本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)替代材料技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及用于修補人體軟組織中大/小孔徑血管缺損的生物醫(yī)學(xué)工程支架材料技術(shù)及其制備方法。

技術(shù)背景

隨著心血管疾病日益增多，尤其是血管堵塞可能會造成血液中含氧量低、間接的器官衰竭甚至死亡使得臨床上需要大量的血管支架替代材料。自體血管組織資源有限，遠遠不能滿足血管移植的需求。目前，天然組織來源的異體血管已廣泛應(yīng)用于臨床，用以彌補自體血管來源的稀缺。天然組織來源血管具有和自體血管類似的化學(xué)組分和利于細胞增殖與黏附的微觀結(jié)構(gòu)，與細胞親和性強，能為細胞生長、增殖、分化及功能發(fā)揮提供近似體內(nèi)組織發(fā)生發(fā)育的細胞外基質(zhì)支架條件。但由于天然組織自活體取出后迅速發(fā)生降解且有嚴重的抗原性，在移植前需進行化學(xué)交聯(lián)修飾。本發(fā)明的發(fā)明人所在實驗室前期的研究成果表明：氧化羧甲基纖維素(DCMC)是一種較理想的氧化多糖交聯(lián)劑，經(jīng)它交聯(lián)的血管組織不僅能較長時間保存良好的力學(xué)性能，且有效提高其抗酶降解性，同時消除了材料的抗原性；與傳統(tǒng)交聯(lián)劑戊二醛等相比，它具有良好的細胞相容性和與新生組織生長速率匹配的降解速率，這大大拓展了其應(yīng)用范圍。但與其他已投入臨床應(yīng)用的傳統(tǒng)交聯(lián)劑類似，DCMC交聯(lián)血管也存在內(nèi)皮化效果差、易鈣化、易形成血栓等缺陷，幾乎無法用于小孔徑血管的修復(fù)。

有效改善材料的內(nèi)皮化效果是制備血管支架替代材料亟待解決的首要問題。規(guī)整排列的單層內(nèi)皮細胞層可以保持血管內(nèi)壁光滑，抑制血栓形成；此外，它還可以保證血液正常流動，防止鈣化，延長血管支架的使用壽命。因此，理想的血管支架替代材料除了應(yīng)具備良好的生物相容性，與周圍組織匹配的力學(xué)性能以及一定的抗酶降解性能，還應(yīng)具備一定的“促內(nèi)皮化能力”。目前，促進血管支架材料內(nèi)皮化的方法主要有兩種，一種為生長因子法，另一種為表面的蛋白修飾法。生長因子法由于生長因子的半衰期短、釋放速率不易控制等缺陷難以達到最優(yōu)的內(nèi)皮化效果；表面的蛋白修飾法則由于其價格非常昂貴，難以投入臨床應(yīng)用。

為了解決上述血管支架替代材料存在的不足，需要尋找一種新的材料修飾方法，使之在保存其良好生物相容性與交聯(lián)理化性能的同時，可以改善材料的內(nèi)皮化作用，進一步促進血管內(nèi)壁單層細胞層的形成，以制備出更為理想的血管支架替代材料。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)血管支架替代材料存在的不足，本發(fā)明的目的旨在提供一種既有良好的生物相容性，與周圍組織匹配的力學(xué)性能以及一定的抗酶降解性能，又有較好的“促內(nèi)皮化能力”的人工器官用生物組織材料及其制備方法，使其具有雙重防治改性效果。

本發(fā)明提供的人工器官用生物組織材料，是一種由脫細胞豬主動脈血管采用粒徑微米級的摻鍶聚磷酸鈣(SCPP)進行摻鍶修飾改進內(nèi)皮化后，再經(jīng)氧化羧甲基纖維素鈉(DCMC)交聯(lián)固定制取的生物組織材料，是一種有機/無機復(fù)合軟組織工程支架材料。

上述摻鍶修飾改進血管內(nèi)皮化的SCPP，優(yōu)先選用鍶/鈣摩爾比(6-9)：(91-94)、粒徑20μm-50μm的SCPP粉末。

上述人工器官用生物組織材料，可通過括以下制備步驟的方法來制備：

(1)將脫細胞豬主動脈血管浸泡于0.5mg/ml-1.5mg/ml的SCPP/PBS(磷酸鹽緩沖液)懸濁液中，交替采用震蕩和真空兩種吸附方式于不高于40℃下進行吸附摻鍶4-6h，實現(xiàn)摻鍶修飾改進血管內(nèi)皮化；

(2)將經(jīng)步驟(1)摻鍶修飾改進內(nèi)皮化的血管浸泡于質(zhì)量濃度0.5-1.0％的DCMC有機溶液中，于25-40℃下震蕩交聯(lián)反應(yīng)48-120h；

(3)將經(jīng)步驟(2)交聯(lián)后的血管材料浸泡于溫度0-10℃、質(zhì)量濃度0.5-4％的NaBH₄/乙醇溶液中，使血管中的亞胺鍵還原為水相中可穩(wěn)定存在的碳氮單鍵；

(4)將經(jīng)步驟(3)還原處理后的血管材料用生理鹽水反復(fù)漂洗后，即制得以生物來源組織為基體的人工器官用生物組織材料。

在本發(fā)明上述制備方法中，所述吸附摻鍶最好于35-40℃下進行；且最好交替在恒溫震蕩箱中采用水浴震蕩和在真空干燥箱中在真空下進行吸附摻鍶，以保證SCPP顆粒充分吸附。

在本發(fā)明上述制備方法中，為了保證血管與交聯(lián)液充分均勻接觸，經(jīng)摻鍶修飾改進內(nèi)皮化的血管浸泡于質(zhì)量濃度0.5-1.0％的DCMC有機溶液，最好是采用搖床在持續(xù)輕微震蕩條件下于35-37℃聯(lián)反應(yīng)48-76h；交聯(lián)過程需保證DCMC交聯(lián)液的用量充足，為此，交聯(lián)劑DCMC有機溶液的用量一般為每1cm²血管不少于1ml，最好控制在1ml-5ml的范圍。

在本發(fā)明上述制備方法中，經(jīng)交聯(lián)后的血管材料最好浸泡于溫度4-6℃、質(zhì)量濃度0.5-1.5％的NaBH₄/乙醇溶液中，使血管材料中的亞胺鍵還原為水相中可穩(wěn)定存在的碳氮單鍵。

在本發(fā)明的上述制備方法中，所述脫細胞豬主動脈血管為經(jīng)下述方法處理得到的豬主動脈血管：

(1)來自屠宰場的血管熱缺血時間不超過6h的豬主動脈血管，用溫度不大于10℃的生理鹽水洗去血跡，剔去血管表面附著的脂肪層；

(2)將經(jīng)步驟(1)處理后的豬主動脈血管分別依次先浸泡于0.01-0.1％胰蛋白酶/PBS溶液和體積濃度不低于1％的曲拉通溶液中于10-30℃下震蕩脫去細胞成分得到網(wǎng)狀支架的血管。

在本發(fā)明上述制備方法中，所述摻鍶聚磷酸鈣為經(jīng)下述方法制備的摻鍶聚磷酸鈣：

(1)將Sr/Ca摩爾比為6-9：91-94的碳酸鍶和碳酸鈣混合粉末加入濃度為2mol/L-3mol/L的磷酸溶液中，持續(xù)攪拌至粉末完全溶解，密閉靜置不少于8小時后，于60℃-90℃加熱旋蒸出磷酸二氫鍶和磷酸二氫鈣的混合結(jié)晶；

(2)用乙醇充分洗滌至pH呈中性，裝入瓷盤中經(jīng)紅外燈干燥后在馬弗爐中經(jīng)兩次高溫?zé)Y(jié):第一次以室溫為起始點以8℃/min-10℃/min升溫至400℃-600℃，保溫8h-10h；隨后升溫至1000℃-1200℃，保溫40min-1h，將坩堝從馬弗爐中取出，迅速將其中的熔融、粘稠液體倒入由去離子水凍成的冰水混合物中淬火，得到塊狀透明燒料；第二次燒結(jié)將所得燒料以室溫為起點以同樣的升溫速率升溫至700℃-900℃，保溫4h-6h,即制備出6％-9％的摻鍶聚磷酸鈣；

(3)將制取的摻鍶聚磷酸鈣以無水乙醇為分散劑在球磨機中研磨成粒徑為20μm-50μm的粉末，即制得用于物理吸附修飾的SCPP微米級顆粒。

在制備人工器官用生物組織材料的研究完成過程中，發(fā)明人在前期研究中經(jīng)過反復(fù)試驗最終選定氧化羧甲基纖維素作為豬主動脈血管的交聯(lián)劑。氧化羧甲基纖維素是羧甲基纖維素的衍生物，羧甲基纖維素是一種水溶性的纖維素醚，且其造價低廉、資源廣泛可再生，生物相容性好，無免疫原性，不會誘發(fā)炎性反應(yīng)。用高碘酸鈉對羧甲基纖維素進行選擇性氧化，在保留其良好生物相容性的前提下，引入高反應(yīng)活性的醛基，能夠與氨基酸或蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。氧化羧甲基纖維素作為一種天然生物交聯(lián)劑，具有較高的反應(yīng)活性、較低的細胞毒性和優(yōu)異的生物相容性；經(jīng)它交聯(lián)的主動脈血管具有可有效保持天然生物材料富有韌性、彈性好的力學(xué)性能優(yōu)勢，不會破壞生物來源材料促進細胞黏附與增殖的微觀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且有效消除材料的抗原性，抗酶降解性能和生物相容性優(yōu)異。但是，DCMC交聯(lián)血管也存在內(nèi)皮化效果差、易鈣化、易形成血栓等缺陷，幾乎無法用于小孔徑血管的修復(fù)。

為了進一步提高人工器官用生物組織材料的生物相容性與活性，考慮引入鍶元素對交聯(lián)后血管支架表面修飾改性，希望通過鍶元素的引入促進血管的內(nèi)皮化效果。摻鍶聚磷酸鈣(SCPP)是一種含有鍶元素的無機聚合物，由于它與天然骨的組成成分類似，故具有生物相容性好、抗酶降解性能優(yōu)異且可控、力學(xué)強度高耐磨損等諸多優(yōu)點。值得一提的是：由于其可控的降解性能，鍶離子可以持續(xù)恒速地從SCPP中釋放出來，長期促進內(nèi)皮細胞的生長與管腔表面內(nèi)皮細胞層的形成，有效改善材料的內(nèi)皮化效果,保證血液正常流動，防止鈣化，延長血管支架的使用壽命。

本發(fā)明是以氧化羧甲基纖維素為交聯(lián)劑，以豬主動脈血管為主體，以SCPP微米級顆粒為摻鍶修飾物制備的人工器官用生物組織材料，它既保留了天然生物組織中利于細胞增殖黏附的微觀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，又有效消除其抗原性，提高其力學(xué)性能與抗酶降解性能。DCMC的交聯(lián)可以有效抑制改性后血管的鈣化，不易變得僵硬，并能減小炎癥反應(yīng)，克服了傳統(tǒng)交聯(lián)劑的諸多缺陷。通過引入SCPP微米級顆粒，以物理吸附作用對交聯(lián)血管進行摻鍶改性，促進血管內(nèi)壁形成單層內(nèi)皮細胞層，抑制血栓形成；有效改善材料的內(nèi)皮化效果,保證血液正常流動，防止鈣化，延長血管支架的使用壽命，很適合作為血管替代材料，為血管的修復(fù)治療奠定了堅實的基礎(chǔ)。

后面的實施例充分表明了本發(fā)明提供的以無機摻鍶聚磷酸鈣(SCPP)微米級顆粒修飾、以氧化羧甲基纖維素鈉(DCMC)交聯(lián)固定豬主動脈血管得到的人工器官用生物組織材料，作為有機/無機復(fù)合軟組織工程支架材料，不僅能較長時間保存良好的力學(xué)性能，有效提高其抗酶降解性，同時消除了材料的抗原性；且它有優(yōu)異的“促內(nèi)皮化效果”，有效抑制鈣化，防止血栓的形成。是一種種既有良好的生物相容性，與周圍組織匹配的力學(xué)性能以及一定的抗酶降解性能，又有較好的“促內(nèi)皮化能力”的具有巨大臨床應(yīng)用前景的新型血管支架替代材料。

附圖說明

附圖1新鮮樣及DCMC/SCPP交聯(lián)修飾樣的EDS譜圖。圖中1-a為新鮮樣的元素含量圖，圖中1-b為DCMC/SCPP交聯(lián)修飾樣的元素含量圖。

附圖2交聯(lián)前后材料在D-Hanks溶液中浸泡一定時長后(分別為0d,1d,3d,7d,15d和30d)的力學(xué)穩(wěn)定性。圖中2-1為最終斷裂強度隨浸泡時間的變化柱狀圖；圖中2-2為彈性模量隨浸泡時間的變化柱狀圖。其中*表示與新鮮樣有顯著性差異，P＜0.05。

附圖3內(nèi)皮細胞在與經(jīng)不同方式修飾處理的血管復(fù)合培養(yǎng)的生長曲線圖。

附圖4內(nèi)皮細胞在與經(jīng)不同方式修飾處理的復(fù)合培養(yǎng)4d的形態(tài)學(xué)掃描電鏡照片(放大500倍)。圖中4-a中的材料為新鮮樣，圖中4-b中的材料為DCMC交聯(lián)血管樣，圖中4-c中的材料為DCMC/SCPP交聯(lián)修飾血管樣，圖中4-d中的材料為GA交聯(lián)血管樣。

附圖5內(nèi)皮細胞在與經(jīng)不同方式修飾處理的復(fù)合培養(yǎng)4d的FDA/PI活死細胞染色圖，其中(a)-(d)為FDA染色的活細胞顯綠色熒光圖，(a’)-(d’)為PI染色的死細胞顯紅色熒光圖。圖中(a)和(a’)的材料為新鮮樣，圖中5(b)和(b’)中的材料為DCMC交聯(lián)血管樣，圖中5(c)和(c’)中的材料為DCMC/SCPP交聯(lián)修飾血管樣，圖中5(d)和(d’)中的材料為GA交聯(lián)血管樣。

具體實施方案

下面給出本發(fā)明的實施案例，并通過實施例對本發(fā)明進行進一步的具體描述。需要特別指出的是：實施例只是就本發(fā)明做進一步的闡釋說明，不應(yīng)理解為本發(fā)明的保護范圍僅限于此例。實際上，凡基于本發(fā)明的相關(guān)內(nèi)容實現(xiàn)的技術(shù)均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍。

1.以無機摻鍶聚磷酸鈣(SCPP)微米級顆粒修飾氧化羧甲基纖維素(DCMC)

交聯(lián)固定豬主動脈血管制備血管支架替代材料實施例

實施例1

將Sr/Ca摩爾比為8:92的碳酸鍶和碳酸鈣混合粉末加入濃度為2mol/L的磷酸溶液中，持續(xù)攪拌至粉末完全溶解為止，密閉并靜置8小時。隨后，將溶液轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，80℃加熱旋蒸出磷酸二氫鍶和磷酸二氫鈣的混合結(jié)晶。隨后，用乙醇充分洗滌至pH呈中性，裝入瓷盤中經(jīng)紅外燈干燥后在馬弗爐中經(jīng)兩次高溫?zé)Y(jié):第一次以室溫為起始點以10℃/min的升溫速率至600℃，保溫8h；隨后升溫至1100℃，保溫1h。將坩堝從馬弗爐中取出，迅速將其中的熔融、粘稠液體倒入由去離子水凍成的冰水混合物中淬火，得到塊狀透明燒料。第二次燒結(jié)將所得燒料以室溫為起點以同樣的升溫速率升溫至800℃，保溫6h,即制備出8％的摻鍶聚磷酸鈣。將制取的摻鍶聚磷酸鈣以無水乙醇為分散劑在球磨機中研磨成粒徑為20μm-50μm的粉末，即制得用于物理吸附修飾的SCPP微米級顆粒。

實施例2

將將Sr/Ca摩爾比為7:93的碳酸鍶和碳酸鈣混合粉末加入濃度為2mol/L的磷酸溶液中，持續(xù)攪拌至粉末完全溶解為止，密閉并靜置8小時。隨后，將溶液轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，80℃加熱旋蒸出磷酸二氫鍶和磷酸二氫鈣的混合結(jié)晶。隨后，用乙醇充分洗滌至pH呈中性，裝入瓷盤中經(jīng)紅外燈干燥后在馬弗爐中經(jīng)兩次高溫?zé)Y(jié):第一次以室溫為起始點以8℃/min的升溫速率至600℃，保溫10h；隨后升溫至1200℃，保溫1h。將坩堝從馬弗爐中取出，迅速將其中的熔融、粘稠液體倒入由去離子水凍成的冰水混合物中淬火，得到塊狀透明燒料。第二次燒結(jié)將所得燒料以室溫為起點以同樣的升溫速率升溫至800℃，保溫8h,即制備出8％的摻鍶聚磷酸鈣。將制取的摻鍶聚磷酸鈣以無水乙醇為分散劑在球磨機中研磨成粒徑為20μm-50μm的粉末，即制得用于物理吸附修飾的SCPP微米級顆粒。

實施例3

將Sr/Ca摩爾比為6:94的碳酸鍶和碳酸鈣混合粉末加入濃度為2mol/L的磷酸溶液中，持續(xù)攪拌至粉末完全溶解為止，密閉并靜置8小時。隨后，將溶液轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，80℃加熱旋蒸出磷酸二氫鍶和磷酸二氫鈣的混合結(jié)晶。隨后，用乙醇充分洗滌至pH呈中性，裝入瓷盤中經(jīng)紅外燈干燥后在馬弗爐中經(jīng)兩次高溫?zé)Y(jié):第一次以室溫為起始點以10℃/min的升溫速率至600℃，保溫8h；隨后升溫至1100℃，保溫1h。將坩堝從馬弗爐中取出，迅速將其中的熔融、粘稠液體倒入由去離子水凍成的冰水混合物中淬火，得到塊狀透明燒料。第二次燒結(jié)將所得燒料以室溫為起點以同樣的升溫速率升溫至800℃，保溫6h,即制備出6％的摻鍶聚磷酸鈣。將制取的摻鍶聚磷酸鈣以無水乙醇為分散劑在球磨機中研磨成粒徑為20μm-50μm的粉末，即制得用于物理吸附修飾的SCPP微米級顆粒。

實施例4

將自屠宰場活殺豬體上取下的主動脈血管用4℃生理鹽水洗去多余的血跡，用鑷子小心地剔去血管表面附著的脂肪層。豬主動脈自活體取出至進行交聯(lián)處理的時間(熱缺血時間)不超過6h，且需在4℃的冰生理鹽水中浸泡運輸。將脫細胞血管置于1mg/ml的SCPP/PBS懸濁液中6h進行以物理吸附作用為主的摻鍶修飾，過程中交替在恒溫震蕩箱中37℃震蕩和在真空干燥箱中抽真空以保證SCPP顆粒充分吸附。將血管置于1％的DCMC有機溶液體系中進行交聯(lián)處理，在恒溫震蕩箱中37℃持續(xù)震蕩反應(yīng)72h以上。反應(yīng)時，需保證DCMC交聯(lián)液的用量充足：每1cm²的組織樣塊用1.5ml的交聯(lián)液進行處理；為了保證血管與交聯(lián)液充分均勻接觸，優(yōu)先選擇在搖床內(nèi)有輕微震動的條件下進行交聯(lián)處理。由0.625％戊二醛/PBS溶液交聯(lián)的血管作為實驗的對照樣。隨后，將試樣于4℃下重新浸泡于1％的NaBH₄/乙醇溶液中，使亞胺鍵還原為水相中可穩(wěn)定存在的碳氮單鍵。經(jīng)生理鹽水反復(fù)漂洗后即制得以生物來源組織為基體的血管替代材料。

2.人工血管支架材料性能指標測試實施例

(1)元素分析測試實施例

EDS元素分析是一種可以精確確定固體樣品表面元素成分的方法，它可以對絕大部分元素進行定性、定量分析，主要應(yīng)用于表面元素分析、化合物結(jié)構(gòu)鑒定等領(lǐng)域。經(jīng)過DCMC/SCPP的交聯(lián)修飾，血管支架的元素組成會發(fā)生明顯變化。通過EDS分析，確定交聯(lián)修飾前后血管支架的元素組成。取經(jīng)過交聯(lián)和摻鍶修飾處理的血管樣塊，經(jīng)冷凍干燥后進行EDS分析，確定是否有鍶元素引入。

從附圖1看出：新鮮樣中完全檢測不到Sr的信號；而經(jīng)DCMC/SCPP兩步修飾的血管材料在其表面元素分析的譜圖中出現(xiàn)了Sr的明顯出峰，說明這一修飾方法能有效引入鍶元素，粘附在血管表面和內(nèi)部。

(2)交聯(lián)修飾血管在D-Hanks溶液中的力學(xué)穩(wěn)定性測試實施例

作為血管支架替代材料的生物組織工程材料，DCMC/SCPP兩步修飾固定血管的理化性能表征主要側(cè)重在力學(xué)穩(wěn)定性上。分別測試在D-Hanks溶液中浸泡0d,1d,3d,7d,15d和30d的交聯(lián)試樣的最大載荷與彈性模量值。不同修飾方法的血管材料的力學(xué)穩(wěn)定性能采用INSTRON公司的302instron萬能材料試驗機測試:試樣尺寸為40mm×5mm的長方形條狀樣品，每組樣品5個，加載速度10mm/min。

從附圖2可以看出：本實驗中以新鮮樣未經(jīng)D-Hanks溶液浸泡時所具有的最大載荷與彈性模量值作為經(jīng)交聯(lián)處理的血管樣條應(yīng)達到的力學(xué)強度最低值，用以評價血管在交聯(lián)、后期修飾處理后力學(xué)強度與力學(xué)穩(wěn)定性的變化。

未經(jīng)D-Hanks溶液浸泡時(第0天)，經(jīng)交聯(lián)處理血管的力學(xué)強度明顯增大，且單純經(jīng)DCMC交聯(lián)樣的力學(xué)強度要略好于DCMC/SCPP聯(lián)合修飾樣。這說明每個氧化多糖分子鏈中有兩個或兩個以上的活性官能團，可以與血管中的氨基反應(yīng)形成分子內(nèi)或分子間交聯(lián)，且NaBH₄還原和摻入微米級SCPP顆粒都不會破壞這種穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。這說明DCMC是一種有效的新型組織交聯(lián)劑，它可以在一段時間內(nèi)保持材料的力學(xué)強度。

在經(jīng)D-Hanks溶液浸泡后的貯存初期，DCMC交聯(lián)后血管樣條和DCMC/SCPP聯(lián)合修飾的產(chǎn)品在D-Hanks溶液中俱顯示較好的力學(xué)穩(wěn)定性；在貯存一段時間后(約在7或15d時)，它們的力學(xué)強度有略微的降低，但始終高于新鮮樣，這可能是因為DCMC作為一種氧化多糖本身會發(fā)生降解，致使在組織表面形成微孔使其與酶接觸的機會增大。經(jīng)DCMC/SCPP兩步修飾的血管試樣在貯存同樣時間段后其力學(xué)強度略好于單純經(jīng)DCMC交聯(lián)的試樣。在用交聯(lián)劑處理后，血管的彈性模量也有明顯增大，但是在D-Hanks溶液中浸泡7d后，單純經(jīng)DCMC交聯(lián)的樣塊彈性模量逐漸降低，最終幾乎與開始時的新鮮樣類似。而DCMC/SCPP聯(lián)合修飾樣的彈性模量減小速度相對較慢。這可能是因為SCPP的微小顆粒會減小血管組織與溶液的接觸的機會，起到一定的保護作用。這說明DCMC交聯(lián)劑可以在一段時間內(nèi)保持材料的力學(xué)穩(wěn)定性；而引入鍶元素的二次修飾也對其力學(xué)穩(wěn)定性有一定改善。

(3)細胞增殖實驗實施例

內(nèi)皮細胞在血管支架表面的正常生長對血管替代材料功能的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。規(guī)整排列的單層內(nèi)皮細胞層可以保持血管內(nèi)壁光滑，抑制血栓形成；此外，它還可以保證血液正常流動，防止鈣化，延長血管支架的使用壽命。為了定量表征不同交聯(lián)劑和不同交聯(lián)修飾方法處理過的血管對HUVECs細胞生長、增殖的影響，需進行MTT測試。

附圖3中展示了經(jīng)不同交聯(lián)劑和不同交聯(lián)方法處理的血管樣塊在與HUVECs共同培養(yǎng)時顯示出的細胞毒性。從圖中可以看出：除新鮮樣和GA交聯(lián)樣，經(jīng)過交聯(lián)處理的組織樣塊其細胞毒性都有一定降低，且隨與材料接觸時間的延長，細胞可以有一定程度的增殖。而新鮮樣與戊二醛交聯(lián)組細胞數(shù)量很少且隨培養(yǎng)時間的延長細胞數(shù)目變化不大。這是因為GA交聯(lián)樣的細胞毒性較大，且會持續(xù)釋放出高細胞毒性的自由醛基，嚴重抑制了細胞增殖與生長。新鮮樣有較強的抗原性，也會嚴重影響HUVECs細胞的正常增殖。對于經(jīng)DCMC交聯(lián)的組織樣塊，其細胞相容性有較明顯的改善；而經(jīng)進一步摻鍶修飾后，所測得的材料的OD值明顯增大，這說明隨SCPP降解而持續(xù)釋放出的Sr²⁺不僅會徹底消除其細胞毒性，還會明顯地促進內(nèi)皮細胞的增殖與粘附，進一步改善其細胞相容性。

(4)不同種類血管支架材料表面內(nèi)皮細胞的生長形態(tài)掃描電鏡觀察實驗實施例

材料與細胞接觸后，細胞首先在材料表面完成粘附和鋪展行為，繼而經(jīng)過一段時間的滯留期后才開始增殖，因此細胞在材料表面的粘附情況是細胞在材料表面發(fā)揮功能的前提。本例通過掃描電鏡觀察細胞在材料表面的形貌與鋪展黏附情況。

將內(nèi)皮細胞與不同種類血管支架材料進行共同培養(yǎng)，四天后做掃描電鏡觀察。附圖4是內(nèi)皮細胞在不同種類血管支架上復(fù)合培養(yǎng)4d的形態(tài)學(xué)掃描電鏡照片(放大1000倍)。圖4-a的支架材料為新鮮樣，圖4-b的支架材料為DCMC交聯(lián)樣，圖4-c的支架材料為DCMC/SCPP聯(lián)合修飾樣，圖4-d的支架材料為GA交聯(lián)樣。如圖所示：在新鮮樣和GA交聯(lián)樣表面細胞數(shù)量很少且都為圓球形。這主要是因為新鮮樣沒有經(jīng)過交聯(lián)劑處理，帶有較大抗原性；GA細胞毒性極高，嚴重影響在細胞在其表面的生長與鋪展。在DCMC交聯(lián)樣表面有一定數(shù)量的細胞生長，但細胞形態(tài)不規(guī)則：在細胞的四周雖然有一些突觸但細胞沒有多邊形鋪展。這說明DCMC交聯(lián)樣雖然不影響細胞的增殖，但是在一定時間段內(nèi)會影響內(nèi)皮細胞在其表面的粘附、鋪展效果。而DCMC/SCPP聯(lián)合修飾樣表面的內(nèi)皮細胞生長狀態(tài)良好且完全鋪展開，從細胞四周伸出的偽足清晰可見，并與周圍細胞緊密聯(lián)系；細胞與材料緊密地貼附在一起且有融合為一層內(nèi)皮細胞層的趨勢。這說明在摻鍶修飾試樣表面細胞的粘附和增殖都受到明顯的促進作用，細胞形態(tài)良好，細胞活性較高。

(5)不同種類血管支架材料表面內(nèi)皮細胞的活死細胞熒光染色實驗實施例

活死細胞熒光染色可以觀察到在血管支架材料表面細胞的數(shù)量和分布狀況，且可以在一定程度上反應(yīng)出細胞的形態(tài)。其中，F(xiàn)DA染色活細胞成綠色，PI染色死細胞成紅色。如附圖5，新鮮樣和經(jīng)GA交聯(lián)的組織樣塊表面活細胞極少，且皆為圓球形；而單純的DCMC交聯(lián)樣表面雖然細胞數(shù)量較多，但細胞活性不好，多為球形或橢球形。DCMC交聯(lián)樣雖然不影響細胞的增殖，但是在一定時間段內(nèi)會影響內(nèi)皮細胞在其表面的粘附、鋪展效果。而DCMC/SCPP聯(lián)合修飾樣表面的細胞生長狀況最好，數(shù)目多，排列密集且?guī)缀醵紴槎噙呅渭毎?，細胞活性較高，死細胞數(shù)量很少。這說明隨SCPP降解而持續(xù)釋放出的Sr²⁺可以有效消除材料的細胞毒性，提高表面細胞的生長活性，有優(yōu)異的促內(nèi)皮化效果。

綜上實施例，以無機摻鍶聚磷酸鈣(SCPP)微米級顆粒修飾氧化羧甲基纖維素鈉(DCMC)交聯(lián)固定豬主動脈血管得到的有機/無機復(fù)合軟組織工程支架不僅能較長時間保存良好的力學(xué)性能，有效提高其抗酶降解性，同時消除了材料的抗原性；且它有優(yōu)異的“促內(nèi)皮化效果”，有效抑制鈣化，防止血栓的形成。是一種種既有良好的生物相容性，與周圍組織匹配的力學(xué)性能以及一定的抗酶降解性能，又有較好的“促內(nèi)皮化能力”的具有巨大臨床應(yīng)用前景的新型血管支架替代材料。