專利名稱:一種含poly I:C佐劑的新型乙肝疫苗制劑的制作方法
—種含poly I :C佐劑的新型乙肝疫苗制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的乙肝疫苗制劑，為采用Poly I:c和鋁佐劑的乙型病毒性肝炎(以下簡稱乙肝)疫苗，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)我國有50-70%的人群感染過乙型肝炎病毒(HBV)，10%的人群(約
I.3億人)為病毒攜帶者。目前還缺乏根治乙肝的有效方法，接種乙肝疫苗是預(yù)防肝炎最為經(jīng)濟(jì)有效的措施。隨著近年對治療性疫苗研究的深入，防治結(jié)合的乙肝疫苗將具有更為廣闊的前景[1-4]。
乙型肝炎病毒(HBV)是一種具有噬肝性的DNA病毒，只對人和猩猩易感，可引起肝組織損傷，導(dǎo)致乙型病毒性肝炎。HBV病毒結(jié)構(gòu)由外殼和核心組成，外殼所含的乙肝表面抗原(HBsAg)又包含S抗原,前SI和前S2抗原,作為病毒識(shí)別和侵入宿主細(xì)胞的主要結(jié)合蛋白，HBV表面抗原是目前HBV疫苗研發(fā)針對的主要靶點(diǎn)。目前臨床所使用的基因工程疫苗以及血源性疫苗，都是由乙肝表面抗原主蛋白(S)組成[5，6]。自1985年在我國廣泛接種·以來，產(chǎn)生了非常良好的疾病防控效果，HBV的感染和發(fā)病率得到有效控制[4，7]。然而，龐大的人口基數(shù)決定了我國HBV的防控任務(wù)依然嚴(yán)峻，特別是HBV的抗病毒治療成本高昂且療效有限，易耐藥，故而研發(fā)具有治療性效果的HBV疫苗非常必要[8]。
目前中國大量使用的乙肝疫苗中，主要采用HbsAg作為抗原，O.5-lmg的鋁佐劑進(jìn)行增強(qiáng)，這種配伍誘發(fā)的體液免疫水平較低，而且在細(xì)胞免疫方面存在缺陷。該類疫苗存在約有10%左右的人群對其無免疫反應(yīng)或反應(yīng)低下，且存在部分免疫逃逸的突變株等缺點(diǎn)
。
聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosine-polycytidylicacid, Poly I: C)是一種人工合成的雙鏈RNA，可被免疫細(xì)胞上的Toll樣受體-3 (Toll-like receptor 3，TLR-3)所識(shí)別，從而誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生干擾素α和β，具有抗病毒和調(diào)節(jié)免疫的多重功效[10-12]。目前Poly I:C主要作為免疫刺激劑、腫瘤治療藥物，用于慢性乙型肝炎、流行性出血熱、流行性乙型腦炎、病毒性角膜炎、帶狀皰疹、各種疣類和呼吸道感染等。臨床成人用量為每次l_2mg肌肉注射，主要副作用為注射后少數(shù)病人可發(fā)生一過性低熱，其作為人用疫苗佐劑的應(yīng)用存在安全問題的可能性較低[13-14]。
目前尚無采用乙肝表面抗原加PolyI :C和鋁佐劑的雙佐劑配伍應(yīng)用于乙型肝炎疫苗的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的乙型肝炎疫苗制劑，該疫苗的組成除包括HbsAg和鋁佐劑夕卜，還包括Poly I:C。
本發(fā)明的乙型肝炎疫苗利用聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosine-polycytidylicacid，簡寫為Poly I:C)免疫佐劑的作用，Poly I: C可有效地激活免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生以一型干擾素為主的多種免疫激活因子，在試驗(yàn)動(dòng)物中能誘生高水平的抗原特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。采用此種特定類型的免疫佐劑可以進(jìn)行各種類型的HBV感染的免疫治療及對免疫抑制藥物使用者進(jìn)行有效的免疫，可將目前較難治療的無癥狀HBV表面抗原(HBsAg)攜帶者轉(zhuǎn)陰并出現(xiàn)抗-HBs，亦有可能使受損的肝臟獲得一定程度的再生修復(fù)。
本發(fā)明中使用的乙型肝炎表面抗原為基因工程重組抗原或其片段或含pre SI成分的抗原，而不是來源于乙型肝炎病人血漿的乙型肝炎表面抗原。由酵母菌或CHO細(xì)胞表達(dá)的基因工程表面抗原由226個(gè)氨基酸組成。重組酵母菌或CHO細(xì)胞表達(dá)的HBsAg均可形成22nm的VLP顆粒，應(yīng)用于人群免疫多年，臨床證明具有良好的預(yù)防效果和安全性。
本發(fā)明的乙型肝炎疫苗每劑中各主成分的含量范圍如下Poly I:C 0.2-1.2mg、HBsAg5-125ug、鋁佐劑(按鋁離子計(jì)算)O. 2-1. 2mg。
優(yōu)選的范圍如下
Poly I :C O. 5-1. Omg、HBsAg 10-100ug、氫氧化招佐劑(按 Al3+計(jì)算，lmg/ml) O. 5-1. Omg0
最優(yōu)選的范圍如下
Poly I :C O. 5-1. Omg、HBsAg 25_75ug、氫氧化招佐劑(按 Al3+ 計(jì)算，Img/ml) O. 5-1. Omg0
以上說述每劑是指每一疫苗制劑，如每一注射針劑，或每支注射劑，或每次使用量的注射用藥劑。
本發(fā)明的疫苗使用方法與現(xiàn)有的乙型肝炎疫苗使用方法相同。
本發(fā)明的乙型肝炎疫苗可以通過以下方法制備
組成
聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly I:C)
乙型肝炎病毒表面抗原(疫苗)
氫氧化鋁佐劑
制備
乙型肝炎病毒表面抗原中加入氫氧化鋁佐劑，混勻后，加入Poly I :C溶液，混勻，即得疫苗液，該疫苗液經(jīng)過分裝可制成單位劑量的注射用的疫苗制劑。
本發(fā)明的疫苗制劑中還可含有其它可提高機(jī)體免疫的人體或微生物蛋白質(zhì)、多糖或小分子化合物。
本發(fā)明的疫苗制劑可作為成人、腎透析病人、器官移植病人及乙型肝炎高危人群的免疫治療的藥物。也可作為慢性乙型肝炎病人的免疫治療的藥物。
本發(fā)明的疫苗還可與其他含鋁佐劑的疫苗制劑組成聯(lián)合疫苗。
本發(fā)明的乙型肝炎疫苗與現(xiàn)有乙型肝炎疫苗的不同之處在于，加入了免疫增強(qiáng)劑PolyI: C，將Poly I: C加入到疫苗中，可有效的刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平體液免疫及細(xì)胞免疫，該疫苗將會(huì)給慢性乙型肝炎的治療帶來光明的前景。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，本發(fā)明疫苗明顯優(yōu)于現(xiàn)有的乙型肝炎疫苗。應(yīng)用于人體后將可大輻度的提高人體抗乙型肝炎病毒的體液免疫和細(xì)胞免疫，可用于慢性乙型肝炎病人的治療。
動(dòng)物試驗(yàn)表明該新型乙型肝炎疫苗是安全的，對試驗(yàn)動(dòng)物無可見的毒性?？捎行У拇碳?dòng)物產(chǎn)生高滴度的特異性抗體。
本發(fā)明的乙型肝炎疫苗采用的配方，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。該疫苗可用于成人、其它類型乙型肝炎疫苗免疫失敗者、腎透析病人、器官移植病人的免疫，以及慢性乙型肝炎病人的免疫治療。


圖I為ELISA檢測蛋白抗原免疫后小鼠血清抗S特異性IgG抗體圖。利用ELISA檢測I. 25 μ g乙型肝炎病毒表面抗原配合佐劑刺激BALB/c小鼠說產(chǎn)生S特異性IgG的結(jié)果。Fl代表單純疫苗組，F(xiàn)2代表疫苗加氫氧化鋁佐劑組，F(xiàn)3代表疫苗加Poly I:C佐劑組，F(xiàn)4代表疫苗加氫氧化鋁加Poly I :C雙佐劑，NS代表單純生理鹽水組。在第一次免疫后第2周,采用含Poly I:C佐劑組的小鼠均出現(xiàn)明顯抗體陽轉(zhuǎn),第二次免疫后第2周(6week)檢測時(shí)佐劑組強(qiáng)于未加佐劑組(P < O. 05)，第二次免疫后第8周(12week)檢測氫氧化鋁佐劑組滴度為103 38±°_31，雙佐劑組抗體滴度分別為103 78±°_48，均強(qiáng)于其他兩組(P > O. 05)。該結(jié)果說明雙佐劑與單純氫氧化鋁協(xié)同蛋白抗原在誘導(dǎo)產(chǎn)生S特異性抗體的作用相當(dāng)，且都能長時(shí)間維持。圖2為ELISA檢測蛋白抗原免疫后小鼠血清抗S特異性IgG抗體圖。利用ELISA檢測I. 25 μ g乙型肝炎病毒表面抗原配合佐劑刺激BALB/c小鼠說產(chǎn)生SI特異性IgG的結(jié)果。Fl代表單純疫苗組，F(xiàn)2代表疫苗加氫氧化鋁佐劑組，F(xiàn)3代表疫苗加Poly I:C佐劑組，F(xiàn)4代表疫苗加氫氧化鋁加Poly I :C雙佐劑，NS代表單純生理鹽水組。在第一次免疫后第2周，各組小鼠均出現(xiàn)抗體陽轉(zhuǎn)，第二次免疫后第2周(6week)檢測時(shí)各組抗體滴度無明顯差異(P > O. 05),第二次免疫后第8周(12week)檢測氫氧化招佐劑組滴度為104_ 18±°_38,雙佐劑組抗體滴度分別為104 25±°_75，均強(qiáng)于單純蛋白組(P > O. 05)。該結(jié)果說明雙佐劑與單純氫氧化鋁協(xié)同蛋白抗原在誘導(dǎo)產(chǎn)生SI特異性抗體的作用相當(dāng)，且都能長時(shí)間維持。
圖3為ELISA檢測Adv加強(qiáng)免疫后小鼠血清抗S特異性IgG抗體圖。利用ELISA檢測表達(dá)乙型肝炎病毒表面抗原的腺病毒載體疫苗(rAdv)對經(jīng)蛋白疫苗配合不同佐劑免疫小鼠的S特異性IgG的增強(qiáng)效果。Fl+代表單純疫苗+rAdv組，F(xiàn)2+代表疫苗加氫氧化鋁佐劑組+rAdv組，F(xiàn)3+代表疫苗加Poly I: C佐劑組+rAdv組，F(xiàn)4+代表疫苗加氫氧化鋁加Poly I :C雙佐劑+rAdv組,rAdv代表單純生理鹽水組+rAdv組。在加強(qiáng)免疫后第2周，采血檢測抗S特異性抗體，抗體滴度分別為Fl+: 102-99±0·13, F2+: 103·42±0·59, F3+: 103·15±0·46,F4+:10 3 68±°_56F2+組與F4+組明顯大于Fl+組(p < O. 05)。該結(jié)果再次說明采用該免疫方案下，雙佐劑與單純氫氧化鋁協(xié)同蛋白抗原進(jìn)行早期免疫，誘導(dǎo)產(chǎn)生S特異性抗體的作用相當(dāng)。
圖4為ELISA檢測Adv加強(qiáng)免疫后小鼠血清抗S特異性IgG抗體圖。利用ELISA檢測表達(dá)乙型肝炎病毒表面抗原的腺病毒載體疫苗(rAdv)對經(jīng)蛋白疫苗配合不同佐劑免疫小鼠的SI特異性IgG的增強(qiáng)效果。Fl+代表單純疫苗+rAdv組，F(xiàn)2+代表疫苗加氫氧化鋁佐劑組+rAdv組，F(xiàn)3+代表疫苗加Poly I: C佐劑組+rAdv組，F(xiàn)4+代表疫苗加氫氧化鋁加Poly I :C雙佐劑+rAdv組,rAdv代表單純生理鹽水組+rAdv組。在加強(qiáng)免疫后第2周，采血檢測抗SI特異性抗體，抗體滴度分別為Fl+:103.59±0.61，F(xiàn)2+:103-89±0·54, F3+:103-89±0·26,F4+:104 38±°_66僅F4+組明顯強(qiáng)于Fl+組(p<0.05)。該結(jié)果說明采用該免疫方案下，雙佐劑協(xié)同蛋白抗原進(jìn)行早期免疫經(jīng)腺病毒載體疫苗增強(qiáng)后，在誘導(dǎo)產(chǎn)生S I特異性抗體方面具有一定優(yōu)勢。
圖5為ELISP0T檢測Adv加強(qiáng)免疫后小鼠S特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)。利用ELISP0T檢測表達(dá)乙型肝炎病毒表面抗原的腺病毒載體疫苗(rAdv)對經(jīng)蛋白疫苗配合不同佐劑免疫小鼠的S特異性T細(xì)胞免疫的增強(qiáng)效果。Fl+代表單純疫苗+rAdv組，F(xiàn)2+代表疫苗加氫氧化鋁佐劑組+rAdv組，F(xiàn)3+代表疫苗加Poly I: C佐劑組+rAdv組，F(xiàn)4+代表疫苗加氫氧化鋁加Poly I C雙佐劑+rAdv組，rAdv代表單純生理鹽水組+rAdv組。在加強(qiáng)免疫后第2周，無菌取脾進(jìn)行S特異性ELIPOT檢測，結(jié)果顯示雙佐劑組別所誘導(dǎo)產(chǎn)生的點(diǎn)數(shù)明顯多于其他各組(P < O. 05)。該結(jié)果說明采用雙佐劑協(xié)同蛋白抗原進(jìn)行早期免疫經(jīng)腺病毒載體疫苗增強(qiáng)后，能誘導(dǎo)產(chǎn)生較其余參照佐劑組更強(qiáng)的S特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，為疫苗的治療性應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
圖6為ELISP0T檢測Adv加強(qiáng)免疫后小鼠SI特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)。利用ELISP0T檢測表達(dá)乙型肝炎病毒表面抗原的腺病毒載體疫苗(rAdv)對經(jīng)蛋白疫苗配合不同佐劑免疫小鼠的SI特異性T細(xì)胞免疫的增強(qiáng)效果。Fl+代表單純疫苗+rAdv組，F(xiàn)2+代表疫苗加氫氧化鋁佐劑組+rAdv組，F(xiàn)3+代表疫苗加Poly I: C佐劑組+rAdv組，F(xiàn)4+代表疫苗加氫氧化招加Poly I C雙佐劑+rAdv組，rAdv代表單純生理鹽水組+rAdv組。在加強(qiáng)免疫后第2周，無菌取脾進(jìn)行SI特異性ELIPOT檢測，結(jié)果顯示雙佐劑組別所誘導(dǎo)產(chǎn)生的點(diǎn)數(shù)明顯多·于其他各組(P < O. 05)。該結(jié)果說明采用雙佐劑協(xié)同蛋白抗原進(jìn)行早期免疫經(jīng)腺病毒載體疫苗增強(qiáng)后，能誘導(dǎo)產(chǎn)生較其余參照佐劑組更強(qiáng)的SI特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，為疫苗的治療性應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例I
乙型肝炎疫苗注射劑的制備方法
原料及來源
CHO細(xì)胞表達(dá)乙型肝炎病毒表面抗原(疫苗干粉)為華北制藥股份有限公司產(chǎn)品，用注射用生理鹽水配制成200 μ g/ml,。
氫氧化招佐劑1.Omg/ml (按 Al3+ 計(jì)算，lmg/ml)。
聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly I:C):購自美國SIGMA公司。用注射用生理鹽水配制成2mg/ml，以O(shè). 22 μ m的除菌濾膜過濾除菌，凍存于_20°C。
疫苗的制備方法取CHO細(xì)胞表達(dá)的乙型肝炎病毒表面抗原5. Oml于無菌玻璃瓶內(nèi)，加入氫氧化鋁佐劑IOml充分混勻后，加入Poly I :C溶液5. Oml，混勻后即為20ml疫苗溶液。所配制的疫苗液每毫升含乙型肝炎表面抗原50ug、鋁佐劑O. 5mg(按Al3+計(jì)算，Img/ml). Poly I:C O. 5mg，該溶液分裝后，制成20瓶每瓶Iml的疫苗注射劑。
實(shí)施例2
比較研究本發(fā)明的疫苗制劑和常用的氫氧化鋁佐劑配伍制劑在兩針單純蛋白免疫中的作用，
實(shí)驗(yàn)如下
制備疫苗的原料及來源如下
CHO細(xì)胞表達(dá)乙型肝炎病毒表面抗原(疫苗)為華北制藥股份有限公司產(chǎn)品，用注射用生理鹽水配制成200 μ g/ml,。
氫氧化招佐劑1.Omg/ml (按 Al3+ 計(jì)算，lmg/ml)。[0051]聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly I:C):購自美國SIGMA公司。用注射用生理鹽水配制成2mg/ml，以O(shè). 22 μ m的除菌濾膜過濾除菌，凍存于_20°C。
疫苗的制備方法取CHO細(xì)胞表達(dá)的乙型肝炎病毒表面抗原5. Oml于無菌玻璃瓶內(nèi)，加入氫氧化鋁佐劑IOml充分混勻后，加入Poly I :C溶液5. 0ml，混勻后即為20ml疫苗溶液。所配制的疫苗液每毫升含乙型肝炎表面抗原50ug、鋁佐劑O. 5mg(按Al3+計(jì)算，Img/ml)、Poly I:CO. 5mg。
其他各對照組疫苗的配方如下(表I)，制備方法同上。
表I、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用乙型肝炎疫苗的配制
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎疫苗制劑，其特征在于，該制劑中含有乙肝表面抗原，氫氧化鋁佐劑，以及聚肌苷酸-聚胞卩密唳核苷酸(polyinosine-polycytidylic acid, poly I: C)。
2.權(quán)利要求
I的疫苗制劑，其特征在于，其中乙型肝炎表面抗原為重組CHO細(xì)胞制造的乙型肝炎病毒表面抗原或其片段或含preSl的抗原。
3.權(quán)利要求
I的疫苗制劑，其特征在于，每劑疫苗中Polyl:C的含量為0.2-1.2mg，乙肝表面抗原的含量為5-125ug，氫氧化鋁佐劑(以鋁離子的量計(jì)算)O. 2-1. 2mg。
4.權(quán)利要求
I的疫苗制劑，還可含有其它已知的可提高機(jī)體免疫的人體或微生物蛋白質(zhì)及多糖或小分子化合物。
5.權(quán)利要求
I的疫苗制劑在制備用于成人、腎透析病人、器官移植病人及乙型肝炎高危人群免疫的藥物以及制備慢性乙型肝炎病人的免疫治療藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求
I的疫苗制劑和其他的慢性乙型肝炎病人治療用的化學(xué)合成藥物聯(lián)合應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種含poly I:C佐劑的新型乙肝疫苗制劑。所屬技術(shù)領(lǐng)域：
1.生物技術(shù)2.基因工程疫苗。本發(fā)明涉及一種乙型肝炎疫苗的新配方，該疫苗的主要成分為基因工程乙型肝炎病毒表面抗原、鋁佐劑、聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(poly I:C)等。以該配方制備的乙型肝炎疫苗的免疫原性優(yōu)于目前使用的單純鋁佐劑疫苗，該乙型肝炎疫苗可用于成人、腎移植病人、腎透析病人等的免疫，以預(yù)防乙型肝炎病毒的感染，該乙型肝炎疫苗亦可用于慢性乙型肝炎患者的免疫治療。
文檔編號(hào)A61K39/29GKCN102949717SQ201210232237
公開日2013年3月6日 申請日期2012年7月6日
發(fā)明者譚文杰, 揣俠, 陳紅, 文波, 阮力 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan