本發(fā)明涉及納米醫(yī)學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體地，涉及納米膠束技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種能進(jìn)行mr-熒光雙模態(tài)淋巴成像、可降解的小粒徑納米膠束及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

據(jù)2012年2月世界衛(wèi)生組織（who）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，惡性腫瘤的治愈已成為世界性難題，也是目前全世界的主要死亡原因之一，在2008年造成760萬死亡，約占所有死亡人數(shù)的13%，且惡性腫瘤致死人數(shù)會逐年增加，到2030年將超過1310萬。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤難以治愈的主要原因，而淋巴道的轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的特征之一，因此淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期檢出和準(zhǔn)確評判對于腫瘤分期和制定治療計(jì)劃具有十分重要的意義，對腫瘤患者的預(yù)后有非常重要的指導(dǎo)作用。淋巴系統(tǒng)是人體復(fù)雜的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，其主要功能是利用巨噬細(xì)胞清除組織間隙內(nèi)的液體和大分子物質(zhì)（如異物、毒素等）。傳統(tǒng)影像診斷中，根據(jù)淋巴結(jié)大小、形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)及與周圍組織器官的關(guān)系評價其良惡性易出現(xiàn)一定的假陽性和假陰性的誤診，診斷正確率較低，難以滿足臨床需要。

常規(guī)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)如x線淋巴造影、超聲、ct、核素和常規(guī)mri對淋巴系統(tǒng)的診斷價值有限。mri具有極高的空間分辨率和軟組織分辨率，然而常規(guī)mri技術(shù)基于淋巴結(jié)大小和信號強(qiáng)度變化用于淋巴結(jié)的評價仍然價值有限，且其敏感性仍相對較低。以超小型超順磁性氧化鐵（superparamagneticironoxide，spio）為代表的mr淋巴成像（mrlymphography）對腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的檢出和良惡性淋巴結(jié)的鑒別有很大幫助，顯示了廣闊的臨床應(yīng)用前景，然而仍然面臨較大挑戰(zhàn)，主要表現(xiàn)在其敏感性和特異性仍有待進(jìn)一步提高。而多模態(tài)成像綜合2種及以上成像技術(shù)，例如光學(xué)成像和mri，聯(lián)合各成像技術(shù)的優(yōu)勢，將mri與光學(xué)成像技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，既能提高分辨率，獲取更多結(jié)構(gòu)的組織學(xué)信息，同時又能實(shí)現(xiàn)高靈敏度的功能學(xué)顯像，最終達(dá)到完美的功能學(xué)顯像與組織結(jié)構(gòu)顯像的統(tǒng)一。

然而，淋巴結(jié)成像本身具有一定的困難，具體表現(xiàn)在：當(dāng)造影劑粒徑大于40nm時候，進(jìn)入體內(nèi)后導(dǎo)致其被肝、脾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬的比例大為增加，從而腫瘤（或淋巴結(jié)）靶向效應(yīng)有所減低。控制造影劑粒徑小于40nm時，可產(chǎn)生獨(dú)特的被動靶向淋巴結(jié)的功能，使造影劑聚集于淋巴結(jié)，實(shí)現(xiàn)淋巴結(jié)的成像。然而，粒徑小于40nm的單顆粒造影劑的造影能力又難以滿足淋巴造影的需要，需借助聚合物膠束將小顆粒的造影劑包覆起來，利用集群增強(qiáng)效應(yīng)實(shí)現(xiàn)淋巴結(jié)的高靈敏成像。高分子聚合物膠束具有粒徑可控、生物安全及組織相容性好、細(xì)胞毒副作用低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，在藥物傳輸和成像探針構(gòu)筑領(lǐng)域顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢。盡管已經(jīng)有多篇關(guān)于納米載體用于淋巴結(jié)成像的報道，但多數(shù)都是通過局部組織間注射來實(shí)現(xiàn)局部淋巴結(jié)的成像，在臨床運(yùn)用方面受到很大的限制。如何安全、有效的實(shí)現(xiàn)靜脈淋巴結(jié)成像，仍然是淋巴結(jié)成像向臨床轉(zhuǎn)化的重要難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種可降解兩親性嵌段聚合物。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種能同時負(fù)載spio和尼羅紅的納米膠束。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種能同時負(fù)載spio和尼羅紅的納米膠束的制備方法。

本發(fā)明的另一個目的是提供上述兩親性嵌段聚合物在制備能進(jìn)行mr-光學(xué)雙模態(tài)成像的納米膠束中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個目的是提供上述納米膠束在對鼠單核巨噬細(xì)胞進(jìn)行高效、安全標(biāo)記中的應(yīng)用。所述納米膠束能對鼠單核巨噬細(xì)胞進(jìn)行高效標(biāo)記，且易水解，水解產(chǎn)物可用于臨床使用，安全無毒副作用。

本發(fā)明的另一個目的是提供上述納米膠束在對鼠單核巨噬細(xì)胞進(jìn)行mr-熒光雙模態(tài)淋巴結(jié)成像中的應(yīng)用。所述納米膠束能負(fù)載高敏磁造影劑及熒光染料，就淋巴結(jié)成像過程中對淋巴結(jié)內(nèi)巨噬細(xì)胞對膠束的攝取及分布進(jìn)行有效的、實(shí)時的定位監(jiān)測。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種可降解兩親性嵌段聚合物，聚合物由聚乙二醇-樹狀低聚賴氨酸親水段和膽酸疏水支鏈段構(gòu)成；所述聚乙二醇-樹狀低聚賴氨酸親水段分子量為2500da，膽酸疏水支鏈段長度為2～8個膽酸。

一種同時負(fù)載spio和尼羅紅的納米膠束，所述納米膠束由可降解兩親性嵌段聚合物自組裝形成，spio及尼羅紅負(fù)載于其疏水內(nèi)核；所述兩親性嵌段聚合物由聚乙二醇-樹狀低聚賴氨酸親水段和膽酸疏水支鏈段構(gòu)成；所述聚乙二醇-樹狀低聚賴氨酸親水段分子量為2500da，膽酸疏水支鏈段長度為2～8個膽酸。

本發(fā)明所述的可降解兩親性嵌段聚合物自組裝后能形成一種較小納米尺寸的正電荷納米膠束，將疏水性的spio及尼羅紅負(fù)載于其疏水內(nèi)核，得到同時負(fù)載mri造影劑及熒光造影劑的納米膠束，將這種納米膠束與鼠單核巨噬細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了對鼠單核巨噬細(xì)胞高效率雙模態(tài)標(biāo)記。同時，由于該兩親性嵌段聚合物易水解，水解產(chǎn)物可用于臨床使用，納米膠束對鼠單核巨噬細(xì)胞顯示了極小的細(xì)胞毒性，對人體安全無毒副作用。

本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)時對鼠單核巨噬細(xì)胞細(xì)胞的高效標(biāo)記，選取聚乙二醇-樹狀低聚賴氨酸親水段；選取膽酸為疏水段，能夠同時負(fù)載疏水性spio和尼羅紅，同時使spio在細(xì)胞內(nèi)的再聚集，可滿足高靈敏度mr-熒光雙模態(tài)造影劑的要求。

本發(fā)明為了得到超小粒徑納米膠束，可以通過調(diào)控聚乙二醇-樹狀低聚賴氨酸連接的膽酸數(shù)目，得到能被動靶向淋巴結(jié)的造影粒子。所述納米膠束粒徑為25～40nm。

本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)時對鼠單核巨噬細(xì)胞的安全標(biāo)記，將極易得到生物安全的聚乙二醇聚合物和膽酸通過可降解的酰胺鍵鏈接，水解產(chǎn)物（peg、賴氨酸和膽酸）均細(xì)胞毒性極小，對人體安全無毒副作用。

所述同時負(fù)載spio和尼羅紅的納米膠束的制備方法，包括如下步驟：

s1.將(s)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸通過酰胺化反應(yīng)接到聚乙二醇的氨基端；

s2.將氨基的保護(hù)基團(tuán)叔丁氧羰基脫去，得到聚乙二醇-賴氨酸；

s3.在聚乙二醇-賴氨酸的基礎(chǔ)上，重復(fù)s1和s2的步驟，得到末端接1～7個賴氨酸的聚乙二醇，表述為mpeg-lys1～7；

s4.在hbtu和hobt的偶聯(lián)下，將膽酸通過酰胺化反應(yīng)接到mpeg-lys1～7的氨基端，得到可降解兩親性嵌段聚合物；

s5.可降解兩親性嵌段聚合物進(jìn)行自組裝，將疏水性的spio及尼羅紅負(fù)載于其疏水內(nèi)核，得到同時負(fù)載spio和尼羅紅的納米膠束。

如上所述的可降解兩親性嵌段聚合物在制備能進(jìn)行mr-熒光雙模態(tài)成像的納米膠束中的應(yīng)用。

所述同時負(fù)載spio和尼羅紅的納米膠束在進(jìn)行mr-熒光雙模態(tài)淋巴成像的應(yīng)用。

所述同時負(fù)載spio和尼羅紅的納米膠束在對鼠單核巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用。

如上所述的納米膠束在對鼠單核巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外標(biāo)記及體內(nèi)mr-熒光雙模態(tài)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明提供了一種mr-熒光雙模態(tài)淋巴成像的納米膠束的制備方法及應(yīng)用，針對現(xiàn)有淋巴結(jié)成像難度大、敏感型及特異性較低的問題，得到同時負(fù)載mri造影劑及熒光造影劑的小粒徑納米膠束，將這種納米膠束與鼠單核巨噬細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，能夠?qū)奘杉?xì)胞進(jìn)行高效的spio、熒光標(biāo)記，就淋巴結(jié)成像過程中對淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞對膠束的攝取及淋巴結(jié)內(nèi)分布進(jìn)行有效的、實(shí)時的動態(tài)mr-熒光雙模態(tài)定位監(jiān)測。同時，由于該兩親性嵌段聚合物極易水解，水解產(chǎn)物可用于臨床使用，該納米膠束對巨噬細(xì)胞顯示了極小的細(xì)胞毒性，對人體安全無毒副作用，有望真正實(shí)現(xiàn)納米載體標(biāo)記淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。

附圖說明

圖1為納米膠束的制備示意圖。

圖2為納米膠束的tem圖、粒徑。

圖3為納米膠束弛豫率的mri檢測。

圖4為納米膠束標(biāo)記鼠單核巨噬細(xì)胞的熒光標(biāo)記檢測：激光共聚焦顯微鏡法。

圖5為納米膠束標(biāo)記鼠單核巨噬細(xì)胞的鐵標(biāo)記檢測：（a）mrit2值測量法；（b）普魯士藍(lán)鐵染色法。

圖6為納米膠束對鼠單核巨噬細(xì)胞的毒性測試：mtt法。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步解釋說明，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明范圍的限制，但凡采用等同替換或等效變換的形式所獲得的技術(shù)方案，均應(yīng)包括在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。

以下實(shí)施例和對比例中，所用原料均為市售商品。

實(shí)施例1

s1.聚乙二醇-雙(叔丁氧羰基)-l-賴氨酸（mpeg-lys(boc)2）的合成，反應(yīng)機(jī)理及過程如下：

首先，將boc-lys(boc)-oh通過酰胺化反應(yīng)接到聚乙二醇的氨基端（mpeg-nh2）。具體地，1.0gmpeg-nh2（0.5mmol），207mg(s)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸（0.60mmol），81mg1-羥基苯并三唑（hobt,0.60mmol），238mgo-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽（hbtu,0.60mmol）和100μln，n-二異丙基乙胺（dipea）裝入反應(yīng)瓶（25ml）中，加入無水dmf（15ml）溶解，室溫下攪拌反應(yīng)8h。用茚三酮測試驗(yàn)證反應(yīng)進(jìn)行是否完全：反應(yīng)液與茚三酮檢測液顯棕黃色（無藍(lán)色）說明反應(yīng)完全。反應(yīng)完后的溶液用乙醚沉淀并多次洗滌，經(jīng)分離干燥得到目標(biāo)分子聚乙二醇-雙(叔丁氧羰基)-l-賴氨酸（mpeg-lys(boc)2）。

s2.聚乙二醇-賴氨酸（mpeg-lys）的合成，反應(yīng)機(jī)理及過程如下：

用三氟乙酸將氨基的保護(hù)基叔丁氧羰基脫去，按每1g聚合物加10ml三氟乙酸的用量，反應(yīng)在常溫進(jìn)行，保持?jǐn)嚢璋胄r后沉淀在無水乙醚中，過濾、洗滌、干燥后得到聚乙二醇-賴氨酸。

s3.mpeg-lys3的合成，反應(yīng)機(jī)理及過程如下：

在聚乙二醇-賴氨酸的基礎(chǔ)上，重復(fù)上述的接boc-lys(boc)-oh和脫保護(hù)的步驟，得到mpeg-lys3（末端接三個賴氨酸的peg，氨基變成四個）。

s4.聚乙二醇-樹狀低聚賴氨酸-膽酸（mpeg-lys3-ca4）合成，反應(yīng)機(jī)理及過程如下：

在hbtu和hobt的偶聯(lián)下，將膽酸通過酰胺化反應(yīng)接到mpeg-lys3的氨基端。具體地，0.6gmpeg-lys3（0.25mmol），490mg膽酸（1.2mmol），162mg1-羥基苯并三唑（hobt,1.2mmol），476mgo-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽（hbtu,1.2mmol）和200μln,n-二異丙基乙胺（dipea）裝入反應(yīng)瓶（25ml）中，加入無水dmf（15ml）溶解，室溫下攪拌反應(yīng)8h。用茚三酮測試驗(yàn)證反應(yīng)進(jìn)行完全后，裝入透析袋內(nèi)（截留分子量：1kda）在無水甲醇中透析兩天，沉淀在無水乙醚中，經(jīng)過濾、洗滌、干燥后，得最終產(chǎn)物mpeg-lys3-ca4。

s5.負(fù)載尼羅紅和spio的納米膠束制備

20mgmpeg-lys3-ca4用0.5mldmso溶解后與溶有1mgspio，0.2mg尼羅紅的1.5ml氯仿溶液混合，超聲作用下，乳化在20mlpbs中，旋蒸除去氯仿后，用450nm的針筒過濾器除去大的聚集體和游離的spio和尼羅紅，pbs中透析（14kda）兩天除去dmso，然后用100kda的超濾管濃縮并洗滌，得到同時負(fù)載尼羅紅和spio的納米膠束，制備思路如圖1所示。所得納米膠束平均粒徑為33.8±5.8nm。

制備的納米膠束表征

取實(shí)施例1得到的納米膠束溶液，測定其水力學(xué)直徑及形貌結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2所示。（a）納米膠束粒徑為33.8±5.8nm。（b）電鏡結(jié)果表明，納米粒子呈均勻的球形結(jié)構(gòu)。

納米膠束弛豫率的mri檢測

將實(shí)施例1制備的納米膠束于96孔板內(nèi)按濃度梯度逐級稀釋，進(jìn)行mri（gediscoverymr750，3.0t）體外測試。使用快速自旋回波序列，獲取t2加權(quán)圖像，成像參數(shù)如下tr/te=5000/111ms，fov為100mm，矩陣：256*256，層厚：2mm，間隔：0，roi=28mm²，獲取t2的弛豫時間。以鐵濃度（ug/ml）為橫坐標(biāo)，t的倒數(shù)（r2）為縱坐標(biāo)，采用線性最小二乘回歸分析，直線斜率即為t2的弛豫度。圖3結(jié)果顯示，負(fù)載于納米膠束內(nèi)的spio由于團(tuán)簇效應(yīng)，具有很高的t2弛豫率，能夠?qū)崿F(xiàn)對鼠巨噬細(xì)胞的有效標(biāo)記。

納米膠束標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞的熒光標(biāo)記檢測

將實(shí)施例1制備的納米膠束在鐵濃度為10μg/ml的情況下標(biāo)記鼠巨噬細(xì)胞6小時后，激光共聚焦顯微鏡觀察納米膠束對細(xì)胞的熒光標(biāo)記情況。圖4結(jié)果表明：激光共聚焦顯示細(xì)胞被載有熒光染料尼羅紅的納米膠束高效標(biāo)記。

納米膠束對神經(jīng)干細(xì)胞的鐵標(biāo)記檢測

將實(shí)施例1制備的納米膠束在鐵濃度為10μg/ml的情況下標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞6小時后，收集細(xì)胞pbs洗滌三次后重懸細(xì)胞于200μl1%瓊脂糖凝膠中（細(xì)胞密度為2.5×10⁶/ml），mri、普魯士藍(lán)檢測納米膠束對鼠單核巨噬細(xì)胞的spio標(biāo)記情況，mri參數(shù)同弛豫率的檢測。圖5結(jié)果顯示：（a）mr示標(biāo)記后細(xì)胞的t2信號明顯降低，低于空白對照組；（b）普魯士藍(lán)染色示標(biāo)記鼠單核巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有較多藍(lán)染鐵顆粒；滿足后續(xù)活體mr示蹤的條件。

納米膠束的細(xì)胞毒性檢測

采用mtt法檢測實(shí)施例1制備的納米膠束與鼠單核巨噬細(xì)胞孵育后細(xì)胞的存活率，評價納米膠束對細(xì)胞的毒性，結(jié)果如圖6所示，納米膠束顯示了極小的細(xì)胞毒性，對人體安全無毒副作用，有望真正實(shí)現(xiàn)納米載體標(biāo)記巨噬細(xì)胞從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。

實(shí)施例2

參照實(shí)施例1合成兩親性嵌段聚合物，其中聚乙二醇-氨基（mpbla-nh2）其末端氨基經(jīng)1次與(s)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸耦合、脫保護(hù)后，可得到末端帶兩個氨基的peg-lys。pbla-lys按實(shí)施例1的方法接上膽酸，可得到末端接2個膽酸的兩親性聚合物。負(fù)載尼羅紅和spio的納米膠束制備方法同實(shí)施例1。所得納米膠束平均粒徑為38±2.0nm。

實(shí)施例3

參照實(shí)施例1合成兩親性嵌段聚合物，其中聚乙二醇-氨基（mpbla-nh2）其末端氨基經(jīng)3次與(s)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸耦合、脫保護(hù)后，可得到末端帶8個氨基的peg-lys7。pbla-lys7按實(shí)施例1的方法接上膽酸，可得到末端接8個膽酸的兩親性聚合物。負(fù)載尼羅紅和spio的納米膠束制備方法同實(shí)施例1。所得納米膠束平均粒徑為32.5±5.4nm。