本發(fā)明涉及細胞電生理技術領域，尤其涉及一種熒光可見的電生理微電極結構及其制作方法。

背景技術：

細胞電生理技術，或膜片鉗技術，是以微弱電流信號測量為基礎的,使用微玻管電極接觸細胞膜，吸附并封接，使與電極尖開口處相接的細胞膜的小區(qū)域與其周圍在電學上分隔，對此膜片上的離子通道的pA級離子電流進行監(jiān)測記錄的方法。此技術對生物科學尤其是神經(jīng)科學具有重大意義，被稱為研究離子通道的“金標準”，獲得了1991年度的諾貝爾生理學與醫(yī)學獎。

隨著神經(jīng)電極，光遺傳等科學研究和技術的發(fā)展，對于特定神經(jīng)細胞和特定神經(jīng)通路的電信號傳導，以及活體的電生理研究引起了研究者的注意。然而，目前的技術面臨的問題是：用于進行細胞內(nèi)電生理記錄和測量的玻璃微電極，本身是透光的，且不具有熒光特性。雖然可以通過細胞染色等方式對待測的特定細胞或神經(jīng)通路進行精確標記，可微電極本身卻很難在熒光顯微鏡下進行定位和引導。如何制作出可以在熒光下可見，可定向引導，且電學性能良好的微電極成為了關鍵問題。

近年來，國內(nèi)外的科研工作者也在想方設法對微電極進行改進，現(xiàn)有技術中第一種對微電極進行改進的方案包括：通過量子點的方式在電極表面進行修飾，實現(xiàn)了熒光在多光子熒光顯微鏡下的可見，經(jīng)過測試，加工出的電極在腦組織內(nèi)部達到500微米的深度時，熒光依然可以被觀測。后續(xù)進行的特定神經(jīng)細胞體外和體內(nèi)的電生理實驗都證明了電極良好的熒光和電學性能。

上述現(xiàn)有技術中的第一種對微電極進行改進的方案的缺點為：采用了量子點的修飾，由于使用的是人工蘸取的加工方式，其工藝的重復性和效率，以及其生物兼容性都是值得探討的問題。

現(xiàn)有技術中第二種對微電極進行改進的方案包括：使用了熒光修飾蛋白涂敷電極，使用商用熒光修飾白蛋白作為標記物，利用熒光的引導實現(xiàn)了腦切片內(nèi)小于一微米尺度的軸突的接觸記錄。

上述現(xiàn)有技術中的第二種對微電極進行改進的方案的缺點為：同樣存在加工重復性和效率的問題，同時以生物蛋白作為熒光標記的穩(wěn)定性也有待提高。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的實施例提供了一種熒光可見的電生理微電極結構及其制作方法，以實現(xiàn)電生理微電極的熒光可見。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了如下技術方案。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種熒光可見的電生理微電極結構，包括：絕緣毛細管體、絕緣微米針尖和熒光涂敷層；

所述絕緣毛細管體為管狀中空結構，一端與所述絕緣微米針尖相連，另外一端裸露在外；

所述絕緣微米針尖為中空結構，與特定細胞進行吸附封接，與所述絕緣毛細管體共同形成毛細管內(nèi)的電學通路；

所述熒光涂敷層為薄膜結構，包裹在所述絕緣毛細管體和所述絕緣微米針尖上，所述熒光涂敷層具有熒光特性，形成電極的熒光標記。

進一步地，所述絕緣毛細管體在進行電生理操作時灌注導電細胞內(nèi)液，通過插入惰性Ag/AgCl電極與測量儀器連接。

進一步地，所述絕緣毛細管體和所述絕緣微米針尖的材料為玻璃，所述熒光涂敷層的材料為聚對二甲苯Parylene。

進一步地，所述絕緣毛細管體的長度為4cm至6cm，內(nèi)徑尺寸為毫米量級；所述絕緣微米針尖的開口范圍為1μm至3μm；所述熒光涂敷層的厚度范圍為200nm至1μm。

進一步地，所述熒光可見的電生理微電極與細胞進行吸附，形成吉歐封接，進行電生理測量記錄。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種熒光可見的電生理微電極的制作方法，包括：

步驟1：用超聲波清洗玻璃毛細管，去除所述玻璃毛細管的表面顆粒；

步驟2：對所述玻璃毛細管進行拉制，在所述玻璃毛細管上形成微米級電極針尖開口；

步驟3：對所述玻璃毛細管上的所述微米級電極針尖進行拋光，使得所述微米級電極針尖表面平整光滑；

步驟4：對拋光后的玻璃毛細管電極進行Parylene涂覆，通過化學氣相淀積的方式在玻璃毛細管電極的表面均勻且保形地生長Parylene，形成一層Parylene薄膜，并保證所述微米級針尖開口仍處于保留狀態(tài)；

步驟5：將帶有Parylene薄層的毛細管電極進行退火，退火溫度高于Parylene的玻璃化溫度，使得所述Parylene薄膜重結晶，得到熒光可見的電生理微電極。

進一步地，所述方法還包括：

將加工后的電生理微電極置于熒光顯微鏡下，通過UV/blue，blue/green和green/red的通道，觀察到所述電生理微電極的熒光發(fā)射，根據(jù)熒光的形貌判斷出所述電生理微電極的輪廓和針尖的所在位置。

進一步地，所述步驟4中的Parylene的制作方法，包括以下步驟：

步驟1：取Parylene的二聚體原料，通過控制所述Parylene的二聚體原料的重量調(diào)整淀積厚度，所述Parylene的二聚體原料的重量與淀積厚度的對應關系為1.6g/μm；

步驟2：將所述Parylene的二聚體原料和待淀積玻璃毛細管電極放入化學氣相淀積系統(tǒng)，抽真空至5mTorr以下；

步驟3：預熱所述化學氣相淀積系統(tǒng)的裂解爐管至690攝氏度；

步驟4：加熱所述化學氣相淀積系統(tǒng)的原料倉，使得Parylene的二聚體原料升華至氣態(tài)，進入690攝氏度的裂解爐管被裂解，裂解的Parylene的二聚體原料進入置有待淀積玻璃毛細管電極的室溫腔室，在玻璃毛細管電極的表面生長成為聚合物薄膜；直至所述原料倉的溫度升至175攝氏度，所有Parylene的二聚體原料蒸發(fā)完畢；

步驟5：將所述化學氣相淀積系統(tǒng)內(nèi)各加熱部件降至室溫，放掉系統(tǒng)真空，打開腔室，取出帶有Parylene薄層的玻璃毛細管微電極。

進一步地，所述步驟5中的將帶有Parylene薄層的毛細管電極進行退火，退火溫度高于Parylene的玻璃化溫度，使得所述Parylene薄膜重結晶，得到熒光可見的電生理微電極，包括：

步驟1：將帶有Parylene薄層的玻璃毛細管微電極置于退火爐內(nèi)，爐管內(nèi)通入氮氣，氮氣流量為4.5L/min，形成惰性環(huán)境；或者，對所述退火爐進行抽真空，形成惰性環(huán)境；

步驟2：設置退火程序，退火溫度高于Parylene的玻璃化溫度，從室溫開始的升溫時間為30min，退火時間為60min以上；

步驟3：運行退火程序，退火程序結束后，繼續(xù)對所述退火爐維持氮氣供給；或者，繼續(xù)對所述退火爐進行抽真空，直至所述退火爐的溫度降至室溫后，再將所述玻璃毛細管微電極取出。

由上述本發(fā)明的實施例提供的技術方案可以看出，本發(fā)明實施例通過利用了Parylene材料退火后良好的自發(fā)熒光特性，解決了電生理微電極的熒光觀察問題，相較于背景技術中提及到的其它改良方法，具有良好的化學穩(wěn)定性，生物兼容性和熒光可見能力。通過微電子工藝加工的方式，其成本低廉，加工重復性好，形貌控制均勻，成品率高，可批量生產(chǎn)。

本發(fā)明附加的方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，這些將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例提供的一種熒光可見的電生理微電極的結構示意圖；

圖2為本發(fā)明實施例提供的一種熒光可見的電生理微電極的加工流程示意圖。

附圖標示：1.絕緣毛細管體，2.絕緣微米針尖，3.熒光涂敷層；4.玻璃毛細管，5.玻璃毛細管電極，6.熒光可見的電生理微電極，7.熒光顯微鏡視野，8.目標細胞。

具體實施方式

下面詳細描述本發(fā)明的實施方式，所述實施方式的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施方式是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能解釋為對本發(fā)明的限制。

本技術領域技術人員可以理解，除非特意聲明，這里使用的單數(shù)形式“一”、“一個”、“所述”和“該”也可包括復數(shù)形式。應該進一步理解的是，本發(fā)明的說明書中使用的措辭“包括”是指存在所述特征、整數(shù)、步驟、操作、元件和/或組件，但是并不排除存在或添加一個或多個其他特征、整數(shù)、步驟、操作、元件、組件和/或它們的組。應該理解，當我們稱元件被“連接”或“耦接”到另一元件時，它可以直接連接或耦接到其他元件，或者也可以存在中間元件。此外，這里使用的“連接”或“耦接”可以包括無線連接或耦接。這里使用的措辭“和/或”包括一個或更多個相關聯(lián)的列出項的任一單元和全部組合。

本技術領域技術人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術語(包括技術術語和科學術語)具有與本發(fā)明所屬領域中的普通技術人員的一般理解相同的意義。還應該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術語應該被理解為具有與現(xiàn)有技術的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。

為便于對本發(fā)明實施例的理解，下面將結合附圖以幾個具體實施例為例做進一步的解釋說明，且各個實施例并不構成對本發(fā)明實施例的限定。

Parylene(聚對二甲苯)材料是一種微加工工藝兼容的有機物，可以通過化學氣相淀積的形式形成百納米至數(shù)十微米的保形性薄膜，同時還具有優(yōu)異的物化特性和生物兼容性，尤其是其電學絕緣性，達到了8.8×10¹⁶Ω·cm，可以與玻璃相比擬。在生物兼容程度方面，Parylene材料可以進行人體植入，這一點也經(jīng)過了美國食品藥品管理局(FDA)的認證。由于Parylene材料其具有特殊的苯環(huán)和碳鏈結構，其熒光特性也由于干擾生物實驗測量等原因逐漸被發(fā)現(xiàn)和報道。本發(fā)明正是利用了Parylene的材料特性，通過微加工的技術實現(xiàn)了Parylene的均勻涂敷，且通過熱退火的方式Parylene材料重結晶，顯著增強了熒光強度，使其達到了微尺度鏡下可見的效果。

圖1為本發(fā)明實施例提供的一種熒光可見的電生理微電極的結構圖，包括：絕緣毛細管體1、絕緣微米針尖2和熒光涂敷層3。其中絕緣毛細管體1是微電極的主體結構，一端與拉制出的絕緣微米針尖2相連，另外一端裸露在外，用于在電生理操作時灌注導電細胞內(nèi)液。在絕緣毛細管體1上插入惰性Ag/AgCl電極與測量儀器，形成電連接。

絕緣微米針尖2為中空結構，具有1至3微米量級的開口，用于與特定細胞進行吸附封接，與絕緣毛細管體1共同形成毛細管內(nèi)的電學通路。

熒光涂敷層3為百納米量級的薄膜結構，均勻包裹在絕緣毛細管體1和絕緣微米針尖2上，所述熒光涂敷層具有熒光特性，形成電極的熒光標記，在熒光顯微鏡的各通道下可見。熒光涂敷層3的材料為Parylene，生物兼容性和電學絕緣性都極佳，一方面便于與細胞接觸，一方面作為電極外材料，抗干擾能力增強。

圖2為本發(fā)明實施例提供的一種熒光可見的電生理微電極結構的加工流程，包括以下步驟：

步驟1、取外徑1.5mm、內(nèi)徑0.86mm和長度10mm的硼硅酸鹽玻璃毛細管4，用超聲對硼硅酸鹽玻璃毛細管4進行清洗，去除表面顆粒，以備進入超凈工藝環(huán)境；

步驟2、對玻璃毛細管4進行拉制，采用兩步法進行拉制，加熱溫度分別設置為660和530攝氏度，最終形成具有1μm至3μm針尖開口的玻璃毛細管微電極5；

步驟3、對拉制后的玻璃毛細管微電極5進行拋光，使得針尖表面平整光滑，為后續(xù)包覆工藝提供優(yōu)質(zhì)表面，便于與目的細胞形成電學封接；

步驟4、對拋光后的玻璃毛細管電極5進行Parylene涂覆，通過化學氣相淀積的方式在玻璃毛細管微電極5的表面均勻且保形地生長Parylene，形成一層小于1微米的薄膜，并保證微米級針尖開口仍處于保留狀態(tài)；

上述Parylene的涂覆制作方法為：

a)取Parylene的二聚體原料，重量約為0.8g，根據(jù)目標的淀積厚度，可通過控制原料重量調(diào)整淀積厚度，上述Parylene的二聚體原料的重量與厚度的對應關系為1.6g/μm；

b)將Parylene的二聚體原料和待淀積玻璃毛細管電極5放入化學氣相淀積系統(tǒng)，抽真空至5mTorr以下，以保證薄膜的生長質(zhì)量；

c)預熱化學氣相淀積系統(tǒng)的裂解爐管，至690攝氏度，即原料的裂解溫度；

d)緩慢加熱化學氣相淀積系統(tǒng)的原料倉，使得Parylene的二聚體原料升華至氣態(tài)，進入690攝氏度的爐管被裂解。之后，裂解的Parylene的二聚體原料進入置有待淀積玻璃毛細管電極的室溫腔室，在玻璃毛細管電極的表面生長成為聚合物薄膜；在生長過程中，通過調(diào)節(jié)原料倉的加熱溫度，控制系統(tǒng)真空在21mTorr附近，保證Parylene淀積的速率和質(zhì)量；直至原料倉溫度升至175攝氏度，所有原料蒸發(fā)完畢；

e)將化學氣相淀積系統(tǒng)內(nèi)各加熱部件降至室溫，放掉系統(tǒng)真空，打開腔室，取出帶有Parylene薄層的玻璃毛細管微電極。

以上各條件參數(shù)僅作為參考，實際加工過程中可以根據(jù)需要加工出的Parylene的厚度和特性進行適當調(diào)整改變。

步驟5、將帶有Parylene薄層的玻璃毛細管微電極進行退火，退火溫度高于Parylene的玻璃化溫度，時間大于1小時，使得表面Parylene層重結晶，提升薄層的結晶度，從而增強表層Parylene的熒光。

上述玻璃毛細管微電極的退火過程包括：

a)將帶有Parylene薄層的玻璃毛細管微電極置于退火爐內(nèi)，爐管內(nèi)通入氮氣，氮氣流量為4.5L/min，以形成惰性環(huán)境(也可以通過抽真空來實現(xiàn))；

b)設置退火程序，退火溫度為270攝氏度，從室溫開始的升溫時間為30min，退火時間為60min以上；

c)運行退火程序，退火程序結束后繼續(xù)維持氮氣供給(或真空)，直至爐內(nèi)溫度降至室溫后，再將微電極取出，以防Parylene薄膜被氧化或老化；

步驟6、將加工出的熒光可見的電生理微電極6置于熒光顯微鏡視野7下，通過UV/blue，blue/green和green/red的通道，可觀察到該熒光可見的電生理微電極6的熒光發(fā)射，根據(jù)熒光的形貌判斷出微電極的輪廓和針尖的所在位置。利用熒光引導和定位，可與目標細胞8形成封接測量。

綜上所述，本發(fā)明實施例通過利用了Parylene材料退火后良好的自發(fā)熒光特性，解決了玻璃電極的熒光觀察問題，相較于背景技術中提及到的其它改良方法，具有良好的化學穩(wěn)定性，生物兼容性和熒光可見能力。通過微電子工藝加工的方式，其成本低廉，加工重復性好，形貌控制均勻，成品率高，可批量生產(chǎn)。

本發(fā)明實施例的熒光可見的電生理微電極的加工采用了化學氣相淀積的方式來進行涂覆。簡化了熒光修飾的工藝過程和人工操作，最終得到的微電極針尖的開口可由淀積厚度來決定，工藝控制精確，適用范圍廣。

本領域普通技術人員可以理解：附圖只是一個實施例的示意圖，附圖中的模塊或流程并不一定是實施本發(fā)明所必須的。

本說明書中的各個實施例均采用遞進的方式描述，各個實施例之間相同相似的部分互相參見即可，每個實施例重點說明的都是與其他實施例的不同之處。尤其，對于裝置或系統(tǒng)實施例而言，由于其基本相似于方法實施例，所以描述得比較簡單，相關之處參見方法實施例的部分說明即可。以上所描述的裝置及系統(tǒng)實施例僅僅是示意性的，其中所述作為分離部件說明的單元可以是或者也可以不是物理上分開的，作為單元顯示的部件可以是或者也可以不是物理單元，即可以位于一個地方，或者也可以分布到多個網(wǎng)絡單元上?？梢愿鶕?jù)實際的需要選擇其中的部分或者全部模塊來實現(xiàn)本實施例方案的目的。本領域普通技術人員在不付出創(chuàng)造性勞動的情況下，即可以理解并實施。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求的保護范圍為準。