本發(fā)明涉及一種后彈力層角膜內(nèi)皮移植術(shù)用移植片及其液泡分離制備法，具體涉及一種用豬角膜制備的后彈力層角膜內(nèi)皮移植術(shù)用移植片及其液泡分離制備法。

背景技術(shù)：

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)目前約有700000因嚴(yán)重角膜疾病而致盲的患者，角膜盲已經(jīng)成為第二位可治療性盲。角膜移植是患者復(fù)明的唯一手段。約50％的患者可以通過(guò)角膜內(nèi)皮移植術(shù)(Endothelial Keratoplasty，EK)復(fù)明。作為最新的角膜內(nèi)皮移植術(shù)，后彈力層角膜內(nèi)皮移植術(shù)(Descemet Membrane Endothelial Keratoplasty，DMEK)具有諸多其他EK不具備的優(yōu)勢(shì)，因而臨床應(yīng)用前景廣闊。但是，人角膜供體來(lái)源匱乏的現(xiàn)狀嚴(yán)重制約了DMEK發(fā)展，因而尋找可以替代的生物活性材料成為必然。

與傳統(tǒng)穿透性角膜移植術(shù)(Penetrating Keratoplasty，PKP)將角膜全層移植給供體的方式不同，EK僅將供體角膜的內(nèi)皮層移植給患者，這在很大程度上彌補(bǔ)了PKP一些不可避免的缺陷。EK方式地不斷革新，使其臨床應(yīng)用前景愈加廣闊，最新的DMEK更是以良好的術(shù)后視覺(jué)質(zhì)量恢復(fù)、很輕的術(shù)后炎癥反應(yīng)、較低的免疫排斥率獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。DMEK要求的移植片僅包含后彈力層和角膜內(nèi)皮層，具有厚度薄(約15μm)、脆弱易破、易卷曲等特性，因而將其完整從角膜基質(zhì)層分離下來(lái)難度較大。另一方面，由于受傳統(tǒng)觀(guān)念的影響、法律法規(guī)的制約、公眾捐獻(xiàn)宣傳教育工作的欠缺等，我國(guó)角膜供體來(lái)源極度匱乏的現(xiàn)狀也嚴(yán)重制約了DMEK的發(fā)展，由于豬角膜來(lái)源廣泛，物理和光學(xué)性質(zhì)及內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)與功能與人角膜相似，因而成為目前可替代人角膜內(nèi)皮的最佳選擇。

角膜分為五層，由前向后依次為：上皮細(xì)胞層(Epithelium)、前彈力層(BowmanMembrane)、基質(zhì)層(Stroma)、后彈力層(Descemet Membrane，DM)和內(nèi)皮細(xì)胞層(Endothelium)。上皮細(xì)胞層厚約50μm，占整個(gè)角膜厚度的10％，由5-6層上皮細(xì)胞組成，角膜周邊部分上皮細(xì)胞層增厚，細(xì)胞增加到8-10層。前彈力層為一層均質(zhì)透明膜，無(wú)細(xì)胞成分，電鏡觀(guān)察顯示主要由膠原纖維所構(gòu)成?；|(zhì)層由約200層與角膜表面平行的膠原纖維束薄板組成，厚約500μm，占整個(gè)角膜厚度的90％。后彈力層為較堅(jiān)韌的透明均質(zhì)膜，富于彈性，對(duì)化學(xué)物質(zhì)和病理?yè)p害的抵抗力強(qiáng)。內(nèi)皮細(xì)胞層為一層六角形扁平細(xì)胞構(gòu)成，具有角膜-房水屏障功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種后彈力層角膜內(nèi)皮移植術(shù)用移植片及其液泡分離制備法，具體涉及一種用豬角膜制備的后彈力層角膜內(nèi)皮移植術(shù)用移植片及其液泡分離制備法。

本發(fā)明提供了一種以豬角膜為材質(zhì)的移植片的制備方法，包括如下步驟：

(1)取離體的豬眼球，切取外邊緣帶有鞏膜環(huán)的角膜；

(2)取步驟(1)得到的角膜，去除小梁網(wǎng)，暴露出后彈力層止端；

(3)用裝有針頭的注射器抽取液體，對(duì)完成步驟(2)的角膜進(jìn)行注射，注射方式如下：

①?gòu)暮髲椓又苟颂庒樇庑毕騼?nèi)皮細(xì)胞層方向進(jìn)針，針尖在基質(zhì)層內(nèi)潛行，(盡量)靠近后彈力層但不能破壞后彈力層；當(dāng)針尖斜面完全進(jìn)入基質(zhì)層后開(kāi)始注液，當(dāng)液體進(jìn)入基質(zhì)層和后彈力層之間形成液泡時(shí)加快推注速度直至整體大液泡形成；如果前一步驟中，基質(zhì)層中發(fā)生水腫未形成液泡，繼續(xù)向前進(jìn)針超過(guò)水腫區(qū)域，然后將針尖上挑并注液，當(dāng)液體進(jìn)入基質(zhì)層和后彈力層之間形成液泡時(shí)加快推注速度直至整體大液泡形成，進(jìn)針深度不應(yīng)超過(guò)角膜橫徑的1/3；

②如果步驟①?zèng)]有得到基質(zhì)層和后彈力層之間形成整體大液泡的角膜，選擇與步驟①的進(jìn)針位置相對(duì)位于其他象限的點(diǎn)作為進(jìn)針位置，重復(fù)步驟①。

③如果步驟②沒(méi)有得到基質(zhì)層和后彈力層之間形成整體大液泡的角膜，選擇與步驟①和步驟②的進(jìn)針位置相對(duì)位于其他象限的點(diǎn)作為進(jìn)針位置，重復(fù)步驟①。

④如果步驟③沒(méi)有得到基質(zhì)層和后彈力層之間形成整體大液泡的角膜，選擇與步驟①和步驟②和步驟③的進(jìn)針位置相對(duì)位于其他象限的點(diǎn)作為進(jìn)針位置，重復(fù)步驟①；

(4)完成步驟(3)后，取基質(zhì)層和后彈力層之間形成整體大液泡的角膜，將液體抽出，切割剝離，得到由后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層組成的移植片。

步驟(1)中，外邊緣帶有鞏膜環(huán)的角膜中的鞏膜為部分鞏膜。

步驟(1)中，外邊緣帶有鞏膜環(huán)的角膜具體可為外邊緣帶有1-2毫米鞏膜環(huán)的角膜。

步驟(2)中，所述“去除小梁網(wǎng)”可為去除部分或全部小梁網(wǎng)，只要實(shí)現(xiàn)暴露出后彈力層止端即可。小梁網(wǎng)上附著有色素，因此去除小梁網(wǎng)的同時(shí)也去除了色素。

步驟(2)中，可先進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，然后去除(具體可為刮除)小梁網(wǎng)。

步驟(2)中，所述臺(tái)盼藍(lán)染色，可以對(duì)整個(gè)帶有1-2毫米鞏膜環(huán)的角膜進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，也可以在帶有1-2毫米鞏膜環(huán)的角膜的鞏膜溝處進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色。

步驟(2)中還包括如下步驟：進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色之后，刮除小梁網(wǎng)之前，用PBS緩沖液沖洗角膜。所述PBS緩沖液具體可為PBS pH7.4basic(1×)。

步驟(3)中，所述液體為角膜保存液，具體可為Optisol GS。

步驟(3)中，所述針頭為彎曲角度為90-120°的彎曲針頭。

步驟(3)中，所述針頭中，針孔位于針尖斜面上。

步驟(3)中，所述裝有針頭的注射器具體可為針頭與針筒為一體結(jié)構(gòu)的注射器。

步驟(3)中，所述裝有針頭的注射器具體可為規(guī)格為1ml的注射器。

步驟(3)中，所述裝有針頭的注射器具體可為胰島素注射器，例如舒銳^TM一次性使用無(wú)菌胰島素注射器。

步驟(3)中，用裝有針頭的注射器抽取液體具體可為用裝有針頭的注射器抽取0.6ml-0.8ml液體。

步驟(4)中，所述切割剝離的實(shí)現(xiàn)方式為：將角膜置于負(fù)壓切割枕上，環(huán)鉆切割，剝離。

本發(fā)明還保護(hù)一種以豬角膜為材質(zhì)的移植片的制備方法，包括如下步驟：

(1)取離體的豬眼球，切取外邊緣帶有鞏膜環(huán)的角膜；

(2)取步驟(1)得到的角膜，去除小梁網(wǎng)，暴露出后彈力層止端；

(3)完成步驟(2)后，分離后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層組成的膜，得到由后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層組成的豬DMEK移植片。

步驟(1)中，外邊緣帶有鞏膜環(huán)的角膜中的鞏膜為部分鞏膜。

步驟(1)中，外邊緣帶有鞏膜環(huán)的角膜具體可為外邊緣帶有1-2毫米鞏膜環(huán)的角膜。

步驟(2)中，所述“去除小梁網(wǎng)”可為去除部分或全部小梁網(wǎng)，只要實(shí)現(xiàn)暴露出后彈力層止端即可。小梁網(wǎng)上附著有色素，因此去除小梁網(wǎng)的同時(shí)也去除了色素。

步驟(2)中，可先進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，然后去除(具體可為刮除)小梁網(wǎng)。

本發(fā)明還保護(hù)一種以豬角膜為材質(zhì)的移植片的制備方法，包括如下步驟：以豬角膜為原料，通過(guò)注射液體的方式在基質(zhì)層和后彈力層之間形成整體大液泡，然后切割分離，得到由后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層組成的移植片。

所述液體為角膜保存液，具體可為Optisol GS。

所述切割剝離的實(shí)現(xiàn)方式為：將角膜置于負(fù)壓切割枕上，環(huán)鉆切割，剝離。

以上任一所述的離體的豬眼球，約新鮮越好。

以上任一所述方法制備得到的移植片也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明還保護(hù)所述移植片在制備用于后彈力層角膜內(nèi)皮移植術(shù)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還保護(hù)一種用于后彈力層角膜內(nèi)皮移植術(shù)的產(chǎn)品，包括所述移植片。

本發(fā)明還保護(hù)所述移植片作為后彈力層角膜內(nèi)皮移植術(shù)的移植片的應(yīng)用。

本發(fā)明的發(fā)明人在大量試驗(yàn)摸索和驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，結(jié)合豬角膜自身的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，提供了一套完整的移植片制備方法，以期用于人后彈力層角膜內(nèi)皮移植術(shù)。

采用本發(fā)明提供的移植片進(jìn)行后彈力層角膜內(nèi)皮移植術(shù)具有以下的優(yōu)勢(shì)：1)豬角膜內(nèi)皮組織所含的異種抗原及抗原遞呈細(xì)胞遠(yuǎn)較全層及板層要少，這在很大程度上避免了超急性和遲發(fā)型排斥反應(yīng)的發(fā)生；2)完全處于房水中的豬角膜內(nèi)皮組織將受到前房?jī)?nèi)一系列抑制免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的細(xì)胞因子與機(jī)制(前房免疫偏移狀態(tài))的保護(hù)；3)內(nèi)皮植片不需縫線(xiàn)固定，這避免了因縫線(xiàn)刺激產(chǎn)生新生血管誘發(fā)排斥反應(yīng)的可能。

豬作為最為普通的家畜，其來(lái)源廣泛、對(duì)于臨床領(lǐng)域來(lái)說(shuō)價(jià)格低廉。本發(fā)明以豬眼球?yàn)樵?，制備了由后彈力層和?nèi)皮細(xì)胞層組成的移植片，期待能夠有效緩解目前人角膜內(nèi)皮供體極度匱乏的現(xiàn)狀，為大量角膜盲患者帶來(lái)復(fù)明的希望，具有重大的社會(huì)價(jià)值，并且具有非常大的產(chǎn)業(yè)化、商品化價(jià)值，投入臨床市場(chǎng)后將帶來(lái)可觀(guān)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為在鞏膜溝處進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色后的角膜。

圖2為刮除部分小梁網(wǎng)，暴露出后彈力層止端的角膜。

圖3為將針頭彎曲成90-120°角的胰島素注射器的照片。

圖4為步驟①中，從Schwabe線(xiàn)處針尖斜向上進(jìn)針，針尖在基質(zhì)層內(nèi)潛行的照片。

圖5為步驟①中，基質(zhì)層中發(fā)生水腫未形成液泡的照片。

圖6為步驟①中，基質(zhì)層中發(fā)生水腫未形成液泡，繼續(xù)向前進(jìn)針超過(guò)水腫區(qū)域，然后將針尖上挑并注液，仍然未形成液泡的照片。

圖7為步驟②中，液體進(jìn)入基質(zhì)層和后彈力層之間形成液泡的照片。

圖8為步驟②中，當(dāng)液體進(jìn)入基質(zhì)層和后彈力層之間形成液泡時(shí)加快推注速度直至整體大液泡形成的照片。

圖9為將角膜置于負(fù)壓切割枕上的照片。

圖10為豬DMEK移植片的照片。

圖11為染色后在顯微鏡下觀(guān)察豬DMEK移植片角膜內(nèi)皮情況的照片。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

角膜保存液(OptisolGS)：Bausch&Lomb Rochester,NY；貨號(hào)50006-OPT。

胰島素注射器：BD Ultra-Fine^TMNeedle Insulin Syringe(舒銳^TM一次性使用無(wú)菌胰島素注射器)，1ml，29G×1/2〞(0.33mm×12.7mm)，針頭與針筒為一體結(jié)構(gòu)，針孔位于針頭的針尖斜面上。

PBS緩沖液：PBS pH7.4basic(1×)；gibco by Lifetechnologies^TM。

整體大液泡：即覆蓋角膜全橫徑的液泡。

實(shí)施例1、

1、取離體的豬眼球，切取外邊緣帶有1-2毫米鞏膜環(huán)的角膜。

2、取步驟1得到的角膜，在鞏膜溝處進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色(實(shí)際操作中，也可以對(duì)步驟1得到的整個(gè)角膜進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色)，然后用PBS緩沖液沖洗，然后用無(wú)齒顯微鑷刮除小梁網(wǎng)(小梁網(wǎng)上附著有色素)，暴露出后彈力層止端(Schwabe線(xiàn))。

在鞏膜溝處進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色后的角膜見(jiàn)圖1。

刮除小梁網(wǎng)，暴露出后彈力層止端的角膜見(jiàn)圖2。

3、取胰島素注射器，抽取0.6ml角膜保存液，然后將針頭彎曲成90-120°角。

將針頭彎曲成90-120°角的胰島素注射器的照片見(jiàn)圖3。

4、完成步驟3后，取所述胰島素注射器，對(duì)完成步驟2的角膜進(jìn)行注射(角膜放置于培養(yǎng)皿中，內(nèi)皮細(xì)胞層向上)，注射方式如下：

①?gòu)腟chwabe線(xiàn)處針尖斜向上進(jìn)針(針尖斜向上指的是針尖斜向內(nèi)皮細(xì)胞層方向)，針尖在基質(zhì)層內(nèi)潛行，盡量靠近后彈力層但不能破壞后彈力層；當(dāng)針尖斜面完全進(jìn)入基質(zhì)層后開(kāi)始注液，液體在局部蓄積，當(dāng)液體進(jìn)入基質(zhì)層和后彈力層之間形成液泡時(shí)加快推注速度直至整體大液泡形成；如果前一步驟中，基質(zhì)層中發(fā)生水腫未形成液泡，繼續(xù)向前進(jìn)針超過(guò)水腫區(qū)域，然后將針尖上挑并注液，當(dāng)液體進(jìn)入基質(zhì)層和后彈力層之間形成液泡時(shí)加快推注速度直至整體大液泡形成，進(jìn)針深度不應(yīng)超過(guò)角膜橫徑的1/3。

②如果步驟①?zèng)]有得到基質(zhì)層和后彈力層之間形成整體大液泡的角膜，選擇與步驟①的進(jìn)針位置相對(duì)位于其他象限的點(diǎn)作為進(jìn)針位置，重復(fù)步驟①。

③如果步驟②沒(méi)有得到基質(zhì)層和后彈力層之間形成整體大液泡的角膜，選擇與步驟①和步驟②的進(jìn)針位置相對(duì)位于其他象限的點(diǎn)作為進(jìn)針位置，重復(fù)步驟①。

④如果步驟③沒(méi)有得到基質(zhì)層和后彈力層之間形成整體大液泡的角膜，選擇與步驟①和步驟②和步驟③的進(jìn)針位置相對(duì)位于其他象限的點(diǎn)作為進(jìn)針位置，重復(fù)步驟①。

步驟①中，從Schwabe線(xiàn)處針尖斜向上進(jìn)針，針尖在基質(zhì)層內(nèi)潛行的照片見(jiàn)圖4。

步驟①中，基質(zhì)層中發(fā)生水腫未形成液泡的照片見(jiàn)圖5。

步驟①中，基質(zhì)層中發(fā)生水腫未形成液泡，繼續(xù)向前進(jìn)針超過(guò)水腫區(qū)域，然后將針尖上挑并注液，仍然未形成液泡的照片見(jiàn)圖6。

步驟②中，液體進(jìn)入基質(zhì)層和后彈力層之間形成液泡的照片見(jiàn)圖7。

步驟②中，當(dāng)液體進(jìn)入基質(zhì)層和后彈力層之間形成液泡時(shí)加快推注速度直至整體大液泡形成的照片見(jiàn)圖8。

5、完成步驟4后，取基質(zhì)層和后彈力層之間形成整體大液泡的角膜，將形成整體大液泡的液體抽出，然后置于負(fù)壓切割枕上，進(jìn)行環(huán)鉆切割，用無(wú)齒顯微鑷剝離，得到由后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層組成的豬DMEK移植片。

將角膜置于負(fù)壓切割枕上的照片見(jiàn)圖9。

豬DMEK移植片的照片見(jiàn)圖10。

進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)試驗(yàn)中對(duì)100個(gè)離體的豬眼球進(jìn)行上述操作，豬DMEK移植片的得率為85％-90％。

對(duì)比例1、

1、取離體的豬眼球，切取外邊緣帶有1-2毫米鞏膜環(huán)的角膜。

2、取胰島素注射器，抽取0.6ml角膜保存液，然后將針頭彎曲成90-120°角。

3、完成步驟2后，取所述胰島素注射器，對(duì)步驟1得到的角膜進(jìn)行注射(角膜放置于培養(yǎng)皿中，內(nèi)皮細(xì)胞層向上)，注射方式如下：

從Schwabe線(xiàn)處針尖斜向上進(jìn)針(針尖斜向上指的是針尖斜向內(nèi)皮細(xì)胞層方向)，針尖在基質(zhì)層內(nèi)潛行，盡量靠近后彈力層但不能破壞后彈力層；當(dāng)針尖斜面完全進(jìn)入基質(zhì)層后開(kāi)始注液，液體在局部蓄積，當(dāng)液體進(jìn)入基質(zhì)層和后彈力層之間形成液泡時(shí)加快推注速度直至整體大液泡形成。

4、完成步驟3后，取基質(zhì)層和后彈力層之間形成整體大液泡的角膜，將形成整體大液泡的液體抽出，然后置于負(fù)壓切割枕上，進(jìn)行環(huán)鉆切割，用無(wú)齒顯微鑷剝離，得到由后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層組成的豬DMEK移植片。

進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)試驗(yàn)中對(duì)100個(gè)離體的豬眼球進(jìn)行上述操作，豬DMEK移植片的得率為0％-5％。

實(shí)施例2、

取實(shí)施例1制備的豬DMEK移植片，檢測(cè)細(xì)胞密度和活細(xì)胞比例。

具體方法如下：

1、取豬DMEK移植片，采用0.2％臺(tái)盼藍(lán)染色液染色2min。

2、完成步驟1后，用PBS緩沖液清洗2遍。

3、完成步驟2后，用1％茜素紅S染色液染色3min。

4、完成步驟3后，用PBS緩沖液清洗2遍。

5、完成步驟4后，在顯微鏡下觀(guān)察，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度(隨機(jī)取3個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)，總和取平均值)和活細(xì)胞比例。

照片見(jiàn)圖11。箭頭標(biāo)注死細(xì)胞。

取實(shí)施例1制備的豬DMEK移植片，均達(dá)到如下標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞密度>2500/mm²,活細(xì)胞比例>90％。

取實(shí)施例1制備的移植片，對(duì)恒河猴進(jìn)行后彈力層角膜內(nèi)皮移植術(shù)，連續(xù)觀(guān)察半年，恒河猴生活狀態(tài)良好、水腫角膜恢復(fù)透明，DMEK移植片位置正常，未見(jiàn)明顯排斥反應(yīng)發(fā)生。