本發(fā)明涉及一種治療白癜風(fēng)的維藥復(fù)方有效部位和有效部位群及其制備方法，屬于民族醫(yī)藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
白癜風(fēng)是一種色素障礙性疾病，表現(xiàn)為皮膚脫色而影響美容。由于多發(fā)于皮膚暴露部位，常給患者帶來巨大的心理精神壓力，因此該病一直是皮膚科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。白癜風(fēng)的組織病理特征顯示，患者白斑區(qū)的黑素細(xì)胞(Melanocyte，MC)及黑素顆粒出現(xiàn)部分缺失或完全缺失。
維吾爾醫(yī)認(rèn)為白癜風(fēng)是由異常粘液質(zhì)引起的，臨床分型有異常甜味、異常咸味、異常酸味、異常澀味、異常淡味、異常凝固樣等六種粘液質(zhì)型。治療過程中，分析發(fā)病原因、原氣質(zhì)和異常體液分布、影響因素以及對不同辯證分型與之關(guān)聯(lián)的證候癥狀，在此基礎(chǔ)上采用飲食忌口、使用成熟劑和清除劑以及藥物、非藥物等綜合療法，活血化瘀、促進(jìn)新陳代謝和黑色素細(xì)胞的形成，達(dá)到治療白癜風(fēng)的目的。在治療白癜風(fēng)方面，維吾爾醫(yī)藥有著獨(dú)特治療療法和用藥經(jīng)驗(yàn)，并在長期的治療過程中，形成了很多療效顯著、副作用低的藥物及復(fù)方藥物。維藥復(fù)方制劑白熱斯丸和白熱斯蜜膏收載于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)，均由驅(qū)蟲斑鳩菊、盒果藤、阿納其根、玫瑰花瓣、干姜、蒺藜六味藥材組成，該復(fù)方制劑是根據(jù)維醫(yī)藥理論，依據(jù)少數(shù)民族在長期的民間臨床實(shí)踐，療效確切、副作用少，尤其是對澀味粘液質(zhì)型白癜風(fēng)治療效果好，分型調(diào)查結(jié)果顯示，澀味粘液質(zhì)型白癜風(fēng)發(fā)病率占總發(fā)病率的34.6％，發(fā)病率最高，該分型的白癜風(fēng)較難治愈、易復(fù)發(fā)，該復(fù)方也是經(jīng)過了長期的臨床應(yīng)用，并在維吾爾醫(yī)治療白癜風(fēng)的各個(gè)階段都有應(yīng)用，可見該復(fù)方在治療白癜風(fēng)方面的優(yōu)勢和特色。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于，提供一種治療白癜風(fēng)的維藥復(fù)方有效部位和有效部位群及其制備方法，該有效部位和有效部位群是由驅(qū)蟲斑鳩菊、盒果藤、阿納其根、玫瑰花瓣、干姜和蒺藜混合粗粉后，通過水或乙醇提取后，經(jīng)過柱層析分離純化得到總黃酮、總皂苷、總酚酸等部位以及有效部位群，其中有效部位群主要含黃酮、皂苷和酚酸，其含量大于50％。通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這三個(gè)有效部位及有效部位群藥效顯著，且給藥劑量小，成分易溶出，利于機(jī)體吸收，提高藥效。
本發(fā)明所述的一種治療白癜風(fēng)的維藥復(fù)方有效部位和有效部位群，是由原料藥按重量配比驅(qū)蟲斑鳩菊10-150g，盒果藤5-100g，阿納其根5-100g，玫瑰花瓣30-200g，干姜5-50g，蒺藜5-30g制成，其中有效部位為總黃酮和總酚酸部位，有效部位群為總黃酮、總皂苷和總酚酸。
所述的一種治療白癜風(fēng)的維藥復(fù)方有效部位和有效部位群的制備方法，按下列步驟進(jìn)行：
a、稱取驅(qū)蟲斑鳩菊10-150g，盒果藤5-100g，阿納其根5-100g，玫瑰花瓣30-200g，干姜5-50g，蒺藜5-30g混合粉碎至20-80目，用6-12倍量的溶劑為20-95％濃度的乙醇水溶液或水溶液提取1-4次，溫度50℃-100℃，每次提取時(shí)間0.5-3小時(shí)，合并提取液，溫度45-80℃減壓濃縮，真空干燥或噴霧干燥，即得干浸膏；
b、將步驟a中得到的干浸膏用濃度為20-80％乙醇溶解，采用大孔樹脂或聚酰胺進(jìn)行吸附，再用濃度30％-70％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度40-70℃減壓濃縮，干燥，即得該復(fù)方的總黃酮部位，以干品重量計(jì)算含總黃酮50-99％，該黃酮部位中主要含有紫鉚素、紫鉚花素和槲皮素，各黃酮成分含量為20—99.9％；
c、將步驟a得到的干浸膏用水溶解后，再用石油醚萃取脫脂，繼續(xù)用水飽和的正丁醇或乙酸乙酯反復(fù)萃取水溶液部分，合并正丁醇層或乙酸乙酯層，溫度50-80℃濃縮干燥成浸膏，用大孔樹脂或硅膠柱進(jìn)行吸附，再用濃度為5-80％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度40-60℃減壓濃縮，干燥，即得該復(fù)方的總皂苷部位，以干品重量計(jì)算含總皂苷50-99％；
d、將步驟a得到的干浸膏分散于水溶液或濃度為20-80％乙醇中，用大孔樹脂或葡聚糖凝膠進(jìn)行吸附，再用濃度為5-60％甲醇洗脫，收集洗脫液，即得該復(fù)方的總酚酸部位，以干品重量計(jì)算含總酚酸50-99％；
e、將步驟a得到的干浸膏用水或濃度為5-90％乙醇溶解，用大孔樹脂或聚酰胺進(jìn)行吸附，再用濃度為40-70％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度50-70℃減壓濃縮，干燥，即得該復(fù)方的總黃酮、總皂苷、總酚酸有效部位群，以干品重量計(jì)算含總黃酮、總皂苷、總酚酸50-99％。
本發(fā)明所述的一種治療白癜風(fēng)的維藥復(fù)方有效部位和有效部位群及其制備方法，通過現(xiàn)代分離純化技術(shù)對傳統(tǒng)的維藥復(fù)方進(jìn)行了去粗存精，根據(jù)現(xiàn)代分析手段和藥理篩選結(jié)果表明，所得的有效部位群、有效部位及其活性成分明確，治療白癜風(fēng)的作用效果更佳，不良反應(yīng)更低。
具體實(shí)施方式
為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明，下面以具體實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明，這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1
a、稱驅(qū)蟲斑鳩菊10g，盒果藤50g，阿納其根50g，玫瑰花瓣100g，干姜10g，蒺藜30g，混合粉碎至20目，用12倍量的濃度為80％乙醇水溶液提取2次，提取溫度70℃，每次提取時(shí)間2小時(shí)，合并提取液，回收溶劑，溫度45℃減壓濃縮，真空干燥，即得干浸膏；
b、將步驟a中得到的干浸膏用濃度60％乙醇溶解，采用聚酰胺進(jìn)行吸附，再用濃度為50％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度60℃減壓濃縮，真空干燥，即得該復(fù)方的總黃酮部位，以干品重量計(jì)算含總黃酮含量為50.1％，其中紫鉚素含量為45.6％，紫鉚花素含量為55.8％，槲皮素含量為99.9％；
c、將步驟a得到的干浸膏用水溶解后，再用石油醚萃取脫脂，繼續(xù)用水飽和的正丁醇反復(fù)萃取水溶液部分，合并正丁醇層，溫度50℃濃縮干燥成浸膏，用大孔樹脂進(jìn)行吸附，先用濃度為5％乙醇洗脫，再用65％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度45℃減壓濃縮，干燥，即得該復(fù)方的總皂苷部位，以干品重量計(jì)算含總皂苷含量為55.34％。
d、將步驟a得到的干浸膏分散于水溶液中，用葡聚糖凝膠進(jìn)行吸附，再用濃度為60％甲醇洗脫，收集洗脫液，即得該復(fù)方的總酚酸部位，以干品重量計(jì)算含總酚酸含量為51.21％；
e、將步驟a得到的干浸膏用水溶解，用大孔樹脂進(jìn)行吸附，再用濃度為60％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度55℃減壓濃縮，干燥，即得該復(fù)方的總黃酮、總皂苷、總酚酸有效部位群，以干品重量計(jì)算含總黃酮、總皂苷、總酚酸總和為67.19％。
實(shí)施例2
a、稱驅(qū)蟲斑鳩菊30g，盒果藤20g，阿納其根20g，玫瑰花瓣150g，干姜5g，蒺藜30g混合后，粉碎至40目，用10倍量的水溶液提取4次，提取溫度100℃，每次提取時(shí)間3小時(shí)，合并提取液，回收溶劑，溫度65℃減壓濃縮，噴霧干燥，即得干浸膏；
b、將步驟a中得到的干浸膏用濃度40％乙醇溶解，用葡聚糖凝膠進(jìn)行吸附，再用濃度為70％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度40℃減壓濃縮，真空干燥，即得該復(fù)方的總黃酮部位，以干品重量計(jì)算含總黃酮含量為90.3％，其中紫鉚素含量為76.9％，紫鉚花素含量為88.2％，槲皮素含量為67.2％；
c、將步驟a得到的干浸膏用水溶解后，再用石油醚萃取脫脂，繼續(xù)用水飽和的乙酸乙酯反復(fù)萃取水溶液部分，合并乙酸乙酯層，溫度60℃濃縮干燥成浸膏，用硅膠柱進(jìn)行吸附，再用濃度為10％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度40℃減壓濃縮，干燥，即得該復(fù)方的總皂苷部位，以干品重量計(jì)算含總皂苷含量為64.20％。
d、將步驟a得到的干浸膏分散于濃度為20％乙醇中，用大孔樹脂進(jìn)行吸附，再用濃度為5％甲醇洗脫，收集洗脫液，即得該復(fù)方的總酚酸部位，以干品重量計(jì)算含總酚酸含量為76.78％；
e、將步驟a得到的干浸膏用濃度為5％乙醇溶解，用聚酰胺進(jìn)行吸附，再用濃度為40％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度50℃減壓濃縮，干燥，即得該復(fù)方的總黃酮、總皂苷、總酚酸有效部位群，以干品重量計(jì)算含總黃酮、總皂苷、總酚酸總和為72.44％。
實(shí)施例3
a、稱驅(qū)蟲斑鳩菊150g，盒果藤5g，阿納其根5g，玫瑰花瓣30g，干姜50g，蒺藜10g混合后，粉碎至80目，用6倍量的濃度為95％乙醇水溶液提取3次，提取溫度80℃，每次提取時(shí)間0.5小時(shí)，合并提取液，回收溶劑，溫度80℃減壓濃縮，真空干燥，即得干浸膏；
b、將步驟a中得到的干浸膏用濃度為20％乙醇溶解，用大孔樹脂進(jìn)行吸附，再用濃度為30％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度70℃減壓濃縮，真空干燥，即得該復(fù)方的總黃酮部位，以干品重量計(jì)算含總黃酮含量為68.9％，其中紫鉚素含量為20.9％，紫鉚花素含量為33.8％，槲皮素含量為46.1％；
c、將步驟a得到的干浸膏用水溶解后，再用石油醚萃取脫脂，繼續(xù)用水飽和的正丁醇反復(fù)萃取水溶液部分，合并正丁醇層，溫度70℃濃縮干燥成浸膏，用硅膠柱進(jìn)行吸附，再用濃度為30％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度50℃減壓濃縮，干燥，即得該復(fù)方的總皂苷部位，以干品重量計(jì)算含總皂苷含量為87.45％；
d、將步驟a得到的干浸膏分散于濃度為60％乙醇中，用葡聚糖凝膠進(jìn)行吸附，再用濃度為40％甲醇洗脫，收集洗脫液，即得該復(fù)方的總酚酸部位，以干品重量計(jì)算含總酚酸含量為50.76％；
e、將步驟a得到的干浸膏用濃度為50％乙醇溶解，用大孔樹脂進(jìn)行吸附，再用濃度為60％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度60℃減壓濃縮，干燥，即得該復(fù)方的總黃酮、總皂苷、總酚酸有效部位群，以干品重量計(jì)算含總黃酮、總皂苷、總酚酸總和為52.30％。
實(shí)施例4
a、稱驅(qū)蟲斑鳩菊70g，盒果藤80g，阿納其根80g，玫瑰花瓣200g，干姜20g，蒺藜5g混合后，粉碎至60目，用8倍量的40％乙醇水溶液提取1次，提取溫度50℃，每次提取時(shí)間2小時(shí)，合并提取液，回收溶劑，55℃濃縮，噴霧干燥，即得干浸膏。
b、將步驟a中得到的干浸膏用濃度為80％乙醇溶解，用大孔樹脂進(jìn)行吸附，再用濃度為60％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度50℃減壓濃縮，真空干燥，即得該復(fù)方的總黃酮部位，以干品重量計(jì)算含總黃酮含量為80.2％，其中紫鉚素含量為60.2％，紫鉚花素含量為57.9％，槲皮素含量為84.8％；
c、將步驟a得到的干浸膏用水溶解后，再用石油醚萃取脫脂，繼續(xù)用水飽和的乙酸乙酯反復(fù)萃取水溶液部分，合并乙酸乙酯層，溫度80℃濃縮干燥成浸膏，用大孔樹脂進(jìn)行吸附，再用濃度為80％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度60℃減壓濃縮，干燥，即得該復(fù)方的總皂苷部位，以干品重量計(jì)算含總皂苷含量為90.12％；
d、將步驟a得到的干浸膏分散于濃度為80％乙醇中，用大孔樹脂進(jìn)行吸附，再用濃度為60％甲醇洗脫，收集洗脫液，即得該復(fù)方的總酚酸部位，以干品重量計(jì)算含總酚酸含量為87.43％；
e、將步驟a得到的干浸膏用濃度為90％乙醇溶解，用聚酰胺進(jìn)行吸附，再用濃度為70％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度70℃減壓濃縮，干燥，即得該復(fù)方的總黃酮、總皂苷、總酚酸有效部位群，以干品重量計(jì)算含總黃酮、總皂苷、總酚酸總和為92.45％。
實(shí)施例5
a、稱驅(qū)蟲斑鳩菊20g，盒果藤100g，阿納其根100g，玫瑰花瓣50g，干姜20g，蒺藜20g混合后，粉碎至40目，用10倍量的濃度為60％乙醇水溶液提取4次，提取溫度90℃，每次提取時(shí)間1.5小時(shí)，合并提取液，回收溶劑，溫度70℃濃縮，真空干燥，即得干浸膏；
b、將步驟a中得到的干浸膏用30％乙醇溶解，用葡聚糖凝膠進(jìn)行吸附，再用40％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度45℃減壓濃縮，真空干燥，即得該復(fù)方的總黃酮部位，以干品重量計(jì)算含總黃酮含量為92.4％，其中紫鉚素含量為77.8％，紫鉚花素含量為92.3％，槲皮素含量為40.5％；
c、將步驟a得到的干浸膏用水溶解后，再用石油醚萃取脫脂，繼續(xù)用水飽和的正丁醇反復(fù)萃取水溶液部分，合并正丁醇層，溫度75℃濃縮干燥成浸膏，用硅膠柱進(jìn)行吸附，再用濃度為70％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度55℃減壓濃縮，干燥，即得該復(fù)方的總皂苷部位，以干品重量計(jì)算含總皂苷含量為58.68％。
d、將步驟a得到的干浸膏分散于濃度為70％乙醇中，用大孔樹脂進(jìn)行吸附，再用濃度為50％甲醇洗脫，收集洗脫液，即得該復(fù)方的總酚酸部位，以干品重量計(jì)算含總酚酸含量為75.66％。
e、將步驟a得到的干浸膏用濃度為80％乙醇溶解，用聚酰胺進(jìn)行吸附，再用濃度為60％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在溫度65℃減壓濃縮，干燥，即得該復(fù)方的總黃酮、總皂苷、總酚酸有效部位群，以干品重量計(jì)算含總黃酮、總皂苷、總酚酸總和為79.41％。
實(shí)施例6
白熱斯總黃酮部位對氫醌脫色C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性白癜風(fēng)小鼠的療效：
1、實(shí)驗(yàn)材料：本實(shí)驗(yàn)常規(guī)材料，維藥復(fù)方總黃酮部位，總黃酮含量為70％，其中紫鉚素含量為25.5％，紫鉚花素含量為36.4％，槲皮素含量為57.3％。
2、實(shí)驗(yàn)方法：
2.1試藥給藥劑量計(jì)算：參照藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，采用公式：計(jì)算任何體重的動(dòng)物公斤體重劑量(mg/kg)dA是已知a種動(dòng)物的劑量(mg/kg)，dB是欲求b種動(dòng)物的劑量(mg/kg)，RA、RB是其體型系數(shù)，WA、WB為其體重(kg)。白熱斯蜜膏人用最高劑量為每天30g，即30000mg/70kg＝428mg/kg·d，折算到小鼠，公斤體重用量為：428mg/kg×(0.059/0.1)×(70/0.02)1/3＝3832mg/kg，按處方生藥量折算用量為：843mg/kg。
2.1.1白熱斯蜜膏生藥劑量：低劑量：843mg/kg；中劑量：1686mg/kg；高劑量：3372mg/kg；
2.1.2有效部位給藥劑量計(jì)算：根據(jù)有效部位得率及生藥量折算，低劑量：8mg/kg；中劑量：16mg/kg；高劑量：32mg/kg。
2.1.3陽性藥8-MOP的劑量換算：根據(jù)《甲氧沙林片說明書》可知，白癜風(fēng)成人，按體重0.5mg/kg計(jì)算，成人每次服用量為25-30mg，每周2-3次，折算至小鼠公斤體重劑量：0.5mg/kg×(0.059/0.1)×(70/0.02)1/3＝4.25mg/kg。
2.2實(shí)驗(yàn)方法：
購入C57BL/6小鼠后，提供合格飼料和飲水，溫度21-24℃，濕度50-60％，光暗周期為12h/12h(光照時(shí)間6:00-18:00)，每3d更換一次墊料和籠盒，動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境3天，第4日，松香/蠟混合物脫去各小鼠背部毛1.5×1.5cm2，24h后開始造模，造模周期為60天，動(dòng)物分組和處理方法見表1；從第31天開始，每組灌胃給藥，連續(xù)給藥30天，每天進(jìn)行皮膚情況拍照。實(shí)驗(yàn)期間密切觀察小鼠皮膚顏色變化。
表1動(dòng)物分組及造模方法
以上各組動(dòng)物每2天受試區(qū)脫毛一次。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
治療結(jié)束后，肉眼大體觀察對動(dòng)物模型的療效。末次給藥后，采血，測定血清中膽堿酯酶活力和丙二醛含量，切取用藥中心部位皮膚1cm×1cm，用10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片后常規(guī)染色后觀察皮膚病理切片。
3.1肉眼觀察正常組皮膚變化：
造模結(jié)束后，空白對照組小鼠毛囊生長進(jìn)入休止期，各模型組受試區(qū)皮膚均長出白色毛發(fā)。各治療組白色毛發(fā)與模型組比較，已明顯減少。
3.2總黃酮部位對C57BL/6小鼠白癜風(fēng)模型血清中膽堿酯酶(CHE)活力的影響：
取小鼠血清50μL，按膽堿酯酶測定試劑盒說明書操作，于酶標(biāo)儀520nm處測定膽堿酯酶活力。血清中用SPSS13.0軟件對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
結(jié)果，模型組CHE活力明顯低于空白對照組(P<0.01)；而各給藥組CHE活力均明顯高于模型組(P<0.01)；有效部位低、中、高劑量組CHE活力明顯高于白熱斯蜜膏低、中、高劑量組(P<0.01)，見表2。
表2總黃酮部位對C57BL/6小鼠模型血清中CHE活力的影響(n＝12)
[注]**P＜0.01VS模型組；ΔΔP＜0.01，白熱斯蜜膏低、中、高劑量組VS有效部位低、中、高劑量組。
3.3總黃酮部位對C57BL/6小鼠白癜風(fēng)模型血清中丙二醛(MDA)含量的影響：
取小鼠血清100μl，按MDA試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀在532nm處比色，測定血清中MDA含量，血清中用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
結(jié)果，模型組MDA含量明顯高于空白對照組(P<0.01)；而甲氧沙林片組，白熱斯蜜膏中、高劑量組，有效部位中、高劑量組小鼠血清中MDA含量明顯低于模型組(P<0.01)，有效部位中、高劑量組明顯高于白熱斯蜜膏中、高劑量組(P<0.01)，見表3。
表3總黃酮部位對C57BL/6小鼠模型血清中MDA含量的影響(n＝12)
[注]*P＜0.05VS模型組；ΔΔP＜0.01有效部位中、高劑量組VS白熱斯蜜膏中、高劑量組。
3.4總黃酮部位對C57BL/6小鼠白癜風(fēng)模型皮膚中含黑色素毛囊計(jì)數(shù)的影響：
沿小鼠脊椎中線剪取1cm×1cm大小的皮膚，將所取皮膚用10％中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色后，進(jìn)行皮膚組織學(xué)觀察、毛囊計(jì)數(shù)，用光鏡觀察50個(gè)毛囊，計(jì)算其中有黑色素的毛囊數(shù)。
結(jié)果，空白對照組皮膚含黑色素毛囊數(shù)明顯高于模型組(P<0.01)；各給藥組含黑色素毛囊數(shù)亦明顯高于模型組(P<0.01)，有效部位各劑量組小鼠皮膚中含黑色素毛囊數(shù)顯著高于白熱斯蜜膏組，見表4。
表4總黃酮部位對C57BL/6小鼠模型皮膚含黑色素毛囊數(shù)的影響(n＝12)
[注]**P＜0.01VS模型組；ΔΔP＜0.01，白熱斯蜜膏低、中、高劑量組VS有效部位低、中、高劑量組。
4小結(jié)：
肉眼觀察各組動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)造模組小鼠受試區(qū)皮膚毛囊進(jìn)入生長期速度較空白對照組慢，長出新毛發(fā)的速度也較空白對照組變慢，受試區(qū)皮膚明顯偏白。造模結(jié)束后，空白對照組小鼠毛囊生長進(jìn)入休止期，各模型組受試區(qū)皮膚均長出白色毛發(fā)，給藥結(jié)束后各治療組白色毛發(fā)與模型組比較，已明顯減少。模型組膽堿酯酶活力明顯低于空白對照組，而各給藥組動(dòng)物血清中CHE活力顯著高于模型組，且有效部位低、中、高劑量組CHE活力均高于白熱斯蜜膏組。模型組MDA含量明顯高于空白對照組(P<0.01)；而甲氧沙林片組，白熱斯蜜膏中、高劑量組，有效部位中、高劑量組小鼠血清中MDA含量明顯低于模型組(P<0.01)，有效部位中、高劑量組明顯高于白熱斯蜜膏中、高劑量組(P<0.01)。模型組小鼠皮膚中含黑色素毛囊數(shù)明顯低于空白組小鼠(P<0.01)；各給藥組含黑色素毛囊數(shù)亦明顯高于模型組(P<0.01)，有效部位各劑量組小鼠皮膚中含黑色素毛囊數(shù)顯著高于白熱斯蜜膏組(P<0.01)。結(jié)果表明白熱斯蜜膏及有效部位均對實(shí)驗(yàn)性白癜風(fēng)模型小鼠有一定的治療作用，且有效部位的作用顯著較蜜膏給藥好，可見白熱斯蜜膏處方中的藥材經(jīng)提取純化后，富集得到有效部位，更有利于其中的有效成分的溶出，利于機(jī)體吸收，藥效更佳。
實(shí)施例7
白熱斯總皂苷部位對B16黑素瘤細(xì)胞增殖及黑素合成的影響：
1試驗(yàn)材料：本實(shí)驗(yàn)常規(guī)材料。
2實(shí)驗(yàn)方法：
2.1實(shí)驗(yàn)分組：
在無菌條件下將總皂苷部位和8-MOP用黑素細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成以下濃度：200、100、50、25、12.5μmol·L-1，用0.45μm濾膜過濾，溫度4℃避光保存，其中8-MOP作為陽性對照藥物，單純培養(yǎng)基為空白對照。
2.2細(xì)胞體外培養(yǎng)：
將細(xì)胞置于溫度37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)，細(xì)胞長滿至培養(yǎng)瓶底的80％時(shí)，傾去舊培養(yǎng)基，PBS洗滌2遍，加入0.5ml0.25％胰酶，輕輕晃動(dòng)使胰酶浸潤培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞，倒掉多余胰酶，將培養(yǎng)瓶放置于培養(yǎng)箱中，3min后取出，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞突起收回變圓時(shí)，立即加入適量新鮮的完全培養(yǎng)液，吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，后將細(xì)胞懸液分裝至新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，每3-4天傳代一次，每次試驗(yàn)取同一代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2.3細(xì)胞增殖率測定：
選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25％胰酶消化，收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，置溫度37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基后，分別加入終濃度為200、100、50、25、12.5μmol·L-1含藥培養(yǎng)液200μL，繼續(xù)培養(yǎng)48h。于結(jié)束前4h，每孔加入5mg/mL的MTT20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去上清液，加入DMSO150μL/孔，震蕩10min，使結(jié)晶完全溶解，立即于酶標(biāo)儀490nm處測定吸收值(OD)，每一濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔,取平均值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，增殖率(％)＝加藥組OD/空白組OD×100％。
2.4細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性測定：
將加入含藥培養(yǎng)液的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48h后棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，每孔加入1％TritonX-100溶液50μl,迅速置溫度-80℃凍存30min，隨后室溫融化使細(xì)胞完全裂解，溫度37℃預(yù)溫后加入0.25％L-DOPA溶液10μl，置溫度37℃電熱恒溫水槽中反應(yīng)2h，于酶標(biāo)儀490nm處測定吸收值，每一濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，取平均值。激活率(％)＝加藥組OD/空白組OD×100％。
2.5黑素含量測定：
將加入含藥培養(yǎng)液的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48h，用0.25％胰蛋白酶消化，將細(xì)胞收集入離心管3000r/min離心10min傾去上清，再用PBS洗2次后,用1mol·L-1NaOH 0.5ml在溫度37℃作用48h充分堿裂解細(xì)胞和溶解黑素顆粒，100μl/孔加入96孔板中，用酶標(biāo)儀測定405nm光吸收值，每一濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，取平均值，黑素含量(％)＝加藥組OD/空白組OD×100％。
2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：
用SPASS13.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各指標(biāo)檢測結(jié)果以表示，當(dāng)P<0.05有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。
3結(jié)果：
3.1總皂苷部位對小鼠B16黑素瘤細(xì)胞增殖的影響：
與空白對照相比，濃度大于50μmol·L-1時(shí)總皂苷部位組均能顯著促進(jìn)小鼠B16細(xì)胞增殖(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果見表5。
3.2總皂苷部位對B16小鼠黑素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響：
與空白對照，相比濃度在25-100μmol·L-1時(shí)的總皂苷部位均能夠顯著升高酪氨酸酶活性(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果見表5。
3.3總皂苷部位對B16小鼠黑素瘤細(xì)胞黑素含量的影響：
與空白對照相比，濃度為200μmol·L-1時(shí)，總皂苷能夠顯著升高黑素含量(P<0.05，P<0.01)，其他濃度有升高的趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果見表5。
表5總皂苷部位對B16黑素瘤小鼠細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素含量的影響
與空白對照組比較，*P<0.05,**P<0.01。
4小結(jié)：
近年來，國內(nèi)外學(xué)者在研究皮膚病實(shí)驗(yàn)中采用了不同的體外黑素細(xì)胞模型，主要有：正常人黑素細(xì)胞、永生化黑素細(xì)胞株、黑素瘤細(xì)胞、毛囊外毛根鞘無色素黑素細(xì)胞等。人正常黑素細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下，生長緩慢，隨著傳代次數(shù)增加細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)復(fù)制衰亡，不能充分提供所需的細(xì)胞數(shù)量，影響了黑素細(xì)胞的的研究和臨床運(yùn)用。永生化黑素細(xì)胞株和人及鼠黑素瘤細(xì)胞系已被廣泛應(yīng)用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中，尤其黑色瘤細(xì)胞株，具有產(chǎn)生黑素功能對環(huán)境要求不高，不需添加特殊的促分裂成分，同時(shí)繁殖快，生長穩(wěn)定，當(dāng)體外條件滿足生長所需時(shí)，能夠無限制生長下去，成為研究黑素細(xì)胞的理想對象。因此，本實(shí)驗(yàn)選用B16黑素瘤細(xì)胞株，是一種高度黑素化的黑素瘤細(xì)胞株，國際上常用于黑素合成的相關(guān)研究，作為體外模型進(jìn)行藥效試驗(yàn)。
本研究通過檢測細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素含量，初步從體外水平研究白熱斯總皂苷部位抗白癜風(fēng)作用，結(jié)果該部位達(dá)到一定濃度時(shí)，能夠促進(jìn)B16黑素瘤細(xì)胞增殖，升高酪氨酸酶活性和黑素含量。表明白熱斯總皂苷部位可能具有抗白癜風(fēng)作用。
實(shí)施例8
白熱斯總酚酸部位對黑素細(xì)胞遷移功能和粘附能力的影響：
1篩選模型：正常人黑素細(xì)胞，HaCat細(xì)胞。
2細(xì)胞培養(yǎng)方法：
取正常兒童環(huán)切包皮，加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，對苯二甲酸(TPA)的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)原代培養(yǎng)一周，HaCat常規(guī)高糖培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)，共培養(yǎng)體系以黑素細(xì)胞：HaCat細(xì)胞＝1：3接種于96孔板，傳代培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的藥物和對照，48h后進(jìn)行測定分析相關(guān)指標(biāo)，陽性對照藥為8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-mop)(日本東京化成)，濃度為5μg/ml。
3對黑素細(xì)胞遷移能力的影響：
取transwell，在上表面涂布50μl人纖維連接蛋白(FN)(10μg/ml)，在干燥的孵箱中干燥2h，在24孔培養(yǎng)板中加入600ul高糖培養(yǎng)基(DMEM)(10％胎牛血清)，將預(yù)處理過的Transwell放入孔中，藥物處理過的細(xì)胞胰酶消化后用高糖培養(yǎng)基(DMEM)(不含胎牛血清)稀釋為1×105/ml，取200ul加入Transwell小室的上室放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，取出Transwell，用棉簽擦去上室細(xì)胞和FN，PBS洗2遍，將小室放入體積比1:3的醋酸:甲醇固定液中固定30min，晾干，放入吉姆薩中染色10min，緩沖液洗滌3遍，晾干后將小室放在載玻片上，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞，換不同視野拍照，每組8張，細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果見表6。
表6含高良姜素有效部位對黑素細(xì)胞遷移功能的影響(n＝8)
[注]*為與正常對照組比較P<0.05；**為與正常對照組比較P<0.01。
4對黑素細(xì)胞粘附能力的影響：
96孔板，每孔20ulFN(5μg/ml)，室溫晾干，將藥物預(yù)處理過細(xì)胞制備成5×104/ml的細(xì)胞懸液，每孔100μl，每組6個(gè)重復(fù)孔培養(yǎng)1h，吸去上清，加入10％三氯乙酸50μl，溫度4℃固定1h，蒸餾水沖洗5遍，晾干，2％結(jié)晶紫染色10min，蒸餾水沖洗晾干，每孔加入2％SDS100μl震蕩5min，570nm測定OD值，結(jié)果見表7。
表7含高良姜素有效部位對黑素細(xì)胞粘附能力的影響(n＝6)
[注]*為與正常對照組比較P<0.05；**為與正常對照組比較P<0.01。
4結(jié)果分析：
結(jié)果表明含白熱斯總酚酸部位可通過增強(qiáng)黑素細(xì)胞的遷移和粘附能力，從而起到治療白癜風(fēng)的作用。