本發(fā)明涉及藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種化橘紅提取物及其在制備治療ape1介導(dǎo)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
化橘紅，即化州橘紅，來源本品為蕓香科植物化州柚或柚的未成熟或近成熟的干燥外層果皮。具有化痰止咳、治療風(fēng)寒咳嗽的作用。
肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。目前，肺癌的主要治療手段為放療和化療，其中放療和化療的聯(lián)合治療也是常見的治療方式。
ape1為脫嘌呤/脫嘌呤核酸內(nèi)切酶，是一種生物大分子功能復(fù)合體，是dna堿基切除修復(fù)途徑的關(guān)鍵限速酶，具有核酸內(nèi)切酶以及氧化還原功能，是細(xì)胞化療藥物致傷的重要修復(fù)因子。現(xiàn)有研究(張志敏.ape1作用相關(guān)蛋白及其在腫瘤放射治療中的作用研究[d].第三軍醫(yī)大學(xué),2011.)表明在肺癌細(xì)胞中ape1的表達(dá)會(huì)促使nm23-h1的表達(dá)，ape1和nm23-h1協(xié)同可以修復(fù)肺癌細(xì)胞的dna，從而使得肺癌細(xì)胞產(chǎn)生放療或化療抵抗。因此，開發(fā)一種既具有ape1表達(dá)抑制功能，又具有抗肺癌功能的藥物具有廣闊的市場(chǎng)前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種化橘紅提取物，所述的化橘紅提取物能抑制ape1表達(dá)且同時(shí)具有非常好的抗肺癌效果。
本發(fā)明所要解決的上述技術(shù)問題，通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
一種化橘紅提取物，包含如下有效成分：川陳皮素、槲皮素以及柚皮甙。
優(yōu)選地，所述的化橘紅提取物，其特征在于，包含如下重量百分比的有效成分：川陳皮素20～30％；槲皮素10～20％；柚皮甙30～40％。
上述化橘紅提取物的制備方法，其包含如下步驟：
(1)取化橘紅，用乙醇加熱回流提取，濃縮提取液得化橘紅乙醇提取物；
(2)將化橘紅乙醇提取物加水溶解成懸濁液，先用石油醚萃取，棄去石油醚萃取物，再用乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯萃取物得化橘紅萃取物；
(3)將化橘紅萃取物經(jīng)硅膠柱層析富集有效成分即得化橘紅提取物；
步驟(3)中硅膠柱層析富集有效成分的具體方法為：將化橘紅萃取物上硅膠柱，先用體積比為85:15～80:20的溶劑a和溶劑b組成的混合溶劑體系進(jìn)行洗脫除雜；然后再用體積比為75:25～72:28的溶劑a和溶劑b組成的混合溶劑體系進(jìn)行洗脫并收集洗脫部位，即得化橘紅有效部位；所述的溶劑a為石油醚，溶劑b為乙酸乙酯；
體積比為85:15～80:20的溶劑a和溶劑b組成的混合溶劑體系的用量為硅膠柱柱體積的1～3倍；體積比為75:25～72:28的溶劑a和溶劑b組成的混合溶劑體系的用量為硅膠柱柱體積的3～5倍。
優(yōu)選地，步驟(3)中硅膠柱層析富集有效成分的具體方法為：將化橘紅萃取物上硅膠柱，先用體積比為80:20的溶劑a：溶劑b組成的混合溶劑體系進(jìn)行洗脫除雜；然后再用體積比為72:28的溶劑a：溶劑b組成的混合溶劑體系進(jìn)行洗脫并收集洗脫部位，即得化橘紅有效部位；
體積比為80:20的溶劑a和溶劑b組成的混合溶劑體系的用量為硅膠柱柱體積的3倍；體積比為72:28的溶劑a和溶劑b組成的混合溶劑體系的用量為硅膠柱柱體積的5倍。
所述硅膠柱柱體積是指用硅膠裝柱后，從柱底到硅膠沉積表面的體積。
優(yōu)選地，步驟(3)硅膠柱中所用硅膠的重量為化橘紅萃取物干重的20～40倍。
優(yōu)選地，步驟(1)中所述的乙醇為體積分?jǐn)?shù)為80～100％的乙醇水溶液；所述的乙醇的用量與化橘紅的用量比為8～15ml:1g；所述的加熱回流提取的時(shí)間為1～3h；步驟(2)中先用與懸濁液等體積的石油醚萃取1～3次，棄去石油醚萃取物，再用與懸濁液等體積的乙酸乙酯萃取1～3次，濃縮乙酸乙酯萃取物得化橘紅萃取物。
上述化橘紅提取物在制備ape1抑制劑中的應(yīng)用。
上述化橘紅提取物在制備治療ape1介導(dǎo)的疾病的藥物中的應(yīng)用；所述ape1介導(dǎo)的疾病為ape1介導(dǎo)的肺癌。
上述化橘紅提取物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，所述的抗癌藥物為抗肺癌藥物。
本發(fā)明還提供一種來源于化橘紅的抗癌藥物組合物，其包含川陳皮素、槲皮素以及柚皮甙，所述的川陳皮素、槲皮素以及柚皮甙的重量比為2～3：1～2：3～4；所述的抗癌藥物為抗肺癌藥物。
有益效果：本發(fā)明提供了一種全新的化橘紅提取物，所述的化橘紅提取物能有效抑制肺癌細(xì)胞中的ape1的表達(dá)，可以作為ape1抑制劑使用，用于治療ape1介導(dǎo)的疾?。粚?shí)施例實(shí)驗(yàn)還表明，所述的化橘紅提取物提取物具有非常顯著的體外抗肺癌作用；此外，本發(fā)明提供的化橘紅提取物有效成分以及含量清楚，有利于提取物的質(zhì)量控制以及用藥安全。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例對(duì)本發(fā)明不做任何形式的限定。
實(shí)施例1化橘紅提取物的制備
(1)取化橘紅，用體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇水溶液加熱回流提取1.5h，濃縮提取液得化橘紅乙醇提取物；
(2)將化橘紅乙醇提取物加水溶解成懸濁液，先用等體積的石油醚萃取，重復(fù)萃取3次，棄去石油醚萃取物，再用等體積的乙酸乙酯萃取，重復(fù)萃取3次，合并濃縮乙酸乙酯萃取物得化橘紅萃取物；
(3)將化橘紅萃取物經(jīng)硅膠柱層析富集有效成分即得化橘紅提取物；
所述硅膠柱層析富集有效成分的方法為：將化橘紅萃取物上硅膠柱(硅膠柱中所用硅膠的重量為化橘紅萃取物干重的30倍，硅膠的規(guī)格為200目)，先用體積比為80:20的溶劑a：溶劑b組成的混合溶劑體系(用量為3倍柱體積)進(jìn)行洗脫除雜；然后再用體積比為72:28的溶劑a：溶劑b組成的混合溶劑體系(用量為8倍柱體積)進(jìn)行洗脫并收集洗脫部位，即得化橘紅有效部位；所述的溶劑a為石油醚，溶劑b為乙酸乙酯。
經(jīng)檢測(cè)，所述化橘紅提取物中含有重量百分比為28％的川陳皮素、19％的槲皮素以及37％的柚皮甙。
上述成分的含量測(cè)定方法為(下同)：使用液相色譜檢測(cè)，以川陳皮素、槲皮素以及柚皮甙作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用外標(biāo)法測(cè)得。
所述的液相色譜條件為：用agilentzorbaxsbc18(柱長(zhǎng)250mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5μm)為色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相a，以0.05％的乙酸溶液為流動(dòng)相b，檢測(cè)波長(zhǎng)為330nm；柱溫25℃，流速為1.0ml/min；流動(dòng)相a：流動(dòng)相b＝15:85。其中柚皮甙的保留時(shí)間為5.1min，槲皮素的保留時(shí)間為9.3min，川陳皮素的保留時(shí)間為14.4min。
實(shí)施例2化橘紅提取物的制備
(1)取化橘紅，用體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇水溶液加熱回流提取1.5h，濃縮提取液得化橘紅乙醇提取物；
(2)將化橘紅乙醇提取物加水溶解成懸濁液，先用等體積的石油醚萃取，重復(fù)萃取3次，棄去石油醚萃取物，再用等體積的乙酸乙酯萃取，重復(fù)萃取3次，合并濃縮乙酸乙酯萃取物得化橘紅萃取物；
(3)將化橘紅萃取物經(jīng)硅膠柱層析富集有效成分即得化橘紅提取物；
所述硅膠柱層析富集有效成分的方法為：將化橘紅萃取物上硅膠柱(硅膠柱中所用硅膠的重量為化橘紅萃取物干重的30倍，硅膠的規(guī)格為200目)，先用體積比為85:15的溶劑a：溶劑b組成的混合溶劑體系(用量為3倍柱體積)進(jìn)行洗脫除雜；然后再用體積比為75:25的溶劑a：溶劑b組成的混合溶劑體系(用量為8倍柱體積)進(jìn)行洗脫并收集洗脫部位，即得化橘紅有效部位；所述的溶劑a為石油醚，溶劑b為乙酸乙酯。
經(jīng)檢測(cè)，所述化橘紅提取物中含有重量百分比為26％的川陳皮素、16％的槲皮素以及34％的柚皮甙。
實(shí)施例3化橘紅提取物的制備
(1)取化橘紅，用體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇水溶液加熱回流提取1.5h，濃縮提取液得化橘紅乙醇提取物；
(2)將化橘紅乙醇提取物加水溶解成懸濁液，先用等體積的石油醚萃取，重復(fù)萃取3次，棄去石油醚萃取物，再用等體積的乙酸乙酯萃取，重復(fù)萃取3次，合并濃縮乙酸乙酯萃取物得化橘紅萃取物；
(3)將化橘紅萃取物經(jīng)硅膠柱層析富集有效成分即得化橘紅提取物；
所述硅膠柱層析富集有效成分的方法為：將化橘紅萃取物上硅膠柱(硅膠柱中所用硅膠的重量為化橘紅萃取物干重的30倍，硅膠的規(guī)格為200目)，先用體積比為85:15的溶劑a：溶劑b組成的混合溶劑體系(用量為3倍柱體積)進(jìn)行洗脫除雜；然后再用體積比為72:28的溶劑a：溶劑b組成的混合溶劑體系(用量為8倍柱體積)進(jìn)行洗脫并收集洗脫部位，即得化橘紅有效部位；所述的溶劑a為石油醚，溶劑b為乙酸乙酯。
經(jīng)檢測(cè)，所述化橘紅提取物中含有重量百分比為23％的川陳皮素、12％的槲皮素以及31％的柚皮甙。
實(shí)施例4提取物抑制ape1表達(dá)實(shí)驗(yàn)
構(gòu)建質(zhì)粒pcdna3.0-ape1并轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞a549，然后將人肺癌細(xì)胞a549分別置于含有實(shí)施例1所述化橘紅提取物、實(shí)施例2所述化橘紅提取物、實(shí)施例3所述化橘紅提取物、藥物組合物(組合物由重量比為3:2:3的川陳皮素、槲皮素以及柚皮甙組成)以及不含任何藥物的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h，然后利用westernblotting檢測(cè)細(xì)胞中ape1蛋白的表達(dá)情況。具體方法參見“張志敏.ape1作用相關(guān)蛋白及其在腫瘤放射治療中的作用研究[d].第三軍醫(yī)大學(xué),2011.”。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在含有本發(fā)明化橘紅提取物以及藥物組合物的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞a549中的ape1蛋白含量顯著少于不含任何藥物的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞a549。這說明：本發(fā)明所述的化橘紅提取物以及由川陳皮素、槲皮素以及柚皮甙組成的藥物組合物能顯著抑制肺癌細(xì)胞中的ape1的表達(dá)，可以作為ape1抑制劑使用，能夠作為治療ape1介導(dǎo)的疾病的藥物使用。
實(shí)施例5提取物抗肺癌活性測(cè)試
取人肺癌細(xì)胞a549置于培養(yǎng)基(rpmi1640培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，癌細(xì)胞以10×103每孔加入96孔板中，在37℃含5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后貼壁后吸去原來的培養(yǎng)基。然后空白組再加入含10％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)組分別加入含有0.01～100μg/ml待測(cè)藥物的rpmi1640培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)48h后，再加入濃度5mg/ml的mtt，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清液，加入100μldmso，暗處放置10min，利用酶標(biāo)儀(sunrise公司)在570nm下測(cè)定吸光值，并根據(jù)吸光值計(jì)算細(xì)胞存活情況，每個(gè)處理設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。細(xì)胞存活率(％)＝δod藥物處理組/δod空白組×100。再根據(jù)劑量效應(yīng)曲線計(jì)算細(xì)胞半抑制濃度(ic50)，結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)組的藥物分別如下：實(shí)驗(yàn)組1使用單獨(dú)使用川陳皮素；實(shí)驗(yàn)組2單獨(dú)使用槲皮素；實(shí)驗(yàn)組3單獨(dú)使用柚皮甙；實(shí)驗(yàn)組4使用川陳皮素、槲皮素以及柚皮甙按重量比為3:2:4組成的組合物1；實(shí)驗(yàn)組5使用陳皮素、槲皮素以及柚皮甙按重量比為3:1:3組成的組合物2；實(shí)驗(yàn)組6使用陳皮素、槲皮素以及柚皮甙按重量比為2:1:3組成的組合物2；實(shí)驗(yàn)組7使用實(shí)施例1制備得到的化橘紅提取物；實(shí)驗(yàn)組8使用實(shí)施例2制備得到的化橘紅提取物；實(shí)驗(yàn)組9使用實(shí)施例3制備得到的化橘紅提取物。
表1.藥物對(duì)人肺癌細(xì)胞a549的ic50測(cè)試結(jié)果
從表1中的實(shí)驗(yàn)組1～6可以看出，川陳皮素、槲皮素以及柚皮甙單獨(dú)使用具有一定的抗肺癌效果，當(dāng)川陳皮素、槲皮素以及柚皮甙三者按本發(fā)明所述的比例混合時(shí)，其抗肺癌效果更顯著，這說明川陳皮素、槲皮素以及柚皮甙三者混合后能產(chǎn)生協(xié)同抗肺癌作用。因此，將川陳皮素、槲皮素以及柚皮甙三者組合可以作為抗肺癌藥物使用。
從表1中的實(shí)驗(yàn)組7～9可以看出，本發(fā)明所述的化橘紅提取物具有非常顯著的抗肺癌作用，且其抗肺癌作用要強(qiáng)于其中任意一種單體的抗肺癌作用，這是由于其中的有效成分川陳皮素、槲皮素以及柚皮甙產(chǎn)生協(xié)同抗肺癌的作用。