本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種細(xì)胞因子組合物及其在抗衰老虛弱中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、衰老虛弱是一種復(fù)雜的老年綜合癥，隨著年齡的增長(zhǎng)，多種因素導(dǎo)致身體虛弱，包括基因組不穩(wěn)定、dna損傷、表觀遺傳改變、干細(xì)胞衰竭等。這些相互關(guān)聯(lián)的因素綜合導(dǎo)致組織穩(wěn)態(tài)的喪失和脆弱時(shí)儲(chǔ)備能力的減少。因此，衰老的機(jī)體逐漸表現(xiàn)出虛弱的癥狀，器官的生理功能下降。由于其復(fù)雜的病理生理，需要有效的策略干預(yù)致病過(guò)程，以改善虛弱患者的健康狀況。間充質(zhì)干細(xì)胞（mscs）具有再生和抗炎作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植是解決虛弱綜合征病理生理問(wèn)題的一種有前途的治療策略。目前，mscs治療已經(jīng)在人類(lèi)受試者中進(jìn)行了i期和ii期試驗(yàn)，這些試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了mscs治療衰老虛弱的有效性。干細(xì)胞主要依靠分泌的多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，來(lái)促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞再生和調(diào)節(jié)免疫過(guò)程和全身炎癥等，來(lái)綜合治療衰老虛弱。然而現(xiàn)有技術(shù)中采用細(xì)胞因子來(lái)抗衰老虛弱的效果有限。

2、因此，亟需一種可以抗衰老虛弱的細(xì)胞因子組合物來(lái)進(jìn)行有效作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞因子組合物，以便更好的對(duì)抗衰老虛弱進(jìn)行作用。

2、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明具體提供下述技術(shù)方案：

3、本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)胞因子組合物，包括間充質(zhì)干細(xì)胞液和輔料溶液；輔料溶液由酪氨酸甲酯衍生物、咖啡酸甲酯和表面活性素加入pbs緩沖液中得到；酪氨酸酯衍生物由酪氨酸、甲醇和月桂酰氯反應(yīng)得到。酪氨酸甲酯衍生物和咖啡酸甲酯的使用，可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞液進(jìn)行作用，進(jìn)一步有效減緩間充質(zhì)干細(xì)胞的氧化損傷和降低與衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶活性，從而逆轉(zhuǎn)間充質(zhì)干細(xì)胞的衰竭，且可以有效降低cd3+總t細(xì)胞的增殖，提高免疫抑制。

4、優(yōu)選地，間充質(zhì)干細(xì)胞液的使用量和輔料溶液的使用量的體積比為1：0.8-1.5。

5、本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)胞因子組合物的制備方法，包括：

6、s1：首先將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種dmem培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)至p4-p6代，接著將p4-p6代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于無(wú)血清dmem/f12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收集上清液經(jīng)過(guò)微孔過(guò)濾和超濾離心得到間充質(zhì)干細(xì)胞液。

7、s2：向輔料溶液中加入間充質(zhì)干細(xì)胞液混合得到細(xì)胞因子組合物。

8、優(yōu)選地，s1中傳代培養(yǎng)溫度為35-37℃，培養(yǎng)條件為4%-6%?co2，傳代時(shí)間為細(xì)胞長(zhǎng)至70-85%融合后。

9、優(yōu)選地，s1中無(wú)血清dmem/f12培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)間為36-60h。

10、優(yōu)選地，s1中超濾離心的溫度為0-12℃，速度為1500-3500rpm，超濾所用超濾膜為5-10kd。

11、優(yōu)選地，s2中輔料溶液由酪氨酸甲酯衍生物、咖啡酸甲酯和表面活性素加入pbs緩沖液中得到。

12、更優(yōu)選地，酪氨酸甲酯衍生物加入pbs緩沖液的量為0.08-0.3mg/ml，咖啡酸甲酯加入pbs緩沖液的量為0.05-0.25mg/ml，表面活性素加入pbs緩沖液的量為0.009-0.017mg/ml。

13、優(yōu)選地，間充質(zhì)干細(xì)胞液的使用量和輔料溶液的使用量的體積比為1：0.8-1.5。

14、本發(fā)明還公開(kāi)了一種細(xì)胞因子組合物在抗衰老虛弱中的應(yīng)用，包括上述細(xì)胞因子組合物或上述方法制備得到的細(xì)胞因子組合物。

15、本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)胞因子組合物的制備方法，包括：

16、s1：間充質(zhì)干細(xì)胞液的制備：將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于dmem培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)傳代至p4-p6代，取p4-p6代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于無(wú)血清dmem/f12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收集上清液，并經(jīng)過(guò)微孔過(guò)濾和超濾離心，得到間充質(zhì)干細(xì)胞液。

17、s2：細(xì)胞因子組合物的制備：向輔料溶液中加入間充質(zhì)干細(xì)胞液混合得到細(xì)胞因子組合物。

18、優(yōu)選地，在上述s1中，dmem培養(yǎng)液中含有體積分?jǐn)?shù)為8-12％胎牛血清、90-110u/ml青霉素和90-110u/ml鏈霉素。

19、優(yōu)選地，在上述s1中，傳代培養(yǎng)溫度為35-37℃，培養(yǎng)條件為4-6%?co2，傳代時(shí)間為細(xì)胞長(zhǎng)至70-85%融合后。

20、優(yōu)選地，在上述s1中，無(wú)血清dmem/f12培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)間為36-60h。

21、優(yōu)選地，在上述s1中，超濾離心的溫度為0-12℃，速度為1500-3500rpm，超濾所用超濾膜為5-10kd。

22、優(yōu)選地，在上述s2中，輔料溶液由酪氨酸甲酯衍生物、咖啡酸甲酯和表面活性素加入pbs緩沖液中得到。

23、更優(yōu)選地，酪氨酸甲酯衍生物加入pbs緩沖液的量為0.08-0.3mg/ml.

24、更優(yōu)選地，咖啡酸甲酯加入pbs緩沖液的量為0.05-0.25mg/ml。

25、更優(yōu)選地，表面活性素加入pbs緩沖液的量為0.009-0.017mg/ml。

26、優(yōu)選地，在上述s2中，間充質(zhì)干細(xì)胞液的使用量與輔料溶液的使用量的體積比為1：0.8-1.5。

27、本發(fā)明公開(kāi)了酪氨酸甲酯衍生物的制備方法，具體為：

28、將酪氨酸加入鹽酸甲醇混合液中進(jìn)行反應(yīng)，并經(jīng)過(guò)減壓分離和重結(jié)晶得到酪氨酸甲酯。將月桂酰氯加入苯中得到月桂酰氯-苯溶液。然后將酪氨酸甲酯加入吡啶和苯得到溶解液，向溶解液中加入月桂酰氯-苯溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后靜置洗滌并干燥得到粗品，粗品重結(jié)晶得到酪氨酸甲酯衍生物。

29、優(yōu)選地，酪氨酸加入鹽酸甲醇混合液中的量為0.1-0.2g/ml。

30、優(yōu)選地，鹽酸甲醇混合液中鹽酸和甲醇的體積比為1：8-12。

31、優(yōu)選地，月桂酰氯加入苯中的量為0.08-0.15g/ml。

32、優(yōu)選地，酪氨酸甲酯的使用量為0.5-0.8g/ml。

33、優(yōu)選地，溶解液中苯的使用量與吡啶的使用量的體積比為1：0.2-0.4。

34、優(yōu)選地，酪氨酸甲酯的使用量與月桂酰氯的使用量的質(zhì)量比為1：0.5-0.6。

35、優(yōu)選地，對(duì)酪氨酸甲酯進(jìn)行制備時(shí)，反應(yīng)溫度為55-65℃，反應(yīng)時(shí)間為6-10h。

36、優(yōu)選地，對(duì)酪氨酸甲酯進(jìn)行制備時(shí)，使用的重結(jié)晶溶劑為75-85%乙醇，結(jié)晶次數(shù)為2-4次。

37、優(yōu)選地，對(duì)酪氨酸甲酯衍生物進(jìn)行制備時(shí)，反應(yīng)溫度為65-75℃，反應(yīng)時(shí)間為3-5h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至23-27℃，繼續(xù)反應(yīng)0.8-1.2h。

38、更優(yōu)選地，在細(xì)胞因子組合物的制備中，在使用酪氨酸甲酯衍生物、咖啡酸甲酯和表面活性素的基礎(chǔ)上，還可以加入甘露醇六乙酸酯。甘露醇六乙酸酯可以與酪氨酸甲酯衍生物和咖啡酸甲酯相互作用，發(fā)揮協(xié)同增效作用，進(jìn)而進(jìn)一步降低細(xì)胞衰老，提高免疫抑制。

39、更優(yōu)選地，甘露醇六乙酸酯加入pbs緩沖液中的量為0.015-0.08mg/ml。

40、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較具有如下有益效果：

41、本發(fā)明提出了一種細(xì)胞因子組合物及其在抗衰老虛弱中的應(yīng)用。采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，再經(jīng)過(guò)過(guò)濾和超濾濃縮獲得間充質(zhì)干細(xì)胞液；將酪氨酸甲酯衍生物、咖啡酸甲酯和表面活性素加入pbs緩沖液中得到的輔料溶液；然后間充質(zhì)干細(xì)胞液和輔料溶液混合，得到細(xì)胞因子組合物。能夠有效降低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老率，且可提高免疫抑制能力，在衰老虛弱方面有一定的潛力。