本發(fā)明屬于醫(yī)用水凝膠，尤其涉及一種加載仿生納米囊泡的響應(yīng)性水凝膠及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、骨是人體運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)人體具有支持、保護(hù)的作用。但炎癥、創(chuàng)傷、腫瘤、手術(shù)等常?？蓪?dǎo)致骨缺損，導(dǎo)致相關(guān)的功能障礙。口腔頜面部的骨缺損，會(huì)嚴(yán)重影響口頜面部的生理功能，如吞咽、發(fā)音等，除此之外還嚴(yán)重影響美觀，對(duì)患者的心理健康造成負(fù)面影響。雖然骨組織具有一定的自我修復(fù)能力，但較大范圍的骨缺損常常難以自行修復(fù)。針對(duì)這一挑戰(zhàn)，目前臨床上已經(jīng)開發(fā)了自體骨移植、異體骨移植等治療策略，但二次手術(shù)的創(chuàng)傷、免疫排斥反應(yīng)等限制了其臨床應(yīng)用。骨組織工程理念將生物材料-種子細(xì)胞-生長因子復(fù)合體植入骨缺損區(qū)域，但種子細(xì)胞的來源、存活率等仍然困擾著研究者，與之相比，無細(xì)胞的骨組織支架材料顯示出特有的優(yōu)勢，免疫風(fēng)險(xiǎn)較低且不具有倫理問題。

2、在骨組織工程中，良好的支架材料應(yīng)當(dāng)可以在充當(dāng)藥物載體的同時(shí)，起到調(diào)節(jié)局部免疫微環(huán)境、促進(jìn)成骨分化的作用。近年來，因其良好的機(jī)械性能、細(xì)胞相容性等特點(diǎn)，水凝膠作為一種支架材料的潛力得到了廣泛研究。但是傳統(tǒng)的水凝膠藥物釋放模式單一，細(xì)胞對(duì)藥物的利用率相對(duì)較低，藥物的作用也不具有靶向性，而炎癥響應(yīng)性水凝膠可以實(shí)現(xiàn)藥物的按需釋放，若同時(shí)負(fù)載包裹了治療藥物的干細(xì)胞囊泡，則可進(jìn)一步使該體系的藥物遞送具有干細(xì)胞靶向性，得以發(fā)揮治療因子對(duì)調(diào)節(jié)骨缺損環(huán)境的最大作用。但是在既往研究中，具有局部遞送干細(xì)胞囊泡的水凝膠往往結(jié)構(gòu)簡單，囊泡釋放模式單一，不穩(wěn)定，同時(shí)，遞送的囊泡往往為外泌體，其提取步驟繁瑣、產(chǎn)量有限，且存在細(xì)胞外囊泡純度較低、轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞的效率較低（例如靶向骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的效率較低）等一個(gè)或者多個(gè)問題，十分限制其臨床應(yīng)用。

3、因此，非常有必要提供一種加載仿生納米囊泡的響應(yīng)性水凝膠及制備方法和應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的一個(gè)或者多個(gè)技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種加載仿生納米囊泡的響應(yīng)性水凝膠及制備方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明在第一方面提供了一種加載仿生納米囊泡的響應(yīng)性水凝膠的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：

3、（1）往牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞中加入化學(xué)囊泡刺激劑后置于co2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行刺激，得到巨型質(zhì)膜囊泡溶液；所述化學(xué)囊泡刺激劑包含緩沖液、二硫蘇糖醇溶液和多聚甲醛溶液，所述緩沖液包含氯化鈉8.5~9g/l、二氯化鈣0.2~0.24g/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.3~2.4g/l和去離子水；

4、（2）將褪黑素母液與巨型質(zhì)膜囊泡溶液混合并經(jīng)擠出，得到仿生納米囊泡；

5、（3）將6-arm-peg-nh2與經(jīng)edci/nhs活化的可被基質(zhì)金屬蛋白酶切割的多肽進(jìn)行反應(yīng)，得到偶聯(lián)有可被基質(zhì)金屬蛋白酶切割的多肽的化合物6-arm-peg-pp-nh2；

6、（4）將6-arm-peg-pp-nh2與仿生納米囊泡配制成第一前體溶液以及將六臂聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸酯與仿生納米囊泡配制成第二前體溶液，然后將第一前體溶液和第二前體溶液混合后靜置成膠，制得加載仿生納米囊泡的響應(yīng)性水凝膠。

7、優(yōu)選地，在步驟（1）中，所述牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得方法為：將牙周膜組織或牙髓組織進(jìn)行消化與離心，棄上清，然后加入含有胎牛血清和青霉素-鏈霉素的α-mem培養(yǎng)基并混合均勻，再經(jīng)co2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至原代干細(xì)胞達(dá)到80%~90%融合后，用胰蛋白酶-edta消化液消化并按照1:2或1:3的比例培養(yǎng)擴(kuò)增至p4~p6代，獲得牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞。

8、優(yōu)選地，所述α-mem培養(yǎng)基中含有胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)為10~20%，所述α-mem培養(yǎng)基中含有青霉素-鏈霉素的體積分?jǐn)?shù)為0.8~1.2%；和/或所述胰蛋白酶-edta消化液為含有0.25wt%的胰蛋白酶和0.1wt%的edta的消化液。

9、優(yōu)選地，在步驟（1）中：所述二硫蘇糖醇溶液為二硫蘇糖醇水溶液，所述二硫蘇糖醇水溶液的濃度為150~160mg/ml；所述多聚甲醛溶液為4%多聚甲醛固定液；和/或所述緩沖液、所述二硫蘇糖醇溶液和所述多聚甲醛溶液的體積比為1000：（1.5~2.5）：（16~20）。

10、優(yōu)選地，在步驟（1）中：所述co2恒溫培養(yǎng)箱中含有co2的體積分?jǐn)?shù)為5%，所述co2恒溫培養(yǎng)箱的溫度為37℃，濕度為100%；所述刺激的時(shí)間為18~30h；所述化學(xué)囊泡刺激劑的加入量為每平方厘米的牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞加入18~25微升的化學(xué)囊泡刺激劑；和/或所述巨型質(zhì)膜囊泡溶液中含有巨型質(zhì)膜囊泡的濃度為6.0×106~6.7×106個(gè)/ml。

11、優(yōu)選地，在步驟（2）中：所述褪黑素母液以?二甲基亞砜和pbs緩沖液為溶劑，所述褪黑素母液中含有褪黑素的濃度為0.0008~0.0012mol/l；所述褪黑素母液與所述巨型質(zhì)膜囊泡溶液的體積比為1：（8~10）；所述仿生納米囊泡的粒徑不大于200nm；和/或所述擠出為使用脂質(zhì)體擠出器過聚碳酸酯膜反復(fù)擠出，反復(fù)擠出的次數(shù)為8~12次，所述聚碳酸酯膜為孔徑為200nm的聚碳酸酯膜。

12、優(yōu)選地，在步驟（3）中：所述6-arm-peg-nh2與所述經(jīng)edci/nhs活化的可被基質(zhì)金屬蛋白酶切割的多肽的質(zhì)量比為（30~40）：1；和/或所述反應(yīng)的溫度為30~40℃，所述反應(yīng)的時(shí)間為18~30h。

13、優(yōu)選地，在步驟（4）：所述第一前體溶液的配制為：用pbs緩沖液將仿生納米囊泡配制成含有仿生納米囊泡的pbs緩沖液，然后往含有仿生納米囊泡的pbs緩沖液中加入6-arm-peg-pp-nh2并混合均勻，得到第一前體溶液，所述含有仿生納米囊泡的pbs緩沖液中仿生納米囊泡含有的蛋白質(zhì)濃度為1~1.5mg/ml，所述含有仿生納米囊泡的pbs緩沖液與所述6-arm-peg-pp-nh2的質(zhì)量比為100：（10~18）；所述第二前體溶液的配制為：用pbs緩沖液將仿生納米囊泡配制成含有仿生納米囊泡的pbs緩沖液，然后往含有仿生納米囊泡的pbs緩沖液中加入六臂聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸酯并混合均勻，得到第二前體溶液，所述含有仿生納米囊泡的pbs緩沖液中仿生納米囊泡含有的蛋白質(zhì)濃度為1~1.5mg/ml，所述含有仿生納米囊泡的pbs緩沖液與所述六臂聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸酯的質(zhì)量比為100：（10~18）；和/或所述第一前體溶液中含有的6-arm-peg-pp-nh2與所述第二前體溶液中含有的六臂聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸酯的質(zhì)量比為（0.5~2）：（0.5~2）。

14、本發(fā)明在第二方面提供了由本發(fā)明在第一方面所述的制備方法制得的加載仿生納米囊泡的響應(yīng)性水凝膠。

15、本發(fā)明在第三方面提供了由本發(fā)明在第一方面所述的制備方法制得的加載仿生納米囊泡的響應(yīng)性水凝膠在骨組織修復(fù)材料中的應(yīng)用。

16、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比至少具有如下有益效果：

17、（1）本發(fā)明通過誘導(dǎo)牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞自發(fā)起泡并結(jié)合擠出技術(shù)，成功得到了納米級(jí)干細(xì)胞仿生納米囊泡的同時(shí)，成功負(fù)載褪黑素，同時(shí)通過相對(duì)簡單的流程制作出具有炎癥響應(yīng)性釋放特點(diǎn)的水凝膠，將負(fù)載褪黑素的仿生納米囊泡加載至響應(yīng)性水凝膠中，獲得了兼具響應(yīng)局部炎癥微環(huán)境，能夠按需釋放褪黑素和能夠使褪黑素高效靶向遞送至靶細(xì)胞的加載仿生納米囊泡的響應(yīng)性水凝膠藥物遞送體系，從而能夠明顯增強(qiáng)骨再生能力。

18、（2）本發(fā)明獲得了具有基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性的水凝膠，可以響應(yīng)性釋放負(fù)載褪黑素的仿生納米囊泡，局部遞送負(fù)載褪黑素的仿生納米囊泡，提出了一種新的胞內(nèi)高效遞送褪黑素以及能夠增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力的方式，大大促進(jìn)了局部骨缺損的修復(fù)能力；本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的水凝膠藥物遞送體系藥物釋放模式單一、不穩(wěn)定，水凝膠藥物遞送體系藥物靶向性差，褪黑素應(yīng)用手段單一，胞內(nèi)遞送褪黑素的效率低下等一個(gè)或者多個(gè)技術(shù)問題。

19、（3）本發(fā)明通過化學(xué)囊泡刺激劑從牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞中生成和分離出巨型質(zhì)膜囊泡，再經(jīng)擠出，得到了具有納米尺寸的仿生納米囊泡，本發(fā)明方法相比于從細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取細(xì)胞外囊泡的傳統(tǒng)方法，可以獲得更高產(chǎn)量和更高純度的囊泡，本發(fā)明采用的化學(xué)囊泡刺激劑包含的多聚甲醛溶液能夠誘導(dǎo)細(xì)胞膜中蛋白質(zhì)的非特異性交聯(lián)，包含的二硫蘇糖醇能夠作為小分子還原劑切割硫酯鍵，促進(jìn)細(xì)胞膜發(fā)泡形成巨型質(zhì)膜囊泡gpmv并脫落到上清中；同時(shí)，所述化學(xué)囊泡刺激劑包含的緩沖液中具有鈣離子ca2+，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在ca2+存在的條件下，細(xì)胞暴露于多聚甲醛溶液和二硫蘇糖醇溶液中，可以使得連續(xù)的ca2+流入，有利于促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)膜起泡，本發(fā)明采用的化學(xué)囊泡刺激劑使得本發(fā)明生產(chǎn)的巨型質(zhì)膜囊泡gpmv不包含細(xì)胞骨架或核物質(zhì)，而直接對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行擠出或裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞膜，不可避免的會(huì)受到細(xì)胞器或核物質(zhì)的污染，因此相比于其他細(xì)胞膜囊泡的生產(chǎn)方法，本發(fā)明方法產(chǎn)生了更為純凈的細(xì)胞膜囊泡（仿生納米囊泡）；并且所得到的仿生納米囊泡保留了許多干細(xì)胞標(biāo)志物如cd90、cd105等，以及趨化因子cxcr4，對(duì)干細(xì)胞具有靶向作用；本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在響應(yīng)性水凝膠中加載純度更高的所述仿生納米囊泡，可以利用仿生納米囊泡的干細(xì)胞靶向作用，增加干細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，實(shí)現(xiàn)藥物在骨組織中的靶向遞送和緩釋，從而能夠明顯增強(qiáng)骨再生能力。