本發(fā)明涉及一種治療骨質(zhì)疏松性骨折的中藥復(fù)方制劑,此外,本發(fā)明還涉及該中藥復(fù)方制劑的制備方法和醫(yī)藥用途。
背景技術(shù):
骨質(zhì)疏松性骨折是骨質(zhì)疏松癥的嚴(yán)重并發(fā)癥,常在輕微外力作用下即可造成全身各部位骨折,多發(fā)于脊柱、髖部和橈尺骨遠(yuǎn)端,其他部位也易發(fā)生骨折,常可引起骨折部位疼痛、畸形、功能障礙,脊柱骨折還可引起身高變矮、駝背等。
隨著我國人口老齡化,原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率也呈現(xiàn)明顯的上升趨勢,造成的骨質(zhì)疏松性骨折也越來越多。對(duì)于骨質(zhì)疏松性骨折的治療,主要分為非手術(shù)和手術(shù)治療,但由于骨質(zhì)疏松癥患者自身成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞藕聯(lián)關(guān)系的失衡,其骨折愈合的時(shí)間延遲,甚至不愈合,預(yù)后質(zhì)量也較正常者差,易導(dǎo)致再次手術(shù)或二次骨折風(fēng)險(xiǎn),給患者軀體、精神、經(jīng)濟(jì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。因此,還需結(jié)合系統(tǒng)性管理、抗骨質(zhì)疏松治療(西藥、中藥、物理療法、康復(fù)訓(xùn)練、運(yùn)動(dòng)療法)。
中醫(yī)藥在防治骨質(zhì)疏松癥方面具有重要作用和獨(dú)有特色。但由于骨質(zhì)疏松性骨折多發(fā)于中老年人,非手術(shù)治療的重要原則是長期固定制動(dòng),一定程度上增加了褥瘡、深靜脈血栓、肺部感染及心腦血管病等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn),其危害性甚至超過了骨折本身。因此就骨質(zhì)疏松性骨折的首選療法而言,中醫(yī)藥相對(duì)于現(xiàn)代手術(shù)治療就沒有那么明顯的優(yōu)勢。不過,骨質(zhì)疏松性骨折再次骨折的發(fā)生率相對(duì)較高,必須堅(jiān)持抗骨質(zhì)疏松治療,西藥、中藥均可作為主要輔助手段。雖然手術(shù)可解決骨折部位的復(fù)位、固定及早期康復(fù)鍛煉,但由于老年人體質(zhì)因素較弱、基礎(chǔ)疾病較多,仍會(huì)有骨折延遲愈合及不愈合的發(fā)生,通過中醫(yī)藥的對(duì)癥處理和整體調(diào)節(jié),可充分發(fā)揮中醫(yī)藥的特色優(yōu)勢。
脾腎陽虛證是原發(fā)性骨質(zhì)疏松性骨折的重要證型之一,因此,本發(fā)明選用施杞教授臨診中的經(jīng)驗(yàn)方——健脾補(bǔ)腎方,通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn),運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)手段進(jìn)行研究,結(jié)合―先后天之本”、―脾腎相關(guān)”中醫(yī)理論,以闡明健脾補(bǔ)腎方促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合的作用機(jī)制及療效分析,進(jìn)而為臨床醫(yī)師在診治該病時(shí)提供一定的理論指導(dǎo)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足,根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,希望提出一種療效確切、安全性高的治療骨質(zhì)疏松性骨折的中藥復(fù)方制劑——健脾補(bǔ)腎方,并提出其制備方法和醫(yī)藥用途。
本發(fā)明所涉及的中藥藥材質(zhì)量均應(yīng)符合中國藥典2015年版一部相應(yīng)藥材項(xiàng)下各有關(guān)規(guī)定。其中:
黨參為為桔梗科植物黨參codonopsispilosula(franch.)nannf.、素花黨參codonopsispilosulanannf.var.modesta(nannf.)l.t.shen或川黨參codonopsistangshenoliv.的干燥根。
刺五加為五加科植物刺五加acanthopanaxsenticosus(rupr.etmaxim.)harms的干燥根及根莖或莖。
骨碎補(bǔ)為為水龍骨科植物槲蕨drynariafortunei(kunze)j.sm.的干燥根莖。
淫羊藿為小檗科植物淫羊藿epimediumbrevicornumaxim的干燥葉。
丹參為為唇形科植物丹參salviamiltiorrhizabge.的干燥根和根莖。
獨(dú)活為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸angelicapubescensmaxim.f.biserratashanetyuan的干燥根。
具體而言,本發(fā)明治療骨質(zhì)疏松性骨折的中藥復(fù)方制劑,由上述健脾補(bǔ)腎中藥與藥物輔料制成,所述健脾補(bǔ)腎中藥的重量份配比如下:黨參6-30,刺五加6-30,骨碎補(bǔ)6-30,淫羊藿6-30,丹參6-15,獨(dú)活3-12。
本發(fā)明中藥復(fù)方制劑的健脾補(bǔ)腎中藥經(jīng)過乙醇或水溶劑提取和醇沉、濾過的方法純化,其中所采用的提取方法是根據(jù)藥物中有效成分的理化性質(zhì),選用醇沉、濾過的提取溶劑和提取條件;所采用的純化方法在保證療效的前提下,選用乙醇沉淀法經(jīng)行純化處理。
本發(fā)明提供了上述中藥復(fù)方制劑的制備方法。
本發(fā)明中藥復(fù)方制劑通過下述方法和步驟制備:
①按組方重量稱取各藥材,浸泡1h,煎煮1~3次,每次煎煮0.5~1.5h,一煎加水10~14倍,二、三煎加水量6~10倍,合并煎煮液,濾過,在60~70℃溫度下,濾液濃縮至相對(duì)密度為1.05~1.30的浸膏。其中,優(yōu)選煎煮2次,每次煎煮1h,一煎加水14倍,二煎加水量10倍,合并煎煮液,濾過,優(yōu)選濾過液濃縮至相對(duì)密度為1.05~1.07的浸膏液;
②上述①浸膏液中加入乙醇,至乙醇濃度為50%~80%,優(yōu)選加乙醇至濃度為60%;靜置過夜,醇沉。濾過,濾液在60~70℃溫度下回收乙醇,并濃縮至相對(duì)密度為1.35~1.40的濃浸膏;
③上述②濃浸膏在70~80℃時(shí)減壓干燥,粉碎成細(xì)粉,過60目篩,即得浸膏粉;
④按照浸膏粉:填充劑:崩解劑=12:5:1重量比例配比(浸膏粉,微晶纖維素101,交聯(lián)羧甲基纖維素納),取上述③制得的組分,加入上述比例的填充劑、崩解劑?;靹?,采用干法制粒,壓制成片,包薄膜衣,制成成品片劑,即得。
本發(fā)明中藥復(fù)方制劑的制備方法,采用了水提取法并優(yōu)選了煎煮次數(shù)、時(shí)間和加水量,并優(yōu)選了醇沉的密度和乙醇濃度經(jīng)行醇沉純化,最大限度的提取有效成分并去除雜質(zhì),在減壓低溫條件下濃縮、干燥,同時(shí)對(duì)干燥方法及條件、制劑成型工藝的輔料、制粒方法及條件等經(jīng)行考查、篩選,優(yōu)選出適合于工業(yè)化的制備工藝。
本發(fā)明中藥復(fù)方制劑可按常規(guī)方法制成各種口服制劑,包括片劑、顆粒劑、膠囊、合劑、散劑等。
本發(fā)明所述的健脾補(bǔ)腎方在治療骨質(zhì)疏松性骨折的醫(yī)療用途是通過發(fā)現(xiàn)健脾補(bǔ)腎方對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折動(dòng)物模型的作用療效而得出的。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),健脾補(bǔ)腎方均能顯著促進(jìn)去卵巢后骨質(zhì)疏松性骨折小鼠在不同時(shí)期骨痂的愈合,包括在骨折早期0-7天可促進(jìn)膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨,斷端附近可見大量肥大軟骨細(xì)胞增生;而在骨折中后期,14-28天,軟骨細(xì)胞凋亡,促進(jìn)成骨細(xì)胞的大量增生,同時(shí),不會(huì)抑制破骨細(xì)胞數(shù)量,以起到骨痂塑形重建的作用,使骨髓腔再通。健脾補(bǔ)腎方能明顯提高骨痂的骨量和骨強(qiáng)度。健脾補(bǔ)腎方促進(jìn)骨折斷端肌肉和骨痂中β–catenin的表達(dá)。健脾補(bǔ)腎方增加骨折斷端肌肉中肌源性干細(xì)胞的數(shù)量和促進(jìn)其增值。健脾補(bǔ)腎方促進(jìn)肌源性干細(xì)胞遷移至骨痂,從而刺激成骨,加速骨質(zhì)疏松性骨折愈合。
本發(fā)明所述的健脾補(bǔ)腎方用于治療骨質(zhì)疏松性骨折時(shí),以中藥煎劑、農(nóng)本方、顆粒劑等形式使用。
附圖說明
以下附圖中:saline—生理鹽水;jpbs-健脾補(bǔ)腎;qgjn-強(qiáng)骨膠囊。骨體積分?jǐn)?shù)(bv/tv)、骨小梁數(shù)目(tb.n)、骨小梁厚度(tb.th)、骨小梁分離度(tb.sp)、骨密度(mean/densityoftv、mean/densityofbv)。
圖1為去卵巢后3月模型組與假手術(shù)組血清雌二醇含量比較。
圖2為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊各組干預(yù)骨質(zhì)疏松性骨折28天后血清雌二醇含量比較。
圖3去卵巢模型組與假手術(shù)組腰椎micro-ct三維重建。
圖4去卵巢模型組與假手術(shù)組腰椎micro-ct參數(shù)情況。
圖5為去卵巢模型組與假手術(shù)組脛骨micro-ct參數(shù)情況。
圖6為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊干預(yù)小鼠7、14、28天骨折斷端x-ray線。
圖7為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊干預(yù)小鼠7、14、28天骨痂三維重建。
圖8為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊干預(yù)小鼠7、14、28天脛骨骨痂micro-ct參數(shù)情況。
圖9為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊干預(yù)小鼠28后脛骨骨折部位生物力學(xué)。
圖10為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊干預(yù)小鼠28后骨折愈合部位受力分析。
圖11為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊干預(yù)小鼠7、14、28天脛骨骨折部位he染色。
圖12為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊干預(yù)小鼠7、14、28天脛骨骨折部位abh/og染色。
圖13為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊干預(yù)小鼠7、14、28天脛骨骨折部位trap染色。
圖14為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊干預(yù)小鼠7、14、28天脛骨骨折部位β-catenin染色。
圖15為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊干預(yù)小鼠7、14、28天脛骨骨折部位runx2染色。
圖16為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊干預(yù)小鼠7天腓腸肌pax7+brdu免疫熒光染色。
圖17為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊干預(yù)小鼠14天腓腸肌pax7+brdu免疫熒光染色。
圖18為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊干預(yù)小鼠7天腓腸肌myod+brdu免疫熒光染色。
圖19為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊干預(yù)小鼠14天腓腸肌myod+brdu免疫熒光。
圖20為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊干預(yù)小鼠7天脛骨后肌相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)。
圖21為生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊干預(yù)小鼠14天脛骨后肌相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例應(yīng)理解為僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改,這些等效變化和修飾同樣落入本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍。
按照重量份配比稱取原料藥,浸泡1h,煎煮1~3次,每次煎煮0.5~1.5h,一煎加水10~14倍,二、三煎加水量6~10倍,合并煎煮液,濾過,在60~70℃溫度下,濾液濃縮至相對(duì)密度為1.05~1.30的浸膏;
②上述①浸膏液中加入乙醇,至乙醇濃度為50%~80%,靜置過夜,醇沉。濾過,濾液在60~70℃溫度下回收乙醇,并濃縮至相對(duì)密度為1.35~1.40的濃浸膏;
③上述②濃浸膏在70~80℃時(shí)減壓干燥,粉碎成細(xì)粉,過60目篩,得藥物組分的浸膏粉;
④按照:浸膏粉:填充劑:崩解劑=12:5:1重量比例配比(浸膏粉,微晶纖維素101,交聯(lián)羧甲基纖維素納),取上述③值得的組分,加入上述比例的填充劑、崩解劑?;靹颍捎酶煞ㄖ屏?,壓制成片,包薄膜衣,制成成品片劑,即得?;虬闯R?guī)方法制成各種口服制劑,包括片劑、顆粒劑、膠囊、合劑、散劑等。
實(shí)施例1
原料藥重量配比:黨參6g,刺五加6g,骨碎補(bǔ)6g,淫羊藿6g,丹參6g,獨(dú)活3g。
實(shí)施例2
原料藥重量配比:黨參30g,刺五加30g,骨碎補(bǔ)30g,淫羊藿30g,丹參15g,獨(dú)活12g。
實(shí)施例3
原料藥重量配比:黨參5.5g,刺五加5.5g,骨碎補(bǔ)5.5g,淫羊藿5.5g,丹參4.5g,獨(dú)活3g。
實(shí)施例4
原料藥重量配比:黨參15g,刺五加15g,骨碎補(bǔ)15g,淫羊藿15g,丹參12g,獨(dú)活9g。
實(shí)施例5
原料藥重量配比:黨參5g,刺五加5g,骨碎補(bǔ)5g,淫羊藿5g,丹參4g,獨(dú)活3g。
實(shí)施例6
原料藥重量配比:黨參12g,刺五加12g,骨碎補(bǔ)12g,淫羊藿12g,丹參9g,獨(dú)活6g。
實(shí)施例7
原料藥重量配比:黨參12g,刺五加12g,骨碎補(bǔ)9g,淫羊藿9g,丹參12g,獨(dú)活9g。
試驗(yàn)例
健脾補(bǔ)腎方對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松性骨折小鼠的作用研究。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房訂購2月齡c57bl/6雌55只,spf級(jí)飼養(yǎng)至3月齡。所有動(dòng)物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均自由飲水和進(jìn)食。許可證號(hào):scxk(京)2012-0001。
1.2實(shí)驗(yàn)藥物
健脾補(bǔ)腎方:由實(shí)施例1-7制得,隨機(jī)選??;強(qiáng)骨膠囊(北京岐黃制藥有限公司)由龍華醫(yī)院提供;10%水合氯醛注射液,批號(hào):20081027,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;ultra-sensitiveestradiolria超敏雌二醇試劑盒(beckmancoulter,dsl-4800,immunotechs.r.o.,usa)
1.3實(shí)驗(yàn)器材
uct80microct(scancomedical,che),discovery雙能x線骨密度儀,cmisa-99b圖像分析管理系統(tǒng),le-80k超速離心機(jī),leicatp1020組織脫水機(jī),leicaeg1160型全自動(dòng)石蠟包埋機(jī),leicarm2135輪轉(zhuǎn)式切片機(jī),leicahistobath型hi1210攤片機(jī),leicahistoplatehi1220型烘片機(jī),leicaemlbslr顯微鏡及照相系統(tǒng),olympus全組織掃描儀,olympusvs120-sl,eppendorf5415d高速離心機(jī)
1.4動(dòng)物模型建立及分組
在雌鼠3月齡時(shí),10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉,剔除小鼠背部正中平兩側(cè)髂嵴水平處鼠毛,碘伏消毒,無菌條件下,俯臥位經(jīng)腰背側(cè)正中切開皮膚約2-3cm切口進(jìn)入,移至一側(cè)肋弓下第3-4腰椎處,鈍性分開腰部筋膜、肌肉,切開腹膜,分離暴露卵巢,結(jié)扎輸卵管和周圍血管后,摘除卵巢。然后按相同的方法摘除對(duì)側(cè)卵巢。在確保摘除雙側(cè)卵巢后,逐層縫合腹膜至皮膚,金霉素眼膏涂抹傷口。隨機(jī)挑取5只作為模型組,5只假手術(shù)組不摘除卵巢,僅摘除雙側(cè)卵巢旁邊少許脂肪組織。其余實(shí)驗(yàn)組小鼠均于3個(gè)月后再復(fù)合脛骨骨折造模。
去卵巢后3月,對(duì)剩余45只小鼠剪腳趾進(jìn)行編號(hào)1-45#,稱量、記錄體重,平均體重為(31.9±4.5)g,運(yùn)用spass18軟件進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組分組,分為三個(gè)組別:生理鹽水組、健脾補(bǔ)腎組、強(qiáng)骨膠囊組。在復(fù)合左側(cè)脛骨骨折術(shù)后第二天,進(jìn)行灌胃治療,三組分別給予生理鹽水、健脾補(bǔ)腎方、強(qiáng)骨膠囊0.2ml/天,每組三個(gè)時(shí)間點(diǎn)7、14、28天,分別灌胃6、12、24次。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5只小鼠。每組到相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分別處死小鼠,取材,進(jìn)行指標(biāo)檢測。
1.5檢測指標(biāo)
1.5.1影像學(xué)檢查:左側(cè)脛骨骨折斷端x-ray檢查,左側(cè)脛骨骨痂micro-ct掃描分析。
1.5.2骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析:在影像學(xué)檢測之后,用14%edta對(duì)左側(cè)脛骨進(jìn)行脫鈣處理,20天左右待鈣質(zhì)完全脫掉后,leicatp1020組織脫水機(jī)行梯度脫水、浸蠟、包埋,切片機(jī)沿脛骨矢狀面,切成5mm厚切片,晾干、烤片,進(jìn)行后期病理組織形態(tài)學(xué)分析(如he、abh/og、trap染色、免疫組化、免疫熒光染色等)。
1.5.3肌肉組織切片分析:取出固定的腓腸肌經(jīng)pbs洗滌、浸泡1-2小時(shí),leicatp1020組織脫水機(jī)行梯度脫水、浸蠟、包埋,切片機(jī)沿肌肉冠狀面,切成5mm厚切片,晾干、烤片,進(jìn)行后期病理組織形態(tài)學(xué)分析(如he、免疫熒光染色等)。
1.5.3生物力學(xué)指標(biāo)檢測:通過有限元分析軟件對(duì)micro-ct三維重建的28d骨痂進(jìn)行力學(xué)分析,測量參數(shù)包括結(jié)構(gòu)剛度、破裂載荷、橫斷面積及彈性模量,由軟件計(jì)算得出。
1.6統(tǒng)計(jì)分析:計(jì)數(shù)指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差
2結(jié)果
2.1健脾補(bǔ)腎方對(duì)去卵巢后骨質(zhì)疏松性骨折小鼠血清激素水平的影響:
圖1血清雌二醇檢測顯示去卵巢后小鼠e2含量低于假手術(shù)組。
圖2說明28天時(shí)健脾補(bǔ)腎組、強(qiáng)骨膠囊組血清e(cuò)2水平與生理鹽水組有顯著性差異,說明健脾補(bǔ)腎方和強(qiáng)骨膠囊在一定療程后可改善去卵巢后雌激素水平,從而減緩高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展。
2.2健脾補(bǔ)腎方對(duì)去卵巢后骨質(zhì)疏松性骨折小鼠不同時(shí)間段骨痂愈合的影響:
圖3micro-ct三維重建可見去卵巢后腰椎骨小梁較假手術(shù)組明顯稀疏,圖4顯示去卵巢后3月,可導(dǎo)致小鼠腰椎bmd(tv)顯著性降低(p<0.01),bv/tv,tb.th,tb.n,tb.sp,bmd(bv)也有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);圖5脛骨bv/tv,tb.th,tb.n,tb.sp,bmd(tv)均顯著性降低(p<0.01),bmd(bv)無差異。根據(jù)腰椎、脛骨micro-ct以及血清雌二醇結(jié)果,說明骨質(zhì)疏松性骨折小鼠模型建立成功。
圖6x-ray顯示7天時(shí)健脾補(bǔ)腎組、強(qiáng)骨膠囊組小鼠脛骨骨折線較生理鹽水組模糊,14天時(shí)健脾補(bǔ)腎和強(qiáng)骨膠囊組骨折線較其生理鹽水組更加模糊,兩組均可見大量骨痂影,跨過骨折線,生理鹽水組骨折線較清晰,且骨痂影較少;28天時(shí)健脾補(bǔ)腎和強(qiáng)骨膠囊組骨折線消失,骨皮質(zhì)連續(xù),生理鹽水組仍可看到模糊骨折線存在,少量骨痂影。
圖7micro-ct三維重建可見健脾補(bǔ)腎和強(qiáng)骨膠囊組7、14、28天骨痂的形態(tài)與密度均優(yōu)于生理鹽水組,其中以健脾補(bǔ)腎組最佳,圖8數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步說明健脾補(bǔ)腎組在早期(7、14天)促進(jìn)小鼠骨折斷端骨痂的形成,其骨小梁體積與骨痂體積比(bv/tv)、骨痂骨密度(bmd)、連接密度(conn.d)等指標(biāo)均優(yōu)于生理鹽水組,盡管28天的數(shù)據(jù)與生理鹽水組無明顯差異,考慮各藥物干預(yù)后骨折斷端可能在21天時(shí)已基本愈合,而生理鹽水組28天時(shí)基本愈合,仍有部分硬骨痂存在,因而兩組未見明顯差異。但圖9、10生物力學(xué)——有限元分析結(jié)果,顯示健脾補(bǔ)腎組和強(qiáng)骨膠囊組骨折斷段愈合后的結(jié)構(gòu)剛度、彈性模量結(jié)果高于生理鹽水組,也說明健脾補(bǔ)腎方及強(qiáng)骨膠囊組骨痂愈合時(shí)間及質(zhì)量均優(yōu)于生理鹽水組。
2.3健脾補(bǔ)腎方對(duì)老年性骨質(zhì)疏松性骨折小鼠軟骨及成骨細(xì)胞活性的影響:
圖11he染色及圖12abh/og染色可見健脾補(bǔ)腎組、強(qiáng)骨膠囊組7天時(shí)骨折斷端大量軟骨增生,而生理鹽水組未見明顯軟骨痂形成;14天時(shí)健脾補(bǔ)腎組軟骨細(xì)胞凋亡,成骨細(xì)胞開始增加,而生理鹽水組在14天時(shí)才形成少量軟骨痂,28天健脾補(bǔ)腎組、強(qiáng)骨膠囊組骨折斷端基本愈合,骨皮質(zhì)連續(xù),骨髓腔已通,生理鹽水組仍可見硬骨痂存在,骨髓腔尚未完全再通,其愈合較中藥組延遲一周。說明中藥組,尤其是健脾補(bǔ)腎組在不同時(shí)間段可顯著上調(diào)軟骨和成骨細(xì)胞的活性,促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折的膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨,以改善骨質(zhì)疏松性骨折延遲愈合和不愈合的情況。
2.3健脾補(bǔ)腎方對(duì)老年性骨質(zhì)疏松性骨折小鼠破骨細(xì)胞活性的影響:
圖13trap染色可見各組7、14、28天骨折斷端的骨痂中均有大量破骨細(xì)胞存在,而健脾補(bǔ)腎組在7天時(shí)僅有少量破骨細(xì)胞形成,14、28天時(shí)破骨細(xì)胞開始增加。
圖13說明健脾補(bǔ)腎組早期可抑制破骨細(xì)胞的增生,僅有少量以吸收壞死骨組織,而14-28天軟骨細(xì)胞開始凋亡,成骨細(xì)胞增加,并需要一定數(shù)量破骨細(xì)胞參與凋亡軟骨細(xì)胞的吸收與骨痂重建,以使骨髓腔再通,形成正常骨骼。因此,健脾補(bǔ)腎方具有平衡成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞藕合關(guān)系,維持組織、器官的正常功能,即陰陽平衡的作用。
2.4健脾補(bǔ)腎方促進(jìn)老年性骨質(zhì)疏松性骨折愈合的分子機(jī)制研究:
圖14骨痂β–catenin免疫組化染色可見,各中藥組治療7、14、28天時(shí)骨痂中均有明顯的β–catenin陽性表達(dá)細(xì)胞,生理鹽水組僅有少量表達(dá),其中以健脾補(bǔ)腎組最為明顯,表明健脾補(bǔ)腎方可有效激活骨痂β–catenin信號(hào)通路在核內(nèi)及胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)。圖15骨痂runx2免疫組化染色可見,各中藥組治療7、14、28天時(shí)骨痂中均有明顯的runx2陽性表達(dá)細(xì)胞,生理鹽水組僅有少量表達(dá),其中以健脾補(bǔ)腎組最為明顯,表明健脾補(bǔ)腎方可有效激活骨痂runx2信號(hào)通路在核內(nèi)表達(dá)。
圖16、17骨折斷端肌肉pax7和brdu雙熒光免疫組化染色可見,與生理鹽水組相比,健脾補(bǔ)腎組在治療7天時(shí)骨折斷端肌肉中有較多pax7和brdu雙表達(dá)的細(xì)胞,表明健脾補(bǔ)腎方可一定程度促進(jìn)骨折斷端肌肉中肌源性干細(xì)胞的增殖活性。
圖18、19骨折斷端肌肉myod和brdu雙熒光免疫組化染色可見,與生理鹽水組比較,健脾補(bǔ)腎組在治療7、14天時(shí)肌肉中myod和brdu雙表達(dá)的細(xì)胞明顯增加,健脾補(bǔ)腎方可促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖活性,以利于肌肉損傷的修復(fù)。
圖20、21骨折后7、14天分離骨折斷段肌肉(脛骨后肌)進(jìn)行成骨分化基因rt-pcr檢測,與生理鹽水相比,健脾補(bǔ)腎組7天時(shí)可明顯促進(jìn)alp、runx2、axin2、pax7、en1及bmp2、oc的表達(dá);14天時(shí)可促進(jìn)axin2、opn、pax7的表達(dá)。強(qiáng)骨膠囊7天時(shí)可明顯促進(jìn)alp、runx2、axin2、pax7、en1及oc的表達(dá);14天時(shí)可促進(jìn)alp、runx2、opn、bmp2、oc、pax7、axin2。說明健脾補(bǔ)腎方在早期7天可一定程度促進(jìn)肌源性細(xì)胞的成骨分化潛能,參與骨折修復(fù)。
綜合以上各實(shí)驗(yàn)結(jié)果,得出健脾補(bǔ)腎方可提高去卵巢后雌激素水平,改善高轉(zhuǎn)換型骨量丟失造成的骨質(zhì)疏松;同時(shí)介導(dǎo)β–catenin信號(hào)通路促進(jìn)骨折部位軟骨、成骨細(xì)胞活性,促使膜內(nèi)和軟骨內(nèi)成骨;平衡破骨細(xì)胞活性,參與骨重建;并可能通過促進(jìn)骨折附近骨骼肌中肌源性干細(xì)胞的增殖,促進(jìn)肌源性干細(xì)胞一定程度上向成骨細(xì)胞特異性分化,參與骨折的修復(fù)。