本發(fā)明屬于生化與生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種玻璃海鞘多肽的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是人類健康的第一殺手，其發(fā)病率和致死率均居各中疾病之首?？拱┧幬锏难芯亢烷_(kāi)發(fā)已成為本世紀(jì)新藥研究的重大課題。從海洋中分離純化抗腫瘤活性物質(zhì)已經(jīng)成為抗癌藥物研究的熱點(diǎn)之一。我們?cè)诤Y選抗腫瘤藥物過(guò)程中發(fā)現(xiàn)從玻璃海鞘中分離純化的一種多肽(PI5931)具有很強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，對(duì)發(fā)展成為新的抗癌藥物具有很大潛力。

海鞘(Ascidian)屬于脊索動(dòng)物門(Chordates)，尾索動(dòng)物亞門(Urochordata)，海鞘綱(Ascidiacea)，全世界大約有1600種。從中發(fā)現(xiàn)了許多具有新的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的環(huán)肽、線性肽及desipeptides。Didemnins(膜海鞘素)最早是從加勒比海鞘中分離的，是desipeptides的家族，具有抗腫瘤，抗病毒和免疫抑制作用，其中Didemnins B是抗腫瘤活性最強(qiáng)的環(huán)肽(體外對(duì)L1210的IC50為2.5ng/ml)，也是第一種進(jìn)入臨床試驗(yàn)的海洋天然產(chǎn)物。由兩種海鞘Didemnum cuculiferum和Polysyncranton lithostrotum中發(fā)現(xiàn)的一種13個(gè)氨基酸的環(huán)肽可顯著抑制微管聚合，并能延長(zhǎng)小鼠p388淋巴細(xì)胞白血病的生存期；但由玻璃海鞘(Ciona intestinalis)中分離出抗腫瘤蛋白一直未見(jiàn)報(bào)道。

玻璃海鞘屬于內(nèi)性目、玻璃海鞘科，為我國(guó)北方海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的主要生物污染物，國(guó)內(nèi)有關(guān)玻璃海鞘的研究?jī)H僅局限于胚胎發(fā)育，生理生化，脂肪酸提取上。董平原等從玻璃海鞘中分離得到了一種具有抗新生血管生成活性和抗腫瘤作用的玻璃海鞘多肽BLF-2，對(duì)斑馬魚胚胎血管生成具有顯著的抑制活性，對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成具有顯著的抑制作用。

由玻璃海鞘中提取分離出抗腫瘤多肽一直未見(jiàn)報(bào)道，本發(fā)明采用多種分離純化手段從玻璃海鞘中分離得到一種新的具有抗腫瘤作用的多肽PI10，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該多肽在體外具有誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402凋亡的活性，并對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有良好的細(xì)胞毒活性。與現(xiàn)有的化療藥物相比，抗腫瘤多肽類藥物具有毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，有望成為新型的抗腫瘤藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種玻璃海鞘多肽的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

玻璃海鞘多肽的應(yīng)用：玻璃海鞘多肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

所述玻璃海鞘多肽在制備抗人肺癌細(xì)胞、人宮頸癌上皮細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。

所述玻璃海鞘多肽按如下方法制備

1)將新鮮的海鞘通過(guò)有機(jī)溶劑以4-20℃進(jìn)行沉淀提取1-3次，沉淀物通過(guò)濾膜進(jìn)行超濾截留大于5KDa物質(zhì)，待用；

2)將上述截留大于5KDa物質(zhì)，以0.05-0.5M的NaCl緩沖液作為洗脫液進(jìn)行DEAE陰離子交換柱層析，收集0.15M NaCl緩沖液洗脫組分，待用；

3)將上述收集的洗脫組分經(jīng)Superdex75分子篩凝膠層析，用超純水做洗脫液，流速為0.8-1.2ml/min，收集洗脫組分，待用；

4)將上述洗脫組分經(jīng)HPLC C-18反相柱分離純化，洗脫液為A液和B液，進(jìn)行梯度洗脫，起始洗脫液中A液占總洗脫液體積的90％，B液占總洗脫液體積的10％，B液每分鐘1％的速率上升，流速為0.5-0.8ml/min，當(dāng)B液占總洗脫液體積的28.4％時(shí)出現(xiàn)活性組分，即得到N-末端序列為YQPDKFMLRGELRNN，分子量為5931Da的單一組分玻璃海鞘多肽；其中A液為A液總體積0.1％的TFA和A液總體積99.9％的超純水，B液為B液總體積0.1％的TFA和B液總體積99.9％的乙腈。

所述步驟1)通過(guò)有機(jī)溶劑沉淀時(shí)采用體積百分含量為10％-90％的丙酮水溶液，并且每次沉淀時(shí)間為12小時(shí)。

所述步驟1)通過(guò)有機(jī)溶劑沉淀時(shí)采用體積百分含量為60％-80％的丙酮水溶液。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明中涉及的多肽是一種海洋來(lái)源的物質(zhì)，由于海洋生態(tài)環(huán)境的特殊性，使得海洋生物具有某些陸上生物所沒(méi)有的活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)往往具有結(jié)構(gòu)新穎、高活性、耐藥性低等特點(diǎn)，可以為新藥研究和開(kāi)發(fā)提供模式結(jié)構(gòu)和醫(yī)藥前體。

2.該多肽在提取過(guò)程中經(jīng)過(guò)了70℃高溫加熱，加熱后仍保持活性不變說(shuō)明該多肽具有熱穩(wěn)定性，將來(lái)制成藥后能延長(zhǎng)藥品的貨架壽命。

3.本發(fā)明將玻璃海鞘多肽經(jīng)MTT測(cè)定、掃描電鏡觀察、細(xì)胞核染色觀察、線粒體膜電位變化等體內(nèi)外方法證明了該多肽對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤作用，可引起腫瘤細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)機(jī)理系通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑，說(shuō)明了此玻璃海鞘多肽在預(yù)防和治療腫瘤方面的作用和新途徑。具體地說(shuō)，就是通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)闡明了玻璃海鞘多肽誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑，確定此多肽在惡性腫瘤的預(yù)防和治療方面的用途。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例提取的多肽PI5931用ABI公司的Q Trap離子噴霧質(zhì)譜儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)以增強(qiáng)的方式測(cè)定其分子量。質(zhì)譜儀配以TurbolonSpray source并以陽(yáng)離子模式操作

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提取的多肽PI5931的Tricine-SDS-Page電泳分析圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例提取的多肽PI5931處理BEL-7402癌細(xì)胞，掃描電鏡下正常細(xì)胞與細(xì)胞凋亡形態(tài)變化。(其中圖3A為正常細(xì)胞，圖3B為處理12小時(shí)后細(xì)胞)

圖4為抗腫瘤多肽PI5931處理BEL-7402癌細(xì)胞，DAPI染色，觀察凋亡小體的出現(xiàn)。(其中1.正常細(xì)胞2.PI5931處理12小時(shí)3、PI5931處理18小時(shí)，4.PI5931處理24小時(shí)(可清晰看見(jiàn)凋亡小體))

圖5為抗腫瘤多肽PI5931處理BEL-7402癌細(xì)胞，AO/EB染色觀察凋亡細(xì)胞細(xì)胞核顏色變化圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

玻璃海鞘多肽的制備方法：

1)丙酮沉淀制備粗提物：取新鮮海鞘洗凈、粉碎、分散勻漿機(jī)勻漿，在70℃下加熱30min，而后以10000rpm，離心20min，得上清，上清液中加入清液體積三倍的體積百分含量為70％的丙酮，在4℃靜置過(guò)夜；靜置過(guò)夜后以1000rpm離心20min，取沉淀。沉淀重新溶解后通過(guò)5KDa的濾膜進(jìn)行超濾截留，保留大于5KDa的部分，待用。

2)DEAE Sepharose^TMFast Flow陰離子交換柱層析：

首先，將粗提物裝入分子截留量為3.5kD的透析袋，采用純水進(jìn)行初步透析，而后將其對(duì)起始緩沖溶液充分透析；將透析好的樣品取出，10000rpm離心去除不溶物，準(zhǔn)備上柱；起始緩沖溶液為0.02M Tris-Cl，pH8.0。

其次，取適量的DEAE Sepharose^TMFast Flow填料(GE公司生產(chǎn))，加入超純水中，用玻璃棒輕微攪拌均勻后，玻璃棒引流，裝入16×26規(guī)格的層析柱，用起始緩沖溶液平衡3-4個(gè)柱體積，基線穩(wěn)定后方可使用。

再次，將樣品上柱后，用起始緩沖溶液沖洗，待不掛柱蛋白完全穿透后，開(kāi)始洗脫，洗脫液為Tris-Cl、NaCl溶液，即在起始緩沖液的基礎(chǔ)上，分別配制0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.3M和0.5MNaCl溶液，而后進(jìn)行分步洗脫，流速為5ml/分鐘，整個(gè)層析過(guò)程采用280nm檢測(cè)蛋白質(zhì)洗脫峰。

最后，將由六個(gè)不同濃度濃度NaCl洗脫所得到的組分用純水充分透析后凍干，用純水溶解；每個(gè)組分質(zhì)量濃度為200ug/ml，MTT試驗(yàn)檢測(cè)各組份活性，0.15M NaCl洗脫組分為活性組分，將活性組份置于-20℃保存，待用。

3)superdex 75分子篩凝膠層析：

首先，取適量的superdex 75分子篩凝膠填料(GE公司生產(chǎn))，清水浸泡24小時(shí)，用玻璃棒輕微攪拌均勻后，玻璃棒引流，裝入1.6×80cm規(guī)格的層析柱，用純水平衡3-4個(gè)柱體積，基線穩(wěn)定后方可使用。

其次，將上述0.15M NaCl洗脫組分上柱，用清水以1ml/min的速度沖洗層析柱，整個(gè)層析過(guò)程采用280nm檢測(cè)蛋白質(zhì)洗脫峰，共得四個(gè)洗脫峰，每個(gè)洗脫峰為一個(gè)組分，將各個(gè)組分冷凍干燥，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，MTT試驗(yàn)檢測(cè)各組份活性，第四個(gè)洗脫組分為活性組分，即截取1小時(shí)40分鐘至1小時(shí)55分鐘的洗脫液。將活性組份置于-20℃保存。

4)將上述洗脫組分經(jīng)HPLC C-18反相柱(4.6×250mm規(guī)格的層析柱)分離純化，洗脫液為A液和B液，進(jìn)行梯度洗脫，起始洗脫液中A液占總洗脫液體積的90％，B液占總洗脫液體積的10％，B液每分鐘1％的速率上升，流速為0.5ml/min，當(dāng)B液占總洗脫液體積的28.4％時(shí)出現(xiàn)活性組分，經(jīng)質(zhì)譜鑒定即得到N-末端序列為YQPDKFMLRGELRNN，分子量為5931Da的單一組分玻璃海鞘多肽(參見(jiàn)圖1)；活性組分由等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)為PI＝7.25。其中A液為A液總體積0.1％的TFA和A液總體積99.9％的超純水，B液為B液總體積0.1％的TFA和B液總體積99.9％的乙腈。

5)海鞘多肽的Tricine-SDS-Page電泳分析鑒定：配置4％的濃縮膠和16.5％的分離膠。取過(guò)C-18反相柱組分點(diǎn)樣，用低分子量蛋白Marker為對(duì)照，進(jìn)行Tricine-SDS-Page蛋白電泳，濃縮膠采用50V電壓，分離膠采用60V電壓進(jìn)行電泳，電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色液進(jìn)行染色，在樣品泳道能夠發(fā)現(xiàn)6KD左右大小的一條亮帶，說(shuō)明該多肽的分子量在6KD左右(參見(jiàn)圖2)。

實(shí)施例2：抗瘤譜的測(cè)定

細(xì)胞：人宮頸癌上皮細(xì)胞(Hela)、人肝癌細(xì)胞(BEL-7402)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、人肺癌細(xì)胞(A549)、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U8T)。以上細(xì)胞均為中科院海洋所海洋藥物實(shí)驗(yàn)室提供。

藥品及試劑：玻璃海鞘多肽：中科院海洋所海洋藥物實(shí)驗(yàn)室提供；5-氟脲嘧啶(5-FU)江蘇南通精華制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)為100402；MTT(SIGMA，USA)；DMSO(SIGMA，USA)；胰蛋白酶(SIGMA，USA)；RPMI1640(GIBCO，Invitragen Co.，USA)；DMEM(GIBCO，Invitragen Co.，USA)；優(yōu)級(jí)胎牛血清(GIBCO，Invitragen Co.，USA)；特級(jí)胎牛血清Fetal BovineSerum(Hyclone)。

儀器：超低溫冰箱(Nature，USA)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO，Japan)，倒置顯微鏡(NIKON，Japan)，酶標(biāo)儀(Bio-Tek Instruments，Inooski，VT，USA)，PH計(jì)(Thermo orion，USA)，超凈工作臺(tái)(FLC-哈爾濱東聯(lián)儀器廠)。

而后通過(guò)MTT法進(jìn)行檢測(cè)抗腫瘤效果，取各種人的腫瘤細(xì)胞株按照常規(guī)方法培養(yǎng)傳代，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度5×10⁴個(gè)/ml左右。將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔加入180μl。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組加入各濃度上述實(shí)施例所得多肽提取物20μl/孔，并以5-FU作為陽(yáng)性對(duì)照組，每組各設(shè)4個(gè)平行孔，并分別設(shè)清水對(duì)照以調(diào)零。在培養(yǎng)箱37℃，培養(yǎng)48h后，用移液槍將96孔板中液體洗凈后每孔加入MTT(1mg/ml)30μl，置CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)4h，棄去上清，每孔加入DMSO 150μl，置搖床搖勻30min，用酶標(biāo)儀在492nm下檢測(cè)，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)算細(xì)胞死亡率，求取IC₅(參見(jiàn)表1)₀。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計(jì)，玻璃海鞘多肽對(duì)用于試驗(yàn)的6種腫瘤細(xì)胞，均有不同程度的抑制作用，并且呈一定的劑量依賴關(guān)系，不同濃度的玻璃海鞘多肽對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的抑制率、IC₅₀值詳見(jiàn)表1。

表1不同濃度的玻璃海鞘多肽對(duì)5種腫瘤細(xì)胞的抑制率

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，活性組分在50ug/ml濃度時(shí)能夠強(qiáng)烈抑制人肝癌細(xì)胞(BEL-7402)、人宮頸癌上皮細(xì)胞(Hela)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U8T)、人肺癌細(xì)胞(A549)生長(zhǎng)，抑制率達(dá)到50％-75％，說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例所得物質(zhì)能夠抑制癌細(xì)胞的增值。

實(shí)施例3：掃描電鏡觀察凋亡現(xiàn)象

用六孔板做細(xì)胞爬片→37℃培養(yǎng)24小時(shí)→加入上述實(shí)施例制備所得終濃度100ug/ml的玻璃海鞘蛋白提取物→37℃培養(yǎng)20小時(shí)→PBS沖洗→2.5％戊二醛固定→30％、50％、70％、80％、90％、100％乙醇梯度脫水→掃描電子顯微鏡下觀察。

掃描電鏡觀察凋亡細(xì)胞的外部形態(tài)：掃描電鏡下觀察BEL-7402處理細(xì)胞，與正常細(xì)胞相比，經(jīng)過(guò)上述實(shí)施例制備所得海鞘多肽處理細(xì)胞表面微絨毛減少或者消失，細(xì)胞變圓皺縮，細(xì)胞表面出現(xiàn)蜂窩狀空洞，少數(shù)細(xì)胞能發(fā)現(xiàn)凋亡小體存在(參見(jiàn)圖3)。

實(shí)施例4：細(xì)胞核染色觀察

1)DAP I染色，觀察凋亡小體的出現(xiàn)，DAPI染色：用六孔板做細(xì)胞爬片→37℃培養(yǎng)24小時(shí)→加入上述實(shí)施例制備所得終濃度100ug/ml的玻璃海鞘蛋白提取物→37℃培養(yǎng)20小時(shí)→PBS沖洗→多聚甲醛固定→PBS沖洗→Triton-100破膜→PBS沖洗→DAPI染色20min→熒光顯微鏡下觀察。

經(jīng)DAPI染色后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)均勻，經(jīng)過(guò)上述實(shí)施例制備所得海鞘多肽處理細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)發(fā)生固縮，可見(jiàn)細(xì)胞核分成大小不同的圓形，是凋亡小體的典型形狀(參見(jiàn)圖4)。

2)AO/EB染色觀察凋亡細(xì)胞細(xì)胞核顏色變化：用六孔板做細(xì)胞爬片→37℃培養(yǎng)24小時(shí)→加入上述實(shí)施例制備所得終濃度100ug/ml的玻璃海鞘蛋白提取物→37℃培養(yǎng)20小時(shí)→PBS沖洗→多聚甲醛固定→PBS沖洗→Triton-100破膜→PBS沖洗→AO/EB混合液染色→熒光顯微鏡下觀察。

經(jīng)AO/EB染色后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，經(jīng)過(guò)上述實(shí)施例制備所得海鞘多肽處理細(xì)胞發(fā)出橙紅色熒光。正常細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)均勻，藥物處理細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)發(fā)生固縮，可見(jiàn)細(xì)胞核分成大小不同的圓形，是凋亡小體的典型形狀(參見(jiàn)圖5)。

實(shí)施例5

線粒體膜電位檢測(cè)(JC-1)：

A細(xì)胞培養(yǎng)瓶細(xì)胞傳代37℃培養(yǎng)24小時(shí)

B加入上述實(shí)施例制備所得終濃度50ug/ml的玻璃海鞘蛋白提取物，37℃培養(yǎng)20小時(shí)

C收集細(xì)胞，取10-60萬(wàn)細(xì)胞重懸于0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液中

D加入JC-1染色工作液，混勻，37℃培養(yǎng)20分鐘。

E 600g離心4分鐘，棄上清

F用JC-1染色緩沖液洗滌2次

G再用JC-1染色緩沖液重懸后，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)490nm)。

經(jīng)玻璃海鞘多肽處理過(guò)的細(xì)胞在熒光分光光度計(jì)激發(fā)波長(zhǎng)為490nm時(shí)，在530nm處出現(xiàn)強(qiáng)烈激發(fā)光，在590nm處激發(fā)光很弱或者沒(méi)有。而正常細(xì)胞相比在激發(fā)波長(zhǎng)為490nm時(shí)，在530nm出現(xiàn)的激發(fā)光弱于590nm出現(xiàn)的激發(fā)光。由此可見(jiàn)玻璃海鞘多肽處理過(guò)的細(xì)胞，線粒體膜電位明顯下降，說(shuō)明玻璃海鞘誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡走的是線粒體途徑。