本發(fā)明屬于仿生生物材料工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種粘接輔助的生物礦化材料及其在仿生礦化中的應(yīng)用，促進I型膠原蛋白及脫礦牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)再礦化。

背景技術(shù)：

無定形礦物相包括二氧化硅、無定形磷酸鈣和無定形碳酸鈣等在自然界中廣泛存在，是生物礦化過程中最先形成的礦物相。牙體硬組織的形成實際上是一個生物礦化的過程，其中起關(guān)鍵作用的是納米顆粒前驅(qū)相，即無定形磷酸鈣(amorphous calcium phosphate,ACP)。羥基磷灰石(Hydroxyapatite，HAP)構(gòu)成了牙齒的無機主體部分，賦予牙齒良好的力學(xué)硬度和生物學(xué)功能。生物礦化過程中，其核心是無機礦物納米前驅(qū)相在有機物的調(diào)控下進行有序的沉積、生長，有機物特別是蛋白質(zhì)的參與對無機物的沉積具有非常重要的作用。在牙釉質(zhì)的形成過程中，釉原蛋白起著最重要的調(diào)控作用，可以對磷酸鈣表面進行選擇性吸附從而決定晶體的生長方向。在牙本質(zhì)的形成過程中，只占牙本質(zhì)有機物中含量10％的非膠原蛋白(non-collagenous proteins，NCPs)可以引導(dǎo)和調(diào)節(jié)牙本質(zhì)的生物礦化。這些蛋白質(zhì)都具有共同的特點，富含很多酸性氨基酸殘基，如釉原蛋白中含有豐富的谷氨酸和天冬氨酸，非膠原蛋白中富含絲氨酸和天冬氨酸。其中氨基酸的功能性基團包括多重羧基或磷酸基，對生物礦物的形成起著重要的作用。齲病是危害人類口腔健康最普遍的疾病，齲齒的形成實際是牙齒在生物環(huán)境中的脫礦過程。促進牙齒的再礦化，可使牙體組織進行自我修復(fù)，阻止齲病的發(fā)生。無定形磷酸鈣(ACP)在牙齒礦化初期起著關(guān)鍵作用，ACP內(nèi)部含有高達10-20％的水量，其內(nèi)部原子介于晶體和溶液的無序排列，賦予了ACP類似于液體的“流動性”，具有極好的生物礦化潛能。隨著ACP在生物礦化過程中的發(fā)現(xiàn)和生物礦物生成機理的不斷揭示，越來越多的研究集中到利用ACP模仿生物礦化途徑來制備新型有機無機復(fù)合材料。但是ACP性能不穩(wěn)定，ACP很容易自發(fā)地相變成熱力學(xué)更穩(wěn)定的結(jié)晶態(tài)HAp。在制備ACP時必須采用特殊的方法或者加入無機物或是有機生物大分子添加劑，以阻止這一轉(zhuǎn)變。大量研究表明：聚電解質(zhì)如聚丙烯酸(Polyacrylic acid，PAA)、聚天冬氨酸(Polyaspartic acid，PAsp)、谷氨酸(Glutamic acid，Glu)或表面修飾等方法可以維持ACP亞穩(wěn)態(tài)。由于天然釉原蛋白和非膠原蛋白提取和純化較困難，成本高，而且除了要保證純度外，還必須保持蛋白產(chǎn)品的生物學(xué)活性，這存在一定的困難。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單元，所以氨基酸在仿生礦化中的作用被廣泛的研究。目前與釉原蛋白和NCPs功能結(jié)構(gòu)域相似的多聚電解質(zhì)如聚丙烯酸，聚乙烯基膦酸(Polyvinylphosphonic acid，PVPA)，聚氨基酸大分子如聚天門冬氨酸、谷氨酸等在仿生再礦化中的應(yīng)用越來越多，力圖通過NCPs類似物在仿生礦化中的應(yīng)用復(fù)制出與自然礦化組織相似的礦化相。但上述研究都是在含鈣離子源、磷酸根離子源及非膠原蛋白類似物的仿生礦化溶液或糊劑中促使牙本質(zhì)膠原纖維礦化，由于與牙齒作用時間短，礦化效果不確定。鈣和磷酸根離子是牙齒再礦化的物質(zhì)基礎(chǔ)，鈣磷離子濃度越高越有利于牙齒的再礦化，基于此原理所生產(chǎn)再礦化制劑主要是以鈣離子或磷酸根離子為主要成分，同時輔以氟離子等物質(zhì)，如漱口水、護牙素等，但其與牙齒表面結(jié)合力差，在牙齒表面停留時間短，無法持續(xù)、穩(wěn)定地提供鈣磷源，使得作用于牙齒表面的鈣磷量無法達到持續(xù)過飽和狀態(tài)，無法達到理想的礦化效果。同時在高氟區(qū)予以氟化制劑會導(dǎo)致慢性氟中毒。因而，能為牙齒持續(xù)、穩(wěn)定提供鈣磷源，并能促使脫礦牙齒再礦化的方法及其材料亟待研究。

根據(jù)粘接劑的操作步驟不同，可以分為酸蝕-沖洗類粘接劑(etch-&-rinse adhesives)和自酸蝕類粘接劑(self-etch adhesives)兩大類牙齒粘接系統(tǒng)。常用的弱酸性自酸蝕粘接劑(self-etch adhesives)含有酸性親水性單體，pH值約為2-3；早期研究發(fā)現(xiàn)自酸蝕粘接劑固化后，呈現(xiàn)半滲透膜的特性，電鏡下可見微孔樣結(jié)構(gòu)。自酸蝕粘接劑處理牙體表面后，可使牙體(牙釉質(zhì)或牙本質(zhì))表面部分脫礦，釋放鈣和磷酸根離子，這些可溶物隨著粘接劑中的水分揮發(fā)，又沉積回牙齒表面，并與粘接劑混合，原位固化形成混合層(hybrid layer)-該層既有牙齒成分又有粘接樹脂成分。

因而，我們希望經(jīng)非膠原蛋白類似物如聚電解質(zhì)PAsp、PAA、Glu等穩(wěn)定劑穩(wěn)定的nACP顆粒添加到弱酸性的自酸蝕粘接劑中，粘接劑固化后直接粘附于脫礦的牙本質(zhì)表面，借助于粘接劑的半滲透特性和分散在粘接劑中的nACP顆粒，依賴粘接劑自身的弱酸性微環(huán)境，使ACP相轉(zhuǎn)變?yōu)镠Ap；同時，自酸蝕粘接劑可使牙齒表面部分脫礦，使粘接劑-牙齒界面的鈣磷濃度達到飽和狀態(tài)。此外，借助于粘接作用，nACP顆粒可以長期粘附于牙齒表面，因而可以長期、穩(wěn)定地提供鈣磷源，促進脫礦牙齒的自我修復(fù)，同時借助NCPs類似物引導(dǎo)脫礦的牙本質(zhì)膠原纖維內(nèi)礦化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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技術(shù)問題:本發(fā)明旨在提供一種粘接輔助生物礦化材料及其應(yīng)用。利用本發(fā)明的粘接輔助礦化材料，與粘接劑混合，固化后可以長期、穩(wěn)定地粘附于牙齒表面，持續(xù)、穩(wěn)定地提供鈣磷源，解決目前再礦化制劑作用時間短，礦化效果差的問題，促使I型膠原蛋白及其脫礦牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)再礦化。

技術(shù)方案：為達上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案包含粘接輔助生物礦化材料及其在仿生礦化中的應(yīng)用。

一種粘接輔助生物礦化材料，其制備方法如下：采用溶液沉淀法，將磷酸二氫鈉和非膠原蛋白類似物混合溶液與氯化鈣溶液混合反應(yīng)，鈣和磷最終摩爾濃度比為10:6；離心放入真空干燥箱內(nèi)過夜，得到用非膠原蛋白類似物穩(wěn)定的nACP；將固態(tài)nACP顆粒保存在聚乙烯塑料瓶內(nèi)室溫下密封保存；nACP顆粒大小為20-100nm。

優(yōu)選的，所述的非膠原蛋白類似物為Pasp、PAA或谷氨酸，最終混合反應(yīng)液中PAA濃度為10-1000ug/ml，PAsp濃度為10-1000ug/ml，谷氨酸的濃度是10-500mM/L。

本發(fā)明公開了一種所述粘接輔助生物礦化材料在仿生礦化中的應(yīng)用，應(yīng)用于體外誘導(dǎo)重組I型膠原再礦化；具體方法為：

1)將鼠尾I型膠原溶于緩沖液配制成50ug/ml的膠原溶液中，緩沖液溶液中甘氨酸濃度為50mM和KCl濃度為200mM，PH＝9.2，然后將3uL的膠原溶液滴在透射電鏡鎳網(wǎng)上，37℃恒溫箱過夜，用質(zhì)量百分比濃度為0.5％的戊二醛交聯(lián)1-2h；得到附有重組膠原的TEM鎳網(wǎng)；

2)制備權(quán)利要求1所述的粘接輔助生物礦化材料，按粘接劑的重量的5-85％，將粘接輔助生物礦化材料與粘接劑混合，攪拌均勻，涂刷于載有I型重組膠原的TEM鎳網(wǎng)上，靜置30-60s，光照固化40s；將鎳網(wǎng)懸浮于人工唾液中，用TEM及選區(qū)電子衍射(selected area electron diffraction，SAED)觀察礦化情況。

應(yīng)用于體外誘導(dǎo)脫礦牙本質(zhì)再礦化；具體方法為：

1)收集無齲的人第三磨牙，用Isomet慢速切割機垂直于牙長軸切取厚度1mm牙本質(zhì)塊，然后用600-2000目SiC紙逐一打磨，再將牙片放入37wt％磷酸溶液中，30秒后取出，用去離子水沖洗，獲得約5-8um的脫礦層；

2)制備權(quán)利要求1所述的粘接輔助生物礦化材料，按粘接劑的重量的5-85％，將粘接輔助生物礦化材料與粘接劑混合，攪拌均勻，涂刷于脫礦牙本質(zhì)表面，靜置30-60s，光照固化40s；將牙本質(zhì)片放入人工唾液中，在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。將礦化的牙本質(zhì)樣本酒精梯度脫水，用TEM及SAED觀察礦化效果。

應(yīng)用于體外誘導(dǎo)脫礦牙釉質(zhì)再礦化；具體方法為：

1)收集無齲的人第一前磨牙，用Isomet慢速切割機垂直于牙冠切取大小約3*3*0.5mm的牙釉質(zhì)塊，然后用600-2000目SiC紙逐一打磨，再將牙片放入37wt％磷酸溶液中，30秒后取出，用去離子水沖洗，獲取脫礦牙釉質(zhì)；

2)制備權(quán)利要求1所述的粘接輔助生物礦化材料，按粘接劑的重量的5-85％，將粘接輔助生物礦化材料與粘接劑混合，攪拌均勻，涂刷于脫礦牙釉質(zhì)表面，靜置30-60s，光照固化40s；將牙釉質(zhì)片放入人工唾液中，在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。將礦化的牙釉質(zhì)樣本酒精梯度脫水，用SEM/TEM及SAED觀察礦化效果。

優(yōu)選的，粘接劑為自酸蝕粘接劑，如Clearfil S3，Easy one bond(3M)等。

有益效果1.粘接輔助礦化材料制備工藝簡單，保存方便，適合大規(guī)模生產(chǎn)，所合成的粘接輔助礦化材料固態(tài)nACP顆粒約為20-100nm大小，易于進入膠原纖維內(nèi)的空隙內(nèi)；2.粘接輔助礦化材料具有良好的生物相容性，無毒無刺激；3.粘結(jié)輔助礦化材料在仿生礦化中的應(yīng)用簡單有效：將自酸蝕粘接劑與粘接輔助礦化材料按照一定的質(zhì)量比混合，形成一種液態(tài)礦化源，然后涂于單層I型重組膠原或脫礦牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)表面，光照固化。SEM、TEM及選區(qū)電子衍射(SAED)觀察牙本質(zhì)及重組I型膠原出現(xiàn)纖維內(nèi)礦化，脫礦牙釉質(zhì)表面出現(xiàn)再礦化。4.獲得良好的長期牙本質(zhì)粘結(jié)強度。

附圖說明：

圖1是PAA穩(wěn)定的nACP顆粒的TEM圖；

圖2是PAA穩(wěn)定的nACP顆粒的紅外光譜圖；

圖3是PAA穩(wěn)定的nACP顆粒的生物相容性實驗結(jié)構(gòu)圖；

圖4是重組I型膠原自組裝的TEM圖；

圖5是粘接輔助礦化重組I型膠原TEM及SAED圖；

圖6是PAsp穩(wěn)定的nACP顆粒的TEM圖；

圖7是PAsp穩(wěn)定的nACP顆粒的XRD圖；

圖8是粘接輔助礦化脫礦牙本質(zhì)的TEM圖；

圖9是粘結(jié)輔助礦化劑的牙本質(zhì)微拉伸粘結(jié)強度。

具體實施方式

本發(fā)明技術(shù)方案只針對重組I型膠原和離開生物活體組織的牙齒進行處理。該方法用于非治療目的。結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進行進一步闡述：

實施例1

1.1合成用非膠原蛋白類似物聚丙烯酸(PAA)穩(wěn)定的nACP顆粒(PAA-ACP)

采用溶液沉淀法，向磷酸二氫鈉和PAA的混合液中滴入等體積的氯化鈣液，滴定過程中溶液的PH值控制在9.5±0.5，控制滴定時間為0.5-1h。鈣和磷最終摩爾濃度比為10:6，PAA最終濃度為500ug/ml。離心放入真空干燥箱內(nèi)過夜。次日將所合成的nACP顆粒保存在聚乙烯塑料瓶內(nèi)室溫下密封保存。透射電子顯微鏡(TEM)觀察觀察PAA穩(wěn)定的ACP顆粒形態(tài)規(guī)則，大小約為20-100nm(附圖1)。傅里葉紅外分析(FTIR)所合成的ACP在580cm^-1處有一個包峰，未發(fā)生劈裂，為無定形相(附圖2)。采用CCK-8方法檢測所合成的PAA-ACP顆粒具有良好的生物相容性(附圖3)。

1.2重組I型膠原模型制備，模擬牙本質(zhì)I型膠原

將來源于鼠尾的I型膠原(sigma公司)溶于緩沖液(甘氨酸50mM、KCl 200mM，PH＝9.2)中，配制成50ug/ml的膠原溶液，然后將3uL的膠原溶液滴在透射電鏡鎳網(wǎng)上，37℃恒溫箱過夜，次日用0.5％戊二醛交聯(lián)1-2h。隨機抽取附有重組膠原的TEM鎳網(wǎng)，乙酸釉中染色，TEM觀察，判斷膠原是否重組成功。附圖4所示膠原纖維呈明暗相間的67nm周期結(jié)構(gòu)，與I型膠原特征性結(jié)構(gòu)吻合。

1.3對單層重組I型膠原礦化

按粘接劑的劑量的25wt％，將上述合成固態(tài)PAA-ACP顆粒與將商品化粘接劑如Clearfil S3 Bond粘接劑混合，攪拌均勻，涂刷于載有I型重組膠原的TEM鎳網(wǎng)上，靜置30-60s，光照固化40s。將鎳網(wǎng)懸浮于人工唾液中，21天后，TEM及SAED觀察膠原出現(xiàn)纖維內(nèi)礦化(附圖5A)。

實施例2

2.1合成用非膠原蛋白類似物聚天冬氨酸酸(PAsp)穩(wěn)定的nACP顆粒(PAsp-ACP)

采用溶液沉淀法，將磷酸二氫鈉和PAsp的混合液與等體積的氯化鈣液混合反應(yīng)10-30min，鈣和磷最終濃度比為10:6，Pasp最終濃度為240ug/ml。離心放入真空干燥箱內(nèi)過夜。次日將所合成的固態(tài)nACP顆粒保存在聚乙烯塑料瓶內(nèi)室溫下密封保存。用透射電子顯微鏡(TEM)觀察觀察ACP形態(tài)規(guī)則，大小約為20-80nm(附圖6)。XRD檢測所合成的ACP為無定形相(附圖7)。

2.2重組I型膠原模型制備，模擬牙本質(zhì)I型膠原：同實施例1

2.3對單層重組I型膠原礦化

按粘接劑的劑量的20wt％，將上述合成固態(tài)PAsp-ACP顆粒與商品化粘接劑如Easy one粘接劑混合，攪拌均勻，涂刷于載有I型重組膠原的TEM鎳網(wǎng)上，靜置30-60s，光照固化40s。將鎳網(wǎng)懸浮于人工唾液中37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，14天后，TEM及SAED觀察膠原出現(xiàn)纖維內(nèi)礦化(附圖5B)。

實施例3

3.1合成用非膠原蛋白類似物聚丙烯酸(PAA)穩(wěn)定的nACP顆粒(PAA-ACP)同實施例1，PAA最終濃度為300ug/ml。

3.2重組I型膠原模型制備，模擬牙本質(zhì)I型膠原

同實施例1

3.3對單層重組I型膠原礦化

按粘接劑的劑量的5wt％，將上述合成固態(tài)PAA-ACP顆粒與將商品化粘接劑如Clearfil S3 Bond粘接劑混合，攪拌均勻，涂刷于載有I型重組膠原的TEM鎳網(wǎng)上，靜置30-60s，光照固化40s。將鎳網(wǎng)懸浮于人工唾液中，21天后，TEM及SAED觀察膠原出現(xiàn)纖維內(nèi)礦化，TEM圖與實施例1相同。

實施例4

4.1合成用非膠原蛋白類似物聚天冬氨酸酸(PAsp)穩(wěn)定的nACP顆粒(PAsp-ACP)同實施例2，PAsp最終濃度為120ug/ml。

4.2脫礦牙本質(zhì)樣本制備

收集無齲的人第三磨牙，用Isomet慢速切割機垂直于牙長軸切取厚度約1mm牙本質(zhì)塊，然后用600-2000目SiC紙逐一打磨，再將牙片放入37wt％磷酸溶液中，30秒后取出，用去離子水沖洗，獲得約5-8um的脫礦層。

4.3脫礦牙本質(zhì)樣本礦化研究

對照組按照商品化粘接劑Clearfil S3 Bond的操作說明，將粘結(jié)劑涂在脫礦牙本質(zhì)表面，實驗組按粘接劑的劑量的20wt％，將固態(tài)PAsp-ACP顆粒與商品化粘接劑Clearfil S3 Bond粘接劑混合，攪拌均勻，涂刷于脫礦牙本質(zhì)表面，靜置30-60s，光照固化40s。將牙本質(zhì)片放入人工唾液中，在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。將礦化的牙本質(zhì)樣本酒精梯度脫水，1個月后，透射電鏡(TEM)及選區(qū)電子衍射(SAED)觀察發(fā)現(xiàn)實驗組在脫礦牙本質(zhì)底部出現(xiàn)礦化(附圖8)。圖8中Dentin:牙本質(zhì)；D：脫礦層，R：再礦化層；A：對照組；B：實驗組；C：為B圖中再礦化層(R)的SAED圖。

實施例5

5.1合成用非膠原蛋白類似物聚天冬氨酸酸(PAsp)穩(wěn)定的nACP顆粒(Pasp-ACP)

同實施例2

5.2脫礦牙本質(zhì)樣本制備:

同實施例4

5.3脫礦牙本質(zhì)樣本礦化研究

對照組按照商品化粘接劑Clearfil S3 Bond的操作說明，將粘結(jié)劑涂在脫礦牙本質(zhì)表面，實驗組按粘接劑的劑量的85wt％，將固態(tài)PAsp-ACP顆粒與商品化粘接劑Clearfil S3 Bond粘接劑混合，攪拌均勻，涂刷于脫礦牙本質(zhì)表面，靜置30-60s，光照固化40s。將牙本質(zhì)片放入人工唾液中，在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。將礦化的牙本質(zhì)樣本酒精梯度脫水，透射電鏡(TEM)及選區(qū)電子衍射(SAED)觀察發(fā)現(xiàn)實驗組在脫礦牙本質(zhì)底部出現(xiàn)礦化，TEM圖同實施例4。

實施例6

6.1合成用非膠原蛋白類似物聚天冬氨酸酸(PAsp)穩(wěn)定的nACP顆粒(Pasp-ACP)

同實施例4

6.2牙本質(zhì)樣本的制作

收集無齲的人磨牙，用慢速切割機垂直于牙體長軸，在牙冠的牙合中1/3處切除牙合面釉質(zhì)，暴露牙本質(zhì)表面(不暴露髓角)。然后，將牙本質(zhì)表面用600顆粒度(grit)碳化硅紙在流水作用下打磨1分鐘。隨機分成5組。對照組采用粘接劑Clearfil S3 Bond(可樂麗公司，日本)。實驗組將nACP顆粒按質(zhì)量比5％wt、10％wt、20％wt和30％wt添加進粘接劑Clearfil s3 Bond中。牙本質(zhì)表面用粘接劑處理靜置30-60s，強吹5s，光照固化40s。接著，用復(fù)合樹脂Clearfil Majesty(可樂麗公司，日本)將樣本都堆成4mm的樹脂冠，每次2mm，光照20s。

6.3微拉伸強度測試

將上述所制的牙本質(zhì)樣本放置在37℃去離子水中儲存，24h和1年后進行微拉伸測試。結(jié)果顯示：自酸蝕粘接劑中添加nACP對即刻牙本質(zhì)粘接強度有所降低，且與添加nACP含量相關(guān)，但能提高長期牙本質(zhì)粘接強度。自酸蝕粘接劑中添加少量nACP不會顯著降低即刻牙本質(zhì)粘接強度，而會增加長期的粘接強度(圖9)。

實施例7

7.1合成用非膠原蛋白類似物聚天冬氨酸酸(PAsp)穩(wěn)定的nACP顆粒(Pasp-ACP)

同實施例2

7.2脫礦牙釉質(zhì)樣本的制作

收集無齲的人第一前磨牙，用Isomet慢速切割機垂直于牙冠切取大小約3*3*0.5mm的牙釉質(zhì)塊，然后用600-2000目SiC紙逐一打磨，再將牙片放入37wt％磷酸溶液中，30秒后取出，用去離子水沖洗，獲取脫礦牙釉質(zhì)。

7.3脫礦牙釉質(zhì)樣本礦化研究

對照組按照商品化粘接劑Clearfil S3 Bond的操作說明，將粘結(jié)劑涂在脫礦牙釉質(zhì)表面，實驗組按粘接劑的劑量的20wt％，將PAsp-ACP顆粒與商品化粘接劑Clearfil S3 Bond粘接劑混合，攪拌均勻，涂刷于脫礦牙釉質(zhì)表面，靜置30-60s，光照固化40s。將牙片放入人工唾液中，在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。將礦化的牙釉質(zhì)樣本酒精梯度脫水，1個月后，透射電鏡(TEM)及選區(qū)電子衍射(SAED)觀察發(fā)現(xiàn)實驗組在脫礦牙釉質(zhì)表面出現(xiàn)礦化。