下降。
(7)據(jù)KosoNewMedicalInstitute編的“中國醫(yī)藥百科全書第二卷”(上?？萍汲霭嫔?，1980年版，第2112頁)中記載，當(dāng)將wide蚯蚓酊劑、干蚯蚓粉懸浮液、蚯蚓熱水浸液或蚯蚓湯藥施用于經(jīng)過麻醉的狗、大鼠、貓或患慢性腎性高血壓的鼠時，記錄到緩慢而持久的降壓效果。當(dāng)將蚯蚓提取物由靜脈內(nèi)注射進被麻醉的狗或貓時，出現(xiàn)快速的降壓效果。然而，另外記載，當(dāng)口服使用或應(yīng)用于臨床試驗時，效果不理想。此外，在同一本書(P.2114)中記載，經(jīng)口服蚯蚓，可有效控制自發(fā)性高血壓。為此，可一天分三次給出10ml40%的蚯蚓酊劑(將40g蚯蚓浸入100ml 60%乙醇而制得)，〔即以12g蚯蚓的日劑量給藥(如本發(fā)明者所計算)〕，該療程持續(xù)30至60天。對不能喝酊劑的患者而言，可將純蚯蚓粉同水以及少量填充劑混合，制成丸劑，一天分三次給出丸劑3至4g，〔即以9至12g蚯蚓的日劑量給藥(如本發(fā)明者所計算)〕。另外據(jù)記載，一天分三次施用2ml B蚯蚓液〔其制備方法是借助于HgCl2除去蚯蚓中的次黃嘌呤，然后通過離子交換樹脂由蚯蚓中分離出降壓成分)，〔即以24g蚯蚓的日劑量給藥(如本發(fā)明者所計算)〕，同樣可有效控制自發(fā)性高血壓。
生產(chǎn)干蚯蚓產(chǎn)物或干蚯蚓粉的慣用方法粗分為以下三種類型。
方法一將每條蚯蚓的軀體切開，除去其內(nèi)含物(即內(nèi)臟和污物)，然后在太陽下、陰涼處或室溫下(通常為50℃或50℃以下)脫水。
方法二將蚯蚓置于植物灰或炭灰中處死，除去污物，然后在太陽下、陰涼處或室溫下(通常為50℃或50℃以下)脫水，得到軀體內(nèi)含污物的干蚯蚓。
方法三除去蚯蚓體內(nèi)的污物，然后將蚯蚓置于植物灰或炭灰中。
需要時，將由此得到的干蚯蚓弄碎，變成粉末使用。上述方法簡單且經(jīng)濟，在家便可方便地實施。然而，若把按所述方法制得的干蚯蚓(或干蚯蚓粉)保存在0℃至5℃的冰箱中或5℃至45℃的房間里的敞開狀態(tài)下，則6個月蚯蚓就會霉?fàn)€，不能再使用。即使將蚯蚓保存在良好的封閉狀態(tài)下，一年內(nèi)它們也會霉?fàn)€。
把按上述方法二制得的體內(nèi)含污物的干蚯蚓或者把按上述方法三制得在植物灰或炭灰中脫水的蚯蚓用作藥物時，普通的做法是用沸水提取蚯蚓，或者將蚯蚓置于沸水中煎湯，將得到的提取液或湯藥過濾，收取濾液。尤其是按方法二制得的干蚯蚓很少以蚯蚓酊劑、粉劑或丸劑形式使用。
按方法一制得的干蚯蚓通常以熱水浸液或湯藥形式使用，或者以蚯蚓酊劑、蚯蚓粉劑或丸劑(由蚯蚓粉與少量水或少量填充劑混合制得)的形式使用。在方法二或方法三中，根據(jù)用作原料的活蚯蚓的不同，干蚯蚓的收率為5%至19%，其含水量為10%至16%。
最近，本發(fā)明者之一的YoichiIshii推薦了一種健康食品，它包含作為主要成分、取自蚯蚓的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，并且提出了生產(chǎn)這類食品的方法〔日本專利公開No.216572/84，(
公開日期1984年12月6日)〕。就生產(chǎn)健康食品干蚯蚓粉而言，該方法是優(yōu)異的。然而，作為生產(chǎn)用作抗高脂血、抗糖尿病和血壓調(diào)節(jié)劑的藥物的方法，就功效而言，上述方法不能令人滿意。具體地說，如果將外部作用施加于活蚯蚓，不可能有選擇地消除污物。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，即使十分仔細，含有大部分具有藥用效果的成分的內(nèi)部器官和體內(nèi)流體至少有一部分將與污物一起被除去，從而降低了療效。此外，根據(jù)作原料的活蚯蚓的不同，收率低達10%至19%。另外，還有一個不利之處，即由于要在0.3托的真空下，于80℃進行最終階段的真空干燥20小時或20小時以上，因此，存在于干蚯蚓中并起重要藥學(xué)作用的酶至少部分會被破壞或滅活。已發(fā)現(xiàn)，按日本專利公開No.216572/’84的方法生產(chǎn)的干蚯蚓粉的抗高血壓效果僅為通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的干蚯蚓粉的效果的50%。
最近，本發(fā)明者之一HisahiMihara和他的合作者證實，取自蚯蚓的溶解纖維蛋白物質(zhì)是具有最pH值的酶蛋白質(zhì)，在pH5～10內(nèi)處于穩(wěn)定狀態(tài)，受Trazirol(商品名)、Transamine(商品名)、大豆胰蛋白酶抑制劑和血清的抑制，具有激活纖維蛋白溶酶原及溶解纖維蛋白的作用，但沒有溶解纖維蛋白原的作用。
在下列專利文獻中描述了用水介質(zhì)提取蚯蚓得到的粗制蛋白質(zhì)以及通過提純該粗制酶蛋白質(zhì)制備溶解纖維蛋白物質(zhì)的方法。所述專利文獻是日本專利公開No.148824/’83(1982年2月27日提交)及其相應(yīng)的外國專利申請，包括美國專利申請No.470394(1983年2月28日提交)、英國專利申請No.8305359(1983年2月25日提交)、意大利專利申請No.47795A(1983年2月25日提交)、法國專利申請No.03165(1983年2月25日提交)、德國專利申請No.93306944.1(1983年2月28日提交)和加拿大專利申請No.422034(1983年2月21日提交)。
此外，HisashiMihara和他的合作者從蚯蚓中獲得了六種新的蛋白酶〔見日本專利公開No.63184/’84(1982年10月2日提交)〕，并研制出了含所述六種蛋白酶(作活性成分)的溶解栓的制劑〔見日本專利公開No.184131/’84(1983年3月31日提交)〕。這些發(fā)明同時在其相應(yīng)的外國專利申請中作了公開。這些外國專利申請包括朝鮮專利申請No.2990(1983年7月30日提交)、澳大利亞專利申請No.16293(1983年6月27日提交)、加拿大專利申請No.431387(1983年6月28日提交)、丹麥專利申請No.3008(1983年6月29日提交)、歐洲專利申請No.83106288.0(1983年6月28日提交)、西班牙專利申請No.523754(1983年6月30日提交)、芬蘭專利申請No.832383(1983年6月29日提交)、挪威專利申請No.2399(1983年6月30日提交)、菲律賓專利申請No.29151(1983年6月30日提交)、臺灣專利申請No.7211983(1983年6月18日提交)和美國專利申請No.508163(1983年6月27日提交)。
本發(fā)明者對文獻作了研究，得到以下結(jié)論(1)在文獻中，沒有報道過含有用干蚯蚓粉作活性成分藥物制劑的抗高脂血作用，更沒有提到過干蚯蚓粉的如下作用和性質(zhì)，即干蚯蚓粉不但能降低血清TC的水平，而且具有降低血清LDL-C水平和升高血清HDL-C水平、以降低AI的作用;干蚯蚓粉是具有高度安全性的藥，不會產(chǎn)生諸如肝肥大和肝功能紊亂之類的副作用。
(2)在文獻中，未提及含有以干蚯蚓粉為活性成分藥劑的抗糖尿病或低血糖作用。也就是說，文獻中未記載對患由阿脲誘發(fā)的糖尿病鼠，施用蚯蚓粉后可顯著降低血糖水平。如下文所述，與營養(yǎng)療法相結(jié)合，給糖尿病患者施用4至9個月含有干蚯蚓粉的膠囊劑。這樣，在經(jīng)過2或3個月的治療后，患輕度糖尿病的病人的血壓水平便開始下降，經(jīng)4個月的治療后，恢復(fù)到健康人的正常值。文獻中找不到如此卓越的效果。
(3)在文獻中，未提及含有以干蚯蚓粉為活性成分的藥物制劑的抗低血壓作用。此外，也沒記載干蚯蚓粉具有調(diào)節(jié)血壓的作用，即將干蚯蚓粉施用于患高血壓和/或低血壓的病人后，俾其血壓由最高值和最低值恢復(fù)到正常值。
本發(fā)明的目的之一在于提供一種生產(chǎn)干蚯蚓粉的方法。通過該方法，可以以高收率獲得藥物上可接受的、具有高度安全性的干蚯蚓粉，所述干蚯蚓粉顯示出卓越的抗高脂血、抗糖尿病或低血糖、抗高血壓和/或抗低血壓活性，而不產(chǎn)生任何副作用。
本發(fā)明的目的之二在于提供抗高脂血、抗糖尿病以及血壓調(diào)節(jié)劑(抗高血壓和/或低血壓)制劑，所述制劑含有按上述方法生產(chǎn)的活性成分干蚯蚓粉。
本發(fā)明的目的之三在于提供一種治療哺乳動物尤其是人類的高脂血、糖尿病、高血壓或低血壓的方法，該方法包括將所述制劑施用于患者，以防治疾病，而不產(chǎn)生任何副作用。
根據(jù)以下的說明，本發(fā)明的其他目的是顯而易見的。
由于抗高脂血藥、抗糖尿病或低血糖藥和血壓調(diào)節(jié)藥(或抗高血壓或抗低血壓藥)需要長期使用，因此這類藥必須不僅具有卓越的效力，而且必須能安全使用，不產(chǎn)生任何副作用。為實現(xiàn)這一目的，本發(fā)明者若干年來作了精心研究，以便從天然原料、尤其是從蚯蚓生產(chǎn)這類安全性高、無副作用的藥。
具體地說，第一目標(biāo)是開發(fā)一種具有高度安全性的藥，它具有優(yōu)異的抗高脂血活性，具有降低血清LDL-C和升高血清HDL-C、以便降低AI值的作用，并且不會有諸如肝肥大和肝功能紊亂之類的副作用。
第二個目的在于開發(fā)一種抗糖尿病藥。將所述藥施用于患早期成熟糖尿病病人(就這類病人而言，僅用營養(yǎng)療法不能完全控制糖尿病)，能有效地治療和預(yù)防糖尿病，不產(chǎn)生副作用，如低血糖、肝功能紊亂和厭食。
降壓藥和增壓藥是以完全不同的方式起作用的藥物。也就是說，降壓藥具有降低血壓的作用，而增壓藥具有升高血壓的作用，因此，始終必須在醫(yī)藥專家的指導(dǎo)下使用。例如，使用降壓藥而產(chǎn)生明顯的降壓效果后，根據(jù)高血壓的程度，應(yīng)采取適宜的措施(例如換藥或暫時停止治療)。若血壓上升，則必須重新施用合適的藥。最好采用單藥治療患高血壓和/或低血壓病人。為此，需要有一種藥，它能將高血壓和或低血壓病人的最高和最低血壓恢復(fù)到其正常水平。此外，由于這類抗高血壓和/或低血壓藥需要長期使用，因此迫切希望有一種不會產(chǎn)生副作用的安全藥物。
如上述引用文獻所述，干蚯蚓產(chǎn)物具有降壓作用。然而，按慣用技術(shù)制得的干蚯蚓產(chǎn)物的收率低僅為5%至19%(具體取決于用作原料的活蚯蚓的情況)。此外，即使將這類干蚯蚓產(chǎn)物保存在室溫(5℃至45℃)下封閉良好的容器中，它們也會在一年內(nèi)霉?fàn)€或變質(zhì)，不再適用于醫(yī)學(xué)目的。此外，由于其中酶的部分破壞或滅活，上述干蚯蚓產(chǎn)物還有效力不足和/或產(chǎn)生副作用的缺點。因此，本發(fā)明者努力開發(fā)一種高收率地生產(chǎn)干蚯蚓粉，而不破壞或使其中的酶滅活的方法，以便獲得無菌的干蚯蚓粉，它具有高度的安全性，不產(chǎn)生副作用，如溶血(即破壞紅血細胞)和心動過速，并且在封閉良好的狀態(tài)下，至少可保存4年。
為解決上述問題，本發(fā)明者作了精心研究，創(chuàng)造了一種新的改良法，用以生產(chǎn)干蚯蚓粉。下文根據(jù)兩個最佳實施例，對本發(fā)明作充分的說明。
生產(chǎn)方法1將一種活蚯蚓置于新鮮水或水溶液中。所述水溶液含不超過0.3%(重量)、最好不超過0.1%(重量)的至少一種化合物。所述化合物選自有機酸，如乙酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸和乳酸;無機酸，如磷酸、硫酸和鹽酸;和這些酸的鈉鹽或鉀鹽。上述溶液的特點是略帶酸性pH值為3至6.5的水溶液。將這些活蚯蚓放在1℃至25℃、最好為2℃至15℃溫度下的水或水溶液中，時間為0.5至72小時、最好為1至40小時。這樣，通過活蚯蚓自身排泄能力，就基本上消除了其消化道內(nèi)的污物。然后，用水洗滌活蚯蚓，以除去其軀體表面的污物。
此后，將活蚯蚓進行濕磨，在-5℃或-5℃、以下最好是在-10℃至-60℃的低溫下，將得到的懸浮液冷凍。隨后，將冰凍的懸浮體凍干并真空干燥。具體地說，在從-60℃至+90℃、最好從-40℃至～+80℃，逐步升溫的同時，將懸浮液凍干，然后在100mmHg或100mmHg以下最好在30mmHg或低于30mmHg的真空下真空干燥，時間為5至100小時，最好為10至60小時。從而得到無菌的干蚯蚓粉。
生產(chǎn)方法2用水洗滌某種活蚯蚓，以除去其軀體表面的所有污物。然后，將活蚯蚓置于新鮮水或水溶液中。所述水溶液含不超過0.3%(重量)、最好不超過0.1%(重量)的至少一種化合物，該化合物選自有機酸，如乙酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸和乳酸;無機酸，如磷酸、硫酸和鹽酸;以及這些酸的鈉鹽和鉀鹽。上述溶液的特點是微帶酸性pH值為3至6.5的水溶液，將這些活蚯蚓放入溫度為1℃至25℃、最好是2℃至15℃的上述水溶液中，時間為0.5至72小時，最好為1至40小時。這樣，經(jīng)過活蚯蚓自身的排泄能力，基本上消除了其消化道內(nèi)的污物。此后，將活蚯蚓濕磨，于-5℃或低于-5℃、最好為-10℃至-60℃的溫度下，將得到的懸浮液冷凍。隨后，將冰凍的懸浮液凍干，真空干燥。具體地說，從-60℃至+90℃、最好從-40℃至+80℃逐漸升溫，同時，將懸浮液凍干，然后在100mmHg或低于100mmHg、最好是30mmHg或低于30mmHg的真空下，真空干燥5至100小時，最好是10至60小時。由此得到無菌的干蚯蚓粉。
在對蚯蚓進行濕磨的步驟中，即在破壞蚯蚓的組織(或細胞)的步驟中，最好采用適宜的裝置，如勻漿器、搗碎器、均勻混合器、打碎器或加壓細胞破碎器，使蚯蚓成懸浮體。較理想的是，于1℃至25℃、最好是2℃至15℃的溫度下，進行該濕磨步驟。
按照上述兩種方法中的任一種方法，可以由活蚯蚓制得黃棕色或棕色的干蚯蚓粉，收率為20%～35%。一般情況下，制得的干蚯蚓粉的含水量為5%至16%、最好為7%至14%，含灰量為3%至8%，最好是4%至7%，含氮量為1%至11%，最好是6%至11%。由此得到的干蚯蚓粉含18種氨基酸，包括天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸。
試驗1表1給出了由上述生產(chǎn)方法1和2制得的幾種干蚯蚓粉的粗略分析結(jié)果。
表1干蚯蚓粉產(chǎn)物粗略分析方法標(biāo)記水份(%)灰分(%)含氧量(%)1M-110.25.19.41M-210.45.38.61M-310.75.29.21M-410.65.69.62M-59.54.57.82M-69.24.78.42M-79.74.68.22M-810.15.59.72M-910.25.69.9試驗2分別對由生產(chǎn)方法1制得的干蚯蚓粉產(chǎn)物(M-2和M-4)和由生產(chǎn)方法制得的干蚯蚓粉產(chǎn)物(M-5)進行了分析。結(jié)果列于表2。
表2M-2M-4M-5水份10.4%10.6%9.5%粗蛋白質(zhì)53.8%60.0%48.8%粗脂質(zhì)12.2%9.3%14.2%可溶性無氮物質(zhì)18.2%14.4%22.9%灰粉5.3%5.6%4.5%粗纖維0.1%0.1%0.1%(以干燥(以干燥(以干燥產(chǎn)品計)產(chǎn)品計)產(chǎn)品計)Ca0.384g%0.389g%0.318g%Mg0.194g%0.202g%0.166g%K0.613g%0624g%0.508g%Na0.382g%0.388g%0.307g%P0.504g%0.512g%0.417g%Fe0.061g%0.064g%0.055g%Cu1.72mg%1.78mg%1.40mg%Zn5.63mg%5.78mg%4.84mg%Mn1.54mg%1.66mg%1.39mg%試驗3分別從兩批干蚯蚓粉產(chǎn)物(M-2和M-4)(按生產(chǎn)方法1制得)和一批干蚯蚓粉產(chǎn)物(M-5)(按生產(chǎn)方法制得)分離粗蛋白質(zhì)，然后進行氨基酸分析。為作比較，按相同的方法，對兩種富蛋白質(zhì)食物(即魚肉和大豆粉)進行分析。所得結(jié)果列于表3。
表3干蚯蚓粉產(chǎn)物M-2M-4M-5魚肉＊大豆粉＊(g/100g)(g/100g)(g/100g)天冬氨酸6.687.526.06--蘇氨酸2.973.342.682.561.95絲氨酸3.063.422.77--谷氨酸8.279.317.67--脯氨酸1.231.371.09--甘氨酸3.263.662.946.312.92丙氨酸3.694.143.41--半胱氨酸0.590.650.550.590.90纈氨酸3.263.632.992.832.44甲硫氨酸1.031.120.951.840.72異亮氨酸3.023.382.832.432.25亮氨酸4.895.494.494.273.42酪氨酸2.472.772.211.911.71苯基丙氨酸2.733.022.552.372.14色氨酸0.320.380.29--賴氨酸4.745.284.491.251.06組氨酸1.651.831.554.533.07精氨酸4.184.473.814.203.53＊以P.McDonald，R.A.Edwards和J.F.D.Greenhalgh在AnimalNutrition(1973)中給出的數(shù)據(jù)為基準(zhǔn)。
從表2和表3可以看出，按生產(chǎn)方法1和2制得的干蚯蚓粉產(chǎn)物富有粗蛋白質(zhì)、粗脂質(zhì)和各種金屬，對粗蛋白質(zhì)所作的氨基酸分析表明，該蛋白質(zhì)含有高比例的基本氨基酸。
按生產(chǎn)方法1制得的干蚯蚓粉產(chǎn)物在某種程度上優(yōu)于按生產(chǎn)方法2制得的干蚯蚓粉產(chǎn)物。此外，與將活蚯蚓放入新鮮水中處理相比，將活蚯蚓放入下述水溶液中，則可更迅速和更徹底清除其消化道。所述水溶液含至少一種上述低濃度的化合物，選自有機酸、無機酸，以及這些酸的鈉鹽或鉀鹽。
HisashiMihara和他的合作者從蚯蚓中獲得了六種新的蛋白酶(或溶解纖維蛋白酶)片段(日本專利公開No.63184/’84和No.184131/’84)。具體做法是，將干蚯蚓粉同10體積單位的生理鹽水混合，將得到的懸浮液保溫2天。用硫酸銨將上層清液分級沉淀，采用SephacrylS-200，所得沉淀物經(jīng)凝膠過濾法。將得到的蛋白質(zhì)部分經(jīng)二乙氨乙基纖維素離子交換層析處理，獲得具有溶解酪蛋白和溶解纖維蛋白活性的蛋白質(zhì)組份Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。當(dāng)用二乙氨乙基纖維素、交聯(lián)葡聚糖凝膠、ToyopearlHW55、ACH-Sepharose、Benzamidine-Sepharose等進一步純化上述蛋白質(zhì)組份Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ時，得到六種純化的酶組份。用SDS-PAGE進行分子量測定時，組份Ⅰ-0的分子量最低，為23，500。組份Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅱ、Ⅲ-1和Ⅲ-2的分子量依次增加，組份Ⅲ-2的分子量為34，200。用等電點電泳分析測定所述六種組份的等電點時，測得組份Ⅰ-0的最高等電點在pH4.12。組份Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅱ、Ⅲ-1和-2的等電點依次降低，組份Ⅲ-2的等電點在pH3.52。這六種組份是新的與絲氨酸酶不同的水解蛋白酶，另據(jù)報道，這些，水解蛋白酶具有最佳的pH值，大約為8或8-10，在pH4-12或pH5-12的范圍是穩(wěn)定的;它們的最佳溫度為50℃或50～60℃，在70℃加熱60分鐘即滅活。
利用按上述生產(chǎn)方法1和2制得的干蚯蚓粉產(chǎn)物M-4和M-5，測試本發(fā)明干蚯蚓粉的溶解纖維蛋白的活性。具體方法是將一份干蚯蚓粉產(chǎn)物M-4同10份生理鹽水混合，用標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白平皿測試所形成的上層清液。如表4所示，立即觀察到溶解纖維蛋白的活性。將干蚯蚓粉產(chǎn)物M-4和生理鹽水的懸浮液于37℃下保溫，第十天時，其上層清液的溶解纖維蛋白的活性增加了4倍，第50天時，增加了5倍，第75天時，增加了5.5倍。這似乎意味著干蚯蚓粉中存在著大量水解蛋白酶前體，其酶活性是自身分解的結(jié)果。若以尿激酶的國際單位表示該上清液的活性，則根據(jù)計算，第50天所觀察的活性大約為800IU/ml。上清液既溶解無(血)纖維蛋白溶酶原的纖維蛋白平皿，也溶解標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白平皿。由于標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白平皿中形成的溶解窗大于無血纖維蛋的溶酶原的纖維蛋白平皿中形成的溶解窗，因而上層清液不僅有使纖維蛋白直接溶解的酶活性，而且具有激活(血)纖維蛋白溶酶原的作用。
用干蚯蚓粉產(chǎn)物M-5代替M-4，重復(fù)上述程序，得到的結(jié)果基本上與表4所示的結(jié)果相同。
表4這一份本發(fā)明的干蚯蚓粉懸浮于10份生理鹽水，并將懸浮液在37℃下保溫所得上清液的溶解纖維蛋白活性保溫時間溶解纖維蛋白活性(天) (標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白平皿的溶解面積，mm2)0200240067171081020870501000751100以口服形式，把由本發(fā)明方法制得的干蚯蚓粉施用于鼠和人類，該干蚯蚓粉具有抗高脂血、降低血糖水平和調(diào)節(jié)血壓(即抗高血壓和/或抗低血壓)的作用，但所述作用的機理還未被充分認識。盡管如此，可以認為，這些作用是由于干蚯蚓粉中水解蛋白酶(蛋白質(zhì))、這些酶的前體(蛋白質(zhì))、其他蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或未知化合物或上述物質(zhì)的結(jié)合體所起作用的結(jié)果。就用作抗高脂血藥、抗糖尿病藥和血壓調(diào)節(jié)劑(或抗高血壓和/或抗低血壓藥)的最佳形式而言，本發(fā)明的干蚯蚓粉應(yīng)具有7%至10%的含氮量，換言之，粗蛋白質(zhì)含量為43.8%至62.5%。
在本發(fā)明的一個最佳實施例中，按上述生產(chǎn)方法1和2，先對蚯蚓進行濕磨，得到蚯蚓懸浮液，然后凍干，真空干燥。具體方法如下。
在-10℃至-60℃、最好是-30℃至-50℃的溫度下，將濕磨后得到的蚯蚓懸浮液冷凍5至60小時。然后，維持相同的溫度，同時，在0.01至0.2mmHg的真空下，用5至12小時，將冷凍的懸浮液凍干。此后，在0.01至0.2mmHg的真空下，于20℃至30℃的溫度，將形成的粉末干燥5至15小時。接著，在35℃至50℃下，將粉末真空干燥5至10小時。由此，得到無菌的干蚯蚓粉，其含水量為5%至15%。真空干燥的最后階段最為重要。為得到無菌的干蚯蚓粉，而又不使其中的水解蛋白酶或其前體滅活，本發(fā)明者作了精心研究，并發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵是在真空干燥的最后階段將三種因素(即真空程度、溫度和時間)有機地結(jié)合起來。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，確定了上述操作條件。
如前所述并已有報道，即在70℃下加熱60分鐘，會使由干蚯蚓粉提純的六種水解蛋白酶全部失活(日本專利公開No.63184/’84和No.184131/’84)。然而，從表4可以看出，通過本發(fā)明方法得到的干蚯蚓粉中的水解蛋白酶不會被滅活。
當(dāng)把由生產(chǎn)方法1和2制得的一些干蚯蚓粉產(chǎn)物以完全封閉態(tài)于室溫下(5℃至45℃)保存5年時，未出現(xiàn)物理變化或化學(xué)變質(zhì)(例如長出霉菌)的跡像。
本發(fā)明中采用的蚯蚓的種類可選自各種普通種類，它們包括
Lumbricusrubellus，Lumbricusterrestris，Eiseniafoetida，Allolobophoracaliginosa，Dendrobaenaoctaedra，AllolobophorajaponicaMichaelsen，DrawidahattamimizuHatai，PheretimadivergensMichaelsen，Pheretimacommunissima，Pheretimaagrestis，PhertimaSieboldiHorst，Pheretimahilgendorfi，Pontodrilus\\matushimensisIieuka，TubifexhattaiNomura，LimnodrilusgotoiHatai(＝L.socialisStephenson)等。
若本發(fā)明的干蚯蚓粉用于臨床治療，它可以呈口服制劑或非腸道用制劑的形式。但口服使用干蚯蚓粉更為理想。就口服用藥而言，可單獨使用本發(fā)明的干蚯蚓粉，或?qū)⑵渑c藥物上可接受的載體結(jié)合，制成藥物制劑來使用。所述藥物制劑包括;膠囊劑、片劑、顆粒劑、粉劑、包衣片劑、糖衣片劑和乳劑。
適宜的藥物載體包括填充劑，例如乳糖、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、淀粉、山梨糖醇、甘氨酸、磷酸鈣和微晶纖維素;粘合劑，例如淀粉、明膠、阿拉伯膠、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、西黃蓍膠、羥丙基纖維素、羥丙氧甲基纖維素、羧甲基纖維素、2-甲基-5-乙烯基吡啶/、α-甲基丙烯酸甲酯/丙烯酸乙酯共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮和藻酸鈉;潤滑劑，例如硬脂酸、硬化油、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、聚氧乙烯單硬脂酸酯、滑石粉、氧化硅和聚乙二醇;崩解劑，如土豆淀粉以及含某種表面活性劑的淀粉或類似物;致濕劑，如十二烷基硫酸鈉。若需要以非腸道形式用藥，則可以按栓劑形式使用本發(fā)明的干蚯蚓粉。就栓劑而言，可將可可白脫、Witepsol、Subanal、聚乙二醇、聚丙二醇、甘油明膠、明膠膠囊等用作基質(zhì)。其他添加劑包括眾所周知的安全防腐劑，例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯和丁基羥基茴香醚;以及安全著色劑。
若本發(fā)明的干蚯蚓粉用于治療高脂血或糖尿病，則其劑量大小根據(jù)下列因素而變化，即，給藥途徑、病人的年齡、體重和病情以及疾病的類型。一般情況下，成人優(yōu)選日劑量為0.01g至5g。最理想的是，以1至3次的均分劑量給出日劑量0.02g至2g。
若本發(fā)明干蚯蚓粉用于調(diào)節(jié)血壓或治療高血壓或低血壓，則其劑量大小取決下列因素，包括給藥途徑、病人的年齡、體重和病情以及疾病的類型。一般情況下，優(yōu)選的日劑量為0.01g至3g。最理想的是，以1至3次的均分劑量給出日劑量0.02g至2g。
效果下文詳細說明對本發(fā)明的干蚯蚓粉進行毒性試驗的步驟和試驗結(jié)果，以及對該蚯蚓粉作藥理試驗的步驟和試驗結(jié)果。藥理試驗包括抗高脂血、抗糖尿病(或低血糖)和抗高血壓(或低血壓)作用。
A.急性毒性試驗通過口服本發(fā)明的干蚯蚓粉，進行急性毒性試驗。在試驗中，使用體重為30±2g的ddy種雄性小鼠和體重為100±2g的Wister種雄性大鼠，分別以五只為一組。試驗樣品為上述干蚯蚓粉產(chǎn)物M-1(含水量為10.2%、含灰量為5.1%、含氮量為9.4%)、M-2(含水量為10.4%、含灰量為5.3%、含氮量為8.6%)、M-3(含水量為10.7%、含灰量為5.2%、含氮量為9.2%)、M-4(含水量為10.6%、含灰量為5.6%、含氮量為9.6%)、M-5(含水量為9.5%、含灰量為4.5%、含氮量為7.8%)和M-6(含水量為9.2%、含灰量為4.7%、含氮量為8.4%)。采用食管探子、將每種試樣管飼于上述小鼠和大鼠，用于小鼠的劑量為0.1g至5g/kg，用于大鼠的劑量為2g至8g/kg。在試驗過程中，給動物用藥后，將其置于22℃至23℃的室溫下，觀察14天。在用于這些試驗的劑量下，末發(fā)現(xiàn)死亡現(xiàn)象。經(jīng)常觀察動物的行為，以判斷是否出現(xiàn)中毒現(xiàn)像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗組和正常對照組之間沒有差別。此外，在增重方面，試驗組與正常對照組之間也沒有明顯差異。試驗結(jié)束時，進行尸體解剖，重要器官中未顯現(xiàn)任何肉眼可見的變化?？梢?，本發(fā)明的干蚯蚓粉的毒性如此之低，以致有可能測定其LD50值。
B.對誘發(fā)性高脂血實驗大鼠的影響1)動物以八只為一組，使用體重為100±1g的Wistar種雄性大鼠。
2)食物將1%(重量)的膽固醇和0.5%(重量)的膽酸加到粉狀飼料(CE-2;由NipponCleaCo.生產(chǎn))中，充分調(diào)和，制得高膽固醇的食物。然后，將該高膽固醇食物分別同兩份按本發(fā)明方法制得的干蚯蚓粉的每一份混合，制得兩份試驗食物。這兩份干蚯蚓粉是M-2(含水量為10.4%，含灰量為5.3%，含氮量為8.6%)和M-5(含水量為9.5%，含灰量為4.5%，含氮量為7.8%)。
3)實驗條件將大鼠分籠喂養(yǎng)，任意提供每份食物和水。于23±1℃下的恒溫和55±5%的恒定相對濕度下將大鼠飼養(yǎng)7天。7天后，使大鼠禁食過夜(但仍然供飲用水)，然后用戊巴比妥鈉(商品名為戊巴比妥)將其麻醉。從腹下行主動脈收集血樣，并在冷凍狀態(tài)離心，得到血清。利用東芝TBA-480自動分析器和TA480試驗試劑(可從WakoPureChemicalCo.Ltd.購得)測定血清中TC、游離膽固衣(下文稱之為FC)、LDL-C和HDL-C的水平。從由此得到的數(shù)據(jù)計算出AI。
4)結(jié)果由此獲得的結(jié)果顯示于表5。
表5高膽固醇含M-2的含M-2的的食物組食物組食物組劑量22(重量百分比)大鼠數(shù)量888(血清水平)TC(mg/dl)325.5±20.8a)185.4±10.7＊＊＊b)186.8±10.6***b)FC(mg/dl)70.4±5.244.8±2.5＊＊45.2±2.4＊＊LDL-C(mg/dl)229.8±22.5113.6±7.7＊＊113.0±7.6＊＊HDL-C(mg/dl)31.6±4.330.5±2.330.7±2.7AI10.21±2.425.52±0.94＊5.55±0.98＊a)每個值表示8只大鼠的平均±標(biāo)準(zhǔn)差(S.D)。
b)與富有膽固醇組的值比較得到的統(tǒng)計學(xué)顯著性差異＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001。
在用含2%本發(fā)明干蚯蚓粉食物喂養(yǎng)的動物組中，血清TC、FC、LDL-C和AI水平呈統(tǒng)計學(xué)顯著下降，但HDL-C沒有明顯變化。
因此，本發(fā)明干蚯蚓粉具有優(yōu)異的抗高脂血作用。
藥理試驗21)動物使用體重為105±1g的Sprague-Dawley種雄性大鼠(下文稱之為SD種)以8只為一組。
2)食物用于藥理試驗2的高膽固醇食物組成如表6所示。
表6成分重量百分比膽固醇0.5膽酸1.0酪蛋白20.0蔗糖50.0硬化椰子油12.0纖維素4.0鹽混合物a4.0維生素混合物b0.5白色魚肉7.5(注)a、bFukushima等人在JapaneseJournalofPharmacy，Vol.89，PP.857-862(1962)上介紹了鹽混合物和維生素混合物的組成。
將表6所列的成分充分混合，制成高膽固醇食物。然后，將該商膽固醇食物與下述物質(zhì)調(diào)和，制得試驗食物。所述物質(zhì)是0.25%(重量)的按本發(fā)明方法制得的干蚯蚓粉產(chǎn)物M-3(含水量為10.7%，含灰量為5.2%，含氮量為9.2%)、0.5%(重量)的按本發(fā)明方法制得的干蚯蚓粉產(chǎn)物M-1(含水量為10.2%、含灰量為5.1%、含氮量為9.4%)、0.5%或1.0%(重量)作對照藥的γ-谷維素(商品名為HizetFineGranules)或1.0%(重量)作對照藥的大豆甾醇(商品名為Moristerol微粒劑)。
3)實驗條件將大鼠置于兩個彼此分開的籠內(nèi)喂養(yǎng)，任意供應(yīng)每份食物和水。在23±1℃的常溫及55±5%的恒定相對濕度下喂養(yǎng)大鼠4周。四周后，禁食過夜(但仍然供水)，然后用戊巴比妥鈉(商品名為戊巴比妥)將大鼠麻醉。從腹下主動脈收集血樣，在冷凍狀態(tài)下離心，獲得血清。利用東芝TBA-480自動分析器和TA480試驗試劑(可從WakoPureChemicalCo.，Ltd購得)測定(或計算)血清中TC、FC、TG、PL、游離脂肪酸(下文稱之為NEFAs)LDL-C、AI、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(下文稱之為GOT)和谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(下文稱之為GPT)的水平。按Folch法，提取肝脂質(zhì);以與上述相同的方法，測定肝脂質(zhì)中TC、TG和PL的水平。
4)結(jié)果表7顯示了實驗結(jié)果。在實驗中，與兩種對照藥(即γ-谷維素和異甾醇)比較，測試本發(fā)明干蚯蚓粉對于患誘發(fā)性高脂血實驗大鼠的作用。與喂了高膽固醇食物一組大鼠相比，喂了含0.25%或0.5%干蚯蚓粉食物的兩組大鼠中，血清TC、FC、PL和NEFA水平呈統(tǒng)計學(xué)顯著下降。血清TG水平傾向于更低，但未觀察到有顯著的下降。
含0.5%或1%γ-谷維素的食物造成NEFA明顯下降，但未發(fā)現(xiàn)使TC、FC、TG或PL顯著下降。另一方面，含有1%大豆甾醇(作為對照藥)的食物使TC、FC和PL明顯下降，而TG和NEFA水平與高膽固醇食物組的TG和NEFA水平基本相同。
如上所述，HDL-C被認為是改善動脈硬化的一個要素，許多基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究人員已證實，HLD-C上升是評價抗高脂血藥的有用標(biāo)準(zhǔn)。從表7可以看出，與高膽固醇食物組相比，以含本發(fā)明的干蚯蚓粉食物喂養(yǎng)的大鼠組HDL-C呈統(tǒng)計學(xué)顯著上升，對比之下，用作對照藥的γ-谷維素不能使HDL-C上升。然而，大豆甾醇使使HDL-C顯著上升。
如上所述，就抗高脂血藥而言，降低AI的作用是很重要的。已經(jīng)訌明，用含本發(fā)明的干蚯蚓粉的食物(或作為對照藥的大豆甾醇)喂養(yǎng)的大鼠組中，AI明顯下降。然而，在喂了含作為對照藥的γ-谷維素的食物的大鼠組中，AI有下降趨勢，但無顯著性。
如上所述，市售的抗高脂血藥會產(chǎn)生肝功能紊亂的副作用。因此，這就提出了一個長期使用的問題。為研究試驗藥物對肝的影響，要測定血清GOT和GPT水平。眾所周知，這些參數(shù)上升意味著肝功能紊亂。與以高膽固醇食物喂養(yǎng)的大鼠組相比，用含本發(fā)明的干蚯蚓粉食物喂養(yǎng)的大鼠組GOT和GPT均明顯下降。對比之下，用含0.5%γ-谷維素(作對照藥)的食物喂養(yǎng)的一組大鼠的GOT和GPT顯示出明顯的(雖然不分突出)上升趨勢;而用含有1%γ-谷維素的食物喂養(yǎng)的一組大鼠的GOT和GPT顯示出十分顯著的呈統(tǒng)計學(xué)顯著上升趨勢。在這方面，與用高膽固醇食物喂養(yǎng)的一組大鼠相比，用含1%大豆甾醇(作對照藥)喂養(yǎng)的一組大鼠GOT和GPT水平下降，但從統(tǒng)計學(xué)看，這種下降并不顯著。
就治療肝肥大而言，與用高膽固醇食物喂養(yǎng)組相比，用含本發(fā)明干蚯蚓粉的食物喂養(yǎng)組的肝肥大顯著減小。然而，根據(jù)測定，用含γ-谷維素和大豆甾醇食物喂養(yǎng)組與用高膽固醇食物喂養(yǎng)組之間幾乎沒有差異。
就肝脂中所存在的TC而言，與用高膽固醇食物喂養(yǎng)組相比，用含本發(fā)明干蚯蚓粉食物喂養(yǎng)組和用含兩個對照藥食物喂養(yǎng)組均呈現(xiàn)顯著下降。
就存在于肝脂中的TG而言，用含本發(fā)明干蚯蚓粉食物喂養(yǎng)組和用含兩個對照藥物食物喂養(yǎng)組TG均呈現(xiàn)不明顯的降低趨勢，但可以認為基本上沒有變化。
就存在于肝脂中的PL而言，與用高膽固醇食物喂養(yǎng)組相比，用含本發(fā)明干蚯蚓粉食物喂養(yǎng)組的PL明顯降低。但用含兩個對照藥物食物喂養(yǎng)組的PL則沒有改變。
在用含本發(fā)明干蚯蚓粉食物喂養(yǎng)組和用含兩種對照藥物食物喂養(yǎng)組中，大鼠體重穩(wěn)步增加，但不呈現(xiàn)任何明顯的異常。
表7食物類型正常食物喂養(yǎng)組高膽固醇食物喂養(yǎng)組劑量(重量%)大鼠數(shù)目88血清TC(mg/dl)50.4±2.5＊＊＊420.2±45.3FC(mg/dl)11.0±0.9＊＊＊100.3±11.8TG(mg/dl)57.6±7.983.4±12.2PL(mg/dl)96.2±3.8＊＊＊176.1±14.2NEFA(mEq/l)0.768±0.022＊＊1.043±0.074HDL-C(mg/dl)28.5±2.0＊＊＊16.4±1.7AI0.81±0.1229.69±5.52GOT(U/l)70.4±5.4＊＊＊372.3±54.7GPT(U/l)28.8±2.5＊＊＊180.7±27.8肝重量(g)9.2±0.3＊＊＊13.6±0.3TC(mg/g)2.8±0.2＊＊＊40.2±0.9TG(mg/g)6.6±1.07.5±0.3PL(mg/g)13.1±0.3＊＊＊24.0±0.4體重(g)開始105.2±1.0105.2±1.0最終286.8±5.8252.6±5.5
含干蚯蚓粉食物喂養(yǎng)組0.250.588195.7±18.1＊＊＊188.7±19.2＊＊＊42.6±3.7＊＊＊42.2±4.8＊＊＊68.1±4.160.3±10.2114.8±4.6＊＊＊116.5±7.1＊＊＊0.773±0.049＊0.681±0.062＊＊22.4±0.8＊22.7±0.9＊8.07±1.84＊＊7.75±2.12＊＊136.7±20.4＊＊＊97.4±3.8＊＊＊61.8±14.0＊＊38.9±2.7＊＊11.3±0.3＊＊10.4±0.5＊＊＊30.6±1.2＊＊＊19.8±1.1＊＊＊6.5±0.67.0±0.620.7±0.3＊＊＊16.9±0.4＊＊＊105.4±1.1105.2±1.0259.2±6.2259.7±7.6
含γ-谷維素食物喂養(yǎng)組含大豆甾醇喂養(yǎng)組0.51.01.0888328.7±39.5307.4±42.3194.3±19.0＊＊＊84.3±9.271.8±9.142.4±5.8＊＊67.4±11.456.9±5.580.7±10.0163.9±12.3151.2±9.7143.5±9.9＊0.688±0.062＊＊0.799±0.060＊1.031±0.05818.0±2.816.5±0.821.8±0.9＊19.86±4.8218.44±4.328.82±2.20＊＊475.8±77.1618.4±94.8＊246.4±33.8249.7±35.4328.7±72.7＊107.2±16.513.8±0.412.8±0.513.2±0.434.2±1.3＊＊32.8±0.9＊＊＊34.3±1.3＊＊6.5±0.66.5±0.67.1±0.623.1±0.923.2±0.623.0±0.6105.1±1.0105.4±1.0105.3±1.0256.4±8.7256.2±10.8258.4±7.0a)每個值表示一個平均±標(biāo)準(zhǔn)差(S.D.)(8只大鼠)。
b)與高膽固醇食物組的值相比得到的統(tǒng)計學(xué)顯著性差異值P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.01。
c)將干蚯蚓粉徑口服施用于患高脂血的病人。
將膠囊劑D經(jīng)口服施用于接受該試驗的志愿者。所述膠囊劑D是按下文例10給出的方法制備的，每顆含有150mg前述M-2(含水量為10.4%、含灰量為5.3%、含氮量為8.6%)。使用劑量為每日三次，每次一粒，飯后30分鐘內(nèi)口服。連續(xù)用藥6個月或7個月，一般情況下，在開始用藥后隔3個月或4個月測定脂質(zhì)中的血清水平。為此，當(dāng)天早上空腹抽取血樣，測試血清的TC、TG、HDL-C和AI水平。利用前述儀器(從WakoPureChemicalsCo.Ltd購得)進行測定。由此得到的結(jié)果顯示于表8。
表8Y.I.(女性，80歲)用藥前1個月后3個月后4個月后6個月后7個月后TC(mg/dl)280.7240.3227.6218.2184.7186.6TG(mg/dl)119.2110.070.994.6106.387.5HDL-C(mg/dl)36.036.736.036.537.438.3AI6.805.545.324.983.943.87S.I.(女性，62歲)用藥前4個月后6個月后TC(mg/dl)239.6206.2197.2TG(mg/dl)92.592.090.1HDL-C(mg/dl)45.242.746.4AI4.303.833.25A.K.(男性，55歲)用藥前3個月后6個月后TC(mg/dl)264.7220.4209.4TG(mg/dl)125.4122.492.8HDL-C(mg/dl)47.246.452.6AI4.613.752.98G.K.(男性，62歲)用藥前3個月后6個月后TC(mg/dl)238.4194.8174.7TG(mg/dl)116.699.583.7HDL-C(mg/dl)56.552.357.4AI3.222.722.04
就實驗(即給4名志愿者口服干蚯蚓粉)所在地的健康居民居而言，其正常的血清脂質(zhì)值如下TC為130～230mg/dl，TG為50～170mg/dl、HDL-C為35～60mg/dl。從表8可以看出，在開始治療前，所有四名病人的TC水平超過其正常范圍。TG和HDL-C水平在正常范圍之內(nèi)。
盡管表8所示結(jié)果是僅從4名志愿者口服干蚯蚓粉后所得到的，但經(jīng)過3個月或4個月的治療后，TC水平由開始治療前的238～280mg/dl降到194～220mg/dl(在正常范圍內(nèi))，6個月或7個月后，顯著地降到174～209mg/dl。經(jīng)3個月或4個月的治療后，AI值開始明顯降低，6個月或7個月后，AI值與TC值一起顯著下降。
另一方面，HDL-C水平幾乎仍然保持恒定，未顯示出明顯變化。然而，6個月或7個月后，觀察到微小但明顯的上升趨勢。3個月或4個月后，TC水平趨于下降，6個月或7個月后明顯下降。
同給患誘發(fā)性高脂血的實驗大鼠口服用藥的實驗情況一樣，在給病人口服用藥的實驗中，TC和AI值顯著下降，HDL-C微量上升，然而，區(qū)別之處在于6個月或7個月后，大鼠的TG值沒有顯著降低，而病人的TG明顯下降。這是一個值得重視的結(jié)果。
這種給病人口服干蚯蚓粉的實驗可安全地完成，不產(chǎn)生任何副作用。例如，即使長期用藥6個月或7個月，也不會引起低血糖(其中血糖水平降至其正常范圍60至110mg/dl的下限以下)。從表8可以看出，干蚯蚓粉不是一種抗高脂血的藥?？垢咧幭笃渌铣捎袡C化合物的藥一樣，能在較短時間內(nèi)迅速達到預(yù)期的目的。這就是說，干蚯蚓粉是一種緩慢起作用的藥，它需要持續(xù)使用較長一段時間。然而，若將干蚯蚓粉施用于人體，3個月或4個月后，TC和AI值開始明顯下降。此外，6個月或7個月后，HDL-C顯示出微量的上升趨勢，TG明顯下降。
對使用本發(fā)明干蚯蚓粉的病人的年齡沒有具體限制。雖然本發(fā)明的干蚯蚓粉是可以普遍使用的，但最好用于中年或老年病人。基于上述結(jié)果，證明本發(fā)明的干蚯蚓粉是安全、有效的治療病，并可預(yù)防高脂血。
D.對患有誘發(fā)性糖尿病實驗小鼠的影響藥理試驗31)動物使用體重為30±2g的ddy種雄性小鼠，以五只為一組。
2)食物和實驗條件在該實驗中，采用由NipponCleaCo.出售的固體食物。將小鼠置于分開的籠內(nèi)，隨意提供食物和水。將小鼠置于23±1℃恒溫的55±5%恒定相對濕度下的環(huán)境中。
對上述ddy種的雄性小鼠禁食16小時，然后經(jīng)靜脈注射75mg/kg阿脲。48小時后，以300mg/kg的劑量，將本發(fā)明干蚯蚓粉的懸浮液經(jīng)口服施用于所述小鼠。為此，將下列干蚯蚓粉產(chǎn)物用作試驗樣品。這些干蚯蚓粉產(chǎn)物包括M-1(含水量10.2%、含灰量5.1%、含氮量9.4%)、M-2(含水量10.4%、含灰量5.3%、含氮量8.6%)、M-3(含水量10.7%、含灰量5.2%、含氮量9.2%)、M-4(含水量10.6%、含灰量5.6%、含氮量9.6%)、M-5(含水量9.5%、含灰量4.5%、含氮量78.%)和M-6(含水量9.2%、含灰量4.7%、含氮量8.4%)。150分鐘后，通過心臟穿刺術(shù)收集血樣，經(jīng)葡萄糖氧化酶法測定其血糖水平。
測定結(jié)果顯示于表9。因此，本發(fā)明的干蚯蚓粉能夠呈統(tǒng)計學(xué)顯著降低血糖水平。
表9本發(fā)明的干蚯蚓粉血糖水平(mg/dl)平均±標(biāo)準(zhǔn)差無(作對照)474±29M-1381±39＊＊M-2351±45＊＊M-3377±35＊＊M-4342±32＊＊＊M-5378±36＊＊M-6383±27＊＊＊P＜0.05;＊＊P＜0.01;＊＊＊P＜0.001。
E.給患有糖尿病的病人口服干蚯蚓粉的試驗結(jié)合采用營養(yǎng)療法將膠囊劑C經(jīng)口服施用于接受該試驗的5名志愿者，所述的膠囊劑C是根據(jù)下文實施例6制備，(每顆含150mg干蚯蚓粉產(chǎn)物M-3，M-3的含水量為10.7%，含灰量為5.2%，含氮量為9.2%)。使用劑量為每日三次，每次一粒，飯后30分鐘內(nèi)口服。就某個年齡為62歲的男性病人的試驗情況而言，連續(xù)治療9個月，每隔一個月收集血樣。在對一個年齡為59歲的男性病人的試驗中，分別在治療前，以及在經(jīng)過2個月、3個月和4個月的治療后，收集血樣。在對一個76歲的女病人的試驗中，分別在治療前以及經(jīng)4個月的治療后，收集血樣。在對一個79歲的女病人進行試驗中，分別在治療前以及經(jīng)過3個月和6個月的治療后，收集血樣，在對一個61歲的女病人的試驗中，分別于治療前以及經(jīng)過1個月、3個月、4個月和8個月的治療后，收集血樣。按照葡萄糖氧化酶法，測定血糖水平。由此得到的結(jié)果顯示于表10。
表10血糖水平(mg/dl)S.T.(男性，62歲)治療前1個月后2個月后3個月后早飯前1241019093早飯后兩小時179169154135午飯前133130110102午飯后兩小時271220133135晚飯前225196108105晚飯后兩小時270220202185K.K.(男性，59歲)治療前2個月后3個月后4個月后早飯前20519810092早飯后兩小時282156150146午飯前13812611494午飯后兩小時283262117150晚飯前1702808391晚飯后兩小時3043241521494個月后5個月后6個月后7個月后8個月后9個月后958590908090132127130128102129100999298909714013212813010511098100105999598150148145143135132
表10(續(xù))血糖水平(mg/dl)K.M.(女性，79歲)治療前3個月后6個月后早飯前1499597早飯后兩小時302130107午飯前1729580午飯后兩小時196171104晚飯前12710791晚飯后兩小時14299116T.Z.(女性，76歲)治療前4個月后早飯前11581早飯后兩小時15595午飯前14895午飯后兩小時127119晚飯前12796晚飯后兩小時114112K.K.(女性，61歲)治療前1個月后3個月后4個月后8個月后早飯前129165747989早飯后兩小時282241230220197午飯前265188256228210午飯后兩小時393325325152141晚飯前378-221141100晚飯后兩小時390-251266143
就實驗所在地的健康居民而言，其正常血糖水平如下早飯前為50～100mg/dl，早飯后兩小時為150mg/dl或低于150mg/dl，午飯前為50～100mg/dl，午飯后兩小時為150mg/dl或低于150mg/dl，晚飯前為50～100mg/dl，晚飯后兩小時為150mg/dl或于150mg/dl。這表明，在開始治療前，表10中的全部五名試驗者早飯前(即饑餓時)的血糖水平很高，因而都患有糖尿病。
經(jīng)過用本發(fā)明的干蚯蚓粉進行治療，兩個月后，原患有輕度糖尿病的62歲的男性病人血糖水平開始改善;三個月后，雖然晚飯后兩小時時的試驗值高達185mg/dl，但其余五個試驗值均恢復(fù)到接近正常的水平。經(jīng)過4個月的治療后，所有六個試驗值都恢復(fù)到其正常水平。因此，在五個月內(nèi)，血糖的六個試驗值維持在正常范圍內(nèi)。
就59歲的男性患者而言，經(jīng)過3個月的治療后，雖然其晚飯前的試驗值略高(114mg/dl)，但其余五個試驗值恢復(fù)到正常水平。經(jīng)過4個月的治療后，所有六個試驗值均在其正常范圍內(nèi)。
就79歲的女性患者而言，經(jīng)過3個月的治療后，雖然午飯后兩小時及晚飯前的試驗值偏高(171mg/dl及107mg/dl)，但其余四個試驗值恢復(fù)到了正常水平。經(jīng)過六個月的治療后，所有六個試驗值完全恢復(fù)到其正常水平。
就患有輕度糖尿病的76歲女性患者而言，經(jīng)過4個月的治療后，六個血糖試驗值全部恢復(fù)到正常水平。
表10中，61歲的女性病人患有較為嚴重的糖尿病。采用本發(fā)明的干蚯蚓粉，經(jīng)過4個月治療后，該病人的血糖水平開始下降。8個月后，盡管早飯后兩小時及午飯前的試驗值分別高達197mg/gl和210mg/dl，但其余四個試驗值恢復(fù)到了正常水平。
可安全地完成將干蚯蚓粉經(jīng)口服施用于人體的試驗，并且不會產(chǎn)生任何副作用。例如，即使在6至9個月的時間內(nèi)長期使用，也不會引起低血糖(即血糖水平降至低于正常范圍的下降)。因此，本發(fā)明的干蚯蚓粉是一種安全藥。
可將上述結(jié)果歸納如下若將本發(fā)明的干蚯蚓粉徑口服施用于患嚴重糖尿病的病人，較難使所有的六個血糖試驗值恢復(fù)到正常水平。然而，經(jīng)過8個月的治療后，情況有所改善，即六個試驗值中的四個恢復(fù)到正常水平。就患有中度糖尿病的病人而言，經(jīng)四個月的治療后，全部試驗值均能恢復(fù)到其正常水平。因此，本發(fā)明的干蚯蚓粉是一種安全而優(yōu)異的低血糖藥，可用來治療和預(yù)防糖尿病。
F.對患自發(fā)性高血壓大鼠(SHRs)的影響藥理試驗4(對SHRs的降壓作用以及使心率增加)以100mg/kg的劑量，將溶于0.5%羧甲基纖維素水溶液中的試樣(即干蚯蚓粉M-4)懸浮液經(jīng)口服施用于經(jīng)過一天一夜禁食的、鼠齡為10至12周的雄性SHRs(體重為200至300g，血壓為150至200mmHg)。(用作對照藥的肼鹽酸鹽的劑量為10mg/kg。)分別在0，1，2，4和6小時后，測量血壓。(結(jié)果用3個或4個測量值的平均值來表示。)這樣，將用藥前的血壓和心率同用藥后的血壓和心率比較，就可判斷由此產(chǎn)生的試樣的降壓作用和心率增加的程度。
按以下方式測量血壓先將SHR加熱至45℃～50℃，時間持續(xù)大約5分鐘;利用自動血壓記錄儀，經(jīng)尾體積掃描法的非外科手段，測定SHRs尾動脈的收縮壓〔TheJournalofLaboratoryandClinicalMedicine，Vol.78，P.957(1971)〕。由此得到的結(jié)果顯示于表11。
根據(jù)用藥前觀察到的收縮壓的最大下降值，表示降壓效果。以100mg/dl的劑量，經(jīng)口服，把通過生產(chǎn)方法1制得的干蚯蚓粉產(chǎn)物M-2、M-4和通過生產(chǎn)方法2制得的干蚯蚓粉產(chǎn)物M-5、M-6施用于SHRs。用藥后1至2小時內(nèi)，觀察到最大的降壓效果。這就是說，干蚯蚓粉將SHRs的血壓降低了28至35mmHg。這一作用持續(xù)6小時。
心率增加的測定結(jié)果同時顯示于表11中。結(jié)果表明，與用作對藥的鹽酸肼不同，干蚯蚓粉試樣未對心臟產(chǎn)生不良副作用(如心動過速)。
表11試樣在SHRs上產(chǎn)生的降壓效果心率增加(-△，mmHg)(跳/分鐘)(干蚯蚓粉)M-23318M-43519M-52822M-63120(對照藥)鹽酸肼6085G.溶血作用藥理試驗5在本試驗中，將干蚯蚓粉M-2和M-4(均按生產(chǎn)方法1制備)和干蚯蚓粉M-5和M-6(均按生產(chǎn)方法2制備)用作試樣。具體地說，將每一試樣的1份(重量)加到5份(重量)的生理鹽水中，并使其充分懸浮于溶液中。在5℃的冰箱內(nèi)，使形成的懸浮液靜置24小時，然后減壓下過濾?？蓪V液看作為水提取物。
將5份(重量)乙醇或丙酮加到各為1份(重量)的四種試樣的每一試樣中，并使后者充分懸浮于前者，進而制備乙醇和丙酮的提取液。于15～20℃下，使形成的懸浮液靜置24小時，然后減壓下過濾。于40-45℃下將濾液蒸干。將形成的殘留物溶于含1%羧甲基纖維素的生理鹽水，制得30%的溶液。以下述方式評價溶血效果從體重約為3kg的成熟兔子的心房靜脈收集血液，并經(jīng)去纖維蛋白法處理。用生理鹽水將各個上述水、乙醇和丙酮提取液的濃度稀釋到5%、1%、0.1%、0.01%、0.001%和0.0001%(重量)。將這些溶液置于5ml的試管內(nèi)，用吸管將一滴去纖維蛋白血加到每一試管中。一小時后，對試管進行溶血分析。由此得到的試驗結(jié)果顯示于表12中。表12表明，在任何濃度下，干蚯蚓粉試樣均不引起溶血。
表12濃度(重量百分比)干蚯蚓粉提取物510.10.010.0010.0001水提取物------乙醇提取物------丙酮提取物------文獻中已記載，干蚯蚓具有以溶血為代表的毒性作用，即破壞紅血細胞〔ShinryuOfuchi，“Mimizu-to-Jinsei(EarthwormsandHumanLife)”，MakiShobo，October30，1947，PP.223-226;NikijiHatai，“Mimizu(Earthworms)，ReprintedEdition)”，ScientistCo.April30，1980，PP.160-163〕。另據(jù)記載，干蚯蚓的水或乙醇提取物具有部分溶血作用〔KenjiroIkawa，YamaguchiIgaku，Vol.9.PP.571-576(1960)〕。然而，已證實，按本發(fā)明方法制備的干蚯蚓粉沒有這類溶血作用。
H.給高血壓或低血壓病人口服干蚯蚓粉將本發(fā)明的干蚯蚓粉經(jīng)口服施用于接受本試驗的14名志愿者(7男和7女)，其中包括8名高血壓病人(4男和4女)、6名低血壓病人(3男和3女)。為此，采用膠囊劑A、膠囊劑E和膠囊劑F。膠囊劑A是按下文實施例4的方法制備的(每顆含150mg干蚯蚓粉產(chǎn)物M-2，M-2的含水量為10.4%、含灰量為5.3%、含氮量為8.6%)，膠囊劑E是按下文實施例11的方法制備的(每顆含150mg干蚯蚓粉產(chǎn)物M-4，M-4的含水量為10.6%，含灰量為5.6%、含氮量為9.6%)，膠囊劑F是按下文實施例12的方法制備的(每顆含150g干蚯蚓粉產(chǎn)物M-5，M-5的含水量為9.5%、含灰量為4.5%、含氮量為7.8%)。使用劑量為每日三次，每次一粒，飯后30分鐘內(nèi)口服。連續(xù)口服2至11個月。在此期間，頭兩個月內(nèi)，每隔1至2周觀察病人;此后，每隔1個月觀察病人。由此得到的結(jié)果顯示于表13。將本發(fā)明的干蚯蚓粉施用于高血壓病人后，其高壓和低壓均下降了約30mmHg。更具體地說，高血壓病人的高壓下降了30至39mmHg，低壓下降了26至34mmHg。血壓恢復(fù)到正常水平后，可穩(wěn)定3至7個月。另一方面，將本發(fā)明的干蚯蚓粉施用于低血壓病人后，血壓上升了15至30mmHg。更具體地說，低血壓病人的高壓上升了20至30mmHg，低壓上升了15至22mmHg。血壓恢復(fù)到正常水平后，可穩(wěn)定3至5個月。雖然含本發(fā)明干蚯蚓粉的膠囊劑要使用長達2至11個月，但未見出現(xiàn)血壓異常下降或異常上升，也未見有任何其他副作用產(chǎn)生。
由此可見，含有以本發(fā)明的干蚯蚓粉為活性成分的血壓調(diào)節(jié)制劑或抗高血壓和/或抗低血壓制劑對人體具有和緩的降壓和/或升壓作用，可使血壓和緩地下降和/或上升，因而可長時間安全使用，既可治療、也可預(yù)防高血壓和低血壓。
表13病人治療前的血壓治療(mmHg)姓名性別年齡高壓低壓膠囊劑類型時間(月)K.H.男57165110A2T.S.男62169110E10F.H.男58167115F4K.S.男70172118E10Y.S.女69167114A8I.S.女62165112E9A.M.女79172120F11S.Y.女73162116E9I.Y.男4210265A6N.K.男3610052E10K.G.男4610560F8K.Y.女3410064A6N.M.女3210862E3K.M.女2910456F3
治療后的血壓停止治療后(mmHg)觀察時間血壓(mmHg)高壓低壓(月)高壓低壓1338471358313282613085131857132851368431348213280413083135836132801378841368613286313482132805130761257431267312875312572124804126771287831267612674312773實施例1片劑A干蚯蚓粉(與前述M-3的組成相同)150mg甘露醇123mg羥丙氧甲基纖維素7mg滑石粉5mg微晶纖維素60mg硬化蓖麻油5mg總計350mg
片劑B干蚯蚓粉(與前述M-3的組成相同)150mg玉米淀粉60mg乳糖80mg滑石粉7mg硬脂酸鎂3mg總計300mg片劑C干蚯蚓粉(與前述M-3的組成相同)150mg可溶淀粉20mg玉米溶粉125mg微晶纖維素45mg氧化硅6mg硬脂酸鎂4mg總計350mg按上述各配方，將各種成分均勻地混合。然后，采用制片機，將產(chǎn)生的粉末制成具有規(guī)定重量的片劑。
實施例2顆粒劑A干蚯蚓粉(具有與前述M-2相同的組成)150mg乳糖20mg微晶纖維素60mg玉米淀粉15mg羥丙基纖維素5mg總計250mg
根據(jù)上述配方，采用流化床制粒機制備顆粒劑。具體方法是將干蚯蚓粉、乳糖、微晶纖維素和玉米淀粉充分混合。向形成的混合物噴酒作為粘合劑的5%羥丙基纖維素的水溶液，然后于低溫下干燥，制成顆粒劑。
實施例3顆粒劑B干蚯蚓粉(具有與前述M-2相同的組成)100mg甘露醇10mg微晶纖維素85mg羧甲基纖維素鈣2mg硬脂酸鎂1.5mg硬化油1.5mg總計200.0mg顆粒劑C干蚯蚓粉(具有與前述M-2相同的組成)150mg乳糖53mg玉米淀粉39mg土豆淀粉2mg滑石粉3mg硬脂酸鎂3mg總計250mg根據(jù)上述各配方，將各種成分均勻混合。然后，采用擠壓機，將得到的粉末混合物制成顆粒。
實施例4膠囊劑A干蚯蚓粉(具有與前述M-2相同的組成)150mg乳糖28mg微晶纖維素47mg甘露醇10mg玉米淀粉10mg聚乙烯吡咯烷酮2mg羥丙基纖維素3mg總計250mg按上述配方，利用流化床制粒機，制備顆粒劑。具體方法是除羥丙基纖維素外，將所有成分均勻混合。向得到的粉末混合物噴灑5%的羥丙基纖維素(作粘合劑)的水溶液，然后，于室溫下干燥，制成顆粒。最后，在每一硬質(zhì)膠囊殼中填入250mg上述顆粒劑，制成硬質(zhì)膠囊劑。
實施例5膠囊劑B采用實施例3中得到的顆粒劑C，在每一硬質(zhì)膠囊殼中填入250mg上述顆粒劑，制成硬質(zhì)膠囊劑。
實施例6膠囊劑C干蚯蚓粉(具有與前述M-3相同的組成)150mg磷酸氫鈣60mg磷酸二氫鈉10mg甘露醇28mg硬脂酸鎂2mg總計250mg
按以上配方，將各種成分均勻混合。然后，將得到的粉狀混合物(250mg)填入No.1明膠殼，制成膠囊劑。
實施例7腸溶片劑干蚯蚓粉(具有與前述M-1相同的組成)100mg甘露醇10mg微晶纖維素85mg羧甲基纖維素鈣2mg硬脂酸鎂1.5mg硬化劑1.5mg總計200mg按以上配方，將各種成分均勻混合，利用制片機，將得到的粉狀混合物制成片劑。然后，用以下腸溶組分包覆上述片劑，制成腸溶片劑。
包衣組分羥丙甲基纖維素鄰苯二甲酸酯14.8mg鄰苯二甲酸二辛酯2.3mg硬脂酸2.3mg輕質(zhì)氧化硅0.6mg總計20.0mg實施例8粉劑A干蚯蚓粉(具有與前述M-4相同組分)150mg甘露醇50mg玉米淀粉50mg總計250mg
粉劑B干蚯蚓粉(具有與前述M-4相同的組成)150mg磷酸氫鈣20mg玉米淀粉80mg總計250mg按以上各配方，用錐形攪拌機將成分均勻混合，制成粉劑。
實施例9栓劑A干蚯蚓粉(具有與前述M-5相同的組成)200mgWitepsolE-85540mgWitepsolW-351454mg對羥苯甲酸甲酯3mg對羥苯甲酸丁酯3mg總計2，200mg栓劑B干蚯蚓粉(具有與前述M-6相同的組成)200mg丁基羥基苯甲醚6mg半合成甘油酯2900mg總計3106mg按上述配方，將各種成分均勻混合、熔化。然后，將熔化物倒入鋁模中，將模子冷卻。
實施例10膠囊劑D干蚯蚓粉(具有與前述M-2相同的組成)150mg十二烷基硫酸鈉4mg磷酸二氫鈉1mg甘露醇93mg硬脂酸鎂2mg總計250mg按上述配方，將各種成分均勻混合。然后，將250mg的該粉狀混合物填入No.1明膠殼，制成膠囊劑。
實施例12膠囊劑F干蚯蚓粉(具有與前述M-5相同的組分)150mg十二烷基硫酸鈉2mg磷酸二氫鈉4mg甘露醇92mg硬脂酸鎂2mg總計250mg按上述配方，將各種成分均勻混合。然后，將250mg粉狀混合物填入No.明膠殼，由此制得膠囊劑。
實施例13用水對一公斤(約20000條)活蚯蚓(Lumbricusrubellus)輕洗，然后將蚯蚓置于4升含蘋果酸和檸檬酸(比例為1∶1)的酸性水溶液(pH6.2)中。在8℃的溫度下，將活蚯蚓于該溶液中保存3小時，使其消化道的污物基本被除去。此后，用水對活蚯蚓進行徹底洗滌，以除去其軀體表面的污物(例如泥和排泄物)。
接著，在混合器中將活蚯蚓濕磨，將得到的懸浮體放在盤里，于-30℃下冷凍40小時。然后，將凍懸浮體維持在-40℃下，同時于0.1mmHg的真空下凍干6小時，待盤架(其上置有盤子)的溫度升至30℃后，于0.1mmHg的真空下真空干燥所得到粉狀物6小時。此后，于50℃的盤架溫度、0.2mmHg的真空下進一步真空干燥10小時，然后于80℃、0.2mmHg的真空下真空干燥8小時。由此得到280g于蚯蚓粉產(chǎn)物(M-1)。
實施例14用水對一公斤活蚯蚓(Lumbricusrubellus)進行輕洗，然后將其置于含磷酸、酒石酸和乳酸(1∶1∶1)的酸性水溶液(pH5.5)中。將置于其中的活蚯蚓于10℃下放置2.5小時，以便使其消化道內(nèi)的污物基本被除去。此后，用水對活蚯蚓徹底洗滌，清除其軀體表面的污物(例如泥和排泄物)。
接著，在混合器中將活蚯蚓濕磨。將得到的懸浮體放入盤中，于-25℃下冷凍20小時。然后，將該冰凍懸浮體維持在-35℃，同時在0.1mmHg下，將其凍干7小時。在放有盤子的盤架溫度升到28℃后，于0.1mmHg的真空下將得到的粉狀物真空干燥10小時。此后，于40℃的盤架溫度、0.2mmHg的真空下進一步真空干燥13小時，然后于78℃的盤架溫度、0.1mmHg的真空下真空干燥8小時，由此得到275g干蚯蚓粉產(chǎn)物(M-2)。
實施例15用水對一公斤活蚯蚓(Lumbricusrubellus)進行輕洗，然后將其置于2升含蘋果酸的酸性水溶液(pH5.8)中。于13℃的溫度下將活蚯蚓在該溶液中放置3小時，使其消化道內(nèi)的污物基本被清除。此后，用水對活蚯蚓徹底洗滌，以除去其軀體表面的所有污物(例如泥和排泄物)。接著，用超均勻混合器(由NipponScikiK.K.生產(chǎn))，將活蚯蚓濕磨。將得到的懸浮體放在盤中，于-30℃下冷凍30小時。然后，使該冷凍懸浮體維持在-30℃下，同時于0.1mmHg的真空下凍干，時間持續(xù)8小時。當(dāng)放有盤子的盤架溫度升至25℃后，于0.1mmHg的真空下，將得到的粉狀物真空干燥7小時。此后，在0.1mmHg的真空下、于45°的盤架溫度，將粉狀物進一步真空干燥12小時，接著在0.1mmHg的真空下、于80°的盤架溫度真空干燥7小時。由此得到275g干蚯蚓粉產(chǎn)物(M-4)。
實施例16用水輕洗一公斤活蚯蚓(Lumbricusrubellus)，然后將其在3升10℃的新鮮水中放置16小時，使其消化道內(nèi)的污物基本被清除。此后，用水徹底洗滌活蚯蚓，以去除其軀體表面的任何污物(例如泥和排泄物)。接著，用超均勻混合器濕磨該活蚯蚓。將所得懸浮體置于盤中，于-25℃下冷凍15小時。然后，將該冰凍懸浮體維持在-35℃下，同時于0.1mmHg的真空下將其凍干6小時。待溫度上升到30℃后，于0.08mmHg的真空下，將所得粉狀物干燥10小時。此后，在0.2mmHg的真空下，于40℃，進一步將該粉狀物干燥15小時，接著在0.1mmHg的真空下、于78℃干燥8小時。由此得到245g干蚯蚓粉產(chǎn)物(M-3)。
實施例17用水將一公斤活蚯蚓(Lumbricusrubellus)徹底清洗五次，以去除其軀體表面的污物(例如泥和稻草碎物)。然后，將活蚯蚓放置在18℃的2.5升新鮮水中，放置時間為18小時，使其消化道內(nèi)的污物基本被清除。接著，用水對活蚯蚓進行輕洗，然后在超均勻混合器中濕磨之。將所得懸浮體置于盤中，于-40℃下冷凍24小時。然后，在將該冰凍的懸浮體維持在-40℃下的同時，于0.1mmHg的真空下，將其凍干，時間持續(xù)5小時。將溫度升至25℃后，于0.1mmHg的真空下，將所得的粉狀物干燥8小時。此后，在0.1mmHg的真空下，于45℃，進一步將該粉狀物干燥12小時，接著在0.1mmHg的真空下，于80℃干燥7小時。由此得到240g干蚯蚓粉產(chǎn)物(M-5)。
實施例18用水將一公斤活蚯蚓(Lumbricusrubillus)徹底清洗四次，以除去其軀體表面的污物(例如泥和排泄物)。然后，將活蚯蚓置于2.5升含蘋果酸和檸檬酸(1∶1)的酸性水溶液(pH5.7)中，在15℃下放置2.5小時，使其消化道內(nèi)的污物基本被清除。接著，用水對活蚯蚓進行輕洗，然后用混合器濕磨之。將所得懸浮體置于盤中，于-35℃下冷凍24小時。然后，在將懸浮體維持在-35℃的同時，于0.1mmHg的真空下將其凍干，時間持續(xù)7小時。放有盤子的盤架溫度升至22℃后，在0.1mmHg的真空下，將所得粉狀物真空干燥10小時。此后，在0.2mmHg的真空下、于42℃的盤架溫度，進一步將該粉狀物干燥15小時;最后，在0.1mmHg的真空下，于78℃的盤架溫度干燥7小時。由此得到265g干蚯蚓粉產(chǎn)物(M-6)。
實施例19將1.5g磷酸一氫鉀溶解于2.5升含檸檬酸的酸性水溶液(pH6.0)中。用水對一公斤活蚯蚓.(Pheretimacommunissima)進行輕洗，將活蚯蚓置于上述溶液中，于10℃下放置2小時，以除去其消化道內(nèi)的污物。此后，用水將活蚯蚓洗滌兩次，除去其其軀體表面的污物(例如泥、排泄物和稻草碎物)。接著，在混合器中將活蚯蚓濕磨。按實施例17中介紹的相同方法，將所得懸浮體凍干并真空干燥。由此得到280g干蚯蚓粉。
實施例20用水將一公斤活蚯蚓(Allolobophoracaliginosa)徹底清洗五次，以去除其軀體表面的污物(例如泥、排泄物稻草碎片)。然后，將活蚯蚓置于3升的酸性水溶液(pH5.7)中。所述溶液含琥珀酸(另外含1g乙酸鈉和0.5g硫酸鈉)。將活蚯蚓于13℃的上述溶液中放置2.5小時，以便清除其消化道內(nèi)的污物。
接著，用水對活蚯蚓進行輕洗，然后用均勻機濕磨之。按實施例18中所述的相同方法，將得到的懸浮體凍干并真空干燥。由此得到275g干蚯蚓粉。
實施例21用水將一公斤活蚯蚓(Pheretimacommunissima)徹底洗滌五次，以除去其驅(qū)體表面的污物(如泥、排泄物和稻草碎片)。然后，將活蚯蚓置于2.5升的酸性水溶液(pH5.9)中。所述水溶液含檸檬酸和酒石酸(1∶1)(另外含0.7g檸檬酸鉀)。使活蚯蚓于15℃的上述溶液中放置2小時，以便清除其消化道內(nèi)的污物。接著，用水對活蚯蚓進行輕洗，用混合機將其濕磨。按例18中所述的相同方法，將得到的懸浮體凍干并真空干燥。由此得到283g干蚯蚓粉。
如上所述，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)干蚯蚓粉的方法，該方法包含以下步驟將活蚯蚓放在新鮮水或略帶酸性的水溶液中，直至其消化道內(nèi)的污物被清除;對該活蚯蚓進行濕磨;于10mmHg或更低的真空度下，將所得的懸浮體凍干或真空干燥10至100小時，同時，將溫度由-60℃逐步升高至80℃，本發(fā)明還涉及含有以干蚯蚓粉為活性成分的抗高脂血、抗糖尿病、抗高血壓和抗低血壓制劑。
按本發(fā)明的新穎改良法生產(chǎn)的干蚯蚓粉中的酶不會被破壞或滅活。此外，按本發(fā)明方法生產(chǎn)的無菌干蚯蚓粉在良好封閉狀態(tài)下至少可保存4年。再者，根據(jù)用作原料的活蚓的不同，可以20%至35%的高收率制得干蚯蚓粉。
通過實驗(在該實驗中，用含有按本發(fā)明方法生產(chǎn)的干蚯蚓粉的高膽固醇食物喂養(yǎng)大鼠1周或四周)，證實本發(fā)明的干蚯蚓粉具有優(yōu)異的抗高脂血作用。在1周的實驗中，與用高膽固醇食物喂養(yǎng)的組比較，用含有干蚯蚓粉的食物喂養(yǎng)組的血清TC、FC、LDL-C和AI值均呈統(tǒng)計學(xué)顯著下降。然而，血清HDL-C未顯著改變。在4周的實驗中，與用高膽固醇食物喂養(yǎng)組比較，用含有干蚯蚓粉的食物喂養(yǎng)組的血清TC、FC、PL和NEFA值均顯著下降。此外，實驗證明HDL-C(被認為是改善動脈硬化的要素)顯著上升，AI值顯著下降。TG未顯著下降，雖然顯示出下降的趨勢。GOT和GPT下降顯著。
肝的重量水平，肝脂質(zhì)中TC和PL水平顯著下降，但TG沒有根本改變。大鼠體重穩(wěn)定增加，未有顯著變異。
于是，將干蚯蚓粉膠囊劑(每粒含干蚯蚓粉150mg)徑口服施用于4名志愿者6個月或7個月。使用劑量為每日三次，每次一粒，飯后服用。治療期間，測定血清TC、TG、HDL-C和AI的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個月或4個月后，TC和AI顯著下降。另一方面，HDL-C未明顯改變，但在6個月或7個月后，顯示出細微的上升趨勢。6個月或7個月后，TG明顯下降。
上述動物實驗及給病人口服用藥的實驗表明，本發(fā)明的干蚯蚓粉是一種安全、效果優(yōu)異的藥，可用于治療和預(yù)防高脂血，改善血清脂質(zhì)代謝，治療和預(yù)防動脈硬化。
本發(fā)明還涉及含以干蚯蚓粉為活性成分的抗糖尿病制劑。將干蚯蚓粉施用于由阿脲誘發(fā)的實驗用糖尿病小鼠后，其血糖水平呈統(tǒng)計學(xué)顯著下降。
于是，結(jié)合營養(yǎng)療法，將干蚯蚓粉膠囊劑(每粒含150mg干蚯蚓粉)經(jīng)口服施用于五名患糖尿病的志愿者。使用劑量為每日三次，每次一粒，飯后服用后各給連續(xù)治療4至9個月。在治療后1，2，3或4個月，至少以1個月為間隔，測定血糖量。為此，分別于早飯前、早飯后兩小時、午飯前、午飯后兩小時、晚飯前、晚飯后兩小時收集六種血樣，分析血糖水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過用干蚯蚓粉進行2個月或3個月的治療后，患中度糖尿病的病人開始好轉(zhuǎn)。經(jīng)過4個月以上的治療后，可使所有六個試驗值均恢復(fù)到其正常水平(每餐前得到的試驗值為50-100mg/dl，每餐后兩小時時獲得的試驗值為150mg/dl或150mg/dl以下)。就患嚴重糖尿病的病人而言，在一定程度上較難使所有六個試驗值恢復(fù)到其正常水平。然而，經(jīng)過8個月的治療后，產(chǎn)生了效果，即六個試驗值中的四個恢復(fù)到正常水平。即使長期用藥6至9個月，也不會產(chǎn)生低血糖之類的風(fēng)險，即不會使血糖水平降至低于其正常范圍的下限。由此可見，本發(fā)明的干蚯蚓粉是一種安全、效果優(yōu)異的藥，可用于治療和預(yù)防糖尿病。
本發(fā)明還涉及含以干蚯蚓粉為活性成分的血壓調(diào)節(jié)制劑或抗高血壓和/或低血壓制劑。若將本發(fā)明的干蚯蚓粉經(jīng)口服施用于SHRs，用藥后1至2小時內(nèi)，血壓下降了28至35mmHg。這一降低血壓作用持續(xù)6小時。本發(fā)明的干蚯蚓粉不產(chǎn)生副作用(如心動過速和溶血)，是一種具有良好保藏性的安全藥。
此外，經(jīng)口服，把通過本發(fā)明方法制備的干蚯蚓粉膠囊劑(每粒含150mg干蚯蚓粉)施用于14名志愿者(8名高血壓病人、6名低血壓病人)，持續(xù)用藥2至11個月。使用劑量為每口三次，每次一粒，飯后服用。這些制劑具有使高血壓病人血壓降低以及使低血壓病人血壓升高的作用，從而可使這些病人的血壓恢復(fù)到其正常水平。另外，通過服用這些制劑而達到的正常血壓水平可穩(wěn)定3至7個月。在治療期間，未發(fā)生血壓的異常下降或異常上升，也未觀察到任何其他副作用。
由此可見，本發(fā)明的制劑是安全、具有卓越療效的藥，可用作血壓調(diào)節(jié)劑(或治療高血壓和/或低血壓藥)或用作高血壓和/或低血壓的預(yù)防劑。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)干蚯蚓粉的方法包括(a)將活蚯蚓洗凈，即將活蚯蚓置于新鮮水或含不超過0.3%(重量)的至少選自下述一種化合物的水溶液中清洗，直至其消化道內(nèi)的污物被清除，所述化合物選自有機酸、無機酸、有機酸的鈉鹽、無機酸的鈉鹽、有機酸的鉀鹽和無機酸的鉀鹽，然后用水對活蚯蚓洗滌，以除去其表面軀體上的所有污物，或者用水清洗活蚯蚓，以除去其軀體表面上的所有污物，然后將活蚯蚓置于新鮮水或所述水溶液中，直至其消化道內(nèi)的污物被清除；(b)將活蚯蚓濕磨；(c)在-60℃至-10℃的溫度下，將得到的懸浮液冷凍；(d)在10mmHg或10mmHg以下的真空下，將懸浮液凍干，然后真空干燥10至100小時，同時使溫度由-60℃逐漸升至80℃，最后，在0.01mmHg至0.5mmHg的真空下，于70℃至80℃，將得到的粉狀物真空干燥5至10小時。
2.按權(quán)利要求1的方法，其中，將活蚯蚓置于新鮮水或水溶液中，直至其消化道內(nèi)的污物被除去，然后用水對活蚯蚓進行洗滌，以除去其軀體表面上的所有污物，從而將活蚯蚓洗凈，此后，使其經(jīng)步驟(b)至(d)的處理。
3.按權(quán)利要求2的方法，其中先用水對活蚯蚓進行洗滌，以除去至少一部分污物，然后將活蚯蚓置于新鮮水或所述水溶液中。
4.按權(quán)利要求1的方法，其中，用水洗滌活蚯蚓，以除去其軀體表面上的所有污物，然后將活蚯蚓置于新鮮水或所述水溶液中，直至其消化道內(nèi)的污物被清除，從而將活蚯蚓洗凈，此后使其經(jīng)步驟(b)至(d)的處理。
5.按權(quán)利要求4的方法，其中在活蚯蚓消化道內(nèi)的污物被清除后，用水進一步洗滌活蚯蚓，以除去其軀體表面上的所有污物。
6.按權(quán)利要求1至5之任一項的方法，其中有機酸為乙酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸或乳酸。
7.按權(quán)利要求1至5之任一項的方法，其中無機酸是磷酸、硫酸或鹽酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)干蚯蚓粉的方法，該方法包括下述步驟將活蚯蚓置于新鮮水或略帶酸性的水溶液中，直至其消化道內(nèi)的污物被清除；將活蚯蚓濕磨，凍干，然后在10mmHg或低于10mmHg的真空下，將所得懸浮體真空干燥10至100小時，同時使溫度由-60℃逐漸升至80℃?？蓪⒃摳沈球痉叟c藥物上可接受的載體結(jié)合，制成藥物組合物，用來治療或預(yù)防人類的高脂血、糖尿病、高血壓和低血壓。
文檔編號A61K35/56GK1031653SQ88106168
公開日1989年3月15日 申請日期1988年8月18日 優(yōu)先權(quán)日1987年8月18日
發(fā)明者石井陽一, 美原恒 申請人:株式會社艾美