本發(fā)明涉及生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鮮蟲草原漿的提取方法。

背景技術(shù)：

冬蟲夏草，為蝙蝠蛾幼蟲被蟲草菌感染死后，尸體、組織與菌絲結(jié)成堅硬的假菌核，在冬季低溫干燥土壤內(nèi)保持蟲形不變達(dá)數(shù)月之久(冬蟲)，待夏季溫濕適宜時從菌核長出棒狀子實體(子囊座)并露出地面(夏草)，又名中華蟲草，又稱為夏草冬蟲，簡稱蟲草，是中國傳統(tǒng)的名貴藥材。真正的冬蟲夏草均為野生，它主要產(chǎn)于中國青海、西藏、新疆、四川、云南、甘肅、冬蟲夏草含水分10.84％，脂肪8.4％，粗蛋白25.32％，粗纖維18.53％，碳水化物28.90％，灰分4.10％。脂肪含飽和脂肪酸13.00％，不飽和脂肪酸82.2％。此外，還含蟲草酸約7％，是奎寧酸的異構(gòu)物，又含冬蟲夏草素，是一種淡黃色結(jié)晶粉末，在試管內(nèi)能抑制鏈球菌、鼻疽桿菌、炭疽桿菌、豬出血性敗血癥桿菌及葡萄狀球菌的生長。另含維生素B1 20.29微克/100克，尚含有麥角脂醇、六碳糖醇、生物堿等。是著名的滋補(bǔ)強(qiáng)壯藥，常用肉類燉食，有補(bǔ)虛健體之效。適用于治療肺氣虛和肺腎兩虛、肺結(jié)核等所致的咯血或痰中帶血、咳嗽。氣短、盜汗等，對腎虛陽痿、腰膝酸疼等亦有良好的療效，也是老年體弱者的滋補(bǔ)佳品。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述存在的問題，本發(fā)明提出了一種鮮蟲草原漿的提取方法，大大提高了鮮蟲草中蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、腺苷、SOD等有效成分的含量，蟲草素提取率為0.028％，蟲草酸的提取率為2.14％，蟲草多糖的提取率為10.78％，腺苷的提取率0.21％。

為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案：

鮮蟲草原漿的提取方法，提取步驟如下：

1)發(fā)酵：挑選鮮蟲草菌株，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，在24-27℃、pH值為5.8-6.5條件下，發(fā)酵處理60-72h，分離得發(fā)酵液和發(fā)酵蟲草菌絲體；

2)干燥破碎：將步驟1)中的發(fā)酵蟲草菌絲體進(jìn)行減壓干燥至含水量小于6％，然后進(jìn)行超微粉碎，過400目篩即可，得發(fā)酵蟲草菌絲體粉末；

3)酶解：向步驟2)中的發(fā)酵蟲草菌絲體粉末加入純水，發(fā)酵蟲草菌絲體粉末與純水的體積比為1∶10-15，然后再加入發(fā)酵蟲草菌絲體粉末質(zhì)量1.3-1.5％的復(fù)合酶，進(jìn)行酶解得蟲草酶解液；

4)超聲提?。合虿襟E3)中的蟲草酶解液中加入無水乙醇至乙醇含量為50-70％，然后在50-80kHz條件下進(jìn)行分段超聲處理，得蟲草提取混合物；

5)離心分離：將步驟4)中的蟲草提取混合物進(jìn)行離心分離處理，靜置取上清液，并向沉降物中加入其3-5倍質(zhì)量的50-70％的乙醇溶液，進(jìn)行二次分段超聲提取和離心分離，得二次上清液和二次沉降物；

6)煎煮：向步驟5)中的二次沉降物中加入其5-6倍質(zhì)量的純水，煎煮提取2次，每次1-1.5h，進(jìn)行離心分離并將兩次的提取液合并得共混液；

7)濃縮干燥：將步驟5)中的上清液、二次上清液與步驟1)中的發(fā)酵液、步驟6)中的共混液合并，再進(jìn)行膜過濾，并將過濾液減壓濃縮至濃縮比重為1.1-1.5g/ml，再進(jìn)行冷凍干燥得鮮蟲草原漿粗品；

8)純化：將步驟7)中鮮蟲草原漿粗品用95％的乙醇重結(jié)晶3次，得結(jié)晶物即可。

優(yōu)選的，步驟1)中發(fā)酵培養(yǎng)基的主要營養(yǎng)成分為：玉米粉1.5％、酵母膏1％、蛋白胨2％、蔗糖4％、磷酸氫二鉀0.15％、硫酸鎂0.08％、檸檬酸鐵胺0.005％、碳酸鈣0.01％、真菌多糖0.002％。

優(yōu)選的，所述真菌多糖為青霉多糖、曲霉多糖、疫霉多糖、灰霉多糖中的一種或兩種及其以上的組合物。

優(yōu)選的，步驟1)中鮮蟲草菌株的接種量為5-8％。

優(yōu)選的，步驟3)中復(fù)合酶包括木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、纖維素酶、α-淀粉酶，所述木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、纖維素酶、α-淀粉酶之間的質(zhì)量比為：(2-2.5)∶(1.5-2)∶1∶(1-2)。

優(yōu)選的，步驟3)中酶解溫度為45-55℃，酶解時間為5-8h，酶解pH值為5.6-5.8。

優(yōu)選的，步驟4)中分段超聲提取具體為先以70℃超聲提取20min，再降溫至65℃提取30min，最后回升至75℃提取20min。

優(yōu)選的，步驟5)中兩次離心分離均為離心轉(zhuǎn)速3000-3500r/min，離心時間20-25min，二次分段超聲提取的操作與步驟4)中的分段超聲處理相同。

優(yōu)選的，步驟6)中離心分離的離心轉(zhuǎn)速為2500-2800r/min，離心時間為15-20min。

優(yōu)選的，步驟7)中膜過濾壓力為0.06-0.08MPa，使用的過濾膜孔徑為400-600nm。

由于采用上述的技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過發(fā)酵、干燥破碎、酶解、超聲提取、離心分離、煎煮、濃縮干燥、純化等步驟制得，在獲得蟲草菌絲體之前先對蟲草菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，優(yōu)化營養(yǎng)成分，大大提高了鮮蟲草中蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、腺苷、SOD等有效成分的含量，如蛋白胨、酵母膏、玉米粉做為氮源的同時，蟲草菌素的含量提高了32.5％，另外，以蔗糖為碳源也有利于蟲草素的提高。檸檬酸鐵胺相較無機(jī)鐵更容易吸收，真菌多糖有利于促進(jìn)蟲草活性物質(zhì)的積累。

提取濃縮前采用破碎、酶解，破壞了細(xì)胞壁等保護(hù)屏障，大大提高了蟲草中活性物質(zhì)的釋放速率和釋放量，提高了蟲草有效成分的提取得率。

酶解后采用多次分段超聲提取和離心分離處理，然后在進(jìn)行高溫煎煮，有效降低了對熱敏物質(zhì)的破壞，提取率高，制備過程中采用減壓干燥、減壓濃縮、冷凍干燥也有利于保留有效成分。另外，分離和濃縮間增加有膜過濾的步驟，大大提高了提取物的純度。

本發(fā)明提取方法提取的蟲草素提取率大于0.028％，蟲草酸的提取率大于2.14％，蟲草多糖的提取率大于10.78％，腺苷的提取率大于0.21％，各提取物純度均大于96.4％。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述?；诒景l(fā)明的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實施例1：

鮮蟲草原漿的提取方法，提取步驟如下：

1)發(fā)酵：挑選鮮蟲草菌株，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，在25℃、pH值為6.0條件下，發(fā)酵處理70h，分離得發(fā)酵液和發(fā)酵蟲草菌絲體；其中，接種量為6％，發(fā)酵培養(yǎng)基的真菌多糖為曲霉多糖和灰霉多糖的組合物；

2)干燥破碎：將步驟1)中的發(fā)酵蟲草菌絲體在壓力為0.05MPa條件下進(jìn)行減壓干燥至含水量小于6％，然后進(jìn)行超微粉碎，過400目篩即可，得發(fā)酵蟲草菌絲體粉末；

3)酶解：向步驟2)中的發(fā)酵蟲草菌絲體粉末加入純水，發(fā)酵蟲草菌絲體粉末與純水的體積比為1∶10，然后再加入發(fā)酵蟲草菌絲體粉末質(zhì)量1.3％的復(fù)合酶，進(jìn)行酶解得蟲草酶解液；其中，木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、纖維素酶、α-淀粉酶之間的質(zhì)量比為2∶1.8∶1∶1.5，酶解溫度為50℃，酶解時間為7h，酶解pH值為5.8；

4)超聲提?。合虿襟E3)中的蟲草酶解液中加入無水乙醇至乙醇含量為65％，然后在75kHz條件下進(jìn)行分段超聲處理，得蟲草提取混合物；

5)離心分離：將步驟4)中的蟲草提取混合物進(jìn)行離心分離處理，靜置取上清液，并向沉降物中加入其5倍質(zhì)量的65％的乙醇溶液，進(jìn)行二次分段超聲提取和離心分離，得二次上清液和二次沉降物；其中，兩次離心分離均為離心轉(zhuǎn)速3000r/min，離心時間20min；

6)煎煮：向步驟5)中的二次沉降物中加入其5倍質(zhì)量的純水，煎煮提取2次，每次1h，進(jìn)行離心分離，并將兩次的提取液合并得共混液；其中，離心分離的離心轉(zhuǎn)速為2800r/min，離心時間為18min；

7)濃縮干燥：將步驟5)中的上清液、二次上清液與步驟1)中的發(fā)酵液、步驟6)中的共混液合并，再進(jìn)行膜過濾，并將過濾液減壓濃縮至濃縮比重為1.4g/ml，再進(jìn)行冷凍干燥得鮮蟲草原漿粗品；其中，膜過濾壓力為0.065MPa，使用的過濾膜孔徑為500nm；

8)純化：將步驟7)中鮮蟲草原漿粗品用95％的乙醇重結(jié)晶3次，然后用無水乙醇洗滌2次，得結(jié)晶物即可。

本實施例提取的蟲草素提取率為0.03％，蟲草素純度為98.7％，蟲草酸的提取率為2.14％，蟲草酸純度為97.2％，蟲草多糖的提取率為10.82％，蟲草多糖純度為96.5％，腺苷的提取率為0.23％，腺苷純度為97.3％。

實施例2：

鮮蟲草原漿的提取方法，提取步驟如下：

1)發(fā)酵：挑選鮮蟲草菌株，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，在24℃、pH值為5.8條件下，發(fā)酵處理72h，分離得發(fā)酵液和發(fā)酵蟲草菌絲體；其中，接種量為5％，發(fā)酵培養(yǎng)基的真菌多糖為曲霉多糖和疫霉多糖的組合物；

2)干燥破碎：將步驟1)中的發(fā)酵蟲草菌絲體在壓力為0.06MPa條件下進(jìn)行減壓干燥至含水量小于6％，然后進(jìn)行超微粉碎，過400目篩即可，得發(fā)酵蟲草菌絲體粉末；

3)酶解：向步驟2)中的發(fā)酵蟲草菌絲體粉末加入純水，發(fā)酵蟲草菌絲體粉末與純水的體積比為1∶12，然后再加入發(fā)酵蟲草菌絲體粉末質(zhì)量1.5％的復(fù)合酶，進(jìn)行酶解得蟲草酶解液；其中，木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、纖維素酶、α-淀粉酶之間的質(zhì)量比為2.3∶2∶1∶1，酶解溫度為45℃，酶解時間為8h，酶解pH值為5.7；

4)超聲提取：向步驟3)中的蟲草酶解液中加入無水乙醇至乙醇含量為50％，然后在60kHz條件下進(jìn)行分段超聲處理，得蟲草提取混合物；

5)離心分離：將步驟4)中的蟲草提取混合物進(jìn)行離心分離處理，靜置取上清液，并向沉降物中加入其3倍質(zhì)量的50％的乙醇溶液，進(jìn)行二次分段超聲提取和離心分離，得二次上清液和二次沉降物；其中，兩次離心分離均為離心轉(zhuǎn)速3200r/min，離心時間25min；

6)煎煮：向步驟5)中的二次沉降物中加入其6倍質(zhì)量的純水，煎煮提取2次，每次1.2h，進(jìn)行離心分離，并將兩次的提取液合并得共混液；其中，離心分離的離心轉(zhuǎn)速為2600r/min，離心時間為20min；

7)濃縮干燥：將步驟5)中的上清液、二次上清液與步驟1)中的發(fā)酵液、步驟6)中的共混液合并，再進(jìn)行膜過濾，并將過濾液減壓濃縮至濃縮比重為1.3g/ml，再進(jìn)行冷凍干燥得鮮蟲草原漿粗品；其中，膜過濾壓力為0.07MPa，使用的過濾膜孔徑為450nm；

8)純化：將步驟7)中鮮蟲草原漿粗品用95％的乙醇重結(jié)晶3次，然后用無水乙醇洗滌2次，得結(jié)晶物即可。

本實施例提取的蟲草素提取率為0.032％，蟲草素純度為99.3％蟲草酸的提取率為2.17％，蟲草酸純度為97.4％，蟲草多糖的提取率為10.78％，蟲草多糖純度為98.4％，腺苷的提取率為0.21％，腺苷純度為96.9％。

實施例3：

鮮蟲草原漿的提取方法，提取步驟如下：

1)發(fā)酵：挑選鮮蟲草菌株，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，在27℃、pH值為6.2條件下，發(fā)酵處理65h，分離得發(fā)酵液和發(fā)酵蟲草菌絲體；其中，接種量為8％，發(fā)酵培養(yǎng)基的真菌多糖為曲霉多糖；

2)干燥破碎：將步驟1)中的發(fā)酵蟲草菌絲體在壓力為0.035MPa條件下進(jìn)行減壓干燥至含水量小于6％，然后進(jìn)行超微粉碎，過400目篩即可，得發(fā)酵蟲草菌絲體粉末；

3)酶解：向步驟2)中的發(fā)酵蟲草菌絲體粉末加入純水，發(fā)酵蟲草菌絲體粉末與純水的體積比為1∶15，然后再加入發(fā)酵蟲草菌絲體粉末質(zhì)量1.4％的復(fù)合酶，進(jìn)行酶解得蟲草酶解液；其中，木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、纖維素酶、α-淀粉酶之間的質(zhì)量比為2.5∶1.5∶1∶1.8，酶解溫度為55℃，酶解時間為5h，酶解pH值為5.6；

4)超聲提取：向步驟3)中的蟲草酶解液中加入無水乙醇至乙醇含量為70％，然后在50kHz條件下進(jìn)行分段超聲處理，得蟲草提取混合物；

5)離心分離：將步驟4)中的蟲草提取混合物進(jìn)行離心分離處理，靜置取上清液，并向沉降物中加入其4倍質(zhì)量的70％的乙醇溶液，進(jìn)行二次分段超聲提取和離心分離，得二次上清液和二次沉降物；其中，兩次離心分離均為離心轉(zhuǎn)速3500r/min，離心時間22min；

6)煎煮：向步驟5)中的二次沉降物中加入其5倍質(zhì)量的純水，煎煮提取2次，每次1.5h，進(jìn)行離心分離，并將兩次的提取液合并得共混液；其中，離心分離的離心轉(zhuǎn)速為2700r/min，離心時間為15min；

7)濃縮干燥：將步驟5)中的上清液、二次上清液與步驟1)中的發(fā)酵液、步驟6)中的共混液合并，再進(jìn)行膜過濾，并將過濾液減壓濃縮至濃縮比重為1.5g/ml，再進(jìn)行冷凍干燥得鮮蟲草原漿粗品；其中，膜過濾壓力為0.06MPa，使用的過濾膜孔徑為400nm；

8)純化：將步驟7)中鮮蟲草原漿粗品用95％的乙醇重結(jié)晶3次，然后用無水乙醇洗滌1次，得結(jié)晶物即可。

本實施例提取的蟲草素提取率為0.028％，蟲草素純度為98.2％，蟲草酸的提取率為2.19％，蟲草酸純度為98.1％，蟲草多糖的提取率為10.79％，蟲草多糖純度為97.5％，腺苷的提取率為0.22％，腺苷純度為96.4％。

實施例4：

鮮蟲草原漿的提取方法，提取步驟如下：

1)發(fā)酵：挑選鮮蟲草菌株，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，在26℃、pH值為6.5條件下，發(fā)酵處理60h，分離得發(fā)酵液和發(fā)酵蟲草菌絲體；其中，接種量為6％，發(fā)酵培養(yǎng)基的真菌多糖為曲霉多糖、青霉多糖和灰霉多糖的組合物；

2)干燥破碎：將步驟1)中的發(fā)酵蟲草菌絲體在壓力為0.04MPa條件下進(jìn)行減壓干燥至含水量小于6％，然后進(jìn)行超微粉碎，過400目篩即可，得發(fā)酵蟲草菌絲體粉末；

3)酶解：向步驟2)中的發(fā)酵蟲草菌絲體粉末加入純水，發(fā)酵蟲草菌絲體粉末與純水的體積比為1∶10，然后再加入發(fā)酵蟲草菌絲體粉末質(zhì)量1.45％的復(fù)合酶，進(jìn)行酶解得蟲草酶解液；其中，木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、纖維素酶、α-淀粉酶之間的質(zhì)量比為2.2∶2∶1∶2，酶解溫度為48℃，酶解時間為6h，酶解pH值為5.6；

4)超聲提?。合虿襟E3)中的蟲草酶解液中加入無水乙醇至乙醇含量為60％，然后在80kHz條件下進(jìn)行分段超聲處理，得蟲草提取混合物；

5)離心分離：將步驟4)中的蟲草提取混合物進(jìn)行離心分離處理，靜置取上清液，并向沉降物中加入其5倍質(zhì)量的60％的乙醇溶液，進(jìn)行二次分段超聲提取和離心分離，得二次上清液和二次沉降物；其中，兩次離心分離均為離心轉(zhuǎn)速3400r/min，離心時間20min；

6)煎煮：向步驟5)中的二次沉降物中加入其5.5倍質(zhì)量的純水，煎煮提取2次，每次1.2h，進(jìn)行離心分離，并將兩次的提取液合并得共混液；其中，離心分離的離心轉(zhuǎn)速為2500r/min，離心時間為17min；

7)濃縮干燥：將步驟5)中的上清液、二次上清液與步驟1)中的發(fā)酵液、步驟6)中的共混液合并，再進(jìn)行膜過濾，并將過濾液減壓濃縮至濃縮比重為1.1g/ml，再進(jìn)行冷凍干燥得鮮蟲草原漿粗品；其中，膜過濾壓力為0.08MPa，使用的過濾膜孔徑為600nm；

8)純化：將步驟7)中鮮蟲草原漿粗品用95％的乙醇重結(jié)晶3次，然后用無水乙醇洗滌2次，得結(jié)晶物即可。

本實施例提取的蟲草素提取率為0.029％，蟲草素純度為98.9％，蟲草酸的提取率為2.18％，蟲草酸純度為98.1％，蟲草多糖的提取率大于10.84％，蟲草多糖純度為98.2％，腺苷的提取率為0.25％，腺苷純度為97.6％。

以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的精神和范圍。