專利名稱:小滴生成的制作方法
本發(fā)明是關(guān)于小滴生成，特別是有關(guān)在微膠囊中活細胞或個體細胞的包囊的小滴生成。
在過去二十多年，為了提供既可生物上適應于身體組織又對免疫系統(tǒng)的組分不滲透的半透性微膠囊，已進行了各種試驗。在美國專利№4352883和4391909中對Franklin Lim所作的描述是這些試驗中有代表性的。
如上述文獻所述，將活組織或個體細胞懸浮在一種可逆凝膠材料，典型的是藻朊酸鈉水溶液中，使這一懸浮液的小滴滴入硬化溶液，典型的是氯化鈣。然后將這樣生成的暫時膠囊用聚賴氨酸和聚乙烯亞胺處理以形成一層半透性外衣。通過鈣離子的離子交換將核心材料重新液化。
在動物身體中，用這一現(xiàn)有技術(shù)方法制得的微膠囊的存活時都小于三周。由此，在治療需要器官移植的疾病，如糖尿病和肝病時，嚴格限制了使用這一現(xiàn)有技術(shù)的包囊方法。
在歐洲專利申請№0127713和0127969中(這兩項申請均已于1984年12月12日出版)，公開了對上述現(xiàn)有技術(shù)方法(該方法形成一半透性膜，該膜既是生物上相容，又能保護移植的組織和細胞不受免疫系統(tǒng)的破壞)的改進，在動物試驗中，在動物試驗中，這樣的改進使得囊島的一次腹膜內(nèi)移植使糖尿狀態(tài)逆轉(zhuǎn)一年以上。
上述出版專利申請的方法的成功是由于一層半透性的和耐火的膜，該膜具有一層生物相容的負電荷材料的外表面。這些微膠囊的改進了的耐火性，即耐破裂性，是由于其幾乎完全的球面形狀和增加了的囊膜厚度。
盡管上述出版的申請制得的微膠囊在治療需要器官移植的疾病方面顯示了重大的進展，但有一個缺點，它阻礙了更理想的使用該微膠囊，這一缺點是由于個體的微膠囊的相對大的尺寸而造成的，它的直徑為700-1000微米。按照Lim的專利方法制得的微膠囊也具有大約1000-2000微米相對大的直徑。具有這樣直徑的微膠囊不能直接注射入心血管系統(tǒng)，因為它們會閉塞血管。因此，微膠囊必須植入大的體腔內(nèi)，如腹膜內(nèi)腔。
在心血管以外的身體區(qū)域植入的位置導致增加微膠囊對改變血液狀態(tài)的反應時間，因為微膠囊不直接與血流接觸。此外，與微包囊的組織或細胞比較，微膠囊的相對大的尺寸(例如，對郎格罕氏島約為200微米)結(jié)果對通過微膠囊中心的分子產(chǎn)生高的擴散阻力。
一種空氣噴射-注射泵擠出方法被用于上述出版的申請的方法和Lim的專利，從而從島在藻朊酸鈉的水溶液的懸浮液中制備含有包裹著島，或其它組織或細胞的凝膠小滴。在這一方法中，將藻朊酸鈉溶液擠壓通過位于一套管的內(nèi)部的針，通過該管，空氣以控制的速率流動。當通過注射泵迫使液體小滴壓出針端時，小滴由于快速流動的空氣造成的剪切力而完成。容積的空氣流速愈高，剪切力愈強，小滴從針端脫開愈快，產(chǎn)生的小滴愈小。
然而，這一現(xiàn)有技術(shù)的方法中存在著固有的限制，該限制阻礙了制得尺寸小于約700微米的微膠囊。這些限制是，形成凝膠的液體的粘度必須大于一個最低粘度以形成完全球形膠囊，針的最小內(nèi)部直徑必須大于300微米以便避免島對針的阻塞，空積空氣流速必須保持在2000毫升/分鐘以下以制得均勻直徑的膠囊。
現(xiàn)在，我們發(fā)現(xiàn)了一種生成完全球形，平滑和均勻小滴的改進了的方法和設備，這樣使得由此能制得完全球形的，平滑和均勻的微膠囊，該膠囊直徑小于700微米，較好的約為150-500微米。這樣的微膠囊構(gòu)成了本發(fā)明的一個方面。
該新型微膠囊是由生物相容的材料制成并含有活組織或細胞作為核心材料。較好的核心材料為郎格罕氏島，以便通過心血管注射生物相容的微包囊的郎格罕氏島實現(xiàn)長期控制患糖尿癥的動物，包括患糖尿病的人類的血糖水平。
按照本發(fā)明提供的較小直徑微膠囊，例如200-300微米，允許把微膠囊直接注射入血流，因此它們最終可以注入身體器官，如肝或脾內(nèi)部，該處以新鮮血流不斷地將它們洗滌。微膠囊和血液之間的直接接觸大大地減少了被包囊的組織或細胞對任何生化變化的反應時間并由此提高了其效率。此外，較小的微膠囊導致對通過微膠囊核心的分子有較低的擴散阻力，進一步提高了細胞的效率。結(jié)果，為了達到延長控制糖尿癥病人的血糖水平，每公斤受主體重只需移植極少量較小直徑的包囊的郎格罕氏島。
也可以將含活組織的膠囊注射入或植入待治療的身體的任何其它合適位置，盡管這一給藥方式由于上述理由不是很好。
按照本發(fā)明所提供的小直徑微膠囊在開始的凝膠小滴生成階段是通過使用一靜電小滴發(fā)生器形成的。在這一方法中(該方法構(gòu)成本發(fā)明的第二方面)，使自原料中懸浮出來的一個小滴，充有高壓靜電壓，并且使第二個位置，例如收集容器被充有相反極性的電壓，以便吸引該小滴。當通過在這兩個位置之間的電壓差閾值時，該小滴從原料處向第二位置移動并因此到達收集容器。
發(fā)生一個可調(diào)的電壓脈沖并通過一注射泵施加該電壓于針端形成的小滴。使電壓脈沖的振幅，脈沖頻率和脈沖寬度與配制的材料量同步，以便能夠使已知尺寸的小滴重復產(chǎn)生并被收集。
用參考
的方法進一步闡明本發(fā)明，其中圖1是按照本發(fā)明一個實施例繪制的小滴生成發(fā)生器的示意圖;
圖2是按照本發(fā)明的第一個實施例繪制的小滴生成發(fā)生器的示意圖;
圖3是施加于圖1或圖2小滴發(fā)生器的電流所需電路的示意及方塊圖以及;
圖4是圖3小滴發(fā)生器電路輸出波形的曲線圖。
參考附圖，圖1表示按照本發(fā)明實施例繪制的小滴生成設備10，如該處所示，非導電的，通常是聚合材料組成的注射器12含有一種小滴形成液體14，該液體含有活細胞。通過一個注射泵18推動柱塞16使小滴20從一個不銹鋼注射針22的低端擠出(針22與注射器12的低端相通)，擠向含有硬化溶液26的收集容器24，在含有藻朊酸鈉的小滴形成溶液的情況下，硬化溶液可以是氯化鈣水溶液。
當電脈沖發(fā)生器的負端導線同硬化溶液相連接時，電脈沖發(fā)生器(見圖3)的正端導線28就同針22相連接。
如果需要，可以使針22在其外尖端27做成斜邊。尖端27位于高在收集容器24中接受介質(zhì)26的頂部的特定距離處，該收集容器與施加到二者之間以實現(xiàn)小滴生成的電壓脈沖保持協(xié)調(diào)一致。小滴的尺寸可通過下列因素予以開變改變針尖27和液體之間的距離，則距離越短導致小滴越小;改變導線28和30所施加的電壓，則用高電壓導致較小的小滴;改變所施加的脈沖長度，則用較小電脈沖長度可導致較小小滴;改變泵18的速度則降低泵的速度導致較小的小滴。
圖2用圖解說明了一種可選擇的裝置，在該裝置中，將來自脈沖發(fā)生器的正導線28與針22分離而代之以使其連結(jié)到不銹鋼環(huán)32上，該環(huán)安裝在非導電材料的錐形支座34的低端上，該支座包圍并延伸到針22的下面。負導線30被連結(jié)到針22而不是連結(jié)到接收介質(zhì)26。在這一裝置中，針22的尖端27和接收介質(zhì)26之間的距離不影響凝(接下頁)膠小滴的尺寸。
在圖1和圖2上的小滴生成期間，由導線28和30所施加的靜電壓導致凝膠小滴的直徑為小于約700微米，較好的為約150-約500微米。然后可以將這些小滴用一種半透性，生物相容的膜的薄涂層包衣。所生成的微膠囊小到使用一根固定在注射器上的18號針足以將其注射入動物體內(nèi)。
因為在小滴生成期間所施加的電壓是靜電壓，所以被包囊的活組織，如郎格罕式島或活細胞的活性不受破壞，從而被包囊的活組織能夠進行新陳代謝。
現(xiàn)在來參考附圖的圖面3和4，圖3說明了一臺靜電脈沖發(fā)生器110，該發(fā)生器適用于發(fā)生通過圖1或2的設備在小滴生成期間被施加的靜電脈沖。
正如該處所見到的那樣，脈沖發(fā)生器110包括一個隔離電源112(可以與任何所希望的電源相連接)，邏輯電路114，控制盤116，該控制盤具有供脈沖頻率118、脈沖寬度120和高壓輸出112的調(diào)節(jié)按鈕，一臺脈沖放大器124，和一臺高壓變壓器及整流器126。該整流器輸出到電流導線28和30。
通過導線28和30通向小滴生成設備10的脈沖電壓，脈沖頻率和脈沖寬度，根據(jù)所需要的小滴尺寸可以各自作很大地改變。決定從針22端拉下小滴的拉力的強度的脈沖電壓通常在從約1至25千伏間變化。決定施加于小滴的脈沖數(shù)量的脈沖頻率，通常在從約10到約100秒-1間變化。決定被施加小滴生成中的時間所要求的脈沖寬度，通常在從約1到6米·秒間變化。圖4進一步說明了各種不同時間周期的相互影響及其意義。這些值與由針所分配的材料量相協(xié)調(diào)以得到均勻尺寸的小滴。
這些專門設計的參數(shù)保證了沒有任何的電壓重疊，因為一個脈沖隨著每個脈沖存在每10至100米·秒，會延長1-6米·秒。因此，在脈沖之間存在4米·秒的最低值和99米·秒的最高值。此外，有一個低的基本電壓，該電壓在脈沖之間的適當位置上保持生成小滴。
在靜電分選生物細胞的裝置，分配油漆和/或聚合物的靜電噴霧以及供油墨印刷用的靜電小滴發(fā)生器的現(xiàn)有技術(shù)中有大量的例子。在美國專利№4347935，4395716和4097373以及英國專利№1346301中有這些裝置的說明性例子。在這些在先的專利中所公開的小滴發(fā)生器使用了開始生成小滴用的一種外部激勵源，如聲頻振蕩。小滴只是在它們離開發(fā)生器后才荷有靜電;而在本發(fā)明中，小滴生成液體14通過高靜電壓直接充電。在現(xiàn)有技術(shù)的裝置中，外部振蕩源引起小滴的生成;而在本發(fā)明中，通過直接靜電相互作用而制得小滴。
本發(fā)明的小滴發(fā)生器能夠制備非常小的，球形的，含有活細胞的小滴，同時小滴生成的每一步是在操作人員的直接控制之下。
盡管這里公開的主要是針對上面概述的專門目的和優(yōu)點的對活組織或細胞的包囊，但應理解，這里所公開的靜電小滴生成方法和設備可在其他領(lǐng)域應用，例如可能用于油漆噴涂和油墨印刷。
在本發(fā)明中，活組織或個體細胞是以水凝膠的形式被包囊在生物相容的半透性膜中。將被包囊的材料懸浮在含有水溶性物質(zhì)的生理上相容的介質(zhì)中，該水溶性物質(zhì)能可逆地被形成膠體以提供一種對組織的暫時保護環(huán)境。使用本發(fā)明的小滴發(fā)生方法使該介質(zhì)形成含有組織的小滴，并通過例如，改變溫度條件，PH或離子環(huán)境使形成膠體，以生成基本上完全球面形狀的暫時性膠囊。而后將所生成的暫時膠囊處理，使在保持形狀的暫時膠囊周圍，形成一層控制滲透性和荷有負電外表面的膜。該膜的半滲透性質(zhì)容許養(yǎng)分和氧流動到核心材料以及代謝物質(zhì)由此流出，同時在微膠囊范圍內(nèi)保持核心材料。該半透性膜的生物相容性質(zhì)容許這種材料向核心及由核心通過而不發(fā)生炎癥和有害的身體反應;同時荷負電的外表面抑制了表面細胞的生長，使得膜在延長的時間周期內(nèi)(典型地從3-6月或更長)，保持半透性和有效。
暫時性膠囊可以由任何無毒的水溶性物質(zhì)構(gòu)成，該物質(zhì)可通過改變在其中放置的介質(zhì)的條件形成膠體生成一種保持形狀的物質(zhì)，該物質(zhì)還含有一個以上的基團，該基團易于離子化以形成陰或陽離子基團。這樣的基團的存在，當使其受到含有相反電荷的多官能度聚合物作用時，能夠使膠囊的表面層交鏈，而形成持久的膜。
暫時性膠囊較好地是由一種多糖樹膠構(gòu)成，該膠可以是天然的，或是合成的，該膠的類型是能夠通過在某些條件下使其變化而形成膠體，以生成一種保持物質(zhì)的形狀，也能被含有反應基團，例如氨基團，這些基團能與酸性多糖組分作用的聚合物持久地交聯(lián)或硬化。樹膠最好是堿金屬藻朊酸鹽，特別是藻朊酸鈉，盡管也可以使用其它水溶性樹膠。
暫時性膠囊可以通過把藻朊酸鈉水溶液小滴擠壓入氯化鈣水溶液由藻朊酸鈉構(gòu)成。較好的是，暫時性膠囊基本上是球形的，以使能生成供心血管注射的完全球形的微膠囊。通過使用藻朊酸鈉水溶液，該溶液的粘度至少為約30厘泊，而生成基本上完全球形的暫時性膠囊粘度低于這一極限下限時，暫時性膠囊生成一個不規(guī)則的形狀。完全球形的膠囊在藻朊酸鈉溶液的粘度大于30厘泊的廣泛范圍內(nèi)得到，粘度的上限在很大程度上取決于將該溶液擠壓入硬化介質(zhì)中的能力。但是，也發(fā)現(xiàn)，在至少約為30厘泊粘度時得到的完全球形小滴的最小尺寸，隨著粘度的增加而增加。
在暫時膠囊周圍持久半透性膜的形成最好是通過凝膠和生物相容的聚合物的表面層中游離酸基團之間的離子反應實現(xiàn)，該聚合物含有酸反應基團，如氨基團，典型地是在所選擇聚合物的稀水溶液中實現(xiàn)。
可以使用的交聯(lián)生物相容的聚合物包括聚氨基酸類，較好的為聚賴氨酸。注意，聚乙烯亞胺和其它含亞胺的聚合物，由于它們的非生物相容的性質(zhì)，不適于膜的生成。優(yōu)選的聚賴氨酸的分子量應控制在約10000至30000的窄范圍內(nèi)，較好地約為17000，以達到所要求的膜的孔隙度。使用聚賴氨酸或其它聚氨酸導致微膠囊具有荷正電的表面，這不適于長時期的生存性，盡管該微膠囊是生物相容的。使聚賴氨酸或其它氨基酸作用一個足以發(fā)展一層堅實的膜厚度的時間周期，以便提供下面提到的供后反應的表面基團的具體數(shù)字，提供允許在體內(nèi)注射的足夠的結(jié)構(gòu)強度和容許在體內(nèi)保持結(jié)構(gòu)完整性的足夠量的生物相容的聚合物，這些對長期在體內(nèi)生存是重要的。通常，對上面提到的分子量范圍的聚賴氨酸，為達到這些結(jié)果需要至少6分鐘的反應時間，較好地至少約9分鐘，一般達到約9分鐘。這些反應時間造成聚賴氨酸厚度約為5微米。
出乎意料，用于與暫時膠囊反應的聚賴氨酸水溶液的實際強度在濃度值超過約0.05重量%時，不影響膠囊壁的厚度。
隨后，將通過與聚氨基酸反應在暫時膠囊周圍生成的半透性膜和一種無毒的，生物相容的水溶性聚合材料反應，該材料能與游離氨基團離子反應，以在膜的周圍生成一層外面荷負電的包衣，典型地是通過把微膠囊懸浮在該聚合材料的水溶液中，進行這一反應。用以形成包衣的材料，較好的是和用來形成暫時膠囊一樣的材料，較好的是一種多糖樹膠，更好地是一種堿金屬藻朊酸鹽，如藻朊酸鈉。含有堿反應基團的其它生物相容的聚合材料，如聚乙烯醇和聚β-羥基丁酸，也可以用以形成微膠囊的外包衣。這種聚合材料的分子量典型地可從約104到約106變化。
含有氨反應基團的生物相容的水溶性聚合材料與半透膜的外部氨基團反應形成一層包衣。包衣持久地復蓋聚氨基酸層，不過完整地留下半透性的孔隙度，同時提供了一層荷負電的表面。由于延長反應時間所形成的在聚氨基酸膜上表面氨基團的數(shù)目，外面荷有負電的聚合物包衣在體內(nèi)降解和分離，以使荷正電的表面不暴露于身體環(huán)境。
用生物相容的堿反應材料處理聚氨基微膠囊，保持了半透膜的全部生物相容性質(zhì)并導致一層荷負電的外表面，該表面抑制細胞生長并從而容許半透性膜在延長的時間周期范圍內(nèi)，保持其滲透性并從而保持效率。
在微膠囊生成以后，核心材料懸浮介質(zhì)的重新液化可以通過重新建立條件而實現(xiàn)，在該條件下，材料是液體。這可以通過離子交換除去多價陽離子，例如通過浸入磷酸鹽緩沖鹽水或檸檬酸鹽緩沖劑中而達到。重新液化的步驟，盡管對降低擴散阻力是有益的，但對提供一種有效的產(chǎn)品不是必需的，從而可以省去，因為已經(jīng)表明，在內(nèi)部沒有重新液化的微膠囊中被移植的島(大鼠移植給小鼠)在降低糖尿癥動物的血糖水平中，同樣有效。出乎意料，藻朊酸鈣凝膠核心在身體內(nèi)部并不重新液化，因為直到在植入一年以后從糖尿癥動物回收的微膠囊中，發(fā)現(xiàn)了完整無損的凝膠核心。
本發(fā)明的方法可以用于包囊活組織，它們的多細胞部分或個體細胞，例如郎格罕氏島，肝細胞和紅血細胞，及其它生物活性材料。生成的微膠囊可以被移入哺乳的動物身體內(nèi)的一個適當位置，以便為該組織提供特殊的生理功能，同時該組織保持活性。可以通過簡單的注射達到植入，從而不需要外科手術(shù)。如前所述，由于從靜電小滴生成方法形成的較小直徑的微膠囊，可以進行心血管注射。
微膠囊的核心含有活組織細胞和一種足以保持該組織并容許其正常代謝作用的水溶液營養(yǎng)介質(zhì)。該細胞是活的，有生理活性并能進行代謝作用。
包囊核心材料的生物相容的半透性膜，由多層離子相互作用的生物相容的互相貫穿層組成。半透性膜的整個壁厚度通常在從約4微米到約6微米變化。微膠囊本身直徑在小于約700微米范圍內(nèi)，對含有郎格罕氏島作為核心材料的微膠囊，直徑較好的是在約150到500微米范圍內(nèi)。生物相容的半透性膜是以水凝膠形式并從而在膜結(jié)構(gòu)內(nèi)含有全部水含量，至少約20重量%，該含量根據(jù)聚氨酸的分子量可以變化到約95重量%。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施例中，活細胞被包囊在聚賴氨酸-藻朊酸鹽半透性水凝膠內(nèi)。一開始就將細胞均勻地懸浮在藻朊酸鈉生理鹽水中。在微膠囊被使用于通過控制動物，包括人類的血糖，治療糖尿病的場合，活細胞采取來自動物胰腺的郎格罕氏島的形式。
含有細胞的球形小滴，用本發(fā)明的小滴生成方法從藻朊酸鈉水溶液中制得，并以凝膠球收集在硬化溶液，如氯化鈣中。該凝膠球用聚賴氨酸，隨后以藻朊酸鈉包衣。然后可以將微膠囊懸浮在等滲的檸檬酸鈉或其它合適的離子交換介質(zhì)中使微膠囊內(nèi)部的藻朊酸鹽重新液化，以使細胞恢復流動狀態(tài)。如前所述，這一步驟如有必要可以省去。
該生物化學上不活潑但生物相容的藻朊酸鹽表面是一種含有高達約95%水的荷負電的水凝膠。外部凸起的凝膠表面和水溶液生物環(huán)境之間的低界面間張力，使蛋白蛋相互作用降至最低，否則，強烈的蛋白質(zhì)-聚合物相互作用可以引起激烈的炎癥反應。水凝膠膜的生物相容性在植入時導致了膠囊的長時期活性。聚乙烯亞胺-表面的微膠囊看來不具有這一特性，因為它們產(chǎn)生強烈的炎癥反應并因此被身體排斥，這嚴格地限制了微膠囊在體內(nèi)的使用期限。大多數(shù)水凝膠的軟橡膠狀稠性，由于減低對周圍組織的摩擦刺激，也可以有助于生物相容性。
微膠囊的強度可以在凝膠重新液化前(如果進行重新液化的話)通過附加交聯(lián)，例如使用戊二醛，提高。
對體內(nèi)植入，生物相容的外表面不是必需由藻朊酸鈉組成，但外表面必須是生物相容的并且荷有負電。在生物相容的外表面材料的荷負電基團，通常是羥基，羰基團和正聚賴氨酸上的荷正電氨基團之間發(fā)生結(jié)合。
利用本發(fā)明從而得到了能夠長期在體內(nèi)的生物相容的微膠囊，該微膠囊并具有使其適于注射活組織進入血流的直徑，因此，使微膠囊可以注入身體器官內(nèi)部并在那里進行代謝作用。雖然本發(fā)明的較小微膠囊的主要益處是在體內(nèi)使用，但也可以將含有活組織的微膠囊放在各種玻璃試管使用。
除了制備含有活組織或細胞的微膠囊外，本發(fā)明也可根據(jù)對微膠囊所預定的最終用途方面，用于形成含有各種其它核心材料的微膠囊。
通過以下實施例說明本發(fā)明。
實施例1這一實施例說明了使用一種靜電小滴發(fā)生器生成小直徑凝膠小滴。
安裝一臺如圖1中說明的設備。將1.5%重量/體積藻朊酸鈉溶液(14)置于10毫升注射器(12)中，在該注射器上連接一根有90°斜角出口的22號不銹鋼針(22)。將正極導線(28)連接到針的金屬平滑固定部分，將針-注射器組合裝置連接到注射泵(18)。將1.1%氯化鈉溶液(26)傾注入4″×1″培養(yǎng)皿(24)中，將負極導線(30)連接到該培養(yǎng)皿。把培養(yǎng)皿(24)放置在適當位置，使得其中的液體表面離開針(22)尖端為10毫米。
將控制盤(116)上脈沖電壓刻度(122)置于12千伏，脈沖頻率刻度(118)置于20秒-1，脈沖長度刻度(120)置于2米·秒，注射泵速度置于4毫開/小時。將注射泵(18)和小滴發(fā)生器都打開，使得藻朊酸鈉液體小滴(20)由針(22)的尖端(27)拉出，并在加氯化鈣溶液進入培養(yǎng)皿(24)時形成藻朊酸鈣凝膠小滴并在該處收集。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的藻朊酸鈣凝膠小滴是完全平滑和球形的并具有300(±50標準差)微米的平均直徑。
這一實施例所用的注射器針(22)的直徑和現(xiàn)有技術(shù)空氣噴射注射器中所用的相同，在現(xiàn)有技術(shù)中使用空氣噴射注射器，將快速流動的空氣流用來使藻朊酸鈉液體小滴從針(22)的尖端(27)分離，可得到的藻朊酸鈣凝膠小滴的最小直徑為700微米。因而，這一實施例中所述的靜電方法能夠使凝膠小滴直徑降低到大約該值的一半。
實施例2這一實施例說明了使用一種小滴生成的可選擇形式形成小直徑凝膠小滴。
重復實施例1的操作，所不同的是使用圖2的設備，即把負極導線(30)連接到針(22)上，把正極導線(28)連接到金屬環(huán)裝置(32)上，該裝置配置在針(22)尖端的下方。將金屬環(huán)(32)置于離針(22)的尖端(27)下方7毫米處，將不荷電的培養(yǎng)皿(24)置于離環(huán)組件下方約5厘米處。
用這一方法制得并收集在培養(yǎng)皿中的藻朊酸鈣凝膠小滴被觀察到是完全平滑和球形的并具有平均直徑為450(±65標準差)微米。當使用相反的電荷重復該試驗時，觀察到凝膠小滴直徑的較大變化，凝膠小滴直徑的標準差(SD)大約加倍。
實施例3這一實施例說明了活組織在通過靜電小滴發(fā)生器的活性。
重復實施例1的操作，所不同的是將從狗的胰腺組織中提取出的郎格罕氏島以500個島/2毫升的濃度加入注射器中的藻朊酸鈉溶液中，并用鹽水代替氯化鈣溶液，因而在這一試驗中，凝膠小滴不生成。在通過靜電小滴發(fā)生器以后，使用錐蟲蘭染色表明，100%的島是存活的。當在顯微鏡下觀察時，全部島呈現(xiàn)白色，沒有任何死島特有的蘭色外觀的痕跡。
實施例4這一實施例說明了含有郎格罕氏島的小的半透性微膠囊的生成。
將培養(yǎng)的大鼠郎格罕氏島(在0.2毫升培養(yǎng)基中有2×103個島)均勻地懸浮在2毫升1.5%(2/2)藻朊酸鈉生理鹽水溶液(粘度51厘泊)中。使用一個靜電小滴發(fā)生器采用實施例1的操作制得含有島的球形小滴，并收集在1.5%(重量/重量)氯化鈣溶液中。將上層清液泌去并用CHESC(2-環(huán)己氨基乙烷磺酸)溶液和1.1%氯化鈣溶液洗滌含有島的形成凝膠的球形藻朊酸鈣小滴。
在排出上層清液后，將形成凝膠的小滴放在0.05%(重量/重量)分子量為17000的聚賴氨酸溶液中孕育6分鐘。將上層清液泌去并用稀CHES，1.1%氯化鈣溶液和生理鹽水洗滌聚賴氨酸膠囊。
將洗滌過的聚賴氨酸膠囊放在30毫升0.03%藻朊酸鈉溶液中孕育4分鐘，通過荷負電的藻朊酸鈉鹽和荷正電的聚賴氨酸之間的離子相互作用使得在開始的聚賴氨酸膜上形成一層外藻朊酸鹽膜。
將生成的微膠囊用鹽水，0.05摩爾檸檬酸鹽緩沖液洗滌6分鐘，以使內(nèi)部藻朊酸鈣重新液化，最終用鹽水洗滌，發(fā)現(xiàn)該微膠囊是完全球形的并且各含有1-2個存活的島。該微膠囊的平均直徑為300(±50標準差)微米，壁厚為5微米。將該微膠囊懸浮在37℃的營養(yǎng)介質(zhì)中。
在將膠囊壁用肝素分解以后，用錐蟲蘭染色證明了島的活性。
實施例5這一實施例說明了含有肝細胞(活性細胞)的小的半透性微膠囊的生成。
重復實施例4的操作，所不同的是，將胎小鼠或成年大鼠的肝細胞加入藻朊酸鹽溶液中，其量為105個肝細胞/每毫升藻朊酸鹽溶液。將由針的尖端至氯化鈣溶液的距離減至7毫米。生成的微膠囊外觀是球形的，其直徑為250微米(±50標準差)。用錐蟲蘭染色和組織學，甚至在37℃培養(yǎng)四周后，證明了活肝細胞的存在。
實施例6這一實施例說明了針的參數(shù)對凝膠小滴尺寸的影響。
重復實施例1的操作，所不同的是，使用有22°斜角的26號針代替有90°斜角的22號針。生成的凝膠直徑為170微米(±30標準差)，顯示了較小直徑的凝膠小滴，因此能使用較小直徑的針生成微膠囊。
概括本申請的詳細說明，本發(fā)明提供了使用靜電力的一種新的小滴生成方法，該方法在微包囊活組織或細胞以形成適于心血管注射的小直徑微膠囊中特別有用。在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以進行改進。
權(quán)利要求
1.球形，平滑和均勻的微膠囊，其特征在于該微膠囊的直徑小于700微米并含有活組織或細胞。
2.如權(quán)利要求
1所述的微膠囊，其特征在于該微膠囊的直徑為150到500微米。
3.如權(quán)利要求
1或2所述的微膠囊，其特征在于該微膠囊是由包囊有活組織或細胞核心的生物相容的半透性膜組成。
4.如權(quán)利要求
3所述的微膠囊，其特征在于活組織包括郎格罕氏島。
5.如權(quán)利要求
1至4中任一項所述的微膠囊，其特征在于活組織或細胞被包囊在一種可重新液化的可逆凝膠材料中。
6.如權(quán)利要求
1-5中任一項所述的微膠囊，其特征在于膜的厚度為4-6微米。
7.一種小滴生成的方法，其特征在于其步驟為，在第一位置處從原料中向下擠壓形成小滴的液體，用一極性電荷使擠壓出的材料荷電，在垂直位于第一位置下面的第二位置處設置一正極電荷，并在第一和第二位置之間提供一電壓差，該電壓差足以從擠壓的材料中形成一液體小滴并將該小滴吸向第二位置。
8.如權(quán)利要求
7所述的方法，其特征在于第一位置包括一根軸向下定向?qū)щ姷尼槨?br>9.如權(quán)利要求
8所述的方法，其特征在于第二位置含有一種接收介質(zhì)，形成的小滴被收集在該介質(zhì)中，該接收介質(zhì)含有一種硬化溶液，以使由該處生成的小滴形成單個的微膠囊。
10.如權(quán)利要求
8所述的方法，其特征在于第二位置包含一個導電材料的環(huán)，該環(huán)環(huán)繞針軸并與軸同心，一種位于第二位置下面的接收介質(zhì)，以接收并收集該處形成的小滴，接收介質(zhì)含有一種硬化溶液以使從該處形成的小滴中形成單個的微膠囊。
11.如權(quán)利要求
7至10中任一項所述的方法，其特征在于用脈沖周期地對連續(xù)擠壓出的形成小滴液體施加供小滴生成的電壓差以進行連續(xù)制備小滴。
12.如權(quán)利要求
11所述的方法，其特征在于脈沖電壓由1到25千伏，脈沖頻率為10-100秒-1，脈沖寬度為1-6米·秒。
13.小滴生成的設備，其特征在于供從原料中向下擠壓形成小滴液體的導電擠壓裝置(22)，供對擠壓裝置(22)施加一種極性靜電荷，使得被擠壓的材料荷電的裝置(28)，供對位于導電擠壓裝置下面的導電體(26)施加正極靜電荷的裝置(30)，和供改變導電擠壓裝置(22)和導電體(26，32)之間的電壓以對由擠壓裝置(22)中被擠壓出的形成小滴液體施加單個形成小滴力的裝置(110)。
14.如權(quán)利要求
13所述的設備，其特征在于擠壓裝置(22)包括一個尖針。
15.如權(quán)利要求
13或14所述的設備，其特征在于導電體(26)包括一種收集單個小滴的接收介質(zhì)(20)。
16.如權(quán)利要求
13或14所述的設備，其特征在于導電體(32)包括一個導電的環(huán)狀組件，該組件環(huán)繞擠壓裝置(22)的軸并與其同心。
17.如權(quán)利要求
13至16中任一項所述的設備，其特征在于供改變電壓的裝置(110)包括供發(fā)生在預定閾電壓值以上的連續(xù)電壓脈沖的電壓脈沖發(fā)生裝置。
18.如權(quán)利要求
17所述的設備，其特征在于電壓脈沖發(fā)生裝置能發(fā)生1-25千伏的脈沖電壓，脈沖頻率為10-100秒-1，脈沖持續(xù)時間為1-6秒。
專利摘要
通過使用一種靜電小滴發(fā)生器制得直徑小于700微米的完全球形平滑和均勻的微膠囊，該微膠囊可以含有活細胞。從一尖源，如針中懸浮出一小滴，并將該小滴用高靜電壓充電。用相反極性電荷使收集容器或環(huán)裝置荷電并吸引該小滴。當通過閾電壓時，小滴由原料運動到收集容器。電壓脈沖振幅，脈沖頻率和寬度，以及小滴的擠壓速度是可調(diào)的，從而可以重復生成和收集預定尺寸的小滴。
文檔編號C12N11/04GK85105964SQ85105964
公開日1987年2月25日 申請日期1985年8月6日
發(fā)明者馬丁·霍姆爾, 安東尼·孫邁方, M·F·A·古斯 申請人:康諾特實驗室有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan