本發(fā)明屬于糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的防治技術(shù)領(lǐng)域，涉及川芎嗪防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)是最常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。糖皮質(zhì)激素在臨床上被廣泛應(yīng)用于包括免疫性及炎性等各種專科疾病，然而其導(dǎo)致的副作用不容忽視。長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素使患者骨量丟失、骨組織結(jié)構(gòu)改變和生物力學(xué)性能減退，引起糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松，極易發(fā)生骨折，嚴重威脅中老年人的身心健康。

骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)在維持骨組織動態(tài)平衡中有關(guān)鍵作用，在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過程中扮演重要角色。高濃度糖皮質(zhì)激素可以抑制BMSCs成骨分化，造成BMSCs和成骨細胞凋亡，延長破骨細胞生存時間，導(dǎo)致骨吸收和骨形成失衡，引起骨微結(jié)構(gòu)改變和骨密度下降。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)自噬(autophagy)是真核細胞中廣泛存在的一種降解性代謝生理過程。自噬利用溶酶體選擇性地清除、降解自身受損、衰老或過剩的生物大分子和細胞器，釋放出游離小分子供細胞回收利用，對于細胞在惡劣的微環(huán)境下維持自我穩(wěn)態(tài)和生存必不可少，在許多疾病的病理過程中起重要作用。

川芎是一種具有高度生物活性的藥用植物，廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)中藥中。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是其主要活性成分，川芎的大部分功效是通過川芎嗪發(fā)揮的。川芎嗪具有多項生理功能：擴血管、抗氧化、改善微循環(huán)和抗凋亡等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供川芎嗪防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的應(yīng)用。

為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

川芎嗪在制備用于防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)用。

含川芎嗪的植物提取物在制備用于防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)用。

川芎嗪在制備用于抗骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。

川芎嗪在制備用于調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞自噬的藥物中的應(yīng)用。

川芎嗪在制備用于抗骨髓間充質(zhì)干細胞分化抑制的藥物中的應(yīng)用。

川芎嗪在制備用于提高骨髓間充質(zhì)干細胞中ALP活性的藥物中的應(yīng)用。

川芎嗪在制備用于提高骨髓間充質(zhì)干細胞中促成骨分化基因Alp、Col1a1、Ocn及Osx表達水平的藥物中的應(yīng)用。

川芎嗪在制備用于提高糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥患者骨量的藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

川芎嗪對骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)無毒性作用；對糖皮質(zhì)激素引起的BMSCs凋亡具有保護作用；可以增強糖皮質(zhì)激素作用下BMSCs自噬活性；對BMSCs成骨分化抑制具有保護作用。在糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松大鼠模型中，川芎嗪可以減少體內(nèi)BMSCs的凋亡并增強自噬活性，改善股骨遠端和腰椎的松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)，提高股骨遠端的骨形成率。

BMSCs是成骨細胞的來源，鑒于川芎嗪對BMSCs存活以及凋亡的作用，其對成骨細胞形成具有保護作用，促進骨形成，最終起到防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的作用。糖皮質(zhì)激素腹腔注射大鼠模型為常用的糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松模型，通過連續(xù)腹腔注射給與不同劑量川芎嗪，明顯減少了體內(nèi)BMSCs的凋亡并增強了自噬，對松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)有保護作用，表明其能夠發(fā)揮預(yù)防及治療糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的作用。

川芎嗪為純天然物質(zhì)，用藥較安全，毒副作用小。

因此，川芎嗪可應(yīng)用于糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的防治，尤其是應(yīng)用在防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥藥物的制備中。

附圖說明

圖1-1為不同濃度川芎嗪對細胞增殖(Cell viability)作用的影響。

圖1-2為川芎嗪對糖皮質(zhì)激素造成的細胞凋亡(Apoptosis)的保護作用。

圖2為川芎嗪增強糖皮質(zhì)激素作用下細胞自噬水平的檢測結(jié)果；第二行圖(左下角比例尺為0.5μm)為第一行圖(左下角比例尺為2μm)中局部(矩形框部分)放大。

圖3-1為川芎嗪在糖皮質(zhì)激素作用后，對細胞堿性磷酸酶活性(ALP activity)的作用。

圖3-2為川芎嗪在糖皮質(zhì)激素作用后，對細胞基質(zhì)鈣鹽沉積的作用；a.成骨誘導(dǎo)液對照組，b.高濃度地塞米松組，c.川芎嗪處理組(50μM)，d.川芎嗪處理組(100μM)，e.川芎嗪處理組(200μM)。

圖3-3為川芎嗪對4種細胞成骨分化基因表達水平的影響。

圖4-1為川芎嗪減少GIOP大鼠體內(nèi)BMSCs凋亡的作用。

圖4-2為川芎嗪增強GIOP大鼠體內(nèi)BMSCs自噬的作用。

圖5-1為川芎嗪改善GIOP大鼠股骨遠端松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)的Micro-CT結(jié)果；第一行為冠狀面，第二行為橫截面。

圖5-2為川芎嗪提高GIOP大鼠股骨遠端的骨形成率(Bone formation rate)的檢測結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。

原代骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)可以向成骨細胞進行分化，是研究成骨作用和骨量平衡較常用的細胞模型。10^-6M地塞米松(dexamethasone,Dex)處理可以較好地模擬體外高濃度糖皮質(zhì)激素損傷模型。出于觀察川芎嗪對成骨作用的影響，及其抗糖皮質(zhì)激素損傷的作用，所以選擇BMSCs作為細胞模型，地塞米松處理為體外糖皮質(zhì)激素模型。潑尼松龍腹腔注射大鼠模型作為動物模型，是常用的模擬糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松(GIOP)模型。

1、川芎嗪對糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致BMSCs凋亡的保護作用

1.1川芎嗪對細胞的毒性作用

將BMSCs以每孔2×10³個接種到96孔板上，待細胞長滿后，棄掉培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分為：α-MEM培養(yǎng)液+10％胎牛血清+1％青鏈霉素)，加含濃度0μM(空白對照組，Control)、10μM、100μM或1mM川芎嗪的無血清培養(yǎng)基至孔板中，分別培養(yǎng)24h和72h，觀察川芎嗪對細胞增殖作用的影響。在觀察點，利用CCK-8試劑對細胞活性進行檢測。

結(jié)果如圖1-1所示，橫坐標(biāo)為不同濃度的川芎嗪作用時間，縱坐標(biāo)為細胞活力值，以各組的吸光度OD值同空白對照組的OD值進行比較的百分數(shù)來表述。由圖可見，不同濃度的川芎嗪在觀察時間內(nèi)，對細胞的增殖并無明顯影響。

1.2川芎嗪對糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致BMSCs凋亡的保護作用

分組情況：空白對照組(不加地塞米松和川芎嗪，Control)；單純地塞米松處理組(Dex組)；50μM川芎嗪+10^-6M地塞米松(Dex+TMP 50μM組)；100μM川芎嗪+10^-6M地塞米松(Dex+TMP 100μM組)；200μM川芎嗪+10^-6M地塞米松(Dex+TMP 200μM組)。

將BMSCs以每孔2.5×10⁵個接種到6孔板上，待細胞長滿后，棄掉培養(yǎng)基，加入10^-6M地塞米松，培養(yǎng)24h，再加入含濃度0、50、100、200μM川芎嗪的無血清培養(yǎng)基至孔板中，培養(yǎng)48h，收集后以流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率。

結(jié)果如圖1-2所示，第一、四象限(B2、B4)為Annexin陽性細胞，可視為凋亡細胞。由圖可見，單純地塞米松作用后，細胞凋亡增加，經(jīng)不同濃度川芎嗪作用后細胞凋亡減少，同單純地塞米松處理組相比，具有統(tǒng)計學(xué)差異。統(tǒng)計圖中的*號表示：同空白對照組相比，**為P＜0.01；圖中的#號表示：同單純地塞米松處理組相比，^#為P<0.05，^##為P<0.01。這表明用川芎嗪處理后能夠保護高濃度糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致BMSCs的凋亡。

綜上所述，高濃度糖皮質(zhì)激素處理BMSCs后，用不同濃度川芎嗪對BMSCs細胞進行干預(yù)，通過CCK-8細胞活性檢測，結(jié)果表明單純糖皮質(zhì)激素作用可造成細胞凋亡。而50、100、200μM川芎嗪處理對糖皮質(zhì)激素這種損傷具有保護作用。因此，川芎嗪對糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的細胞凋亡具有保護作用。

2、川芎嗪增強糖皮質(zhì)激素作用下細胞自噬水平

分組情況：空白對照組(不加地塞米松和川芎嗪，Control)；單純10^-6M地塞米松處理組(Dex組)；50μM川芎嗪+10^-6M地塞米松處理組(Dex+TMP 50μM組)。

將BMSCs以每孔2.5×10⁵個接種到6孔板上，待細胞長滿后，棄掉培養(yǎng)基，加入10^-6M地塞米松，培養(yǎng)24h，再加入含濃度0、50μM川芎嗪的無血清培養(yǎng)基至孔板中，培養(yǎng)48h，刮下細胞收集。固定液固定后脫水，包埋，超薄切片機超薄切片，在透射電鏡下觀察自噬小體。

結(jié)果如圖2所示，黑色箭頭所指為自噬小體，即自噬發(fā)生的形態(tài)學(xué)標(biāo)志物。單純10^-6M地塞米松處理使細胞中產(chǎn)生自噬小體，而加入川芎嗪處理后，自噬小體的數(shù)量、體積均顯著增加。此結(jié)果表明川芎嗪能夠讓受到糖皮質(zhì)激素應(yīng)激產(chǎn)生的自噬水平明顯增加，從而增強BMSCs抵御外界刺激及生存能力。因此，川芎嗪具有調(diào)控糖皮質(zhì)激素作用下BMSCs自噬水平的作用。

3、川芎嗪對高濃度糖皮質(zhì)激素造成BMSCs成骨分化抑制的保護作用

分組情況：單純成骨誘導(dǎo)液對照組；10^-6M地塞米松+成骨誘導(dǎo)液處理組(高濃度地塞米松組)；50μM川芎嗪+10^-6M地塞米松+成骨誘導(dǎo)液處理組；100μM川芎嗪+10^-6M地塞米松+成骨誘導(dǎo)液處理組；200μM川芎嗪+10^-6M地塞米松+成骨誘導(dǎo)液處理組。

將BMSCs以每孔2.5×10⁵個接種到6孔板上，長滿后加入成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)。誘導(dǎo)后第14天，加入10^-6M地塞米松處理24h，再分別給予0、50、100、200μM川芎嗪處理48h。

3.1根據(jù)堿性磷酸酶定量試劑盒進行堿性磷酸酶(ALP)定量，充分裂解細胞后，提取蛋白。測定蛋白濃度，然后按照試劑盒使用說明，進行ALP定量檢測。

結(jié)果如圖3-1所示，橫坐標(biāo)為分組情況，縱坐標(biāo)為ALP定量值，以各組的吸光度OD值同單純成骨誘導(dǎo)液對照組的OD值進行比較的百分數(shù)來表述。高濃度地塞米松作用后，細胞ALP活性表達同單純誘導(dǎo)液對照組相比顯著下降，而各濃度川芎嗪作用后，ALP活性表達升高，同高濃度地塞米松處理組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。圖中的*號表示：同單純成骨誘導(dǎo)液對照組相比，**為P＜0.01；圖中的#號表示：同10^-6M地塞米松+成骨誘導(dǎo)液處理組相比，^#為P<0.05，^##為P<0.01。ALP為成骨細胞分化中期的關(guān)鍵表達蛋白，為檢測成骨細胞分化的特異性指標(biāo)，高濃度糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致ALP活性降低，對成骨分化有抑制作用，但經(jīng)川芎嗪作用后，ALP表達增加，改善了高濃度糖皮質(zhì)激素對BMSCs成骨分化的抑制作用。

3.2鈣化結(jié)節(jié)染色：用PBS緩沖液沖洗培養(yǎng)細胞，多聚甲醛固定后，1％茜素紅染色30min，用水沖洗5次，倒置顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)沉積，分析并拍照。

結(jié)果如圖3-2所示，高濃度地塞米松作用后鈣化結(jié)節(jié)形成較少，但是川芎嗪干預(yù)處理后，結(jié)節(jié)面積明顯增加。鈣結(jié)節(jié)形成為成骨分化的礦化階段，高濃度糖皮質(zhì)激素可以抑制成骨細胞分化，而川芎嗪可以改善糖皮質(zhì)激素對BMSCs分化造成的抑制。

3.3成骨基因的RT-PCR檢測：用Trizol裂解細胞，提取細胞內(nèi)的mRNA，根據(jù)實時定量RT-PCR的程序，對目的基因Alp、Col1a1、Ocn及Osx進行定量檢測。

結(jié)果如圖3-3所示，橫坐標(biāo)為分組處理情況，縱坐標(biāo)為mRNA的相對表達水平(Relative fold expression)，以各組相對于單純誘導(dǎo)液對照組的百分率來表述。由圖可見，高濃度地塞米松作用后，細胞成骨分化基因Alp、Col1a1、Ocn及Osx表達水平下降，而各濃度川芎嗪處理后，成骨基因表達顯著增加。圖中的*號表示：同單純成骨誘導(dǎo)液對照組相比，*為P＜0.05，**為P＜0.01；圖中的#號表示：同10^-6M地塞米松+成骨誘導(dǎo)液處理組相比，^#為P<0.05，^##為P<0.01。Alp、Col1a1、Ocn及Osx基因分別為成骨細胞分化中期和后期的關(guān)鍵基因，決定著細胞的分化水平。高濃度糖皮質(zhì)激素抑制成骨分化基因的表達，而川芎嗪作用后，成骨分化基因表達上調(diào)，說明川芎嗪可以改善糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的BMSCs成骨分化抑制。

綜合以上表明：川芎嗪(TMP)對骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)無毒性作用，不影響細胞增殖；對高濃度糖皮質(zhì)激素造成的BMSCs的凋亡具有保護作用；對糖皮質(zhì)激素作用下BMSCs自噬水平有增強作用；對高濃度糖皮質(zhì)激素造成的BMSCs成骨分化抑制具有保護作用。川芎嗪在體外對高濃度糖皮質(zhì)激素造成的BMSCs的一系列損傷能夠發(fā)揮保護作用，從而達到預(yù)防及治療糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的效果。

4、川芎嗪對糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松(GIOP)動物模型中BMSCs凋亡與自噬的影響

GIOP大鼠模型的建立：

40只4月大Sprague-Dawley雌性大鼠，體重為223±18.5g。本實驗中四組大鼠的初始體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異。將大鼠置于實驗室條件下1周(即通氣良好的20℃恒溫環(huán)境中，每12小時光照與黑暗交替，水糧足量，自由取用)。適應(yīng)1周后，每天腹腔注射等體積的蒸餾水(無處理對照組，Control，n＝10)或5mg/kg潑尼松龍(模型組，n＝30)。首次注射后一周開始，將30只模型組大鼠隨機分成3個實驗組，每天分別增加注射等體積的芝麻油(安慰劑對照，即GIOP處理組，n＝10)，5mg/kg(n＝10)或20mg/kg(n＝10)的川芎嗪溶液。共注射12周。

分組情況：無處理對照組；GIOP處理組(GIOP組)；GIOP+5mg/kg川芎嗪處理組(GIOP+TMP(5)組)；GIOP+20mg/kg川芎嗪處理組(GIOP+TMP(20)組)。

4.1注射給藥完成后，分別從各組大鼠中取原代BMSCs培養(yǎng)，取第一代細胞，收集后以流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率。

結(jié)果如圖4-1所示，第一、四象限為Annexin陽性細胞，可視為凋亡細胞。由圖可見，GIOP處理組中BMSCs凋亡增加，而兩種濃度的川芎嗪給藥組均使細胞凋亡明顯減少，與GIOP處理組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。統(tǒng)計圖中的*號表示：與無處理對照組相比，**為P＜0.01；圖中的#號表示：與GIOP處理組相比，^#為P<0.05，^##為P<0.01。這表明川芎嗪能夠減少GIOP大鼠體內(nèi)BMSCs的凋亡。

4.2注射給藥完成后，分別從各組大鼠中取原代BMSCs培養(yǎng)，取第一代細胞，收集后固定液固定，脫水，包埋，超薄切片機超薄切片，在透射電鏡下觀察自噬小體。

結(jié)果如圖4-2所示，GIOP處理組中BMSCs自噬小體相比無處理對照組有所增加，而兩種濃度的川芎嗪給藥組相比GIOP處理組自噬小體顯著增多。這表明川芎嗪增強了GIOP大鼠體內(nèi)BMSCs的自噬水平。

綜上所述，川芎嗪能夠作用于GIOP大鼠體內(nèi)的BMSCs，減少了GIOP狀態(tài)下BMSCs的凋亡，能夠上調(diào)自噬水平從而保護細胞。此結(jié)果印證了以上體外實驗的結(jié)論。

5、川芎嗪對糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松(GIOP)動物模型骨量的影響

分組情況參照部分4：無處理對照組；GIOP處理組；GIOP+5mg/kg川芎嗪處理組；GIOP+20mg/kg川芎嗪處理組。

5.1動物模型給藥完成后，提取每只大鼠的左側(cè)股骨，清除粘連的肌肉組織，妥善固定。顯微CT檢測骨微結(jié)構(gòu)：股骨遠端的骨微結(jié)構(gòu)通過探索軌跡SP預(yù)臨床標(biāo)本顯微CT進行檢測。分辨率為8mm，管電壓為50kV，管電流為0.1mA。通過一個桌面顯微CT處理軟件進行重建和3D定量分析。所有標(biāo)本的掃描環(huán)境和分析方法相同。股骨掃描區(qū)域限定為遠端干垢端，并且向近端的初級松質(zhì)近末端區(qū)域延伸2.0mm。在這些待掃描的區(qū)域中，松質(zhì)骨與皮質(zhì)骨的分界為內(nèi)皮質(zhì)骨面。選定的感興趣區(qū)的3D參數(shù)用于數(shù)據(jù)分析，包括：骨礦物質(zhì)密度、連接密度、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨小梁分離度和相對骨體積分數(shù)。進行掃描分析的操作者對標(biāo)本的處理過程單盲。

結(jié)果如圖5-1所示，相對于無處理對照組，潑尼松龍注射導(dǎo)致了大鼠松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)的損害，表現(xiàn)為骨礦物質(zhì)密度、連接密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度及相對骨體積分數(shù)的下降；同時，股骨結(jié)構(gòu)模型指數(shù)和骨小梁分離度明顯提高。結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異。然而，兩種劑量的川芎嗪給藥明顯逆轉(zhuǎn)了糖皮質(zhì)激素引起的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化趨勢，起到保持股骨遠端小梁骨骨量的作用。因此，川芎嗪能夠?qū)μ瞧べ|(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥發(fā)揮預(yù)防及治療作用。

5.2鈣黃綠素雙標(biāo)記法檢測骨形成率(bone formation rate)：動物模型給藥完成后，在大鼠處死前的第12天和第2天腹腔注射5mg/kg鈣黃綠素進行熒光素標(biāo)記。處死大鼠后取左側(cè)股骨，依次進行固定、脫水、包埋和切片。在熒光顯微鏡下測定兩次鈣黃綠素標(biāo)線間的距離。應(yīng)用骨形態(tài)學(xué)測量系統(tǒng)軟件計算得到骨形成率。

結(jié)果如圖5-2所示，新生骨被標(biāo)記上了鈣黃綠素?zé)晒狻Ｏ鄬τ跓o處理對照組，GIOP處理組的骨形成率明顯降低。而兩種劑量川芎嗪干預(yù)后，骨形成率明顯升高。結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異。統(tǒng)計圖中的*號表示：與無處理對照組相比，**為P＜0.01；圖中的#號表示：與GIOP處理組相比，^##為P<0.01。因此，川芎嗪能夠通過提高骨形成率而起到保護GIOP大鼠松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)的作用。

總之，川芎嗪可應(yīng)用于糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的防治，尤其是在防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥藥物的制備中應(yīng)用。而川芎嗪是川芎中主要活性成分之一，那么含有川芎嗪的川芎提取物也具有相應(yīng)的應(yīng)用。